Αφηρημένο

καχεξία Ο καρκίνος είναι μια κατάσταση σπατάλης, οδηγείται από συστηματική φλεγμονή και το οξειδωτικό στρες. Αυτή η μελέτη ερεύνησε εικοσιπεντανοϊκό οξύ (ΕΡΑ) σε συνδυασμό με οξυπουρινόλη ως θεραπεία σε ένα μοντέλο ποντικού της καχεξίας καρκίνου. Τα ποντίκια με καρκίνο καχεξία τυχαιοποιήθηκαν σε 4 ομάδες αγωγής (EPA (0,4 g /kg /ημέρα), οξυπουρινόλη (1 mmol /L ad-lib), ο συνδυασμός, ή ελέγχου), και υποβάλλονται σε ευθανασία μετά από 29 ημέρες. Ανάλυση της οξειδωτικής βλάβης στο DNA, η ανάλυση του mRNA του προ-οξειδωτικού, αντιοξειδωτικές και πρωτεολυτική συστατικά μονοπάτι, μαζί με ενζυμική δραστηριότητα των θετικών και των αντιοξειδωτικών ολοκληρώθηκαν στις γαστροκνήμιο μυ. Η ομάδα ελέγχου εμφανίζεται νωρίτερα έναρξη του όγκου σε σύγκριση με το EPA και ομάδες οξυπουρινόλη (P & lt? 0.001). Η ομάδα EPA διατηρείται το σωματικό βάρος για παρατεταμένη διάρκεια (20 ημέρες) σε σύγκριση με την οξυπουρινόλη (5 ημέρες) και ο συνδυασμός (8 ημέρες) ομάδες (Ρ & lt? 0,05). EPA (18,2 ± /ml 3.2 pg) και ο συνδυασμός (18.4 ± 3.7 pg /ml) ομάδες είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα 8-ΟΗ-dG από την ομάδα ελέγχου (12,9 ± 1,4 pg /ml, p ≤ 0,05) υποδεικνύοντας αυξημένη οξειδωτική βλάβη DNA. τα επίπεδα mRNA της GPx1, MURF1 και MAFbx ήταν υψηλότερη μετά τη θεραπεία EPA σε σύγκριση με τον έλεγχο (p ≤ 0,05). Λαμβάνοντας υπόψη ότι η οξυπουρινόλη συσχετίστηκε με υψηλότερα GPx1, MnSOD, CAT, ΧΟΗ, MURF1, MAFbx και η UBB mRNA σε σύγκριση με τον έλεγχο (p ≤ 0,05). Δραστηριότητα των συνολικών SOD ήταν υψηλότερη στην ομάδα οξυπουρινόλη (32,2 ± 1,5 U /ml) σε σύγκριση με τον έλεγχο (27,0 ± 1,3 U /ml, Ρ & lt? 0,01), η δραστηριότητα GPx ήταν χαμηλότερη στην ομάδα ΕΡΑ (8,76 ± 2,0 U /ml) σε σύγκριση με τον έλεγχο (14,0 ± 1,9 U /ml, Ρ & lt? 0,05), και η δραστικότητα της καταλάσης ήταν χαμηλότερη στην ομάδα συνδυασμού (14,4 ± 2,8 U /ml) σε σύγκριση με τον έλεγχο (20,9 ± 2,0 U /ml, Ρ & lt? 0,01). Δεν υπήρξε καμία αλλαγή στο XO δραστηριότητα. Το αυξημένο ποσοστό μείωσης βάρους στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με οξυπουρινόλη υποδεικνύει ότι ΧΟ μπορεί να παίζει ένα προστατευτικό ρόλο κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της καχεξίας καρκίνου, και η αναστολή της είναι επιζήμια για τα αποτελέσματα. Σε συνδυασμό με την EPA, υπήρξε μικρή σημαντική βελτίωση από τον έλεγχο, αναφέροντας οξυπουρινόλη είναι απίθανο να είναι μια βιώσιμη ένωση θεραπείας σε καρκινική καχεξία

Παράθεση:. Vaughan VC, Sullivan-Gunn Μ, Hinch Ε, Martin P, Lewandowski PA (2012) εικοσιπεντανοϊκό οξύ και οξυπουρινόλη στη θεραπεία της μυϊκής ατροφίας σε ένα μοντέλο ποντικού της καρκινικής καχεξίας. PLoS ONE 7 (9): e45900. doi: 10.1371 /journal.pone.0045900

Επιμέλεια: Atsushi Asakura, Πανεπιστήμιο της Μινεσότα Ιατρικής Σχολής, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3η Μαΐου του 2012? Αποδεκτές: 27 Αυγ 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 Σεπτεμβρίου 2012 |

Copyright: © Vaughan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. VV είναι ο αποδέκτης της βικτωριανής Καρκίνου Οργανισμού Παρηγορητικής και υποστηρικτική Υποτροφία φροντίδας μέσω του Victorian Οργανισμού Καρκίνου χρηματοδοτείται από την Πολιτειακή κυβέρνηση της Βικτώριας, Αυστραλία, και την υποτροφία Bellberry Υποστήριξη μέσω Bellberry Ltd. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Πολλές μορφές καρκίνου παρόν με ένα πολύπλοκο. μεταβολικό προφίλ που χαρακτηρίζεται από απώλεια άλιπης μάζας σώματος και του λιπώδους ιστού, που είναι γνωστή ως καχεξία του καρκίνου. Περίπου οι μισοί από όλους τους ασθενείς με καρκίνο αναπτύσσουν καχεξία [1], με την επικράτηση αυξάνεται τόσο υψηλό όπως 86% τα τελευταία 1-2 εβδομάδες της ζωής [2], και το 20% των θανάτων από καρκίνο οφείλονται σε καχεξία [3]. Οι ασθενείς που πάσχουν καχεξία μπορεί να χάσει έως και το 30% του αρχικού σωματικού βάρους τους, με το 45% των ασθενών να χάσει περισσότερο από το 10% του αρχικού τους βάρους κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου [4].

