Αφηρημένο

Σκοπός

μικροδορυφορικού αστάθεια (MSI) χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό του παχέος εντέρου (CRC) για το σύνδρομο Lynch, και να προβλέψει το αποτέλεσμα και την ανταπόκριση στη θεραπεία. Η τρέχουσα τεχνική για τη μέτρηση MSI απαιτεί DNA από την κανονική και νεοπλασματικών ιστών, και αποτυγχάνει να εντοπίσει όγκους με ειδικές επιδιόρθωσης αναντιστοιχία DNA (MMR) ελαττώματα. Δοκιμάσαμε ένα πάνελ πέντε οιονεί μονομορφικής δείκτες μονονουκλεοτιδίου επανάληψη ενισχύεται σε ένα ενιαίο multiplex αντίδραση PCR (Pentaplex PCR) για την ανίχνευση MSI.

Πειραματικός Σχεδιασμός

Ερευνήσαμε μια ομάδα 213 ασθενών CRC, που αποτελείται από 114 MMR ανεπάρκεια και 99 MMR-καλά όγκους. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση (IHC) αξιολόγησε την έκφραση του MLH1, MSH2, PMS2 και MSH6. κατάσταση MSI ορίστηκε από τις διαφορές στο εύρος διακύμανσης οιονεί μονομορφικής (QMVR) από μία λίμνη κανονικών δειγμάτων DNA, και μετρώντας τις διαφορές στα μήκη αλληλόμορφο στο DNA του όγκου.

Αποτελέσματα

Η ενίσχυση του 426 κανονική αλληλόμορφα επέτρεψε τη βελτιστοποίηση της QMVR σε κάθε δείκτη, και εξαλείφεται η απαίτηση για συμφωνημένα αναφοράς DNA για να καθορίσουν MSI σε κάθε δείγμα. Χρησιμοποιώντας ≥2 /5 ασταθή δείκτες και τα κριτήρια για την MSI είχε ως αποτέλεσμα την ευαισθησία του 95,6% (95% CI = 90,1 – 98,1%) και θετική προγνωστική αξία 100% (95% CI = 96,6% -100%). Ανίχνευση MSH6 ανεπάρκειας ήταν περιορισμένη χρήση όλων των τεχνικών. Η ανάλυση των δεδομένων με έναν πίνακα τριών δείκτη (BAT26, NR21 και NR27) ήταν συγκρίσιμη με ευαισθησία (97,4%) και θετική προγνωστική αξία (96,5%) στον πίνακα πέντε δείκτη. Και οι δύο προσεγγίσεις ήταν ανώτερη από την τυπική προσέγγιση για τη μέτρηση της MSI.

Συμπεράσματα

Μια βελτιστοποιημένη Pentaplex (ή triplex) PCR προσφέρει μια εύκολη, ισχυρή, πολύ φθηνή, εξαιρετικά ευαίσθητη και ειδική δοκιμασία για την προσδιορισμός των MSI στο CRC

Παράθεση:. Goel Α, Nagasaka Τ, Χάμελιν R, Boland CR (2010) ένα βελτιστοποιημένο Pentaplex PCR για την ανίχνευση DNA Ασυμφωνία Επισκευή-Ελλιπή παχέος εντέρου. PLoS ONE 5 (2): e9393. doi: 10.1371 /journal.pone.0009393

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, City of Hope Εθνικό Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Νοεμ 2009? Αποδεκτές: 3η Φεβρουαρίου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 24 Φεβρουαρίου 2010

Copyright: © 2010 Goel et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η παρούσα έργο χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις RO1 CA 72851 (για CRB) και RO1 CA 129286 (για AG και CRB) από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, καθώς και κονδύλια από το Ινστιτούτο Ερευνών Baylor. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αστάθεια μικροδορυφόρου (MSI), το οποίο ορίζεται ως η συσσώρευση μεταλλάξεων παρεμβολής διαγραφής σε σύντομο επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA (ή «μικροδορυφόροι») είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των καρκινικών κυττάρων με την επισκευή αναντιστοιχία DNA (MMR) ανεπάρκεια [ ,,,0],1]. Αδρανοποίηση του οποιουδήποτε από αρκετές MMR γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των

