Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του προστάτη είναι μια κοινή και ετερογενής νόσος, όπου ανδρογόνων υποδοχέων (AR) σηματοδότηση διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη και την πρόοδο. Η αρχική θεραπεία για τον προχωρημένο καρκίνο του προστάτη είναι η καταστολή της σηματοδότησης των ανδρογόνων. Αργότερα, ουσιαστικά όλοι οι ασθενείς αναπτύσσουν ένα ανδρογόνο ανεξάρτητο στάδιο το οποίο δεν ανταποκρίνεται σε αντι ορμονική θεραπεία. Έτσι, οι εναλλακτικές στρατηγικές που στοχεύουν νέων μοριακών μηχανισμών που απαιτούνται. β-TrCP είναι ένα Ε3 λιγάση που στοχεύει διάφορα υποστρώματα απαραίτητη για πολλές πτυχές της ογκογένεσης.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η εξάντληση των β-TrCP καταστέλλει τον καρκίνο του προστάτη και να προσδιορίσει τη σχετική ανάπτυξη μηχανισμού ελέγχου. shRNA στοχεύουν εναντίον β-TrCP μειωμένη ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη κυττάρων και συνεργάστηκε με ανδρογόνων

in vitro

και

in vivo

. Βρήκαμε ότι η αναστολή β-TrCP οδηγεί στην προς τα πάνω ρύθμιση του υποδοχέα αρυλ υδρογονάνθρακα (AhR) μεσολαβούν το θεραπευτικό αποτέλεσμα. Το φαινόμενο αυτό θα μπορούσε να είναι συνδέτης ανεξάρτητος, ως συνδέτης AhR 2,3,7,8-τετραχλωροδιβενζο-ρ-διοξίνη (TCDD) δεν μετέβαλε την ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη κυττάρων. Διαπιστώσαμε υψηλή έκφραση AhR και ενεργοποίηση σε βασικά κύτταρα και ατροφική επιθηλιακά κύτταρα του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη που φέρουν. έκφραση και ενεργοποίηση AhR είναι επίσης σημαντικά υψηλότερη σε καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με καλοήθη αδενικό επιθήλιο.

Συμπεράσματα /Σημασία

Μαζί αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση AhR μπορεί να είναι ένας καρκίνος αντιμετώπιση μηχανισμό στον προστάτη. Υποστηρίζουμε ότι συνδυάζοντας αναστολή β-TrCP με ανδρογόνων θα μπορούσαν να ωφεληθούν ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Gluschnaider U, Hidas G, Cojocaru G, Yutkin V, Ben-Neriah Υ, Pikarsky Ε (2010) β- TrCP Αναστολή Μειώνει προστάτη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω η αναβάθμιση της υδρογονανθράκων Receptor Αρύλιο. PLoS ONE 5 (2): e9060. doi: 10.1371 /journal.pone.0009060

Συντάκτης: Τσαντ Creighton, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 του Οκτωβρίου 2009? Αποδεκτές: 16 Ιανουαρίου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 5 Φεβ 2010

Copyright: © 2010 Gluschnaider et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τον Δρ Miriam και Sheldon Adelson Γ Ίδρυμα Ιατρικής Έρευνας, του προστάτη Ίδρυμα Καρκίνου – Ισραήλ και το Ίδρυμα Καρκίνου του προστάτη Ερευνών. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στον κόσμο και η τρίτη κύρια αιτία του καρκίνου στους άνδρες. Στις ανεπτυγμένες χώρες, ο καρκίνος του προστάτη αναπτύσσεται σε ένα από κάθε εννέα άνδρες ηλικίας άνω των 65 ετών. Αυτή είναι μια ετερογενής νόσος από την άποψη της κλινικής πορείας και τα αποτελέσματά της, αλλά σηματοδότηση των ανδρογόνων φαίνεται να είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του [1]. σηματοδότηση AR είναι γνωστό ότι ρυθμίζει την κανονική, καλοήθη και τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη σε διάφορες διαδικασίες (π.χ. διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμό). Επιπλέον, υπάρχουν παρατηρήσεις που δείχνουν ότι η έκφραση AR είναι ογκογόνος σε επιθήλιο προστάτη και προωθεί την εξέλιξη σε ανεξαρτησία από ανδρογόνα [2] – [8]. Η αρχική θεραπεία του προχωρημένου σταδίου και μεταστατικό καρκίνο του προστάτη είναι η καταστολή της παραγωγής ανδρογόνων με ειδικά φάρμακα ή χειρουργικό ευνουχισμό. Αργότερα, ουσιαστικά όλοι οι ασθενείς αναπτύσσουν ένα ανδρογόνο ανεξάρτητο στάδιο το οποίο δεν ανταποκρίνεται σε αντι ορμονική θεραπεία. Η τελευταία φάση είναι πάντα θανατηφόρος? Έτσι, οι εναλλακτικές στρατηγικές που στοχεύουν νέων μοριακών μηχανισμών που απαιτούνται.

Το σύστημα ουμπικιτίνης-πρωτεασώματος είναι ένας κρίσιμος καθοριστικός παράγοντας της σχεδόν όλες τις βιολογικές διεργασίες σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Σε αυτό το μονοπάτι, οι πρωτεΐνες στοχεύονται για αποικοδόμηση από ομοιοπολική πρόσδεση σε ουβικιτίνη, μια εξαιρετικά διατηρημένη μικρή πρωτεΐνη. Πρωτεΐνη ουβικιτινίωση περιλαμβάνει τη συντονισμένη δράση της ουμπικουϊτίνης-ένζυμο ενεργοποίησης Ε1, Ε2 μια ουμπικουϊτίνης-σύζευξη ενζύμου και ενός Ε3 ουβικιτίνης-πρωτεΐνης λιγάση, η τελευταία των οποίων αποδίδει πολλαπλών μορίων ουβικιτίνης με την πρωτεΐνη-στόχο [9] – [11]. Η αναστολή ολόκληρο ουβικιτίνης μονοπάτι πρωτεασώματος έχει θεραπευτική αξία σε καρκίνο (π.χ. Bortezomib, [12]). Ωστόσο, δεδομένου ότι οι αναστολείς πρωτεασώματος έχουν πλειοτροπικές επιδράσεις, η αναστολή ενός μοναδικού κλειδιού Ε3 μπορεί να προσφέρει μια πιο συγκεκριμένη επιλογή θεραπείας με λιγότερες παρενέργειες.