Το οξειδωτικό στρες μπορεί να διαδραματίσει πρωταγωνιστικό ρόλο στην καρκίνο καχεξία, με απόδειξη της οξειδωτικής βλάβης και υψηλά επίπεδα αντιδραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) που βρίσκονται σε πολλά κράτη καρκίνο [5]. Ο ρόλος των ROS στην ανάπτυξη της καχεξίας καρκίνου, και οι μηχανισμοί που προκαλούν την ασθένεια παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες, παρά τις διάφορες πρόοδοι στον εντοπισμό του κυκλοφορικού παράγοντες και οδούς που είναι ενεργές. Μια μετατόπιση της ισορροπίας μεταξύ των δραστικών οξειδωτικών και των αντιοξειδωτικών μπορεί να προκαλέσει μια κατάσταση του οξειδωτικού στρες που είναι επιζήμια για το κύτταρο, και μπορεί να είναι ένας από τους βασικούς παράγοντες για την ανάπτυξη της καχεξίας.

Η υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) είναι ένας υπεύθυνος για την αποσύνθεση του σουπεροξειδίου ανιόντος ενζύμου (O

2

– ·) σε υπεροξείδιο του υδρογόνου και του οξυγόνου. Η δραστηριότητα της SOD έχει αποδειχθεί ότι είναι μειωμένη σε καχεκτική κατάσταση [6], [7], υποδεικνύοντας ότι υπάρχει μια ανικανότητα να αντισταθμίσει αυξήσεις ROS, και ως εκ τούτου η αδυναμία να προστατευθεί το κύτταρο από το οξειδωτικό στρες στο καχεκτική κατάσταση . Τα ένζυμα αντιοξειδωτικό καταλάση και υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPx) που διασπώνται υπεροξείδιο του υδρογόνου σε οξυγόνο και νερό έχουν επίσης βρεθεί να έχουν χαμηλότερα δραστικότητα σε μελέτες για τον καρκίνο καχεξία [8], υποδεικνύοντας ότι τα συστήματα θα μπορούσε να είναι το κλειδί συνεισφέροντες σε οξειδωτικό στρες και τις βλάβες που παρατηρήθηκαν σε καρκινική καχεξία.

Ενώ ορισμένες από τις οδούς που εμπλέκονται στην υπερβολική παραγωγή των ROS έχουν μελετηθεί εκτενώς στην καρκινική καχεξία, υπάρχουν άλλοι που έχουν δειχθεί να παίζει ένα ρόλο στην οξειδωτική προσβολή σε άλλες ασθένειες, οι οποίες έχουν ακόμη να μελετηθεί λεπτομερώς στην καρκινική καχεξία. Ξανθίνης οξειδοαναγωγάση είναι ένα ένζυμο με δύο διακριτές μορφές που είναι υπεύθυνο για την κατάλυση της μετατροπής των υποξανθίνης προς ξανθίνη, και ξανθίνη να ουρικό οξύ [9]. Ξανθίνης αφυδρογονάση (ΧΟΗ) εκφράζεται

in vivo

, και χρησιμοποιεί NAD + ως δέκτη ηλεκτρονίων για την αντίδραση αναγωγής, σχηματίζοντας NADH. Με την παρουσία των προ-φλεγμονωδών μεσολαβητών, ΧΟΗ εύκολα διασπά σε οξειδάση της ξανθίνης (ΧΟ), η οποία αντ ‘αυτού χρησιμοποιεί μοριακό οξυγόνο για τη μετατροπή του υποξανθίνης προς ξανθίνη και της ξανθίνης σε ουρικό οξύ, που παράγει το πολύ δραστικές O

2

– ·, ή υπεροξείδιο του υδρογόνου [9]

τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM

η

Ενώ XO δεν είναι συνήθως παρόν σε υψηλά επίπεδα στους σκελετικούς μύες, αυξημένα επίπεδα είναι κοινώς δει.. σε βλάβη των ιστών των μυών και τραυματισμό ισχαιμίας-επαναιμάτωσης [10]. Τα υψηλά επίπεδα της ΧΟ έχουν επίσης παρατηρηθεί στο αίμα κάποιων ασθενών με καρκίνο σε σύγκριση με ασθενείς χωρίς καρκίνο [11], και είναι προταθεί ότι καχεκτικά ζώα ανταποκρίνονται ευνοϊκά όταν κατεργάζεται με XO αναστολείς [12]. Η αφθονία των προ-φλεγμονωδών παραγόντων που υπάρχουν στο καχεξία μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση της διάσπασης του ΧΟΗ στη μορφή ΧΟ, εξηγώντας υψηλότερα κυκλοφορούντα επίπεδα της ΧΟ. Αυξημένα επίπεδα XO στη συνέχεια θα οδηγούσε στην υπέρβαση της παραγωγής των ROS, και να συμβάλει στο οξειδωτικό στρες στην καρκινική καχεξία.

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM.

Η

οξυπουρινόλη είναι μια μη ανταγωνιστική, μη αναστρέψιμος αναστολέας της ΧΟ, θεωρείται πιο ισχυρή από την αλλοπουρινόλη, του οποίου είναι ένας μεταβολίτης [10]. Επί του παρόντος, η οξυπουρινόλη χρησιμοποιείται ως θεραπεία για καταστάσεις στις οποίες XO είναι ένας παράγοντας που συμβάλλει, και έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν σπατάλη ιστό και να αυξήσει την καρδιακή λειτουργία σε καχεκτικούς ζώα [12], [13]. Μια μείωση της παραγωγής πουρινών και συναφείς απαιτήσεις μεταβολισμός μπορεί να παρακινήσει τη μείωση της έκφρασης ΧΟΗ, και ως εκ τούτου κατάντη δράση αυτού του ενζύμου. Το ουρικό οξύ, που παράγεται από XO, αυξάνει τη μετατροπή του αραχιδονικού οξέος σε βιολογικά δραστικών μεταβολιτών της [14]. Αυτό με τη σειρά του αυξάνει την ενεργοποίηση της οξειδάσης του NADPH, διαιωνίζοντας την καταρράκτη σηματοδότησης που οδηγεί στην ενεργοποίηση των αυξημένη μεταγραφή των συστατικών της ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος σύστημα.

δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες ± SEM.

μια σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με τον έλεγχο,

β σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με την EPA,

c σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με οξυπουρινόλη (P & lt? 0,05).

