Αφηρημένο

Η ανώμαλη γλυκοζυλίωση των βλεννών και άλλων εξωκυτταρικών πρωτεϊνών είναι ένα σημαντικό γεγονός στην καρκινογένεση και τις προκύπτουσες καρκίνου που σχετίζονται γλυκάνες έχουν προταθεί ως στόχοι στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Εκτιμήσαμε το ρόλο της Ο-συνδεδεμένης γλυκοζυλίωσης ΟαΙΝΑο στην πρόσληψη αντιγόνου, την επεξεργασία, και παρουσίαση MHC τάξης Ι και II μόρια. Η επίδραση της ΟαΙΝΑο Ο-γλυκοζυλίωσης παρακολουθούνταν με ένα σύστημα μοντέλο που βασίζεται σε οβαλβουμίνη (OVA) -MUC1 πεπτίδια σύντηξης (+/- γλυκοζυλίωση) φορτώθηκε σε δενδριτικά κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με IL-2 που εκκρίνουν OVA πεπτίδιο-ειδικά υβριδώματα Τ κυττάρων. Για να αξιολογηθεί η

in vivo

απόκριση σε ένα αντιγόνο όγκου συνδέονται με τον καρκίνο, Balb /c ή B6.Cg (CB) -TG (HLA-A /H2-D) 2Enge /J (HLA-A2 διαγονιδιακά) ποντικούς ανοσοποιήθηκαν με ένα μη-γλυκοζυλιωμένη ή ΟαΙΝΑο γλυκοζυλιωμένη MUC 1 πεπτίδιο προερχόμενο που ακολουθείται από σύγκριση του πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων, την απελευθέρωση ΙΡΝ-γ, και επαγωγή αντισωμάτων. ΟαΙΝΑο-γλυκοζυλίωσης προωθείται παρουσίαση των πεπτιδίων σύντηξης OVA-MUC1 με MHC κατηγορίας II μόρια και το αντιγόνο MUC 1 προκάλεσε ειδική παραγωγή Ab και τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων σε τόσο Balb /c και HLA-A2 διαγονιδιακά ποντίκια. Σε αντίθεση, ΟαΙΝΑο-γλυκοζυλίωσης ανέστειλε την παρουσίαση των πεπτιδίων σύντηξης OVA-MUC1 με MHC τάξης Ι και καταργούνται MUC1 ειδικές αποκρίσεις CD8 + Τ κυττάρων σε HLA-A2 διαγονιδιακά ποντίκια. Ως εκ τούτου, ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση του αντιγόνου MUC1 διευκολύνει την πρόσληψη, MHC κατηγορίας II, και η απόκριση αντισώματος, αλλά θα μπορούσε να εμποδίσει την παρουσίαση του αντιγόνου σε CD8 + Τ κύτταρα

Παράθεση:. Madsen CB, Petersen C, Lavrsen Κ, Harndahl Μ, Buus S , Clausen H, et al. (2012) Cancer Associated ανώμαλων πρωτεϊνών, Ο-γλυκοζυλίωση μπορεί να τροποποιήσει επεξεργασία του αντιγόνου και ανοσολογική απόκριση. PLoS ONE 7 (11): e50139. doi: 10.1371 /journal.pone.0050139

Επιμέλεια: Ισαάκ Yang, UCLA, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1η Μάη 2012? Αποδεκτές: 17 Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Νοεμ 2012

Copyright: © 2012 Madsen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Novo Nordisk, το Ιατρικό Ερευνητικό Συμβούλιο της Δανίας, το Ίδρυμα Καρκίνου της Δανίας Research, τα Agnes και Poul Ίδρυμα Friis, η δανική Cancer Society, το Πανεπιστήμιο της Κοπεγχάγης (πρόγραμμα αριστείας), ΕΕ-7ου ΠΠ, της Δανίας Οργανισμού για την Επιστήμη και Τεχνολογίας και Καινοτομίας (FTP). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

