Αφηρημένο

Soricidin είναι ένα 54-αμινοξέων πεπτίδιο που βρέθηκαν στο παραλυτικό δηλητήριο του βόρειου μικρή ουρά μέγαιρα (

Blarina brevicauda

) και έχει βρεθεί ότι αναστέλλει την παροδική δυναμικό υποδοχέα του vallinoid τύπου 6 (TRPV6) διαύλων ασβεστίου. Αναφέρουμε ότι δύο μικρότερα πεπτίδια, SOR-C13 και SOR-C27, που προέρχεται από το C-τελικό άκρο του soricidin, είναι ανταγωνιστές υψηλής συγγένειας της ανθρώπινης κανάλια TRPV6 που ρυθμίζεται προς τα πάνω σε έναν αριθμό καρκίνων. Στο παρόν, αναφέρουμε τις μεθόδους μοριακής απεικόνισης που αποδεικνύουν το

in vivo

διαγνωστικές δυνατότητες του SOR-C13 και SOR-C27 για να θέσεις στόχους όγκων σε ποντίκια που φέρουν όγκους των ωοθηκών ή του προστάτη. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αυτά τα νέα πεπτίδια μπορεί να παρέχει μια λεωφόρο για να παραδώσει διαγνωστικά και θεραπευτικά αντιδραστήρια άμεσα στο TRPV6 πλούσια όγκους και, ως εκ τούτου, να έχουν πιθανές εφαρμογές για ένα φάσμα καρκινώματα, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών, του μαστού, του θυρεοειδούς, του προστάτη και του παχέος εντέρου, καθώς και ορισμένες λευχαιμίες και τα λεμφώματα

Παράθεση:. Bowen CV, DeBay D, Ewart ΕΣ, Gallant P, Gormley S, Ilenchuk TT, et al. (2013)

In Vivo

ανίχνευση της ανθρώπινης TRPV6-Rich Όγκοι με Anti-Cancer πεπτίδια που προέρχονται από Soricidin. PLoS ONE 8 (3): e58866. doi: 10.1371 /journal.pone.0058866

Επιμέλεια: Αντώνης W. Ι Lo, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 2 Νοέμ του 2012? Αποδεκτές: έβδομης Φλεβάρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 15 Μαρτίου, 2013

Copyright: © 2013 Bowen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας πρόγραμμα βοήθειας βιομηχανικών Ερευνών (IRAP) πρόγραμμα (https://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/irap/index.html) και Ατλαντικό Καναδά Οργανισμού Ευκαιρίες (ACOA) (http: //www.acoa-apeca.gc.ca/eng/Pages/Home.aspx) της κυβέρνησης του Καναδά. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. SG, ΤΤΙ, TL, CR και JMS είναι υπάλληλοι της Soricimed Biopharma Inc. Στο ο χρόνος εκτέλεσης και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, HSE ήταν υπάλληλος της NRC. Novaceutics Consulting έχει καμία σχέση με Soricimed. JMS έχει τα ακόλουθα διπλώματα ευρεσιτεχνίας να δηλώσει: US 7,119,168 για πεπτίδια και μεθόδους θεραπείας του καρκίνου, που εκδόθηκε 10 ασημένιου, 2006? US 7273850 για μεθόδους αναστολής πρόσληψης ασβεστίου από ένα καρκινικό κύτταρο για τη μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με χορήγηση σύνολο ή μέρος του πεπτιδίου και μεθόδους θεραπείας του καρκίνου όπου τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του TRPV6, που εκδόθηκε 25 Sept., 2007? και ΗΠΑ 8.211.857 για αξιώσεις που κατευθύνεται προς ένα πεπτίδιο που αποτελείται από SOR-C13 ή SOR-C27, για τη θεραπεία του καρκίνου που εκδόθηκε στις 3 Ιουλίου 2012. JMS δηλώνει επίσης εκκρεμεί διπλώματα ευρεσιτεχνίας που εκδίδονται σε: ΗΠΑ 13 /526.045 για τη συνέχιση των ΗΠΑ 12 /866.397 (US εκδοθεί δίπλωμα ευρεσιτεχνίας 8.211.857) για μεθόδους αναστολή της πρόσληψης ασβεστίου από τα καρκινικά κύτταρα για τη μείωση του πολλαπλασιασμού και μεθόδους θεραπείας καρκινικών κυττάρων? Καναδάς (CA 2718949), την Ευρώπη (ΕΕ 09.721.272,4), Ιαπωνία (JP 2011 έως 500.019), και το Χονγκ Κονγκ (11.106.921,8) για την εφαρμογή PCT σε εθνικό φάση κατευθύνεται προς πεπτίδιο που αποτελείται από SOR-C13 και SOR-C27? Καναδάς 2.544.467 για το πεπτίδιο που κατευθύνεται φαρμακευτικές συνθέσεις και ιατρικές θεραπείες? ΗΠΑ 12 /824.935 για τα πεπτίδια TRPV6 δέσμευσης που περιλαμβάνει το σύνολο ή μέρος του SOR-C27 συζευγμένο με ένα βιομόριο. JMS δηλώνει εφαρμογές PCT σε φάση έθνος, Καναδάς (CA 2766272), την Ευρώπη (ΕΕ 10.791.109,1), Χονγκ Κονγκ (αύξων αριθμός 12.110.289,5), Ιαπωνία (JP 2.012 έως 516.450), το Μεξικό (MX /α /2012 /000.086) και τη Βραζιλία (PI1012676 -9). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Στη Βόρεια Αμερική, 1 στις 70 γυναίκες θα αναπτύξει καρκίνο των ωοθηκών κατά τη διάρκεια της ζωής τους. Παρά τις πρόσφατες προόδους με την ταυτοποίηση, τον καρκίνο των ωοθηκών παραμένει δύσκολο να ανιχνευθεί και τυπικά προσδιορίζεται μόνο αφού έχει κάνει μετάσταση σε άλλα μέρη του σώματος [1]. Η πρόγνωση για την ανίχνευση πρώιμο στάδιο είναι μεταξύ 70% και τα ποσοστά επιβίωσης 100%? Ωστόσο, το 70% των περιπτώσεων διαγιγνώσκονται σε προχωρημένα στάδια, όπου το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι μόνο μεταξύ 15% και [2] 25%. Επί του παρόντος, δεν υπάρχει αξιόπιστο τεστ ανίχνευσης μη επεμβατική για τον καρκίνο των ωοθηκών.