Η

Η προοδευτική καταβολισμό των μυών σε καρκινική καχεξία προτείνει ένα κεντρικό ρόλο στα συστήματα της αποικοδόμησης των πρωτεϊνών, όπως είναι η ουβικιτίνη πρωτεολυτική οδό (UPP). Η UPP έχει βρεθεί να είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα τόσο σε πειραματικά μοντέλα και σε ασθενείς με καχεξία [15], [16], υποδεικνύοντας συμβολή στην απώλεια μυών και συνδέονται αρνητικά αποτελέσματα. Πριν οι πρωτεΐνες διασπώνται από το UPP, πρέπει να στοχεύονται από συζευχθούν με πολλαπλά μόρια του ουβικιτίνης. Για να συμβεί αυτό σύζευξη, ουμπικουϊτίνης πρέπει πρώτα να ενεργοποιηθεί με ένα ουβικιτίνης ένζυμο ενεργοποίησης (Ε1), και στη συνέχεια μεταφέρθηκε στη δραστική θέση μιας μεταφορικής πρωτεΐνης ουβικιτίνης (Ε2). Το δεσμευμένο Ε2 αναγνωρίζει ουμπικουϊτίνης σύζευξης ενζύμων (Ε3 ή Ε3 πρωτεΐνη λιγάση), οι οποίες επιτρέπουν αντιδράσεις σύζευξης να λάβει χώρα, τα οποία σχηματίζουν μια αλυσίδα ubiquitins συνδέονται μεταξύ τους και το πρωτεϊνικό υπόστρωμα. Μόνο όταν ουβικιτίνη στοχεύει σε ένα επιλεγμένο πρωτεΐνη μπορεί στη συνέχεια να αναγνωριστεί από το πρωτεάσωμα, και υποβάλλονται σε επεξεργασία σε μικρότερα πεπτίδια [17]. Αρκετές λιγάσες πρωτεΐνη Ε3 έχει αποδειχθεί ότι είναι ενεργός κατά τη διάρκεια της πρωτεόλυσης σε μυϊκή ατροφία, σε συγκεκριμένο μυ-ειδικού F-box (MAFbx) /atrogin-1 και των μυών ειδικό δαχτυλίδι δάχτυλο 1 (MURF-1) [18].

δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες ± SEM.

μια σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με τον έλεγχο,

β σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με την EPA,

c σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με οξυπουρινόλη (P & lt? 0,05).

Η

εικοσιπεντανοϊκό οξύ (EPA) είναι ένα φυσικό ωμέγα-3 λιπαρών οξέων, που απαντώνται σε λιπαρά ψάρια και σε ορισμένα φύκια, ευρέως θεωρείται ότι έχει μεγάλες δυνατότητες ως antigenotoxic, αντιοξειδωτικό και χημειοπροληπτικές παράγοντα. Η χορήγηση του ΕΡΑ έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει την δραστικότητα του ROS σαρώσεως SOD [19], να επιβραδύνει την ανάπτυξη ορισμένων μορφών καρκίνου, και να αυξήσει την αύξηση του σωματικού βάρους και της ποιότητας ζωής σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος [20]. Τα τελευταία χρόνια, EPA έχει trialed ως θεραπεία για τον καρκίνο καχεξία λόγω διάφορους ρόλους ως αγωνιστής του SOD και σε ανάντι ρύθμιση της έκφρασης και της δραστηριότητας του UPP [20] – [22]. EPA αντικαθιστά το αραχιδονικό οξύ σε φωσφολιπιδικές μεμβράνες όταν καταναλώνεται σε υψηλά επίπεδα [23], και έχει επίσης αποδειχθεί ότι αναστέλλει 15-ΗΕΤΕ παραγωγή από το αραχιδονικό οξύ, το οποίο έχει εμπλακεί στην ρύθμιση UPP σε μοντέλα ποντικών της καχεξίας [24], [25] . Μερικές μελέτες σε ζώα της EPA είχαν επιτυχία, όπως έχει ο συνδυασμός της με άλλες θεραπευτικές προσεγγίσεις σε ανθρώπους ασθενείς, όπως τα συμπληρώματα λευκίνη, υψηλή σε πρωτεΐνες διατροφή και την άσκηση [26], [27].

Η

Η τρέχουσα μελέτη με στόχο να διαπιστώσει κατά πόσον η αναστολή της οξειδάσης της ξανθίνης από οξυπουρινόλη είχε ευεργετική επίδραση στη θεραπεία της μυϊκής ατροφίας στην καρκινική καχεξία. Επιπλέον, οι ερευνητές προσπάθησαν να εξακριβώσει αν ΕΡΑ σε συνδυασμό με οξυπουρινόλη ήταν ένα αποτελεσματικό πολυτροπικό θεραπεία για μυϊκή σπατάλη στην καρκινική καχεξία. Υποτέθηκε ότι η ανασταλτική επίδραση του οξυπουρινόλη επί ΧΟ σε συνδυασμό με την αγωνιστική δράση του ΕΡΑ επί SOD θα μειώσει την παρουσία περίσσειας O

2

– · σε καχεκτικούς μυών, οδηγώντας σε μείωση των οξειδωτική προσβολή και η προκύπτουσα ζημία ή σπατάλη σε σχέση με καχεκτικά ελέγχους.

δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες ± SEM.

μια σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με τον έλεγχο,

β σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με την EPA,

c σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με οξυπουρινόλη (P & lt? 0,05).

Η

Αποτελέσματα

ζωικό μοντέλο

Τέσσερα ζώα από την ομάδα ελέγχου και έναν από κάθε από τα οξυπουρινόλη και ο συνδυασμός των ομάδων θεραπείας θανατώθηκαν πριν από τη σύναψη της δίκης λόγω ηθικές ανησυχίες, και δεν συμπεριλήφθηκαν στη στατιστική ανάλυση.