εμβόλια Καρκίνος υπόσχονται πολλά για την μακροχρόνια θεραπευτική αποτελεσματικότητα [1]. Τρέχουσες εμβόλια πειραματικό καρκίνο αποσκοπούν κυρίως να εκμαιεύσει κυτταρική ανοσία μέσω της επαγωγής ειδικών CD8 + Τ κυττάρων [2] – [5]. Ωστόσο, αυξανόμενες αποδείξεις καταδεικνύει την αξία των αντισωμάτων σε εκρίζωση όγκων [6], [7]. Κατά συνέπεια, υπάρχει ένα αυξανόμενο ενδιαφέρον για το σχεδιασμό εμβολίων που μπορούν να ενεργοποιήσουν τα κύτταρα τόσο CD4 + και CD8 + Τ και με τον τρόπο αυτό ταυτόχρονα προκαλούν χυμική και κυτταρική ανοσία καρκίνου του [8]. Altered πρωτεΐνες παρουσιάζονται σε καρκινικά κύτταρα είναι σημαντικά αντιγόνα όγκου, η οποία μπορεί να στοχεύεται με εμβόλια και θεραπευτικά αντισώματα. Οι περισσότερες πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας γλυκοζυλιωμένες, και κακοήθη μετασχηματισμό των κυττάρων είναι πάντα συνοδεύεται από μεταβολές της μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών [9]. Η ανώμαλη βλεννίνης τύπου Ο-γλυκοζυλίωσης αντιπροσωπεύει μια από τις πλέον άφθονες μεταμεταφραστικές καρκίνο που σχετίζεται αλλαγές δημιουργώντας ένα διαφορετικό σύνολο των μοριακών δομών που βρίσκονται στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων, αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα [9], [10]. Ως αποτέλεσμα, ο ειδικός πρότυπο του καρκίνου που σχετίζεται σύντομο γλυκάνης δομές για τον καρκίνο που σχετίζεται με πρωτεΐνες που παράγει νέα επιτόπια γλυκοπεπτιδίου που μπορούν να στοχεύονται από το ανοσοποιητικό σύστημα [11], [12].

Καρκίνος σχετίζεται γλυκανών επηρεάζουν τον καρκίνο ανοσία με διάφορους τρόπους. Οι παρεκκλίνουσα γλυκάνες είναι ανοσογόνες από μόνες τους, και κολοβωμένη Ο-γλυκάνες (Tn: ΟαΙΝΑο-S /T? STn: NeuAcα2,6GalNAc-S /T? Και Τ: Galβ1,3 ΟαΙΝΑο-S /T) αναγνωρίζονται ως παν-καρκίνωμα αντιγόνα με τα οποία κυκλοφορούν τα αντισώματα που βρέθηκαν σε αυξημένα επίπεδα σε ασθενείς με καρκίνο. Η ανώμαλη γλυκανών μπορεί επίσης να προκαλέσει νέα επιτόπια πρωτεϊνών προκαλώντας μεταβολή διαμόρφωσης ή με τη δημιουργία νέων O-γλυκοπεπτιδίου επίτοπους [13], [14]. Επιπλέον, ο καρκίνος σχετίζεται γλυκάνες μπορούν να περιληφθούν στο σχεδιασμό των ανοσογόνων επιτόπων που μπορεί να επάγει