MLH1

,

MSH2

,

MSH6

και

PMS2

, μπορεί να οδηγήσει σε MSI. Αρχικά, MSI φάνηκε να συσχετίζεται με ελαττώματα σε γονίδια βλαστικής γραμμής MMR σε ασθενείς με σύνδρομο Lynch (LS), όπου & gt? 90% του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) οι ασθενείς παρουσιάζουν MSI [2], [3]. Αργότερα αναγνωρίστηκε ότι MSI παρουσιάζεται επίσης σε ~ 12% των σποραδικών CRCs συμβαίνουν σε ασθενείς που στερούνται μεταλλάξεις MMR βλαστικής σειράς, και MSI σε αυτούς τους ασθενείς οφείλεται σε προαγωγό μεθυλίωση επαγόμενη αποσιώπηση του

MLH1

γονιδιακή έκφραση [4 ]. Προσδιορισμός της κατάστασης της MSI στο CRC έχει κλινική χρήση για τον εντοπισμό ασθενών με ελαττώματα βλαστική γραμμή προδιαθέτουν για MMR-ανεπάρκειας. Επιπλέον, η κατάσταση της MSI έχει προγνωστική και θεραπευτική επιπτώσεις, επειδή MSI CRCs συνήθως έχουν καλύτερη πρόγνωση, και αυτοί οι καρκίνοι είναι λιγότερο δεκτικές σε 5FU επικουρική χημειοθεραπεία βασιζόμενη [5].

Πριν Από την αρχική ανακάλυψη του περισσότερο από μια δεκαετία , οι μέθοδοι και τα κριτήρια για τον προσδιορισμό MSI στο CRC έχουν συνεχώς εξελίσσεται. Ωστόσο, εξακολουθεί να υπάρχει έλλειψη συναίνεσης σχετικά με τη χρήση των διαφόρων δοκιμασιών MSI που είναι πιο ισχυρό, ανέξοδο και θα οδηγήσει σε MSI αναλύσεις που αντιπροσωπεύει καλύτερα MMR-ανεπάρκεια σε εργαστήρια σε όλο τον κόσμο [6]. Σε μια προσπάθεια να ενοποιήσει την ανάλυση MSI στη CRC, το 1997 ένας του National Cancer Institute (NCI) εργαστήριο συνέστησε τη χρήση ενός πίνακα αναφοράς των πέντε δεικτών MSI που αποτελούνταν από 2 δείκτες μονονουκλεοτιδίου επανάληψης (BAT26 και BAT25) και 3 δείκτες δινουκλεοτίδιο επανάληψη (D2S123, D5S346 και D17S250) [7]. Σε συνέχεια εργαστήριο NCI, η επιτροπή αναγνώρισε ορισμένα από τα όρια των αρχικών δεικτών, κυρίως λόγω της συμπερίληψης των δεικτών 3 δινουκλεοτίδιο [8]. Πρώτον, αναγνωρίστηκε ότι οι δείκτες δινουκλεοτίδιο επανάληψη ήταν πιο κατάλληλη για τον εντοπισμό όγκων MSI-L, ενώ μονονουκλεοτιδίου δείκτες επανάληψη ήταν πιο ειδικές και ευαίσθητες για τον προσδιορισμό της MSI (ή MSI-H) CRCs [9]. Δεύτερον, λόγω της πολυμορφικής φύσης των δεικτών δινουκλεοτιδίου, αυτά απαιτείται η διαθεσιμότητα όχι μόνο όγκου αλλά ταιριάζουν κανονικό DNA από κάθε άτομο να ερμηνεύει αποτελέσματα MSI. Έχει δειχθεί ότι ένας πίνακας πέντε οιονεί μονομορφικής δείκτες μονονουκλεοτιδίου επανάληψη σε ένα Pentaplex PCR καθιστούν περιττή την ανάγκη για την κανονική DNA από κάθε ασθενή CRC, και μπορεί να προσφέρει καλύτερη ειδικότητα και ευαισθησία από τους δείκτες ΝΟΙ-πίνακα [10].