Ποντίκια στην ομάδα ελέγχου έδειξαν εμφάνιση όγκου από 6 ± 0,3 ημέρες (Σχήμα 1), ενώ η ηλικία και το βάρος συμφωνημένα EPA (10 ± 0,7 ημέρες) και η οξυπουρινόλη (9 ± 0,6 ημέρες) ομάδες θεραπείας είχαν σημαντική καθυστέρηση στην έναρξη του όγκου σε σύγκριση (P & lt? 0.001). Η ομάδα EPA είχαν επίσης σημαντικά καθυστερημένη έναρξη σε σύγκριση με την ομάδα συνδυασμού (7 ± 0,7 ημέρες, P & lt? 0.001). Η θεραπεία οξυπουρινόλη έναρξη καθυστέρησε όγκου σε σύγκριση με το συνδυασμό (Ρ & lt? 0,01) ομάδα. Δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στο μέγεθος του τελικού όγκου μεταξύ EPA (338 ± 67 χιλιοστά

3) και ελέγχου (308 ± 28 χιλιοστά

3) ομάδες, ενώ η οξυπουρινόλη (489 ± 78 χιλιοστά

3) και ο συνδυασμός (515 ± 41 χιλιοστά

3) ομάδες θεραπείας έδειξε αυξημένο τελικό μέγεθος του όγκου σε σύγκριση με δύο μάρτυρες (P & lt? 0,01) και EPA ομάδες (P & lt? 0,05).

απώλεια βάρους υπολογίστηκε ως ποσοστό της αρχικό βάρος, με διόρθωση μάζα του όγκου (Σχήμα 2). Η ομάδα ελέγχου παρουσίασαν σημαντική απώλεια βάρους σε σύγκριση με το αρχικό βάρος από την 12η ημέρα και μετά (Ρ & lt? 0,05). Η ομάδα EPA αυξήθηκε το σωματικό βάρος κατά τη διάρκεια της προ-καχεκτικό φάση, πριν από τη σταθεροποίηση του βάρους, και διατήρησε αυτό το προ-καχεκτική κατάσταση μέχρι την ημέρα 22, όταν τα βάρη άρχισε να υποχωρεί, με σημαντική απώλεια βάρους από την ημέρα 25. Η ομάδα οξυπουρινόλη παρουσίασαν σταδιακή μείωση από την κορυφή του βάρους από την ημέρα 3, πριν από μια απότομη μείωση του βάρους κατά την ημέρα 13. Η απώλεια βάρους ήταν σημαντική σε αυτή την ομάδα από την ημέρα 14 και σταδιακά μειώθηκε σε τελικό σημείο. Η ομάδα συνδυασμός που ανακτάται από μια απότομη μείωση του σωματικού βάρους κατά την ημέρα 4, αυξάνοντας σημαντικά το σωματικό βάρος από την αρχική, και ήταν σταθερές πριν βιώνουν σημαντική απώλεια βάρους από την ημέρα 17 (εξαιρουμένων των ημερήσιων 19? P & lt? 0,01). Η ομάδα ελέγχου είχαν μέση μεταβολή βάρους -9,06% σε ευθανασία, η ομάδα ΕΡΑ -4,91%, οξυπουρινόλη -9,11% και η ομάδα συνδυασμού -5,03%, ήταν υπάρχουν σημαντικές διαφορές στο ποσοστό απώλειας βάρους μεταξύ των ομάδων σε ευθανασία. Η ομάδα θεραπείας EPA εμφανίζεται απώλεια βάρους σημαντικά χαμηλότερη από την ομάδα ελέγχου (Ρ & lt? 0,05) για παράταση της διάρκειας (Ημέρες 3-15, 17-23, συνολικά 20 ημέρες) σε σύγκριση τόσο με την οξυπουρινόλη (Ημέρες 3, 4, 7, 8, 10, σύνολο 5 ημέρες) και ο συνδυασμός (Ημέρες 6-12, 19, σύνολο 8 ημέρες) ομάδες θεραπείας. Ενώ υπήρχε μια πολύ ισχυρή συσχέτιση μεταξύ του μεγέθους του όγκου και απώλεια βάρους στην ομάδα ελέγχου (r

2 = 0,94), λιγότερο παραλλαγή εξηγείται από τη συσχέτιση μεταξύ της απώλειας βάρους και του μεγέθους του όγκου στην ΕΡΑ (r

2 = 0,72), οξυπουρινόλη (r

2 = 0,72), και ο συνδυασμός (r

2 = 0,70) ομάδες θεραπείας.

στην ομάδα θεραπείας EPA, τους τετρακέφαλους, υποκνημίδιο, ΤΑ και γαστροκνήμιο μυς αποτελούσε σημαντικά υψηλότερο ποσοστό του συνολικού σωματικού βάρους από την ομάδα ελέγχου στο τελικό σημείο (p ≤ 0,05? Σχήμα 3). Στην ομάδα θεραπείας οξυπουρινόλη, TA και γαστροκνήμιο ήταν επίσης ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό του συνολικού σωματικού βάρους σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου στο τελικό σημείο (p ≤ 0,05). Βάρη του υποκνημιδίου, TA και γαστροκνήμιο ήταν επίσης μεγαλύτερη από την ομάδα ελέγχου σε ζώα που υποβλήθηκαν στη θεραπεία συνδυασμού (p ≤ 0,05). βάρος τετρακέφαλου αυξήθηκαν στην ομάδα θεραπείας με EPA σε σύγκριση με τις δύο θεραπείες οξυπουρινόλη και ο συνδυασμός, ωστόσο ΤΑ και plantarus επίσης μειώθηκε σε σύγκριση με οξυπουρινόλη και ο συνδυασμός ομάδες, αντίστοιχα.

Οξειδωτικό στρες

8-OH- επίπεδα ΓΔ στο γαστροκνήμιο μυ από την ομάδα ελέγχου ήταν 12,9 ± 1,4 pg /ml. EPA (18.2 ± 3.2 pg /ml) και ο συνδυασμός (18.4 ± 3.7 pg /ml) ομάδες είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα από ό, τι στην ομάδα ελέγχου (p ≤ 0,05? Σχήμα 4), υποδεικνύοντας αυξημένο οξειδωτικό στρες σε αυτές τις ομάδες. Η ομάδα οξυπουρινόλη δεν εμφανίζει σημαντικά υψηλότερα επίπεδα 8-ΟΗ-dG σύγκριση με τον έλεγχο (14,9 ± 1,5 pg /ml, P≤0.07).