in vivo

αντικαρκινικές ανοσοαποκρίσεις [15]. Μια σημαντική βάση για γλυκάνης που προκαλείται από την ασυλία είναι ότι παρεκκλίνουσα γλυκάνες μπορεί να δεσμεύσει λεκτίνη υποδοχείς. Για παράδειγμα, λεκτίνη πρόσδεσης μακροφάγων γαλακτόζη (MGL) -mediates πρόσληψη συγκεκριμένων O-γλυκοπρωτεϊνών σε δενδριτικά κύτταρα [10], [16]. Πράγματι, τα δενδριτικά κύτταρα είναι τα πλέον ισχυρά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα για εκκίνηση των αφελείς CD8 + και CD4 + Τ κύτταρα. Φέρνουν μια σειρά υποδοχέων υδατάνθρακα της οικογένειας λεκτίνης τύπου (που επισκοπείται στο [17]) και διαθέτουν μια μοναδική ικανότητα να διασταυρούμενης παρούσα εξωκυτταρικό αντιγόνων σε CD8 + Τ κύτταρα [18]. Η επιλεκτική πρόσληψη ΟαΙΝΑο γλυκοσυλιωμένη αντιγόνα (Tn-αντιγόνα) από την κοινή ανθρώπινη και ποντικού δενδριτικών κυττάρων (DC) λεκτίνη τύπου MGL, [19], [20] καθιστά δυνατή την επαγωγή αντισωμάτων καρκίνο συγκεκριμένες γλυκοπεπτιδικά σε ποντίκια και στον άνθρωπο μέσω της επαγωγής ενός κυττάρων CD4 + Th [11], [13], [14], [21]. Τέτοια Tn-γλυκοπεπτιδίου ειδικά αντισώματα διαμεσολαβούν κυτταροτοξικότητα εξαρτώμενη από αντίσωμα [11], [12], [22], [23], και η εμφάνιση ειδικών αντισωμάτων φυσικών γλυκοπεπτιδίου σε ασθενείς με καρκίνο προτείνεται να συνδέεται με αυξημένη επιβίωση [21]. Αντιθέτως, πολύ λίγα CD8 + Τ κύτταρα που στοχεύουν τους επιτόπους γλυκοπεπτιδίου αντιγόνων εξωκυτταρικής όγκου (π.χ. βλεννίνη 1 (MUC1)) έχουν περιγραφεί [24], [25].

Ο καρκίνος που σχετίζεται γλυκοπρωτεΐνη MUC 1 είναι ένα σημαντικό μοντέλο μορίου σε ανοσοθεραπεία καρκίνου και παρεκκλίνοντα γλυκοζυλιωμένη στα περισσότερα αδενοκαρκινώματα [26]. Η εξωκυτταρική περιοχή του MUC 1 αποτελείται από 20-120 διαδοχικές επαναλήψεις (VNTR), που καθεμία περιέχει 20 αμινοξέα με 5 πιθανές θέσεις Ο-γλυκοζυλίωσης [27]. Ανοσοποίηση B6.Cg (CB) -TG (HLA-A /H2-D) 2Enge /J (HLA-A2 διαγονιδιακά ποντίκια) [28] και οι χιμπατζήδες [29] με μη-γλυκοζυλιωμένη αντιγόνων MUC1 προκάλεσε ειδικές MUC1 πεπτίδιο CD4 + και οι αποκρίσεις CD8 + Τ κυττάρων και πολλών επιτόπων κυττάρων CD8 + Τ έχουν ταυτοποιηθεί εντός των εξωκυτταρικών και ενδοκυτταρικών περιοχών του MUC1 [28], [30] – [33]. Σε MUC1 διαγονιδιακά ποντίκια η ανταπόκριση σε εμβόλια μη γλυκοζυλιωμένη MUC 1 πεπτίδιο που βασίζεται, ωστόσο, ήταν πολύ χαμηλή, με μικρό ή μη ανιχνεύσιμο CD4 + και CD8 + αποκρίσεις κυττάρων Τ [34], [35]. Μη-γλυκοζυλιωμένη πεπτίδιο MUC1 συζευγμένο με ανοσογόνο γλυκοσύζευγμα μαννάνης προκάλεσε ισχυρές ανοσοαποκρίσεις συμπεριλαμβανομένης CD8 + Τ κύτταρα [31]. Στους ανθρώπους, τα μη-γλυκοζυλιωμένη εμβόλια πεπτιδίου MUC1 έχουν πρωτίστως προκλητών χυμική και CD4 + Τ κυτταρικές αποκρίσεις [36] – [38], ενώ ιογενείς και DC εμβολίων που βασίζονται επίσης δημιουργούνται κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκυττάρων (CTL) αποκρίσεις [39] – [44] . Η επαγωγή των CD8 + Τ κυττάρων παρατηρήθηκε μόνο σε λίγους ασθενείς ή μετά από αρκετούς γύρους επαναδιέγερση