Οι συγκεντρώσεις ασβεστίου ρυθμίζεται προσεκτικά εντός των κυτταρικών διαμερισμάτων, μέσω της ολοκληρωμένης δράσης των διαφόρων μεμβράνης κανάλια και αντλίες. Κατά τα τελευταία αρκετά χρόνια ορισμένα μέλη της οικογένειας των διαύλων εισροής ιόντων ασβεστίου, που ονομάζονται κανάλια TRPV, έχουν αναδειχθεί ως δυνητικός βιοδείκτες καρκίνου που μπορεί να αποδειχθεί πολύτιμη για την ανάπτυξη βελτιωμένων ανίχνευση όγκου ή /και στοχευμένη θεραπεία φαρμάκων. Το 1999 νέα κανάλια ασβεστίου αναφέρθηκαν σε σωληνάρια νεφρού κουνελιού [3] και του αρουραίου του πεπτικού συστήματος [4] ονομάζεται ECaC1 και CAT1, αντίστοιχα, που έμοιαζε με τον υποδοχέα καψαϊκίνης (βανιλλοειδούς υποδοχέα, VR1) [5]. ECaC1, CAT1, και VR1 αποδείχθηκε ότι σχετίζεται με το κανάλι παροδική δυναμικό υποδοχέα (TRP) ασβέστιο σε

Drosophila

που μεσολαβεί photoreception [6] – [8]. Μέχρι σήμερα έχουν τουλάχιστον 30 ομόλογα κανάλι TRP έχουν ταυτοποιηθεί σε θηλαστικά, τα οποία χωρίζονται σε έξι κύριες υποοικογένειες: trpA (ανκυρίνης), trpC (κανονικό), TRPM (melastatin), TRPML (mucolipin), ίτρΡ (polycystin) και TRPV (βανιλλοειδούς ) [9] – [11]. Η TRPV υπο-οικογένεια αποτελείται από έξι μέλη που ονομάζεται TRPV1 να TRPV6. Τα τέσσερα πρώτα κανάλια συνδέονται στενά και έχουν ρόλους σε αίσθησης διάφορες εισόδους, συμπεριλαμβανομένων τέντωμα, θερμότητας, οξύτητα, επιβλαβή ερεθίσματα (αλγαισθησία) και πόνο [9], [11]. Αυτά τα κανάλια παρουσιάζουν σχετικά χαμηλή εκλεκτικότητα για ιόντων ασβεστίου (P

Ca /P

Na ~ 1 έως ~ 15). Σε αντίθεση, TRPV5 και TRPV6 είναι ιδιαίτερα ιόντα ασβεστίου-επιλεκτικό (P

Ca /P

Na~100). Και τα δύο αυτά κανάλια που εκφράζονται σε ακραία μεμβράνες διαφόρων ιστών, συμπεριλαμβανομένων των νεφρών, του εντέρου, του παγκρέατος και του προστάτη [12] – [14]. Για παράδειγμα, TRPV5 εκφράζεται στα άπω σωληνάρια του νεφρού όπου λειτουργεί στην επαναρρόφηση του ιόντος ασβεστίου από τα ούρα προ-[12]? TRPV6 είναι κυρίαρχη στην γαστρεντερική οδό όπου εμπλέκονται στην ακραία είσοδο του ασβεστίου [14]

TRPV6 εμπλέκεται στην ανάπτυξη και την εξέλιξη [15] του όγκου -. [18]. Η πρωτεΐνη TRPV6 υπερεκφράζεται σε καρκινώματα ωοθήκης και άλλο καρκίνο όπως του μαστού, του παχέος εντέρου, του προστάτη και του θυρεοειδούς [14]. TRPV6 mRNA είναι αυξημένο σε διάφορες κυτταρικές σειρές όγκων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων του παχέως εντέρου, την ανθρώπινη λευχαιμία και του προστάτη [19] – [23]. Στον καρκίνο του προστάτη, τα επίπεδα TRPV6 mRNA συσχετίζονται θετικά με την εξέλιξη του όγκου και επιθετικότητα, όπως υποδεικνύεται από βαθμολογία Gleason, παθολογικές στάδιο και έξτρα-προστατική μεταστάσεων [20], [24]. Πράγματι, TRPV6-θετικούς όγκους του προστάτη έχουν κακή πρόγνωση λόγω της τάσης να εισβάλει περιβάλλοντες ιστούς [25].

Η σχέση μεταξύ της αύξησης του όγκου και υπερέκφραση του TRPV6 μπορεί να περιλαμβάνει την ενίσχυση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων εξαρτώμενη από ασβέστιο και αναστολή της απόπτωσης. Schwarz et al. [26] έδειξε ότι χαμηλές δόσεις εκοναζόλη, ένα χωρητικό blocker εισροή ασβεστίου, μειωμένη τόσο σήματα εισροή ασβεστίου και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα ΗΕΚ-293 επιμολυσμένα με TRPV6. Στην κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη LNCaP, τα πάνω ρύθμιση του TRPV6 αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση ενώ επιβράδυνσης της απόπτωσης μέσω ενός μηχανισμού που φαίνεται ότι περιλαμβάνει την ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα των ενεργοποιημένων Τ-κυττάρων (NFAT) παράγοντα μεταγραφής [27]? μείωση των TRPV6 με siRNA μειωμένο πολλαπλασιασμό και αυξημένη απόπτωση. Σε κύτταρα καρκίνου του μαστού, ταμοξιφαίνη μειώνει την έκφραση του TRPV6 και σηματοδότηση ασβέστιο, μια επίδραση που μπορεί να εξηγήσει εν μέρει τις αντικαρκινικές επιδράσεις της παρούσας ανταγωνιστή οιστρογόνου [28]. Επιπλέον, νοκ ντάουν της TRPV6 με siRNA βελτίωσε την αποτελεσματικότητα της ταμοξιφαίνης. Έτσι όπως προτείνεται σε μια πρόσφατη δημοσίευση, η αναστολή του διαύλου TRPV6 προσφέρει μια νέα θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία των όγκων που υπερεκφράζουν το κανάλι TRPV6 [29].