Γονιδιακής Έκφρασης

Η γονιδιακή έκφραση σε γαστροκνήμιο μυ είναι φαίνονται στον πίνακα 1. το αντιοξειδωτικό GPx1 συστατικό αυξήθηκε 3,1 φορές στην ομάδα του ΕΡΑ και 4,1-φορές στην ομάδα οξυπουρινόλη σύγκριση με τον έλεγχο (Ρ & lt? 0,01), όπως και η έκφραση της ουμπικουϊτίνης Ε3-λιγάσες MURF1 και MAFbx, & gt? 2,5-φορές στην ομάδα ΕΡΑ, και 2,8-φορές και 3,6-φορές στην ομάδα οξυπουρινόλη αντίστοιχα (Ρ & lt? 0,05). Οξυπουρινόλη αύξησε επίσης την έκφραση των αντιοξειδωτικών συστατικών MnSOD κατά 1,9 φορές (Ρ & lt? 0,05) και CAT κατά 2,4 φορές (Ρ & lt? 0,01) σε σύγκριση με τον έλεγχο, ενώ ΧΟΗ αυξημένη 2.7-φορές (Ρ & lt? 0,01) και ένα 1.3-πλάσια αύξηση στην παρατηρήθηκε? πρωτεασώματος υπομονάδα UbB (0,05 P & lt). Οι θεραπείες σε μείωση συνδυασμό EcSOD έκφραση 0,3 φορές σε σύγκριση με τις τιμές ελέγχου (P & lt? 0,05).

Ένζυμο Αναλύσεις

Δραστηριότητα του συνόλου των SOD σημαντικά αυξημένη στην ομάδα οξυπουρινόλη (32,2 ± 1,5 U /ml? Εικόνα 5) σε σύγκριση με τον έλεγχο (27,0 ± 1,3 U /ml, Ρ & lt? 0,01), συνδυασμός (25,0 ± 3,4 U /ml, Ρ & lt? 0,01) και οι ομάδες ΕΡΑ (28,3 ± 1,5 U /ml, Ρ & lt? 0,05). Δεν υπήρξε καμία αλλαγή μεταξύ των άλλων ομάδων. Δραστηριότητα του GPx ήταν σημαντικά μειωμένη στην ομάδα ΕΡΑ (8,76 ± 2,0 U /ml) σε σύγκριση με τα δύο τον έλεγχο (14,0 ± 1,9 U /ml, Ρ & lt? 0,05) και οι ομάδες συνδυασμού (13,6 ± 2,0 U /ml, Ρ & lt? 0,05) . δραστικότητα καταλάσης μειώθηκε στην ομάδα συνδυασμού (14,4 ± 2,8 U /ml) σε σύγκριση με τα δύο τον έλεγχο (20,9 ± 2,0 U /ml, Ρ & lt? 0,01) και οι ομάδες οξυπουρινόλη (24,3 ± 4,7 U /ml, Ρ & lt? 0,05). Δεν υπήρχαν άλλες σημαντικές αλλαγές μεταξύ των ομάδων. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στη δραστικότητα XO μεταξύ των ομάδων.

Συζήτηση

EPA έχει γενικά αποδεκτό να έχουν τη δυνατότητα να βοηθήσει στην θεραπεία της καχεξίας καρκίνου, ιδίως ως μέρος μιας συνδυασμένης προσέγγισης στη θεραπεία [26], [27], ωστόσο περαιτέρω διασαφήνιση των ακριβείς μηχανισμοί είναι απαραίτητη. Στην παρούσα μελέτη, τα ζώα που έλαβαν θεραπεία με ΕΡΑ είχε καθυστερήσει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου, και ως εκ τούτου βελτίωση των αποτελεσμάτων, η οποία μπορεί να οφείλεται σε περιγράφηκε προηγουμένως δράση κατά του όγκου της ΥΠΠ [28], αντί αντι-καχεκτικό δράση μόνο. Ωστόσο, ενώ ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου μπορεί να εξηγήσει εν μέρει εξασθένηση της απώλειας βάρους, προηγούμενες έρευνες δείχνουν ότι το αντι-καχεκτικό αποτέλεσμα του ΕΡΑ είναι μεγαλύτερη από ότι θα αναμενόταν δεδομένου του μεγέθους της μείωσης του όγκου [29], και φαίνεται να αποσπάσει μια απόκριση διαφορετική από την αντικαρκινική δράση [30], υποστηρίζοντας την άποψη ότι η αυξημένη διακύμανση παρατηρήθηκε στην ομάδα ΕΡΑ σε αυτή τη μελέτη μπορεί να οφείλεται σε παράγοντες άλλους από ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου. Μελλοντικές μελέτες θα ωφεληθούν από τα ζώα που σφάζονται σε απώλεια βάρους ή μεγέθους του όγκου όρια, όχι αυθαίρετες ημερομηνίες, προκειμένου να διαπιστωθεί εάν τα ζώα που έλαβαν θεραπεία με ΕΡΑ εμπειρία παρόμοια απώλεια βάρους με τα μη επεξεργασμένα ζώα με παρόμοιο μέγεθος του όγκου και μάζας, παρά την καθυστερημένη έναρξη .

μακριάς αλυσίδας η-3 PUFA, όπως ΕΡΑ, είναι γνωστό ότι επηρεάζεται από το οξειδωτικό στρες, σχηματίζοντας hydroperoxidases λιπιδίων και λιπαρών οξέων υπεροξυλίου ρίζες οι οποίες με τη σειρά τους μπορεί να βλάψει τις μεμβράνες λιπιδίων [31]. Η ενσωμάτωση του ΕΡΑ σε λιπιδικές μεμβράνες των κυττάρων σε ζώα που υποβάλλονται σε συμπλήρωση [23] μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία αυτών των μεμβρανών σε οξειδωτική βλάβη, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων και πυρηνικές μεμβράνες, και περαιτέρω εκθέτοντας περιεχόμενα κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων DNA, με την αυξημένη οξειδωτική κατάσταση, και μπορεί να εξηγήσει η αυξημένη οξειδωτική βλάβη στο DNA που υποδεικνύεται από τα επίπεδα του 8-ΟΗ-dG στην ομάδα ΕΡΑ. 8-ΟΗ-dG είναι η κυρίαρχη μορφή ελευθέρων ριζών που προκαλείται από την οξειδωτική βλάβη, και χρησιμοποιείται συνήθως ως βιοδείκτης για το οξειδωτικό στρες [32]. 8-ΟΗ-dG παράγεται κατά τη διάρκεια της οξειδωτικής βλάβης στο DNA, που προκαλείται από την αλληλεπίδραση μεταξύ των ριζών υδροξυλίου και νουκλεοτιδικές βάσεις των κλώνων του DNA, και θεωρείται ένα καλά χαρακτηρισμένο και ευαίσθητος δείκτης τέτοιας ζημίας [32].