β-τρανσντουσίνης επαναλήψεις που περιέχουν πρωτεΐνες (β-TrCP) χρησιμεύει ως υπόστρωμα αναγνώριση υπομονάδες για την ΕΕΤ

β-TrCP Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης. Αυτές οι λιγάσες ουβικιτίνη φωσφορυλιωμένη υποστρώματα ειδικά και παίζουν κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης και διάφορα μονοπάτια μεταγωγής σήματος, η οποία με τη σειρά τους, είναι απαραίτητα για πολλές πτυχές της ογκογένεσης [13]. Υπάρχουν δύο β-TrCP γονιδίων σε γονιδιώματα θηλαστικών που κωδικοποιούν για τις δύο πλεονάζουν πρωτεΐνες β-TrCP1 και β-TrCP2. Τα τελευταία χρόνια, ποικίλες β-TrCP υποστρώματα που εμπλέκονται σε διάφορες φυσιολογικές και κακοήθεις οδούς ανακαλύφθηκαν [14] – [23]. Δύο καλά χαρακτηρισμένες

καλόπιστους οι

υποστρώματα β-κατενίνης και ΙκΒ. Η αποδόμηση του τελευταίου ελευθερώνει ΝΡ-κΒ να εισέλθει στον πυρήνα και επαγωγή της μεταγραφής [11], [24] – [27]. Από την άλλη πλευρά, β-κατενίνη είναι φωσφορυλιωμένη, αναγνωρίζεται άμεσα από β-TrCP και αποικοδομείται από το πρωτεάσωμα [24]. Έτσι, β-TrCP έχει αντίθετα αποτελέσματα σε δύο βασικούς ογκογόνους μονοπάτια. Ενώ ο ρόλος του β-κατενίνης στον καρκίνο του προστάτη είναι αμφιλεγόμενη [28], [29], υπάρχουν ενδείξεις που υποδηλώνει ότι ΝΡ-κΒ παίζει ένα προ-ογκογόνο ρόλο στον καρκίνο του προστάτη [30] – [32]. Η αντίθετη επίδραση επί αυτών των δύο ογκογόνες πρωτεΐνες απεικονίζει την προσαρμοστικότητα του συγκεκριμένου Ε3 λιγάση. Επιπλέον, β-TrCP άμεσα εμπλακεί σε διάφορους τύπους καρκίνου [33] – [36], έτσι είναι εύλογο να ερευνήσει περαιτέρω το ρόλο της στον καρκίνο του προστάτη

Σε αυτή την εργασία, δείχνουμε ότι η αναστολή της β-TrCP. αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη που δείχνει αθροιστική δράση με ανδρογόνων,

in vitro

και

in vivo

. Αυτή η επίδραση διαμεσολαβείται σε μεγάλο βαθμό μέσω της ενεργοποίησης του υποδοχέα αρυλο υδρογονανθράκων (AhR), όπως χτυπήσει κάτω την πρωτεΐνη αυτή καταργεί την επίδραση της αναστολής της β-TrCP.

Αποτελέσματα

NF-κΒ ενεργοποίησης συσχετίζεται με τον καρκίνο του προστάτη Αποτέλεσμα των ασθενών

β-TrCP είναι ένα σημαντικό Ε3 λιγάση γνωστό ότι ρυθμίζει πολλά διαφορετικά υποστρώματα. ΝΡ-κΒ είναι ένα καλά χαρακτηρισμένο παράγοντα μεταγραφής αρνητικά ρυθμίζεται από ΙκΒ, έτσι έμμεσα θετικά διαμορφώνονται από β-TrCP. Η εμπλοκή της NF-κΒ σε καρκίνο προστάτη είναι καλά διερευνηθεί και προηγούμενες μελέτες έδειξαν ογκογόνο ρόλο της στον προστάτη. Υπάρχει επίσης πρόσφατη ένδειξη για την εμπλοκή ΝΡ-κΒ στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη σε ανδρογόνα ανεξάρτητο στάδιο [37]. Προκειμένου να επιβεβαιώσει τη σημασία αυτού του παράγοντα για την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη, ελέγξαμε κατάσταση ενεργοποίησης της στην πρωτογενή δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική χρώση με αντισώματα κατά του p65 (Σχήμα 1Α). 131 προστάτη δείγματα καρκίνου, στίγματα σε ένα ενιαίο μικροσυστοιχία slide ιστό από ασθενείς με διαφορετικές ποιότητες Gleason αναλύθηκαν. 39% των δειγμάτων έδειξε τουλάχιστον μερικά ρ65 θετικών πυρήνων (Σχήμα 1Β). Αναλύσαμε επίσης 14 προστάτη μεταστάσεων καρκίνου, εκ των οποίων το 64% ήταν θετικά (Σχήμα 1Α, Β). Θέτουμε να αξιολογηθεί η συσχέτιση μεταξύ καρκίνου του προστάτη σκορ Gleason και την ενεργοποίηση του NF-κΒ. Πράγματι, βρήκαμε μια σύνδεση μεταξύ των δύο (p = 0,014, ακριβής δοκιμασία του Fisher). Φάνηκε ότι η πυρηνική χρώση ΝΡ-κΒ ήταν ισχυρότερη σε ασθενείς με υψηλότερα σκορ Gleason ή σε μεταστάσεις αυξάνοντας την πιθανότητα ότι η ενεργοποίηση του NF-κΒ θα μπορούσε να συσχετιστεί με την πρόγνωση. Για να δοκιμάσει αυτή τη δυνατότητα, θα immunstained 80 πρωτογενείς όγκους για p65, από τους ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ριζική προστατεκτομή και για την οποία είχαμε κλινική παρακολούθηση. 77% των ασθενών των οποίων η κύρια δείγματα όγκων αρνητικά χρωματισμένο για την πυρηνική p65, δεν παρουσίασαν καμία υποτροπή έως 8 χρόνια μετά από ριζική προστατεκτομή. Αντίθετα, η νόσος υποτροπιάσει σε 65% των ασθενών θετικών ΝΡ-κΒ (Σχήμα 1 C). Μια άλλη σημαντική προ-ογκογόνο υπόστρωμα β-TrCP είναι β-κατενίνης. Επειδή η αναστολή της β-TrCP θα ενισχύσει τη σταθερότητα β-κατενίνης και την προώθηση της ογκογένεσης, ήταν απαραίτητο να παρακολουθεί επίσης β-catening συσχέτιση με αποτέλεσμα ασθενείς με καρκίνο του προστάτη ». Πυρηνικός εντοπισμός της ενεργοποίησης β-κατενίνης δεν συσχετίστηκε με τη βαρύτητα της νόσου στο ίδιο πληθυσμό ασθενών (Σχήμα S1). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν μια κλινικό πλεονέκτημα για την αναστολή της β-TrCP στον καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, το πλήθος των β-TrCP υποστρώματα (37, με, ενδεχομένως, περισσότερο για να προσδιοριστούν) αποκλείει μια ολοκληρωμένη ανάλυση όλων αυτών με τον ίδιο τρόπο, και απαιτεί μια άμεση προσέγγιση για τη μελέτη της χρησιμότητας της αναστολής β-TrCP στον καρκίνο του προστάτη.