Soricidin (αριθμός πρόσβασης P0C2P6) είναι ένα νέο πεπτίδιο παραλυτική απομονώνεται από τους υπογνάθιους αδένες σάλιο του βόρειου μικρή ουρά μέγαιρα (

Blarina brevicauda

? ένα από τα πιο κοινά θηλαστικά στον Ατλαντικό Καναδά) και, ανέφεραν ότι αναστέλλουν την πρόσληψη ασβεστίου

μέσω

TRPV6 κανάλια [ ,,,0],30]. Στη συνέχεια, δύο αλληλουχίες πεπτιδίου από το C-τελικό άκρο του soricidin (SOR-C13 και SOR-C27? Πίνακας 1), αποδείχθηκε ότι συνδέονται TRPV6 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών με υψηλή συγγένεια [31]. Εδώ, περιγράψαμε τις ιδιότητες του SOR-C13 και SOR-C27 και την ικανότητα αυτών των πεπτιδίων να στοχεύουν ανθρώπινων όγκων των ωοθηκών σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού που δεσμεύονται TRPV6. Με σύζευξη των πεπτιδίων με μια φθορίζουσα χρωστική ή ενός παράγοντα αντίθεσης απεικόνισης μαγνητικού συντονισμού (MRI), ήμασταν σε θέση να παρακολουθεί την βιο-συσσώρευσης και βιο-διανομή των πεπτιδίων

in vivo

, τελικά απεικόνιση όγκων που εκφράζουν TRPV6. Αυτά τα ευρήματα ανοίγουν νέες διαγνωστικές και /ή θεραπευτικές προοπτικές για την έγκαιρη ανίχνευση και θεραπεία των όγκων των ωοθηκών και ενδεχομένως άλλες TRPV6 πλούσια σε όγκους περιλαμβανομένων εκείνων του στήθους, του παχέος εντέρου, του προστάτη και του θυρεοειδούς, καθώς και ορισμένα λευχαιμία και λεμφώματα.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα πεπτίδια

Οι αλληλουχίες των soricidin, οι SOR-C13 και SOR-C27 πεπτιδίων φαίνονται στον πίνακα 1. Τα πεπτίδια παρασκευάστηκαν με CanPeptide (Μόντρεαλ, Καναδάς ) με σύνθεση στερεάς φάσης. SOR-C13 και SOR-C27 έδειξε το αναμενόμενο μοριακό βάρος από το χρόνο-πτήσης φασματομετρίας μάζας (Μ

+ Η

+ του 1566.42 και 2958.02) με καθαρότητα πεπτίδιο (με HPLC) του 96,9% και 96,8% αντίστοιχα . Η περιεκτικότητα σε πεπτίδιο της λυοφιλισμένης λευκή σκόνη (τριφθοροξικό άλας) ήταν 83.5% και 65.2%. Οι επόμενες συγκεντρώσεις πεπτίδιο υπολογίστηκαν με βάση το πεπτίδιο ελεύθερης βάσης.

δομή Λύση NMR του SOR-C27

Προετοιμασία δείγματος.

πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) φασματοσκοπικά δεδομένα ήταν απέκτησε για τον καθορισμό των διαμορφωτική δομικά χαρακτηριστικά του πεπτιδίου SOR-C27 κάτω από διάφορες συνθήκες. Ένα διάλυμα παρακαταθήκης (δείγμα # 1) 10 mM SOR-C27 παρασκευάστηκε σε 90/10 H

2O /D

2O με 50 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού καλίου σε ρΗ 6,6. Από το δείγμα # 1, ετοιμάστηκαν τρία επιπλέον δείγματα: # 2) μητρικό διάλυμα με 200 mM NaCl, # 3) μητρικό διάλυμα με 100 mM dodecylphosphocholine (DPC) και 4) μητρικό διάλυμα # αραιωμένο έως 2 mm, με 100 mM δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS ). Δείγμα # 1 αποκτήθηκε σε θερμοκρασίες που κυμαίνονται 274 έως 308 K. Το πεπτίδιο ήταν εντελώς διαλυτό σε όλες τις λύσεις και κάτω από όλες τις συνθήκες.

Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού.

Για τα δείγματα 1-3

σύνολα δεδομένων 1Η NMR συλλέχθηκαν σε ένα φασματόμετρο DRX-500 (Bruker BioSpin AG, Φάλαντεν, Switzerland) που λειτουργούν σε 500,13 ΜΗζ με χρήση 1 χιλιοστά OD H [ΣΟ] καθετήρα. Για το δείγμα 4,

1 (και έμμεσα

13C και

15Ν) σύνολα δεδομένων NMR συλλέχθηκαν σε ένα φασματόμετρο AVANCEIII 700 λειτουργεί στα 700,13 MHz χρησιμοποιώντας 1,71 χιλιοστά OD HC [Ν] καθετήρα.

χημικές μετατοπίσεις 1Η ανεφέρθησαν εις 2,2-διμεθυλο-2-silapentane-5-σουλφονικό μέσω του συντονισμού του νερού βαθμονομείται σε κάθε θερμοκρασία.

13C και

15N χημικές μετατοπίσεις έμμεσα αναφέρονται μέσω του

αναφορά 1.

Για τον καθορισμό της δομής με δείγματα 1 και 4, φάση-ευαίσθητες 2D

1 Η-

1 σύνολα δεδομένων NOESY (120, 250 και 400 ms χρόνος ανάμιξης) και

1 Η-

1 TOCSY (MLEV17? 120 ms ανάμειξη του χρόνου, το δείγμα 4 DIPSI-2? 90 ms χρόνος ανάμιξης) σύνολα δεδομένων καταγράφηκαν με προ -saturation ή ένα μαλακό παλμό για την καταστολή του νερού. σύνολα Τα δεδομένα συλλέχθηκαν με 1024 × 380 πολύπλοκα σημεία, αποδισμένους με 70 ° μετατοπισμένη συνάρτηση παραθύρου sine-τετράγωνο-καμπάνα και στις δύο διαστάσεις, μηδέν συμπληρώθηκε και γραμμική προβλεπόμενη στην έμμεση διάσταση για να δώσει τελική φάσμα 2D 2048 × 2048 πραγματικών σημείων.

διαρθρωτικά Υπολογισμοί.