EPA θεραπεία προκάλεσε μείωση της δραστηριότητας GPx σύγκριση με την ομάδα ελέγχου στο τελικό σημείο. Αυτή η μείωση της αντιοξειδωτικής ικανότητας μπορεί επίσης να είναι ενδεικτική της μειωμένης απαίτησης για αντιοξειδωτική δράση, που οφείλεται είτε σε μειωμένη παρουσία των ROS ή αυξημένη σάρωσης ROS από άλλα ένζυμα. Επίσης δεν υπήρχε αλλαγή στο SOD ή δραστηριότητα καταλάσης. Μαζί, αυτό δείχνει ότι η δράση της ΥΠΠ δεν είναι ως αγωνιστής του αντιοξειδωτική δράση, όπως έχει υποτεθεί, και ότι στο τέλος του σημείου, το δυναμικό για βελτιωμένη αντιοξειδωτική δράση υποδεικνύεται από την αύξηση στην έκφραση του γονιδίου GPx1 γίνεται βρεγμένο σε αυτήν την ομάδα. Έτσι παρά τις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση που με την απουσία της νόσου μπορεί να έχει προκαλέσει αυξημένη δραστικότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων όπως GPx, η παρουσία της καχεξίας καρκίνου του εμπόδισε τέτοιες λειτουργικές αλλαγές από την εμφάνιση. Με την ολοκλήρωση της μελέτης, η ομάδα ΕΡΑ είχε αρχίσει να μειώνεται το βάρος και συνεπώς είναι πιθανό ότι μια προηγούμενη επίδραση της ΕΡΑ στην αντιοξειδωτική λειτουργία προκάλεσε την καθυστερημένη έναρξη της απώλειας βάρους? Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες χρονική πορεία που απαιτείται για να επιβεβαιωθεί αυτή η υπόθεση. Η μείωση του σωματικού βάρους στην ομάδα ΕΡΑ στο τέλος της μελέτης ήταν ενδεικτική καρκινική καχεξία είναι παρόν.

Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η αναστολή της ΧΟ με κατεργασία οξυπουρινόλη μειωμένη απώλεια ολικού σωματικού βάρους και άπαχο σώμα μάζα, και μείωσε την παραγωγή των ROS σε σύγκριση με ελέγχους [12]. Ωστόσο, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι η θεραπεία οξυπουρινόλη μπορεί να προκαλέσει αρνητικές επιπτώσεις στο μοντέλο τρωκτικών, ιδίως την ταχεία μείωση της απόδοσης που υποδεικνύεται από την απώλεια βάρους παρατηρήθηκε νωρίς στην ασθένεια. Up-ρύθμιση των συστατικών της UPP προτείνει επίσης μια μετατόπιση προς απώλεια μυϊκής μάζας σε αυτή την ομάδα. Πράγματι, η οξυπουρινόλη, αντί να μειώνεται η δραστικότητα της ΧΟ, δεν προκάλεσε καμία συνολική αλλαγή σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Όταν φαίνεται στο πλαίσιο της αυξημένης έκφρασης του γονιδίου του ΧΟΗ, αυτό δείχνει ότι μπορεί να υπάρχει μια ανασταλτική επίδραση, η οποία αντισταθμίζεται από την αυξημένη παραγωγή του XOR. Η ομάδα θεραπείας οξυπουρινόλη παρουσίασαν επίσης μια τάση προς αυξημένη οξειδωτική βλάβη σε σύγκριση με τον έλεγχο (& lt? 0,07) υποδεικνύοντας μπορεί να υπάρχει μια αυξημένη αφθονία του ROS. Η αυξημένη δραστηριότητα της SOD σε αυτή την ομάδα σε σύγκριση με τον έλεγχο προκύψει αύξηση σάρωσης του ROS, πιθανότατα ως απάντηση σε αυτή την αύξηση σε οξειδωτική βλάβη. Αυτές οι διαφορές στην απόκριση μπορεί να οφείλεται σε χαμηλή βιοδιαθεσιμότητα του οξυπουρινόλη στη μέθοδο χορήγησης που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη [13], και εναλλακτικά, υψηλότερη παρασκευάσματα δραστικότητα ή τρόπων χορήγησης θα πρέπει να εξετάζεται σε μελλοντικές μελέτες. Οι μελλοντικές μελέτες για το ρόλο του XOR και του μεταβολισμού της πουρίνης σε καχεξία μπορεί επίσης να επωφεληθούν από την αναστολή αυτής της οδού σε ένα σημείο ανάντη του XOR. Ωστόσο, λόγω των διαφορών μεταξύ των τρωκτικών και των πρωτευόντων μεταβολισμό των πουρινών, είναι σημαντικό ότι αυτό το μονοπάτι να διερευνηθεί πλήρως σε ένα μοντέλο που επιτρέπει κλινικές ομοιότητες που πρέπει να συναχθούν.

Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της μελέτης, η ομάδα συνδυασμός εμφανίζεται απώλεια βάρους χαρακτηριστικά φάση παρόμοια με τόσο το EPA και ομάδες οξυπουρινόλη. Για παράδειγμα, η αρχική αύξηση βάρους και τη σταθεροποίηση αντανακλά την ομάδα EPA, η απότομη πτώση σε 12 ημέρες αντανακλά εκείνη της ομάδας οξυπουρινόλη σε 14 ημέρες. Η ποσότητα της απώλειας βάρους από την ομάδα συνδυασμού είναι, ως επί το πλείστον, όχι ως ακραία ως η ομάδα οξυπουρινόλη, αλλά το βάρος δεν είναι τόσο καλά διατηρημένα ως η ομάδα ΕΡΑ. Αυτά τα σχέδια απώλεια βάρους είναι επίσης διαφορετική από την ομάδα ελέγχου, δείχνοντας ότι είναι ο συνδυασμός των δύο ομάδων, και όχι μια έλλειψη αποτελέσματος, που προκαλούν αυτό το μοτίβο της παρακμής. Μια αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο θεραπειών υποστηρίζεται περαιτέρω από την έκφραση του γονιδίου και η δραστικότητα του ενζύμου δεδομένων, όπου το αποτέλεσμα στην ομάδα συνδυασμού είναι σημαντικά διαφορετική από την επίδραση της θεραπείας είτε μόνες.