τμήματα του καρκίνου του προστάτη είχαν ανοσοχρωματίστηκε χρησιμοποιώντας p65 αντισώματα. Α Αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες ενός πρωτογενούς όγκου (αριστερά) και λεμφαδένα μετάσταση (δεξιά) από τον ίδιο ασθενή. B. Ποσοστό των αρνητικών, θετικών και ισχυρά θετικών κρουσμάτων εντοπίστηκε σε μια μικροσυστοιχία ιστού από τις αναφερόμενες Gleason σκορ (p = 0,0014, ακριβής δοκιμασία του Fisher). Γ όγκοι πρωτογενούς προστάτη (n = 131) ανοσοχρωματίστηκαν για ρ65 και αξιολογήθηκαν για δραστηριότητα ΝΡ-κΒ. Kaplan-Meier οικόπεδο αποκάλυψε συσχέτιση μεταξύ της κατάστασης της ΝΡ-κΒ και του κινδύνου για υποτροπή της νόσου. Μπλε, έντονα χρωματισμένο δείγματα? Κόκκινο, ασθενώς χρωματισμένο δείγματα? Πράσινο, αρνητική χρώση δειγμάτων (p = 0.02).

Η

β-TrCP Αναστολή μειώνει τον καρκίνο του προστάτη Η ανάπτυξη των κυττάρων

Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της αναστολής της β-TrCP στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη . Για το σκοπό αυτό, κατασκευάσαμε ένα δοξυκυκλίνη επαγώγιμο shRNA λεντοϊού φορέα στόχευσης τόσο β-TrCP1 και β-TrCP2 με τα οποία μετάγονται τα δύο ανδρογόνο ευαίσθητες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, LNCaP και LAPC4. θεραπεία δοξυκυκλίνη των trasnduced LNCaP κύτταρα οδήγησε σε αποτελεσματική γκρεμίσουμε και των δύο γονιδίων β-TrCP (85% και 75% για β-TrCP1 και β-TrCP2, αντίστοιχα), όπως προσδιορίζεται με τη χρήση ποσοτικής σε πραγματικό χρόνο PCR (qRT PCR – Σχήμα 2Α). Αυτό συνοδεύτηκε από ΙκΒα σταθεροποίηση τόσο πριν όσο και μετά από διέγερση TNF, επιδεικνύοντας αποτελεσματική επαγωγή πρωτεΐνης κάτω ρύθμιση (Σχήμα 2Β). Για να αξιολογηθεί η συνέπεια της β-TrCP γκρεμίζω σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη, θα παρακολουθείται δοξυκυκλίνη-επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα LNCaP κύτταρα για εννέα ημέρες και μετράται η κυτταρική ανάπτυξη

in vitro

. Το Σχήμα 2C δείχνει μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων μετά είτε β-TrCP αναστολή ή ανδρογόνων θεραπεία εκτομή (κάτω αριστερά και πάνω δεξιά πάνελ, αντιστοίχως). Επιπλέον, συνδυάζοντας β-TrCP αναστολή με ανδρογόνων δείχνει ένα προσθετικό αποτέλεσμα (Σχήμα 2C κάτω δεξιά πάνελ και το Σχήμα 2D). Εμείς επόμενη ποσοτικοποιηθεί κυτταρικής ανάπτυξης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΧΤΤ και επιβεβαίωσε την ανάλυση μορφολογικής μας (Σχήμα 2D). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με LAPC4 κύτταρα (Σχήμα S2).

LNCaP κύτταρα μολύνθηκαν με ένα βραδέος ιού φορέα που φέρει ένα επαγώγιμο δοξυκυκλίνη εξαρτώμενη β-TrCP shRNA. A. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 72 ώρες με 1 μg /ml δοξυκυκλίνης και τα επίπεδα του RNA του β-TrCP1 και β-TrCP2 μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας qRT PCR. Η ανάλυση στυπώματος Western Β εκχυλισμάτων πρωτεΐνης από κύτταρα επεξεργασμένα με TNF, δοξυκυκλίνη ή MG-132 ανοσοστυπώθηκαν με είτε ΙκΒ ή τουμπουλίνης. Γ αντιπροσωπευτική μικροφωτογραφία από κύτταρα που κατεργάζονται όπως υποδεικνύεται και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. δοκιμασία Δ ΧΤΤ χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της κυτταρικής ανάπτυξης σε διαφορετικά χρονικά σημεία. DOX, δοξυκυκλίνη? NT, καμία θεραπεία? FCS, ρυθμισμένο μέσο που περιέχει ορό εμβρύου μόσχου? CSS, ρυθμισμένο μέσο που περιέχει ανδρογόνο απεμπλουτισμένο ορού (κάρβουνο απογυμνωμένο ορό). Οι ράβδοι σφάλματος, SD. * Σημαντικά διαφορετικό από τα μη κατεργασμένα κύτταρα και από την άλλη, ρ-τιμή & lt?. 0,01, t-test

Η

Για να αποκλειστεί shRNA off επιδράσεις στόχο, χρησιμοποιήσαμε ένα περιγράφηκε προηγουμένως β-TrCP κυρίαρχο αρνητικό κατασκεύασμα έλλειψη του πεδίου F-box [33]. Αυτή η παραλλαγή σταθεροποιεί β-TrCP υποστρώματα, καθώς δεσμεύει τις φωσφορυλιωμένη στόχους, αλλά αποτυγχάνει να προσλάβει τα πρόσθετα συστατικά του συμπλόκου SCF τα οποία είναι κρίσιμα για την καταλυτική δράση Ε3 λιγάση. Τα αποτελέσματα της αναστολής β-TrCP χρησιμοποιώντας την κυρίαρχη αρνητική μορφή, ήταν ουσιαστικά παρόμοια με τα αποτελέσματα shRNA (Σχήμα S3A και Β).