NMR φάσματα αναλύθηκαν, και οι θέσεις των κορυφών και των όγκων προσδιορίζεται με τη χρήση Sparky 3.110 λογισμικού που λειτουργούν σε ένα σύστημα Linux PC. Για τις διαρθρωτικές αποφασιστικότητα, όλα τα συστήματα γύρισμα εντοπίστηκαν μέσω χημικών μετατοπίσεων και χαρακτηριστικό TOCSY πρότυπα σταυρό αιχμής. Πλευρική αλυσίδα και την πλάτη των οστών αντηχήσεις της Asn7, Thr9, Phe17 και Val23 ήταν εύκολα ανατεθεί από μοναδικά σχέδια TOCSY τους και κάθε υπόλειμμα συμβαίνει μόνο μία φορά στη σειρά. Ξεκινώντας από αυτά τα υπολείμματα, αλληλουχία-ειδικών αποστολών του σκελετού και των πλευρικών αλυσίδων συντονισμοί προσδιορίσθηκαν με τη χρήση τυποποιημένων μεθόδων,

δηλαδή

ξεκινώντας από τα ευκόλως ανατεθεί υπολείμματα, παρακείμενα υπολείμματα διαδοχικά προσδιορίστηκε ακολουθώντας την H

α

i

-Η

N

i + 1

και H

N

i

-Η

N

i + 1

συνδέσεις NOESY. Μόλις εντοπίστηκαν παρακείμενα υπολείμματα, συνδέσεις NOESY πλέον αποστάσεις έχουν ανατεθεί. Για τους υπολογισμούς δομή του SOR-C27 σε ρυθμισμένο νερό, DPC και SDS μικκύλια, τα υποστηρίγματα απόσταση προσδιορίστηκαν από την ολοκλήρωση των εγκάρσιων κορυφές από τα 250 ms (δείγμα 4? 200 ms) του φάσματος NOESY, και κατατάσσονται σε τέσσερις ομάδες: ισχυρή, μεσαίου , αδύναμη και πολύ αδύναμος που αντιστοιχεί στο μεταξύ πρωτονίων κυμαίνεται απόσταση & lt? 2.3, 2,0-3,5, 3,3 – 5,0 και 4,8 – 6,0 Α, αντίστοιχα

Όλοι οι διαρθρωτικές υπολογισμοί βασίστηκαν σε προηγούμενες μελέτες με τη χρήση του XPLOR. 3.1 πακέτο λογισμικού. Εν συντομία, μια αρχική τυχαία σπείρα επεκταθεί δομή χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργηθεί ένα σύνολο 50 ενσωματωμένων δομών. Οι στενές επαφές αφαιρέθηκαν από την ελαχιστοποίηση ενέργειας του 1000 τα βήματα των συζυγών πριν προχωρήσετε στις συγκρατημένη προσομοιωμένης ανόπτησης μοριακής δυναμικής (MD) υπολογισμούς. Οκτώ βήματα που περιλαμβάνει ένα συνολικό χρόνο προσομοίωσης 120 ps χρησιμοποιήθηκαν για τις προσομοιώσεις MD. Αρχικά, το σύστημα τέθηκε σε 1500 Κ και όλων των σταθερών δύναμη για συνδεδεμένα, NOESY και μη-πλεγμένα αλληλεπιδράσεις κλιμακωθεί στο 10% της πλήρους τιμές τους. Μετά το τρίτο στάδιο, οι σταθερές δύναμη είχε γραμμικά κλιμακώνεται σε πλήρη τιμές τους. Κατά τα τελευταία πέντε βήματα η θερμοκρασία μειώθηκε ομοιόμορφα σε 300 Κ Υπολογιζόμενη δομές στη συνέχεια ενέργεια ελαχιστοποιείται με βήματα των συζυγών του 2000.

Diffusion διαταχθεί φασματοσκοπία (DOSY) είναι σε θέση να προσδιορίσει επακριβώς τις σταθερές διάχυσης των μορίων σε διάλυμα . δεδομένων DOSY αποκτήθηκε για το δείγμα SOR-C27 /SDS. Τα 3 kDa SOR-C27 πεπτιδίων και των 80 kDa SDS μικκύλια έχουν παρόμοια ποσοστά διάχυσης συνεπής με ισχυρή πρόσδεση του πεπτιδίου στα μικκύλια SDS.

Culture κυτταρικών γραμμών

Επιμόλυνση και υπερέκφραση του TRPV6 σε κύτταρα ΗΕΚ-293.

Ανθρώπινα κύτταρα ΗΕΚ-293 (6-9 περάσματα) τοποθετήθηκαν σε ένα 24-φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο, 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση . Κάθε φρεάτιο αραιώνεται σε μέσο ελεύθερο ορού και επωάστηκαν για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια συνδυάστηκαν αργά και επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από επώαση 20 λεπτών, τα κύτταρα εκτέθηκαν στο συγκρότημα που αποτελείται από την επιμόλυνση 0,5 μg του PDI-CAT-L DNA πλασμιδίου (ένα δώρο από τον Dr. V. Flockerzi, Εχρβππιβηίβΐΐβ und Klinische Pharmakologie und Toxikologie der Universität des Saarlandes [23]) και 1,5 μΙ Lipofectamine αντιδραστηρίου 2000. PDI-CAT-L είναι ένα δισιστρονικό φορέα έκφρασης που περιέχει cDNA για την περιοχή κωδικοποίησης πρωτεΐνης του TRPV6 και του μεταλλαγμένου Πράσινη Φθορίζουσα Πρωτεΐνη (S65T? EGPF) που διαχωρίζονται από ένα εσωτερικό ριβοσώματος θέση έκφρασης (β-ακτίνης /Kozak /TRPV6 /IRES /EGFP σε ρΟΑΟΟδ) [23]. Η IRES προέρχεται από ιό εγκεφαλομυοκαρδίτιδας [32]. Η επιμόλυνση των κυττάρων ΗΕΚ-293 με τον δισιστρονικό φορέα επιτρέπει την ταυτόχρονη παραγωγή TRPV6 και EGFP και επιλογή φθοριζόντων κυττάρων που παράγουν TRPV6 για τις μετρήσεις ηλεκτροφυσιολογίας. Από προηγούμενες έρευνες Χρησιμοποιώντας αυτό το πλασμίδιο και άλλα παρόμοια πλασμίδια, προσδιορίστηκε ότι το κανάλι TRPV6 εκφράζεται εξαιρετικά, εντοπισμένη στην επιφάνεια της μεμβράνης, γλυκοζυλιωμένη και ουσιαστικά δραστική δημιουργώντας ένα Ca

2 + -invoked προς τα μέσα ρεύμα [33] – [35].