Δυστυχώς, παρά την προφανή πλεονεκτήματά της, η Pentaplex MSI προσέγγιση έχει αποκτήσει περιορισμένη αποδοχή για MSI προσυμπτωματικό έλεγχο του ΚΕΣ. Μπορεί να υπάρχουν πολλοί λόγοι για αυτό, συμπεριλαμβανομένης της έλλειψης σαφούς κατανόησης σχετικά με τις τεχνικές πτυχές και ανεξάρτητη επικύρωση αυτής της δοκιμασίας. Αυτή η μελέτη αντιμετωπίζει την ανησυχία αυτή με την επικύρωση της ακρίβειας των δεικτών Pentaplex πίνακα σε μια μεγάλη σειρά από MMR-καλά και με ανεπάρκεια CRCs αναλύοντας ΡΟΚ-ενισχυμένο προφίλ του κάθε δείκτη σε τόσο όγκο και ταιριάζουν κανονικό DNA. Στο παρόν, έχουμε επιδείξει ιδιαίτερα ευαίσθητη και ειδική Pentaplex PCR δοκιμασία που απαιτεί εφάπαξ βελτιστοποίηση των οιονεί μονομορφικού εύρους διακύμανσης (QMVR) για κάθε δείκτη σε κανονικό DNA. Παρέχουμε αποδείξεις ότι ένα βελτιστοποιημένο Pentaplex PCR δοκιμασία θα πρέπει να είναι η προτιμώμενη μέθοδος για την αξιολόγηση MSI σε κλινικά και ερευνητικά εργαστήρια, όπως είναι ταχεία, οικονομική, ιδιαίτερα ευαίσθητη και ειδική για την ανίχνευση MMR-ανεπαρκή CRCs και καθιστά περιττή την ανάγκη για παραπομπή κανονική DNA.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλοι οι ασθενείς παρείχαν ενυπόγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση και η μελέτη εγκρίθηκε από θεσμική συμβούλια αναθεώρηση του Πανεπιστημίου Baylor Medical Center, Dallas, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής? Πανεπιστήμιο της Χαϊδελβέργης, Heidelberg, Γερμανία? και το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Οκαγιάμα, Okayama, Japan

ιστών Δείγματα

όγκων και ταιριάζουν βλαστικής σειράς DNA συλλέχθηκε από 213 ασθενείς διαγνώστηκαν με CRC σε τρία διαφορετικά ιδρύματα:. 1) του Πανεπιστημίου Baylor Medical Center, Ντάλας , TX, USA 2) του Πανεπιστημίου της Χαϊδελβέργης, Heidelberg, Γερμανία και 3) το Πανεπιστήμιο Okayama Νοσοκομείο, Okayama, Japan. Μεταξύ αυτής της σειράς, 114 όγκοι ήταν MMR ανεπάρκεια, και περιελάμβανε 50 CRCs με την απώλεια του MLH1, 48 με την απώλεια των MSH2 και 8 περιπτώσεις η κάθε μία με την αποκλειστική απώλεια των πρωτεϊνών PMS2 ή MSH6. Οι υπόλοιπες 99 περιπτώσεις ήταν MMR-καλά.

MMR Πρωτεΐνη Ανοσοϊστοχημεία

Εξετάσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης για MLH1, MSH2, PMS2, και MSH6 σε 213 καρκινικών ιστών με ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση χρησιμοποιώντας ϋΑΚΟ EnVision σύστημα-HRP κιτ πολυμερές σύστημα (Dako Cytomation Inc., Carpinteria, CA). Τομές ιστού ανιχνεύθηκαν με κατάλληλες αραιώσεις των μονοκλωνικών αντισωμάτων ποντικού έναντι MLH1 (κλώνος 13271A, BD Pharmingen, San Diego, CA), MSH2 (κλώνος FE11, Oncogene Research Products, Boston, ΜΑ), PMS2 (κλώνος Α37, BD Pharmingen San Diego, CA), και την πρωτεΐνη MSH6 (κλώνος 44, BD Transduction Laboratories, Lexington, KY). Τα καρκινικά κύτταρα βαθμολογήθηκαν αρνητικά για MMR έκφραση πρωτεΐνης μόνο εάν τα επιθηλιακά κύτταρα εντός του ιστού του όγκου έλειπε πυρηνική χρώση, ενώ τα στρωματικά κύτταρα που περιβάλλουν ακόμη εμφάνισαν θετική χρώση.