Δεδομένου σημαντικές αλλαγές σε πολλές παραμέτρους εμπειρία στη η ομάδα θεραπείας συνδυασμού σε σύγκριση με κάθε συστατικό ξεχωριστά, είναι πιθανό ότι οι οδοί μεταβάλλονται από ΕΡΑ και οξυπουρινόλη συνδέονται μεταξύ τους. Αν και EPA έχει δειχθεί προηγουμένως να καταστείλει ουρικής κρύσταλλο που προκαλείται φλεγμονή σε αρουραίους Sprague-Dawley [33], αυτό δεν έχει προηγουμένως δειχθεί σε ένα μοντέλο της καχεξίας. Περαιτέρω έρευνα είναι απαραίτητη, αλλά η τομή αυτών των δύο οδών σε αραχιδονικό οξύ είναι το πλέον πιθανό σημείο αλληλεπίδρασης [14], [23], [24]. Η συνδυασμένη αναστολή της UPP από την EPA και οξυπουρινόλη υποστηρίζεται από τη μείωση στη γονιδιακή έκφραση του UbB, MURF1, και MAFbx σε αυτή τη μελέτη (βλέπε Πίνακα 1). Σαθεροποιημένο δράση της οδού ανάντη της ΝΑΟΡΗ οξειδάσης από την EPA και οξυπουρινόλη υποστηρίζεται περαιτέρω από την τάση προς μια μείωση στην έκφραση του NOX2 στην ομάδα θεραπείας συνδυασμού σε σύγκριση με το μάρτυρα (Ρ & lt? 0,06), και η μειωμένη έκφραση του NOX2 στην ομάδα συνδυασμού σε σύγκριση με την ομάδα EPA δεικνύει ότι η ένωση επίδραση της συνδυαστικής θεραπείας αυξάνεται αναστολή αυτής της οδού, πιθανότατα μέσω του προηγουμένως προτεινόμενο μηχανισμό. Μια μείωση της παραγωγής πουρινών και συναφείς απαιτήσεις του μεταβολισμού, που προκλήθηκε από την αναστολή της ανάδρασης amidophosphoribosyl τρανσφεράσης [13], μπορεί να παρακινήσει τη μείωση της έκφρασης ΧΟΗ που παρατηρήθηκαν στην ομάδα συνδυασμού. Οι σημαντικές αλλαγές που παρατηρούνται στην ομάδα συνδυασμού μπορεί επίσης να προκαλείται από αυξημένη πρόσληψη οξυπουρινόλη λόγω αλλαγμένης διαπερατότητας των κυτταρικών μεμβρανών που προκαλείται από συμπληρώματα ΕΡΑ, και μπορεί να είναι η αιτία της εμφανούς αλληλεπίδρασης. Altered ρευστότητα και φωσφολιπίδια σύνθεση των κυτταρικών μεμβρανών έχει παρατηρηθεί μετά η-3 PUFA συμπλήρωση [34], τροποποιώντας την πρόσληψη των υδρόφοβων φαρμάκων. Λαμβάνοντας υπόψη το σχετικά υψηλό λιπιδίων διαλυτότητα οξυπουρινόλη [13], αυτή η αλλαγή θα επιτρέψει στο φάρμακο να περάσει εύκολα μέσω παθητικής διάχυσης.

Συμπέρασμα

EPA συνεχίζει να δείξει υπόσχεση ως μέρος μιας πολυτροπικής θεραπεία για την καχεξία, με μια θετική στροφή προς διατήρηση της άπαχης μυϊκής μάζας, και καθυστερημένη έναρξη της απώλειας βάρους στα ζώα που υποβάλλονται σε θεραπεία EPA σε σύγκριση με εκείνους που έλαβαν άλλες θεραπείες. Μηχανισμοί προστασίας δεν ήταν πλέον ενεργή στο τελικό σημείο που μελετήθηκαν, ως εκ τούτου, οι μελέτες χρόνου σπουδών που απαιτείται για τον προσδιορισμό των υπευθύνων για τις προστατευτικές επιδράσεις που παρατηρούνται. Οξυπουρινόλη φαίνεται να προκαλεί ένα αυξημένο ποσοστό της μείωσης του βάρους σε ποντικούς με καχεξία του καρκίνου σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες θεραπείας. Αυτό δείχνει ότι ΧΟ μπορεί να παίζει ένα προστατευτικό ρόλο κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της καχεξίας καρκίνου, και η αναστολή της είναι επιζήμια για τα αποτελέσματα. Ωστόσο, η διατήρηση μάζας σε ορισμένους μύες υποδηλώνει ότι οξυπουρινόλη μπορεί να είναι ευεργετική για τη διατήρηση της μυϊκής μάζας. Οι αυξημένες επιδράσεις στην ομάδα συνδυασμού σε σύγκριση με το ΕΡΑ ή θεραπείες οξυπουρινόλη υποδηλώνουν μια διασταύρωση των δύο μηχανιστικές οδοί, ή ότι υπάρχει μια αυξημένη πρόσληψη του οξυπουρινόλη παρουσία των συμπληρωμάτων EPA, προκαλώντας την φαινομενική αλληλεπίδραση. απαιτούνται περαιτέρω έρευνες για να διαλευκανθεί πλήρως η διαδραστική επίδραση των οξυπουρινόλη και EPA, και το ρόλο του ΧΟ στην καρκινική καχεξία.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Το μυϊκό αδενοκαρκίνωμα 16 (MAC16) κυτταρική γραμμή καλλιεργήθηκε σε RPMI με 10% FBS και 0,5% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Mulgrave, Αυστραλία). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή, φυγοκεντρήθηκαν στα 500

g

για 5 λεπτά στους 4 ° C, και απομονώνεται από το μέσο ανάπτυξης. Τα κύτταρα στη συνέχεια επαναεναιωρήθηκαν σε στείρο PBS, και παρασύρονται σε μια βελόνα 25-gauge για ένεση.