Culture κυτταρικών σειρών καρκίνου.

Όλες οι κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από την Αμερικανική Συλλογή κυτταρικό τύπο και που καλλιεργούνται στις συνιστώμενες συνθήκες 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2. SKOV-3 (ATCC, ΗΤΒ-77) είναι μία κυτταρική γραμμή όγκου αρχικά προέρχεται από την ασκητική ρευστό του θηλυκού υποκειμένου με ένα καρκίνωμα ωοθηκών. Ήταν καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5a που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). DU145 (ATCC, ΗΤΒ-81) είναι μία κυτταρική γραμμή όγκου που προέρχεται από εγκέφαλο αλλοίωση του ένα αρσενικό υποκείμενο με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη. Μπορούν καλλιεργήθηκαν σε Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο Eagle (ATCC) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS. SKOV-3 και DU145 είναι ογκογόνο σε CD-1 γυμνούς ποντικούς, που αποτελούν πρωτογενή αδενοκαρκινώματα των ωοθηκών και του προστάτη, αντίστοιχα.

TRPV6 ηλεκτροφυσιολογίας.

Ολόκληρο-κυττάρων μπάλωμα καταγραφές σφιγκτήρα πραγματοποιήθηκαν σε ΗΕΚ-293 κύτταρα που εκφράζουν TRPV6 και EGFP. Τα επιμολυσμένα κύτταρα ταυτοποιήθηκαν εύκολα από μη επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα φθορίζον μικροσκόπιο Axiovert 135 (Olympus). Οι καταγραφές πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός ενισχυτή Axopatch 1 D ελέγχονται και να παρακολουθούνται με τη χρήση pClamp 9 λογισμικό (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA, USA). σύνολα δεδομένα ψηφιοποιήθηκαν στα 20 kHz και διηθείται σε 2 kHz. σιφώνια Patch τραβήχτηκαν από βοριοπυριτικό γυαλί χρησιμοποιώντας μια πιπέτα P-80C εξολκέα (Sutter Instrument, San Rafael, CA, USA), και είχε μια αντιστάσεις 2-4 ΜΩ όταν γεμίζουν με το διάλυμα της πιπέτας περιείχε: 145 mM σουλφονικό καισίου-μεθάνιο, 8 mM NaCl, 1 mM MgCl

2, 3.64 mM ΟαΟ

2, 10 mM HEPES και 10 mM EGTA (προς ρύθμιση του ενδοκυτταρικού Ca

2+) με το ρΗ ρυθμίστηκε σε 7,2 με χρήση CsOH. Το εξωκυτταρικό διάλυμα περιείχε: 145 mM NaCl, 10 mM CsCl, 10 mM ΟαΟ

2, 2 mM MgCl

2, 2,8 mM ΚΟΙ, 10 mM HEPES και 10 mM γλυκόζη με ρΗ ρυθμισμένο σε 7,2 με χρήση ΝαΟΗ

για την απομόνωση των ρευμάτων TRPV6, ΗΕΚ-293 και κύτταρα επιμολυσμένα ΗΕΚ-293 ήταν τάση συσφίγγεται στο 50 mV με 50 ms γραμμική ράμπα τάσης (-110 mV έως +90 mV) πρωτόκολλο που εφαρμόστηκε σε παρουσία ή απουσία ένας αναστολέας TRPV6, La

3+ ιόντα (10 μΜ), SOR-C27, SOR-C13 ή SOR-C27-Cy5.5. Αν και η La

3+ ιόν είναι ένας μη ειδικός αναστολέας του παρόντος δεν υπάρχει γνωστή εκλεκτικός αναστολέας του καναλιού TRPV6. Η ράμπα ήταν κατά μέσο όρο πάνω από 10 φορές σε 2 s διαστήματα μεταξύ ράμπες.

Η ανάλυση διεξήχθη off-line χρησιμοποιώντας IGOR (WaveMetrics Inc., Lake Oswego, OR, USA) λογισμικού. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με t-test ζεύγη μαθητών (two-tailed). Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM με ένα

σ

-τιμή του & lt?.. 0.05 θεωρείται σημαντική

μελέτες απεικόνισης

Παραγωγή των όγκων για απεικονιστικές μελέτες

Παρόμοια με προηγούμενες έρευνες, CD-1 γυμνά ποντίκια (ηλικίας 6-8 εβδομάδων, Charles River) χρησιμοποιήθηκαν για φθορίζουσα επισήμανση (αρσενικά ποντίκια) και η μαγνητική τομογραφία (θηλυκά ποντίκια) μελέτες [36], [37]. Οι ποντικοί στεγάστηκαν σε κλουβιά σε ομάδες των τριών σε πέντε, και διατηρείται σε μια 12 ωρών φωτός /σκότους πρόγραμμα στους 22 ° C και σχετική υγρασία 50 ± 5%. Αποστειρωμένο φαγητό και νερό ήταν ελεύθερα διαθέσιμα. Η υποδόρια εμφύτευση όγκου εκτελέσθηκε σε ποντικούς υπό ελαφρά αναισθησία ισοφλουρανίου. SKOV-3 ή DU145 (6 × 10

6 κύτταρα /50 μΙ αραίωσης 1:01 Matrigel σε αλατούχο διάλυμα) εμφυτεύθηκαν στο αριστερό πλευρό των ποντικών που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη φθορισμού του ενώ 1 × 10

7 SKOV-3 κύτταρα εγχύθηκαν σε ποντίκια που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη MRI. Το μέγεθος των όγκων, υπολογίζεται με βάση το μήκος τύπο × πλάτος

2/2, παρακολουθήθηκε με δαγκάνες. Πάνω από μια περίοδο 6 εβδομάδων, οι όγκοι αναπτύχθηκαν σε μέγιστο μέγεθος 300 mm

3. Αυτή η έρευνα διεξήχθη σε αυστηρή συμφωνία και τη συμμόρφωση με το Καναδικό Συμβούλιο για την φροντίδα των ζώων. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων του Πανεπιστημίου Dalhousie (πρωτόκολλο # 09-047). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις διεξήχθη κάτω από κατάλληλη αναισθησία και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Προετοιμασία του SOR-C27-Cy5.5 για φθορισμού Σπουδών.