β-TrCP Αναστολή συνεργάζεται με ανδρογόνων

In Vivo

για να αναλυθεί περαιτέρω το αποτέλεσμα της αναστολής της β-TrCP στην ανάπτυξη του όγκου του καρκίνου του ανθρώπινου προστάτη, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος. Εμείς ένεση κυττάρων LNCaP που μεταφέρουν επαγώγιμος β-TrCP shRNA κατασκευάσει μέσα στο υποδόριο των 39 ανοσοκαταστολή

Balb /c RAG1

– /- αρσενικά ποντίκια. 25 από τα ποντίκια (64%) ανέπτυξαν ορατά και μετρήσιμα καρκινώματα 30 ημέρες μετά την ένεση. Από την αρχική ανάπτυξη του όγκου ήταν κάπως ετερογενής σε μέγεθος και κινητική, εμείς διαιρέθηκαν τυχαία αυτά τα 25 ποντίκια σε τέσσερις ομάδες θεραπείας: 1. Ακέραια χωρίς θεραπεία ποντικούς (ΝΤ, η = 4? Μέσος όγκος του όγκου 123,1 ± 70,7)? 2. Οι ποντικοί δίδεται τετρακυκλίνη στο πόσιμο νερό με αποτέλεσμα την αναστολή β-TrCP (Tet, η = 5? Μέσος όγκος του όγκου 80,3 ± 98,2)? 3. Οι ευνουχισμένοι ποντικοί με αποτέλεσμα ανδρογόνων (ηθοποιών, n = 7? Μέσος όγκος του όγκου 121,6 ± 95,0)? 4. Ο ευνουχισμός συν τετρακυκλίνη (Cast + Tet, n = 8? Μέσος όγκος του όγκου 180,3 ± 143,9). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο μέσο μέγεθος όγκου κατά την έναρξη της θεραπείας μεταξύ των τεσσάρων ομάδων. Παρακολουθήσαμε την ανάπτυξη του όγκου μία φορά την εβδομάδα, και θυσιάστηκαν τα ποντίκια 30 ημέρες μετά την αρχική θεραπεία. RNA που εκχυλίζεται από όγκους από τα ποντίκια Tet αγωγή έδειξαν β-TrCP γκρεμίζω που κυμαίνεται από 50% έως 80% (Σχήμα 3Α). Παρόμοια με

in vitro

ευρήματά μας, αναστέλλοντας β-TrCP μειωμένη ανάπτυξη του όγκου, με ή χωρίς αφαίρεση ανδρογόνων (Σχήμα 3Β). Ανάλυση πολλαπλασιασμού όγκου χρησιμοποιώντας BrdU ανοσοβαφή κατέδειξε ότι οι ποντικοί που έλαβαν θεραπεία με αμφότερα ανδρογόνων και της αναστολής β-TrCP έδειξε τα χαμηλότερα ποσοστά πολλαπλασιασμού (Σχήμα 3C και το σχήμα S4). καταστολή της ανάπτυξης του όγκου δεν μπορεί να εξηγηθεί μέσω απόπτωσης, αφού αντι διασπασμένη κασπάση 3 ανοσοχρώση δεν αποκάλυψε καμία διαφορά μεταξύ των ομάδων θεραπείας (Σχήμα 3D). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με κύτταρα καρκίνου του προστάτη AT2.1 αρουραίου σταθερά διαμολυσμένα με ένα επαγώγιμο κυρίαρχο αρνητικό β-TrCP διαγονίδιο (Εικόνα S2B). Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αναστολή της β-TrCP καταστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη και

in vitro

και

in vivo

και δείχνει ένα προσθετικό αποτέλεσμα με ανδρογόνων.

LNCaP κύτταρα φέρουν επαγόμενη τετρακυκλίνη κατασκευάσματος β-TrCP shRNA ενέθηκαν υποδορίως σε ανοσοκαταστολή

RAG1

– /- ποντίκια. Ποντικοί (n≥4 σε κάθε ομάδα) ήταν είτε χωρίς επεξεργασία (ΝΤ), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τετρακυκλίνη στο πόσιμο νερό τους (Tet), φυσικώς ευνουχισμένοι (Cast) ή και των δύο (Cast + Tet) για 30 ημέρες. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν εβδομαδιαίως. (ΈΝΑ). qRT PCR και για τις δύο ισομορφές β-TrCP πραγματοποιήθηκε σε RNA που εκχυλίζεται από τους όγκους που συγκομίζονται την ημέρα κινητική 30. (Β) Η ανάπτυξη του όγκου. Τομές ιστού βάφτηκαν για BrdU (C) ή ενεργοποιημένα κασπάσης 3 (D) και οι βαθμολογίες πολλαπλασιασμό και την απόπτωση, αντίστοιχα, προσδιορίστηκαν για κάθε όγκο. Ορατή είναι μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (Α) ή ± S.E.M (Β, Γ και Δ) * p-value & lt?. 0.05, ** p-value = 0,0002, t-test? p-value σε C αναφέρεται σε t-test.