μικροανατομίας και DNA Amplification

Διαδοχικές τομές (5 μm) από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εγκλεισμένο σε παραφίνη συμφωνημένα φυσιολογικών και καρκινικών ιστών βάφηκαν ως συνήθως, και αντιπροσωπευτικά φυσιολογικών και καρκινικών περιοχών ταυτοποιήθηκαν με μικροσκοπική εξέταση. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από τις ιστούς παραφίνης χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp DNA mini (Qiagen, Valencia, CA) μετά το διαχωρισμό του όγκου και φυσιολογικού ιστού με χειροκίνητη μικροδιατομής.

Pentaplex PCR και οιονεί μονομορφική διακύμανση εύρους (QMVR ) Ορισμός

ανάλυση

MSI διεξήχθη χρησιμοποιώντας στόχους επανάληψη μικροδορυφόρων πέντε μονονουκλεοτίδιο (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 και NR-27) σε ένα Pentaplex σύστημα PCR [10]. Οι Primer αλληλουχίες έχουν περιγραφεί προηγουμένως, και κάθε εκκινητής ήταν επισημασμένος στο άκρο με έναν από τους φθορίζοντες δείκτες: FAM, ΗΕΧ ή NED [11]. Pentaplex PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα MJ Research DNA 200 multicycler (Biorad, Hercules, CA). Οι συνθήκες PCR αποτελούνταν από ένα αρχικό στάδιο μετουσίωσης 15 λεπτά στους 95 ° C, που ακολουθείται από 35 κύκλους στους 95 ° C για 30 s, 55 ° C για 30 s και 72 ° C για 30 s, με μια τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά. Τα ενισχυμένα προϊόντα PCR αραιώνονται με φορμαμίδιο, και τρέχει σε ένα αυτοματοποιημένο αλληλουχητή τριχοειδή ηλεκτροφόρηση DNA Applied Biosystems 3100 Avant. Τα αλληλόμορφα μεγέθη για κάθε ένα από τους δείκτες εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας GeneMapper 3,1 λογισμικό (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Για τον προσδιορισμό και την επικύρωση της σειράς διακύμανσης οιονεί μονομορφικής (QMVR) για κάθε ένα από τα πέντε MSI δείκτες, τα προφίλ ενίσχυσης PCR βαθμολογήθηκαν ξεχωριστά, και το μέγεθος των δύο αλληλόμορφα προσδιορίστηκε για κάθε δείκτη και για κάθε όγκο ξεχωριστά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Για τον υπολογισμό, λόγω της μονομορφικής φύση αυτών των δεικτών, θα υπολογίζεται κάθε μέγεθος αλληλόμορφο δύο φορές σε ομόζυγη δείγματα.

Προσδιορισμός αλληλόμορφες παραλλαγές σε Tumor DNA σε σύγκριση με φυσιολογικά DNA

Στη συνέχεια, διερευνήσαμε είτε τη διαθεσιμότητα των κατάλληλων κανονικό DNA από έναν ασθενή CRC θα ενισχύσει την απόδοση προβολή της Pentaplex PCR σε ανεπάρκεια MMR CRCs. Υπολογίσαμε τις διαφορές στην αλληλομόρφων μήκη μεταξύ όγκου και φυσιολογικό DNA για κάθε ασθενή και κάθε δείκτη MSI. Σε κάθε περίπτωση, θεωρείται η συντομότερη αλληλόμορφο υπάρχει σε όγκο ή φυσιολογικό DNA για σκοπούς υπολογισμού χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:

(διαφορά στο μήκος αλληλόμορφο) =