SOR-C27 (6,64 × 10

-4 mmole) παραγωγοποιήθηκε με αποκλειστική ομάδα θειόλης Cys14 με αντίδραση με 25% περίσσεια του παράγωγο μαλεϊμιδίου του Cy5.5 (8,86 × 10

-4 mmole? GE Healthcare Amersham) σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται. Η ετικέτα πεπτίδιο διαχωρίστηκε από μη αντιδράσαντα συστατικά χρησιμοποιώντας Sephadex G-25 στήλη αποκλεισμού μεγέθους (20 χ 1,5 cm). Κλάσματα που περιέχουν την ετικέτα πεπτίδιο λυοφιλοποιήθηκαν και η καθαρότητα επιβεβαιώθηκε με HPLC.

Από SOR-C13 δεν περιέχει ένα και μοναδικό χώρο σύζευξη, σύζευξη του πεπτιδίου σε έναν εστέρα Cy5.5-NBS (GE Healthcare Επιστημών Ζωής. Μπε d’Urfe, QC) είχε ως αποτέλεσμα ένα μίγμα ετικέτα πεπτιδίων μέσω Lys1 και Lys8. Κατά συνέπεια, οι δεσμευτικές και φθορισμού αποτελέσματα θα μπορούσαν να είναι ασύμμετρη και ως εκ τούτου, μόνο προκαταρκτική

in vivo

έρευνες διεξήχθησαν.

Παρασκευή και χαρακτηρισμός SPIO- (SOR-C27)

x για μελέτες MRI .

βιοκατανομή Παρακολούθηση από MRI βασίζεται σε ένα παράγοντα αντίθεσης, όπως σούπερ-παραμαγνητικά οξείδιο του σιδήρου (SPIO) σφαιρίδια να συνδέονται χημικά με την ένωση του SOR-C27 ενδιαφέροντος (SOR-C13 δεν ήταν χρησιμοποιηθεί, καθώς δεν περιέχει ένα και μοναδικό χώρο σύζευξη). SPIO χάντρες λειτουργοποιημένο με ομάδες μηλεϊμιδίου (MicroMod 77-96-201) χρησιμοποιήθηκαν χωρίς περαιτέρω καθαρισμό. Χάντρες αντέδρασαν με ένα 5-πλάσια μοριακή περίσσεια από πρόσφατα παρασκευασμένο και ρυθμισμένο SOR-C27 (1 mM, 50 mM PBS, ρΗ 7.2) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Το μίγμα αραιώνεται με 50% μεθανόλη και φυγοκεντρείται σε 400 RCF μέχρι το υπερκείμενο είχε μια ελαφρά κόκκινο χρώμα δίδοντας ένα σφαιρίδιο του SOR-C27 functionalized σφαιρίδια SPIO. Η SPIO-πεπτιδίου σφαιρίδιο πλύθηκε και επαναιωρήθηκε σε PBS αποστειρωμένο Dulbecco (DPBS) σε μια συγκέντρωση 2.5 mg Fe /ml για ένεση σε ποντίκια. Για τον έλεγχο, χάντρες SPIO παρασκευάστηκαν με αντίδραση των μηλεϊμίδιο-functionalized χάντρες με ένα πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα κυστεΐνης χρησιμοποιώντας ένα ισοδύναμο πρωτόκολλο. Τα μπλοκ κυστεΐνη μαλεϊμιδο ομάδων στα σφαιρίδια αυτά καθιστούν μη ενεργά.

Ο αριθμός των SOR-C27 πεπτίδια ανά σφαιρίδιο καθορίστηκε με ποσοτική

Ανάλυση 1Η NMR του υπερκείμενου για να καθορίσει τον αριθμό των un-αντέδρασαν πεπτίδιο μόρια. Κατά μέσο όρο 75 μόρια SOR-C27 συζεύχθηκαν σε κάθε σωματίδιο SPIO. Η σύζευξη του πεπτιδίου προς τα σφαιρίδια επαληθεύθηκε με πέψη τρυψίνης του αιωρήματος σφαιριδίων και ανάλυση οι απελευθερωμένες πεπτιδικών θραυσμάτων με φασματομετρία μάζας. Μετά την πέψη και απομάκρυνση των σφαιριδίων με φυγοκέντρηση, το προκύπτον υπερκείμενο περιείχε δύο θραύσματα πεπτιδίου με αλληλουχίες συνεπείς με την διάσπαση του πεπτιδίου SOR-C27.

φθορισμού απεικόνισης set-up και τη συλλογή δεδομένων.

Όλα τα πειράματα οπτικής απεικόνισης πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός μικρού ζώου στο πεδίο του χρόνου Εξερευνήστε Optix MX2 προ-κλινικό σύστημα απεικόνισης, και οι εικόνες αναλύθηκαν ή ανασχηματισμένες όπως χάρτες συγκέντρωση φθορισμού χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης ART Optix Optiview 2.0 (Advanced Research Technologies, Montreal, QC). Μια 670-nm δίοδος παλμικού λέιζερ με συχνότητα επανάληψης των 80 MHz και έναν χρόνο ανάλυσης του φωτός παλμού 12 ps χρησιμοποιείται για τη διέγερση. Η εκπομπή φθορισμού στα 700 nm συλλέχθηκε με ένα εξαιρετικά ευαίσθητο σύστημα καταμέτρησης απλού φωτονίου χρονικά συσχετισμένων και ανιχνεύονται μέσω ενός γρήγορα σωλήνα φωτοπολλαπλασιαστή. Τα δεδομένα καταγράφηκαν ως χρονική λειτουργίες point-spread (TPSF). Για την απεικόνιση, ισοφλουορανίου αναισθητοποιημένα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε ένα στάδιο ζώο μέσα σε ένα θάλαμο που επέτρεψε για τη διατήρηση του αέριου αναισθησίας.