Η

Αρυλ Υδρογονανθράκων Receptor (AhR) ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά την β-TrCP Αναστολή και ανδρογόνων

Για την διαλεύκανση των μοριακών οδών που είναι υπεύθυνες για την ανασταλτική της ανάπτυξης δράση της εξάντλησης β-TrCP σε συνδυασμό με ανδρογόνων πραγματοποιήσαμε ένα ευρύ φάσμα ανάλυσης μικροσυστοιχιών. LAPC4 κύτταρα μολυσμένα με τον φορέα λεντοϊού shβ-TrCP, είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή θεραπεία για 72 ώρες με δοξυκυκλίνη, απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα ορό ή και τα δύο. δείγματα cDNA υποβλήθηκαν σε ανάλυση μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας U133 Affimetrix τσιπ σχολαστικά ~30,000 σετ καθετήρα. Στη συνέχεια προσπάθησε να εντοπίσει τα γονίδια τα οποία επηρεάζονται σε συνεργασία τόσο ανδρογόνων και η αναστολή της β-TrCP. Μεταξύ των ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια, ήταν εν δυνάμει αντιφλεγμονώδη γονίδια (π.χ. ANXA1) και μεταξύ των περίοπτη θέση μειωτικά ήταν προστάτη συγκεκριμένα γονίδια (π.χ. KLK2). Ωστόσο, η πιο δραματική αύξηση ήταν η έκφραση του υποδοχέα αρυλο υδρογονανθράκων (διοξίνη) (AhR). Το γονίδιο αυτό ρυθμίζεται αυξητικά μετά είτε ανδρογόνων ή β-TrCP αναστολή και ήταν το πιο υψηλά αλλαγμένο γονίδιο οφείλεται στη συνδυασμένη θεραπεία (Σχήμα 4). Θα μπορούσαμε να αποδώσουμε AhR επίπεδο προς τα πάνω ρύθμιση σε β-TrCP εξάντληση, δεδομένου ότι η δοξυκυκλίνη μόνο δεν μετέβαλε mRNA του υποδοχέα (Σχήμα S5).

Α. κύτταρα μολυσμένα με LAPC4 επαγώγιμο β-TrCP shRNA υποβλήθηκαν σε αγωγή για 72 ώρες με την υποδεικνυόμενη αγωγή, υποβλήθηκε σε εκχύλιση RNA και ανάλυση μικροσυστοιχιών cDNA (Affymetrix). Μετά την κανονικοποίηση των δεδομένων, τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης συγκρίθηκαν μεταξύ της θεραπείας και των δειγμάτων ελέγχου χωρίς θεραπεία. Α Θερμότητας χάρτη δενδρόγραμμα που δείχνει το δέκα πιο πολύ up (κόκκινο) και κάτω (πράσινο) ρυθμίζονται τα γονίδια οφείλεται στη συνδυασμένη θεραπεία. Διπλώστε αλλαγή αφορά τις συνδυασμένες ανιχνευτές θεραπείας τιμές σε σχέση με τον έλεγχο. Έκφραση των ισομορφών β-TrCP παρουσιάζεται παρακάτω. κύτταρα Β LAPC4 μολυσμένα με τον ίδιο φορέα λεντοϊού και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται υποβλήθηκαν σε εκχύλιση του RNA και ανάλυση qRT PCR με τις αναφερόμενες εκκινητές. CSS, απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα ορό? DOX, δοξυκυκλίνη? Οι ράβδοι σφάλματος, SD.

Η

Το AhR είναι ενεργοποιημένο συνδέτη μεταγραφικός παράγοντας που συμμετέχουν στην οργανογένεση, στην αποτοξίνωση των ενδο- και ξενοβιοτικών ουσιών και στη διαμεσολάβηση ποικίλες όργανο ειδικές τοξικές αντιδράσεις των διοξινών. Ο υποδοχέας αυτός ανήκει στο βασικό helix- loop-helix (bHLH) /PAS (υποδοχέας υδρογονανθράκων Περίοδος -αρύλιο πυρηνική μεταθέτη-Single minded) οικογένεια ετεροδιμερικών ρυθμιστές της μεταγραφής. Οι πρωτεΐνες bHLH /PAS που εμπλέκονται στον έλεγχο των διαφόρων φυσιολογικών διαδικασιών όπως κιρκαδικούς ρυθμούς, ανάπτυξη οργάνων, νευρογένεση, τον μεταβολισμό και την απόκριση στρες σε υποξία [38] – [40]. Πρόσφατες μελέτες αποκάλυψαν μια σύνδεση μεταξύ της οδού και του προστάτη AhR τόσο

in vitro

και

in vivo

, δείχνοντας ότι η AhR αλληλεπιδρά και αναστέλλει την AR. Επιπλέον, η AhR ενεργεί ως Ε3 λιγάση του AR [41] και AhR

null

ποντίκια TRAMP δείχνουν αυξημένη ογκογένεση του προστάτη [42]. Χρησιμοποιήσαμε qRT PCR για την επικύρωση της ανάλυσης σειρά cDNA. Βρήκαμε ότι, ενώ κάθε θεραπεία μόνη αυξημένα επίπεδα AhR RNA περισσότερο από 2 πτυχώσεις, η συνδυασμένη θεραπεία οδήγησε σε περισσότερο από 4 φορές προς τα πάνω ρύθμιση τόσο LAPC4 (Σχήμα 4Β) και κύτταρα LNCaP (Σχήμα S6). Για να ελεγχθεί η λειτουργική δραστηριότητα της οδού της AhR μετρήσαμε τα επίπεδα mRNA του κανονικού στόχου 1Α1 κυτοχρώματος Ρ450 της (CYP1A1). Οι αναλύσεις μας δείχνουν ότι τα επίπεδα CYP1A1 ήταν αυξημένα σε σχέση με τα επίπεδα AhR στις 4 ομάδες θεραπείας (Σχήμα 4Β). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτή η προς τα πάνω ρύθμιση συνέβη χωρίς προσθήκη εξωγενούς συνδέτη AhR. Η προσθήκη του ισχυρού AhR συνδέτη TCDD περαιτέρω επαυξημένης αυξορρύθμιση CYP1A1 (Σχήμα 5C και δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

LNCaP κύτταρα μολυσμένα με ένα επαγώγιμο φορέα λεντοϊού για Shahr μόνο (Α) ή μαζί με shβ-TrCP (Β) ήταν αγωγή για 72 ώρες με την υποδεικνυόμενη θεραπείες και κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με την δοκιμασία ΧΤΤ. Γ qRT PCR επιβεβαίωσε β-TrCP και AhR αποτελεσματική γκρεμίζω. Δ κηλίδες Western που δείχνουν σταθεροποίηση της β-κατενίνης μετά την αναστολή της β-TrCP και επιβεβαιώνοντας την ανύψωση επίπεδο πρωτεΐνης AhR ή γκρεμίσουμε λόγω σχετικής Τα siRNAs. DOX, δοξυκυκλίνη? FCS, ορός εμβρύου μόσχου? CSS, απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα ορό. Οι ράβδοι σφάλματος, SD.