ζωικό μοντέλο

Όλα τα πειράματα σε ζώα που διενεργούνται σε αυτή τη μελέτη είχαν εγκριθεί από την Επιτροπή Ευημερίας Ζώων, σε Πανεπιστήμιο Deakin (αριθμός έγκρισης Α13 /2010). Γυναίκα Balb /c

nu nu

ποντίκια ηλικίας 8 εβδομάδων (Κέντρο ζώων Πόρων, Canning Vale, Αυστραλία) στεγάστηκαν σε ομάδες των 5, με ελεύθερη πρόσβαση σε τυπική τροφή και νερό καθ ‘όλη τη μελέτη, ζυγίζονται κάθε εβδομάδα για τον προσδιορισμό της κατανάλωσης . Θερμοκρασία περιβάλλοντος ελέγχθηκε στους 22 ° C ± 2 ° C, κατά 40-60% υγρασία, με ένα κύκλο φωτός /σκότους 12 ωρών φωτός. Οι ποντικοί εγχύθηκαν με προηγουμένως παρασκευασμένο κύτταρα, στη συνέχεια τυχαιοποιήθηκαν σε 4 ομάδες, που αποτελούνται από θεραπεία ΕΡΑ (EPAX, Αάλσυντ, Νορβηγία, 0,4 g /kg /ημέρα, n = 9 [ΕΡΑ]), η θεραπεία οξυπουρινόλη (Sigma-Aldritch, Castle-Hill , Αυστραλία? 1 mmol /L σε πόσιμο νερό, η = 9), η θεραπεία συνδυασμού (όπως ανά ΕΡΑ και ομάδες οξυπουρινόλη n = 9), ή η ομάδα ελέγχου του καρκίνου καχεξίας (n = 13). Τα ζώα παρακολουθήθηκαν ημερησίως για αλλαγές στο σωματικό βάρος, και τα μεγέθη των όγκων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας καλίμπρες. Οι ποντικοί τερματίστηκαν με ένεση πεντοβαρβιτάλης νατρίου (30 mg /kg) (Virbac την υγεία των ζώων, Regents Park, Australia) σε 29 ημέρες, όταν η απώλεια βάρους έφθασε το 25%, ή το μέγεθος του όγκου έφτασε τα 1000 mm

3, όποιο συνέβαινε πρώτο. μυϊκούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των γαστροκνημίου, plantarus, πρόσθιο κνημιαίο (ΤΑ), και τετρακέφαλο, αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν. Όλα τα δείγματα ήταν θραύση καταψύχθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80

oC για περαιτέρω ανάλυση.

Οξειδωτικό στρες

kit Μια ELISA χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί το παραπροϊόν της οξείδωσης DNA 8-υδροξυ-2-δεοξυ γουανοσίνη (8-OH-2DG) (StressMarq Βιοεπιστημών, Βικτόρια, Καναδάς) ως δείκτης του οξειδωτικού στρες [32]. DNA εκχυλίστηκε από 10 mg γαστροκνήμιο μυ χρησιμοποιώντας ένα κιτ απομόνωσης DNA (Promega, Sydney, Αυστραλία). Κάθε δείγμα στη συνέχεια αραιώθηκε έτσι ώστε 50 μα DNA χρησιμοποιήθηκε στη δοκιμασία 8-ΟΗ-2DG. Η ανταγωνιστική ανοσοδοκιμασία περιλαμβάνει τη σύνδεση του ελεύθερου 8-ΟΗ-2DG σε ένα αντίσωμα επικαλυμμένο πλακίδιο 96 φρεατίων. Η συγκέντρωση δοκιμασίας και δείγμα της 8-ΟΗ-2DG διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Γονιδιακής Έκφρασης

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από 10 mg κατεψυγμένων γαστροκνήμιο μυ χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRI (Astral επιστημονική, Σίδνεϊ, Αυστραλία) σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή. Η συνολική συγκέντρωση RNA προσδιορίστηκε με μέτρηση Α260 /Α280. Ένα μικρογραμμάριο του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας AMV αντίστροφη μεταγραφάση κιτ σύνθεσης πρώτου κλώνου cDNA σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Marligen Biosciences, Sydney, Αυστραλία). Real-Time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης IQ5 Bio-Rad, με αντιδράσεις που διεξάγονται με χρήση SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Sydney, Αυστραλία). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer 3, και λαμβάνεται από GeneWorks (Hindmarsh, Αυστραλία? Βλέπε Πίνακα 2). Η ενίσχυση του cDNA δειγμάτων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας IQ SYBR πράσινο ™ ακολουθώντας τα πρωτόκολλα των κατασκευαστών (BioRad, Sydney, Australia) φθορισμού δεδομένα εκπομπών συνελήφθη και τα επίπεδα mRNA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την τιμή κρίσιμο όριο (CT) [35]. Θερμικών κύκλων και ανίχνευση φθορισμού διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης ακολουθίας IQ5 BioRad (BioRad, Σίδνεϊ, Αυστραλία). Τα δείγματα κανονικοποιήθηκαν για τη συγκέντρωση του cDNA προσδιορίστηκε με OliGreen (Invitrogen, Mulgrave, Αυστραλία) [36]

Protein & amp.? Enzyme Ανάλυση Δραστηριότητας

γαστροκνημίου δείγματα μυϊκού ιστού (20 mg) ομογενοποιήθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στις 10.000

g

στους 4 ° C για 10 λεπτά. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε μέσω της μεθόδου Bradford (BioRad, Sydney, Αυστραλία). Σύνολο SOD, γλουταθειόνης υπεροξειδάσης (GPx), καταλάση, και δραστικότητα XO μετρήθηκαν με εμπορικό κιτ δοκιμασίας ενζύμου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Sapphire Bioscience, Waterloo, Αυστραλία? Invitrogen, Mulgrave, Αυστραλία).

Στατιστικά

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS Statistics Έκδοση 17.0 (IBM, Chicago, USA) ή GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, USA), με τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) και θεωρούνται στατιστικώς σημαντικές εάν ρ & lt? 0,05, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας αμφίδρομη ΑΝΟνΑ, μαζί με τη θέση ενός τεστ Tukey για hoc ανάλυση πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί διαφορές μεταξύ των ομάδων όπου χρειάζεται. Συσχέτιση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας δεδομένα Pearsons Test απώλεια βάρους αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας επανειλημμένες μετρήσεις ANOVA με Bonferroni post-hoc ανάλυση.