Μετά όγκοι έφθασαν έναν όγκο ~ 300 mm

3, SOR-C27-Cy5.5 (100 μg) εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκά (ip) σε (SKOV-3) ξενομοσχεύματος ποντικών που φέρουν όγκο TRPV6-θετικά, και οπτικά απεικονίζεται σε πολλαπλά χρονικά διαστήματα (0.5, 1, 2, 4 και 24 ώρες) μετά την ένεση. Για τις μελέτες ανταγωνισμού, μη επισημασμένη πεπτίδιο SOR-C27 (10 mg) εγχύθηκε 10 λεπτά πριν από την ένεση του Cy5.5 ετικέτα SOR-C27 (100 μg). Στο τέλος της απεικόνισης, τα ζώα θυσιάστηκαν κάτω από αναισθησία με βαθιά ενδοκαρδιακή έγχυση χρησιμοποιώντας φυσιολογικό ορό. Τα όργανα και όγκου αποκόπηκαν και σαρώθηκαν

ex vivo

με το οπτικό σύστημα απεικόνισης.

φθορισμού επεξεργασία και ανάλυση εικόνας.

λογισμικό ανάλυσης ART Optix Optiview χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση του φθορισμού φθορά ρυθμό. Το λογισμικό de-περίπλοκη τη μετρούμενη φθορισμού καμπύλη εξασθένησης της έντασης-χρόνου χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Levenberg-Marquardt, η οποία εφαρμόζει μία μη γραμμική αλγόριθμος ελαχίστων τετραγώνων ελαχιστοποίησης για να υπολογίσει τους συντελεστές ενός πολυ-εκθετική επέκταση της φθοράς φθορισμού. Ένα δύο-εκθέτη εξάρτημα είναι χρησιμοποιείται και καιρό (τ

1) και μικρή (τ

2) συστατικά της ζωής του φθορισμού, μαζί με τη μέση σταθμισμένη αξία τους (τ

av), υπολογίστηκαν αυτόματα σύμφωνα με το ακόλουθη εξίσωση:

όπου A

1 αντιπροσωπεύει το πλάτος της πρώτης εκθετική φθορισμού και Α

2 είναι το πλάτος της δεύτερης εκθετικής φθορισμού

Μαγνητική τομογραφία μεθοδολογία απεικόνιση

Όλες οι μαγνητικές τομογραφίες πραγματοποιήθηκαν σε Magnex επιστημονική 3 Tesla κλινική κεφάλι MR scanner (Oxford, UK) εκ των υστέρων για την απεικόνιση μικρών ζώων, χρησιμοποιώντας ένα πηνίο κλίση Magnex επιστημονική (εσωτερική διάμετρο 21 cm? μέγιστη αντοχή λειτουργίας κλίση 200 mT /m) διασυνδεδεμένο με φασματόμετρο Varian Inc. Direct Drive (Palo Alto, CA). Ένα αναγνωριστικό 25 χιλιοστά »Litzcage» σπείρα τετραγωνισμού RF (Doty Επιστημονική, Columbia, SC), συντονισμένοι σε 128,8 MHz, χρησιμοποιήθηκε ως εκπομπής /λήψης πηνίο έντασης για την απεικόνιση.

In vivo

εικόνες λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα 3D true-FISP (/T1 σταθμισμένη Τ2) ακολουθία απεικόνισης. Επανάληψη του χρόνου (Τ

R), χρόνος ηχούς (Τ

E), άλλη γωνία και το εύρος ζώνης (BW) έχουν βελτιστοποιηθεί για την καλύτερη δυνατή ποιότητα εικόνας. Η σειρά αποτελείται από Τ

R /T

E = 8/4 ms, άλλη γωνία = 30 ° και BW = 50 kHz. Ένα οπτικό πεδίο (FOV) 38,4 × 25,5 × 25,5 με μήτρα διαστάσεων 256 × 170 × 170 χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση 150 μm

3 ισοτροπική εικόνες χωρική ανάλυση με μέσους 6 σήματος (-48 λεπτά ανά μαγνητική τομογραφία). Αυτό επέτρεψε FOV για ταυτόχρονη απεικόνιση του θέση όγκου, καθώς και βουβωνικοί και ιγνυακοί λεμφαδένες.

Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με μια δόση εφόδου 3% ισοφλουράνιο (σε 100% οξυγόνο) σε ένα θάλαμο επαγωγής, και μεταφέρθηκαν σε μια ολοκληρωμένη nosecone και RF έλκηθρο απεικόνισης πηνίο (που αναπτύχθηκε στο σπίτι) για να διατηρηθεί στο 1,5-2% ισοφλουράνιο για τη διάρκεια της μαγνητικής τομογραφίας. Ο αναπνευστικός ρυθμός και η εσωτερική θερμοκρασία του σώματος των ποντικών παρακολουθήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συμβατό σύστημα φυσιολογικές παρακολούθησης και περίφραξη (SA Instruments Inc, Stony Brook, NY) μαγνητική τομογραφία. Η εσωτερική θερμοκρασία του σώματος του ποντικού (που μετράται από του ορθού) διατηρήθηκε σε 37 ± 1 ° C μέσω του ελέγχου της θερμοκρασίας βρόχο ανάδρασης και το σύστημα θέρμανσης του αέρα.

Οι ποντικοί εγχύθηκαν με ~ 300 μι που αντιστοιχούν σε περίπου 24 mg Fe /kg σωματικού βάρους είτε κυστεΐνη μπλοκάρει χάντρες SPIO (CYS-SPIO? ελέγχου,

n = 9

) ή SOR-C27 συζευγμένα σφαιρίδια (SOR-C27-SPIO?

n = 9

) είτε ενδοφλέβια (iv) ή ip ένεση και απεικονίζεται στις 2 ώρες (ημέρα 0) και 26 ώρες (ημέρα 1) μετά την ένεση. σαρώσεις Baseline (ημέρα -1) κάθε ποντικού πραγματοποιήθηκαν επίσης πριν από ενέσεις για να είναι δυνατή η σωστή σύγκριση των όγκων και των λεμφαδένων μορφολογία και την αντίθεση πριν και μετά την ένεση. Μετά την MRI χρονική πορεία, τα ζώα θυσιάστηκαν και οι όγκοι αμέσως αποκόπηκαν για ιστολογική /βιοχημική ανάλυση.

μαγνητική τομογραφία Επεξεργασία Εικόνας.

Όλες οι εικόνες ήταν το πρώτο μηδενικό συμπληρώθηκε χρησιμοποιώντας ImageJ (ΝΙΗ), το λογισμικό . Οι εικόνες συν-νηολογημένα στην RView (Colin Studholme, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια) για κάθε ποντίκι. Μια ρουτίνα τμηματοποίησης όγκο ημι-αυτόματο υλοποιήθηκε μέσω της κατάτμησης σε RView να προσδιοριστεί με ακρίβεια τους όγκους των όγκων.