Η

Η ανάπτυξη καταστολή Επίδραση της β-TrCP Αναστολή διαμεσολαβείται μέσω Προς τα πάνω ρύθμιση της Αρυλ Υδρογονανθράκων Receptor

Για να διερευνηθεί η σημασία της ενεργοποίησης της οδού AhR εξής β- εξάντληση TrCP, έχουμε μολυνθεί πρώτα κύτταρα LNCaP με επαγώγιμων AhR shRNA. Ενώ η θεραπεία με δοξυκυκλίνη οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα mRNA AhR δεν θα μπορούσαμε να ανιχνεύσουν οποιαδήποτε επίδραση επί της ανάπτυξης κυττάρου (Σχήμα 5Α). Στη συνέχεια, συν-μολυσμένα κύτταρα LNCaP που φέρουν επαγώγιμων β-TrCP shRNA με τον επαγόμενο φορέα AhR shRNA. Η προσθήκη δοξυκυκλίνης στο μέσο του διπλού knockdown κυττάρων οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα β-TrCP mRNA, παρόμοια με τα μεμονωμένα κύτταρα knockdown? ακόμη όπως αναμενόταν, σε αυτά τα κύτταρα τα επίπεδα AhR μειώθηκαν αντί να αυξηθούν τόσο στα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης (Εικόνα 5C, D). Έτσι, τα διπλά κύτταρα νοκ ντάουν μας επιτρέπει να ελέγξετε εάν το αποτέλεσμα αναστολής της ανάπτυξης των β-TrCP διαμόρφωση διαμεσολαβείται μέσω AhR ρύθμιση προς τα πάνω. Πράγματι, στο διπλό κύτταρα LNCaP knockdown, β-TrCP εξάντληση απέτυχε να μειώσει την ανάπτυξη των κυττάρων είτε με είτε χωρίς ανδρογόνων (Σχήμα 5Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με ένα διαφορετικό shRNA στοχευμένη εναντίον του AhR (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι ενδιαφέρον ότι, η προσθήκη του ισχυρού εξωγενούς συνδέτη TCDD δεν μείωσε την κυτταρική ανάπτυξη και μόνο? ούτε είχε μια επίδραση με οποιαδήποτε από τις διάφορες θεραπείες (Σχήμα S7). Αυτό υποδηλώνει ότι η επίδραση αυτή είναι AhR συνδέτη ανεξάρτητη. Η ανάλυση στυπώματος Western επιβεβαίωσε σταθεροποίηση β-κατενίνης και την προς τα πάνω ρύθμιση AhR mRNA μετά β-TrCP αναστολής (Σχήμα 5C). Έτσι, τα διπλά νοκ ντάουν αποτελέσματα δείχνουν ότι οι περισσότεροι από την επίδραση της β-TrCP νοκ ντάουν διαμεσολαβείται από ρύθμιση προς τα πάνω του AhR.

AhR έκφραση στον καρκίνο του προστάτη ασθενείς

Παρατήρησης AhR ρύθμιση προς τα άνω κατά την β-TrCP αναστολή σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη μας ώθησε να επιθεωρήσει την κατάσταση AhR σε διάφορα στάδια του καρκίνου του προστάτη. Για την αντιμετώπιση αυτού του στόχου, συλλέξαμε 39 δείγματα πρωτογενών όγκων του καρκίνου του προστάτη από το Ιατρικό Κέντρο Hadassah. Από αυτή την ομάδα, 17 ασθενείς υπέφεραν από υποτροπή της νόσου. Πραγματοποιήσαμε immunohitochemical αντι χρώση AhR και παρακολουθείται κυτταροπλασματική και πυρηνική έκφραση AhR. Πρώτον, ανιχνεύθηκαν υψηλά AhR σε βασικά κύτταρα που βρίσκονται στην περίμετρο καλοήθη αδένα (Σχήμα 6Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, πολλαπλασιαστικών φλεγμονωδών ατροφία (ΡΙΑ), που θεωρείται ως πρόδρομος βλάβη σε καρκίνο του προστάτη έδειξε πολύ ισχυρή κυτταροπλασματική και πυρηνική χρώση (Σχήμα 6Β). Χρησιμοποιήσαμε μια υποκειμενική βαθμολογία από 0 έως 3, για να ποσοτικοποιηθεί ένταση χρώσης σε φυσιολογικά και κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα σε κάθε δείγμα. Η ανάλυσή μας δείχνει προς τα πάνω ρύθμιση του AhR τόσο στα κυτταροπλασματικά και πυρηνικά τοποθεσίες στον κακοήθη επιθήλιο (Εικόνα 6C, D, ρ & lt? 0.001, Mann-Whitney test). Ωστόσο, δεν παρατηρήσαμε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης AhR στα κύτταρα του όγκου και την υποτροπή της νόσου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

τομές προστάτη ανοσοχρώστηκαν με AhR αντίσωμα. Μικροφωτογραφίες παρουσιάζουν ισχυρή έκφραση AhR σε βασικά κύτταρα (βέλη στο Α) και πολλαπλασιαστική φλεγμονώδεις ατροφία (Β). έκφραση C. Υψηλότερες AhR σημειώνεται σε κακοήθεις αδένες (Τ) σε σύγκριση με την κανονική αδένες (Ν). Δ Κανονική και κακοήθεις αδένες βαθμολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μια κλίμακα 0-3. Οι μέσες τιμές ± δ.Ε.Μ. εμφανίζονται (τιμή p & lt? 0,001, Mann-Whitney test).