Αποτελέσματα

δομή NMR Λύση του SOR-C27

Πληροφορίες για SOR-C27 πεπτίδιο δευτερεύουσα δομή προήλθε εξετάζοντας H

α χημικές μετατοπίσεις κάτω από τρεις διαφορετικές συνθήκες, 10 mM φωσφορικό ρυθμιστικό νερό, δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS) και dodecylphosphocholine (DPC). Διαρθρωτικών υπολογισμούς χρησιμοποιώντας πυρηνικό αποτέλεσμα Overhauser (nOe) απόσταση υποστηρίγματα για 10 mM SOR-C27 σε ρυθμισμένο νερό, NaCl ή DPC (Εικ. 1Α) που δημιουργούνται συνολικά 40 δομές χαμηλότερης ενέργειας κάθε που δεν είχαν παραβιάσεις της NOESY περιορισμών & gt? 0,5 ​​A . Δεδομένου ότι κανένα τμήμα του πεπτιδίου θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως υιοθετώντας μια κανονική δομή, οι έλεγχοι των διαρθρωτικών επικύρωση δεν πραγματοποιήθηκαν. Ωστόσο, το SDS μικκύλια αλλαγές στο αμιδίου

1 χημικές μετατοπίσεις παρατηρήθηκαν για τα κατάλοιπα Lys15, Phe17, ίΕυ18, His19, Ser21, Val23, και Arg27 ενδεικτικό μιας διαρθρωτικής αλλαγής στο ανιονικά περιβάλλον. υπολογισμός δομή του SOR-C27 στα 100 mM SDS μικκύλια μέσω της εξ αποστάσεως περιορισμών nOe έδωσε δύο στροφές της α-έλικας (υπολείμματα 15-25) που ήταν συνεπής στο top 10 χαμηλότερες ενεργειακές δομές του 50 υπολογίζεται (Εικ. 1Β) .

Μια αντιπροσωπευτική δομή NMR διάλυμα 10 mM SOR-C27 σε 50 mM ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού καλίου, 200 mM NaCl ή 100 mM dodecylphosphocholine (Α). Μια αντιπροσωπευτική δομή NMR διάλυμα 2 mM SOR-C27 σε ανιονικά 100 mM νάτριο δωδεκυλοθειικό μικκύλια που δείχνει την επαγωγή της ελικοειδούς δομής από τα υπολείμματα 15 έως 25 (Β).

Η

Ηλεκτροφυσιολογίας του TRPV6 και SOR-C27 και SOR -C13

κύτταρα αγρίου τύπου ΗΕΚ-293 δεν εκφράζουν κανάλια TRPV6.

πειράματα Ηλεκτροφυσιολογίας διεξήχθησαν σε κύτταρα ΗΕΚ-293 επιμολυσμένα με κανάλια TRPV6. Πρώτον, για να αποκλείσει την παρουσία των καναλιών TRPV6 στα κύτταρα άγριου τύπου ΗΕΚ-293, ηχογραφήσεις ολόκληρου κυττάρου patch clamp με 50 ms ράμπα γραμμική τάση (-110 mV έως +90 mV) εφαρμόστηκε στην απουσία ή παρουσία της La

3+ ιόντα (10 μΜ). ιόντα λανθάνιο, τα οποία αναστέλλουν την τρέχουσα TRPV6, δεν είχε καμία επίδραση στις τρέχουσες εντάσεις που προκαλούνται από τη ράμπα (έλεγχος: 106 ± 27 pA? La

3+ ιόντα: 111 ± 13 pA,

n

= 3?

σ

& gt? 0,05? Εικ. 2). Ολόκληρο-κυττάρου καταγραφές patch clamp των κυττάρων ΗΕΚ-293 διαμολυνθέντα με TRPV6 /EGFP αποκτήθηκαν απουσία ή παρουσία La

3+ ιόντα (10 μΜ). ιόντα λανθανίου μείωσε τα πλάτη των ρευμάτων TRPV6 που προκαλείται από τις ράμπες κατά 82 ± 5% (έλεγχος: 1065 ± 450 ρΑ? La

3+ ιόντα: 224 ± 105 ρΑ?

n

= 3? Εικ . 2). Τα πλάτη των ρευμάτων που προκαλούνται από τη ράμπα σε αγρίου τύπου ΗΕΚ-293 (106 ± 27 ρΑ,

n

= 3) ήταν σημαντικά μικρότερες (

σ

= 0,002) από ό, τι σε ρεύματα TRPV6 /EGFP επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ-293 (1065 ± 450 ρΑ,

n

= 3).

Οι μετρηθείσες ρεύματα στα κύτταρα άγριου τύπου ΗΕΚ-293 είναι επαγωγικού άνευ υπερ-έκφραση των καναλιών TRPV6. Για TRPV6 /EGFP ΗΕΚ-293, η απουσία La

3+ ιόντα έδειξε ένα μεγάλο ρεύμα με το ρεύμα που μπλοκάρει αποτελεσματικά υπό την παρουσία La

3+ ιόντα. Επίδραση της La

3+ ιόντα (10 μΜ) επί ρεύματα προκαλείται από μία ράμπα 50 ms (κάτω) σε κύτταρα άγριου τύπου ΗΕΚ-293 και τα κύτταρα TRPV6 /EGFP ΗΕΚ-293.

Η

SOR -C13 και SOR-C27 μείωση του πλάτους των ρευμάτων TRPV6.

Παρόμοιες έρευνες διεξήχθησαν για να χαρακτηρίσει την επίδραση των αυξανόμενων συγκεντρώσεων των πεπτιδίων SOR-C13 και SOR-C27 στα κανάλια TRPV6. Με την παρουσία του 83,5 ηΜ, 417.5 ηΜ, 835 ηΜ και 25 μΜ SOR-C13 το πλάτος των ρευμάτων TRPV6 μειώθηκε κατά 18 ± 4,0% (

ρ

& lt? 0,05,

n

= 9), 22 ± 4% (

σ

& lt? 0,05,

n

= 9), 24 ± 4% (

σ

& lt? 0,05,

Σύκο.