Η

Συζήτηση

Ο καρκίνος του προστάτη είναι μια ετερογενής νόσος περιλαμβάνει πολλές γενετικές και φαινοτυπικά χαρακτηριστικά. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου του προστάτη είναι εξέλιξης σε ένα ανδρογόνο ανεξάρτητο στάδιο (ΑΙ) μετά την ορμονική θεραπεία. Οι αιτίες για τη μετάβαση αυτή δεν είναι πλήρως κατανοητοί και επικουρική θεραπείες ισχυροποιώντας ορμονικό χειρισμό που απαιτείται. Ένας παράγοντας που συχνά εμπλέκεται στην πρόοδο του όγκου σε πολλούς τύπους καρκίνου είναι NF-κΒ. Εδώ επιβεβαιώνουμε ότι ΝΡ-κΒ είναι συχνά ενεργοποιείται σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη (Σχήμα 1). Επιπλέον, η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ συσχετίζεται με επανεμφάνιση καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 1 C). Ένας από τους κύριους ρυθμιστές του NF-κΒ είναι το Ε3 ουμπικουιτίνης λιγάση SCF

β-TrCP, η οποία στοχεύει ΙκΒ καθώς και πολλά άλλα υποστρώματα για ουβικιτινίωση και αποδόμησης, [27]. β-TrCP θεωρείται ότι παίζει ένα προ-ογκογόνο ρόλο σε ορισμένους τύπους καρκίνων [43]. Με βάση την παρατηρούμενη προς τα πάνω ρύθμιση του NF-κΒ, ήταν σημαντικό να ακολουθήσει ένα άλλο κοινό προ-ογκογόνο β-TrCP υπόστρωμα, β-κατενίνης, η οποία επίσης ενοχοποιηθεί στον καρκίνο του προστάτη [28], [29], [44]. Ωστόσο, δεν θα μπορούσαμε να ανιχνεύσει μια συσχέτιση μεταξύ της ενεργοποίησης β-κατενίνης και υποτροπής του καρκίνου του προστάτη (Σχήμα S1), γεγονός που υποδηλώνει ότι μόνο μερικοί β-TrCP στόχοι έχουν σημασία για την εξέλιξη της νόσου. Για να αξιολογηθεί το πλήρες πεδίο της β-TrCP αποτελέσματα, στόχος μας ήταν να αναστέλλουν β-TrCP σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη και για την παρακολούθηση της επίδρασης της στην ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη κυττάρων. Μας

in vitro

και

in vivo

μελέτες αποκάλυψαν ότι κατά β-TrCP προστάτη αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων μειώνεται. Θα μπορούσαμε επίσης να ανιχνεύσει ένα προσθετικό αποτέλεσμα όταν συνδυάζονται β-TrCP αναστολή με ανδρογόνων (Σχήμα 2 και 3). Για τον προσδιορισμό των μηχανισμών καταστολής της ανάπτυξης μέσω της αναστολής β-TrCP, θα πραγματοποιηθεί μια ανάλυση της σειράς cDNA και παρατηρήθηκε μία πρόσθετη ύλη προς τα πάνω ρύθμιση του AhR (Σχήμα 4). AhR είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι δρα ως Ε3 λιγάση του AR [41], παρέχοντάς μας μια πιθανή σύνδεση με σηματοδότηση AR. Επιπλέον, σημείωσε ότι η έκφραση AhR είναι υψηλότερη κατά συνδυάζοντας ανδρογόνων και η αναστολή της β-TrCP. Ως εκ τούτου υποθέσαμε ότι η προς τα πάνω ρύθμιση του AhR μπορούσε να μεσολαβούν την ανασταλτική δράση ανάπτυξης των β-TrCP knockdown σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Αυτή η αντίληψη υποστηρίχθηκε από προηγούμενες εκθέσεις που αποδεικνύουν έναν ανασταλτικό ρόλο για την οδό AhR στον καρκίνο του προστάτη. Morrow

et al

έδειξε συνδέτη AhR αναστολή εξαρτάται από την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP. Ομοίως, άλλες μελέτες έχουν επίσης ενοχοποιηθεί τον υποδοχέα ανδρογόνων σε AhR αναστολή της ανάπτυξης [45], [46]. Στη μελέτη μας, να χτυπήσει κάτω το AhR

per se

σε LNCaP κύτταρα δεν μετέβαλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη (Σχήμα 5Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι τα βασικά επίπεδα της AhR δεν ασκούν ανασταλτική ισχύ, εκτός εάν διεγείρεται από συνδέτη. Από την άλλη πλευρά τόνωση έκφραση AhR μέσω εξάντληση β-TrCP συσχετίστηκε με σημαντική καταστολή της ανάπτυξης συνδέτη-ανεξάρτητη. εξάντληση AhR αντέστρεψε το αποτέλεσμα καταστολή της ανάπτυξης των β-TrCP knockdown, ακόμη και υπό ανδρογόνων, αποδεικνύοντας ότι AhR αυξορρύθμιση, η οποία σημειώσαμε και σε άλλες συνθήκες στρες (π.χ. ατροφία, φλεγμονή και ανδρογόνων) αντιπροσωπεύει το β-TrCP ανασταλτική επίδραση (Σχήμα 5). Είναι ενδιαφέρον ότι, η χορήγηση συνδέτη δεν επηρέασε την ανάπτυξη των κυττάρων, ακόμη και αν το έκανε διεγείρουν την έκφραση του κλασικού AhR CYP1A1 στόχο οδού. Αυτά τα αποτελέσματα εμπλέκουν έναν συνδετήρα και CYP1A1 ανεξάρτητο μονοπάτι AhR στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

Chesire

et al

εντόπισε την AhR ως υποτιθέμενο στόχο της β-κατενίνης στα κύτταρα LNCaP [47]. Όπως δείχνουμε ότι εξάντληση β-TrCP σταθεροποιεί β-κατενίνης παράλληλα με την προς τα πάνω ρύθμιση του AhR (Σχήμα 5D), είναι πιθανό ότι η αιτία του AhR ανύψωση εξής εξάντληση β-TrCP είναι σταθεροποίηση β-κατενίνης.

μας μελέτες υποδεικνύουν μία νέα συνδέτη ανεξάρτητη στρατηγική για την ενίσχυση της έκφρασης AhR ως μέσο καταστολής της ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη. Η στρατηγική αυτή μπορεί επίσης να αντανακλάται στη φυσική ιστορία του καρκίνου του προστάτη. Βρήκαμε ότι AhR κανονικά εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα σε προστάτη επιθήλιο βασικά κύτταρα (κυτταροπλασματική και πυρηνική χρώση, Σχήμα 6Α) και είναι ουσιαστικά ρυθμίζεται αυξητικά σε περιοχές της πολλαπλασιαστικής φλεγμονώδους ατροφία (ΡΙΑ), που θεωρείται ένας πρόδρομος βλάβη στον καρκίνο (Σχήμα 6Β). ενεργοποίηση AhR στην βασική και ατροφική κύτταρα μπορεί επομένως να θεωρηθεί ως μηχανισμός αντικαρκινική. Είναι πιθανό ότι μικροπεριβάλλοντος φλεγμονώδη σήματα είναι υπεύθυνες για την εν λόγω στρες που προκαλείται από σηματοδότηση. Μια μετάλλαξη σε ένα αλληλόμορφο β-TrCP1 ταυτοποιήθηκε σε ένα ανθρώπινο όγκο προστάτη σε μια συστηματική οθόνη του Wnt μεταλλάξεων οδού [48]. Ωστόσο αυτή η μετάλλαξη είναι πιθανό να έχει επίδραση επί της οδού των ΝΡ-κΒ ως το άλλο αλληλόμορφο και ενδεχομένως και τα δύο αλληλόμορφα β-TrCP2 ήταν άγριου τύπου. Παρομοίως, για να τις γνώσεις μας, ενεργοποιώντας μεταλλάξεις στο μονοπάτι ΝΡ-κΒ ήταν μέχρι τώρα δεν αναφέρονται σε ανθρώπινους όγκους του προστάτη. Παρ ‘όλα αυτά, ο ΝΡ-κΒ είναι γνωστό ότι μεσολαβεί κακοήθη μετασχηματισμό ιδιοσυστατικά ρυθμίζεται αυξητικά σε αυτόν τον τύπο του όγκου μέσω πολλαπλών μηχανισμών. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι διαφορετικά σήματα στρες, συμπεριλαμβανομένης της φλεγμονής, ατροφία και ανδρογόνων ρυθμίζουν προς τα πάνω έκφραση AhR σε φυσιολογικά και κακοήθη κύτταρα του προστάτη και να διεξαγάγει προστατευτικό μηχανισμό. Αναστέλλοντας β-TrCP σε προχωρημένα στάδια της νόσου μπορεί να είναι χρήσιμες για την ανάπτυξη στρατηγικών για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας των θεραπειών κατά του καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Πειράματα με τους ανθρώπινους ιστούς εγκρίθηκαν από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review, Hadassah-Hebrew University Medical Center. Λόγω της αναδρομικής φύσης της μελέτης αυτής και σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι, οι συμμετέχοντες που δεν παράγονται συνεχώς ενημερωμένοι. Επιπλέον, IRB μας δώσει απαλλαγή από την ανάγκη για γραπτή συγκατάθεση. Όλα τα πειράματα τα ποντίκια έχουν εγκριθεί από το IACUC.

κυρίαρχο αρνητικό β-TrCP (WD)

Κυρίαρχο αρνητικό β-TrCP (WD)

κλωνοποιήθηκε χρησιμοποιώντας E3RS εξαιρούνται από pCDNA3 -EE-hE3RS πλασμίδια με τους εκκινητές 5 ‘προς 3’ προς τα εμπρός: GCGGCCGCTATGGACCC-GGCCGAG (με

ΝοίΙ ιστοσελίδα στο 5 ‘του)? αντίστροφη: TTATCTGGAGATGTAGGTGT? το προϊόν κλωνοποιήθηκε σε φορέα ΤΑ (Invitrogen). Το τελευταίο φορέας κόβεται με

AvrII /Asp718

, συμπληρωμένο και αμβλύνθηκε συνδέθηκε. Η σχετική θραύσμα αποκόπηκε και εισήχθη εντός φορέα έκφρασης pFLAG-CMV ™ -2 (Sigma-Aldrich) με

NotI /BamHI

. Αυτή η διαδικασία παρήγαγε ένα κατασκεύασμα WD λείπει τμήμα της F-box και συζευγμένο με σημαία. Το WD-FLAG εισήχθη στο πλαίσιο αμφίδρομη τετρακυκλίνη υποστηρικτής εκφράζουν GFP. Το προκύπτον πλασμίδιο διαμολύνθηκε σε AT2.1 Rat κύτταρα καρκίνου του προστάτη που εκφράζουν το τετρακυκλίνη trans-ενεργοποιητή, χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Fugene (Roche Applied Science). Τα επιμολυσμένα κύτταρα επελέγησαν χρησιμοποιώντας υγρομυκίνη και νεομυκίνη (Sigma-Aldrich) που περιέχει μέσα για να παραχθεί ένα σταθερό κλώνο που εκφράζει ένα κυρίαρχο αρνητικό β-TrCP κατά την προσθήκη τετρακυκλίνη ή δοξυκυκλίνη παραγώγου της.

επαγώγιμοι β-TrCP και AhR shRNA

Το ανθρώπινο shRNA 5’GUGGAAUUUGUGGAACAUC 3 ‘στοχεύουν ενάντια β-TrCP1 και β-TrCP2 δομήθηκε σε pter πλασμίδιο και εισάγεται σε ένα τροποποιημένο φορέα λεντοϊού pRRL.sin.PPT.tetO7.MCS.PRE. Ο φορέας αποτελείται από ένα υποκινητή ΗΙ, tet χειριστής, την αλληλουχία που κωδικοποιεί shRNA και eF1α υποκινητή οδήγηση του καταστολέα tet συγχωνευμένο με eGFP. Η παραγωγή ιού και μόλυνση έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [49]. Για να στοχεύσετε το AhR χρησιμοποιήσαμε τις ακόλουθες αλληλουχίες shRNA: 1. 5 ‘CAGCUGAAUUAAAUAACAU 3’? 2. 5 ‘CAGACAGUAGUCUGUUAUA 3’. Και οι δύο που αποδείχθηκε αποτελεσματική στο να χτυπήσει κάτω τον υποδοχέα (τα δεδομένα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν εκείνα αποκτήσει με την τελευταία σειρά). έκφραση shRNA επάγεται μόνο μετά τετρακυκλίνη ή δοξυκυκλίνη (Sigma-Aldrich) χορήγηση. Ο φορέας μόνος χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Διπλό γκρέμισε κύτταρα LNCaP σχεδιάστηκαν με συν-μολύνοντας shβ-TrCP κυττάρων με φορείς λεντοϊού που φέρουν είτε της ανωτέρω περιγραφείσης αλληλουχίας.

Cell Culture

DMEM, RPMI 1640, θρυψίνη EDTA, Πενικιλλίνη στρεπτομυκίνη διάλυμα, L-γλουταμίνη, ορό εμβρύου μόσχου (FCS), απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα ορό (CSS) αγοράστηκαν από την Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Ισραήλ.