in vitro

[39] – [44], ωστόσο, αρκετές από τα εμβόλια έχουν αποδείξει την αποτελεσματικότητα, αν και περιορισμένη [38 ] – [41], [44] – [57]. Δύο ιικά εμβόλια που εκφράζουν MUC 1, είτε σε συνδυασμό με IL-2 (TG4010) [41], [48] – [51] ή σε συνδυασμό με καρκινοεμβρυονικό αντιγόνο (PANVAC) [52], έχουν καταδείξει κλινική δράση σε ασθενείς με μη μικρών πνεύμονα και καρκίνο του παγκρέατος [39] – [41], [48] – [52]. Επιπλέον, η κλινική δράση έχει επίσης καταδειχθεί με το λιποσωματικό εμβόλιο (BLP25) που αποτελείται από ένα 25 μερές μη-γλυκοζυλιωμένη πεπτιδίου από την περιοχή διαδοχικών επαναλήψεων MUC1 [53] – [57]. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε μια μικρή κλινική μελέτη σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού πρώιμο στάδιο ανοσοποιηθεί με μαννάνη-MUC1, το εμβόλιο που προκαλείται από τις δύο χυμική και Τ-κυττάρων αποκρίσεις σε μη-γλυκοζυλιωμένη MUC 1 και εξαλείφεται υποτροπή της νόσου [45].

Πιο προηγούμενα εμβόλια έχουν στοχεύσει μη γλυκοζυλιωμένη MUC 1, αν και αυτό μπορεί να μην είναι η πιο συγκεκριμένος στόχος του καρκίνου. Στόχευση του καρκίνου που σχετίζονται επιτόπων γλυκοπεπτιδίων στην MUC1, όπως ΟαΙΝΑο-MUC1 [11], [12], [58] θα είναι ευνοϊκές, αλλά βιοσύνθεση των MUC1 επιτόπων γλυκοπεπτιδίου που εκφράζονται από όγκους έχει παρεμποδιστεί από την έλλειψη των σχετικών τεχνολογιών και το υψηλό κόστος. Έτσι, προσωρινά δεν είναι σαφές πώς γλυκάνες θα επηρεάσει την πρόσληψη, την παρουσίαση, την αναγνώριση, και διέγερση ανοσοαποκρίσεων σε επιτόπους CD8 + Τ κυττάρων. Παρά το γεγονός ότι η παρουσία του γλυκάνες μπορεί να έχει θετική επίδραση στην πρόσληψη της γλυκοζυλιωμένης αντιγόνων [19], [20], [59], γλυκάνες θα μπορούσε να θέσει σε κίνδυνο την έναρξη της ανοσο-πρωτεασώματος [60], η διάσπαση του πρωτεασώματος, ΤΑΠ-μεσολάβηση μετατόπιση, και φόρτωσης πεπτιδίου επί μορίων κατηγορίας Ι MHC [60], [61].

στην παρούσα μελέτη έχουμε εξετάσει την συνέπεια της MUC1 ΟαΙΝΑο-γλυκοζυλίωσης σε γνωστά αντιγόνα CD8 + και CD4 + Τ κυττάρων ενεργοποίησης. Πήραμε πλεονέκτημα του συστήματος μοντέλου οβαλβουμίνη με τη χρήση πεπτιδίων σύντηξης OVA-MUC1 περιέχει το ανοσοκυρίαρχο MHC τάξης Ι (SIINFEKL) και MHC τάξης II (ISQAVHAAHAEINEAGR) επιτόπων OVA ως ένδειξη για πρόσληψη και επεξεργασία αντιγόνου. Οι επίτοποι που πλαισιώνεται από ΟαΙΝΑο γλυκοζυλιωμένη ή μη γλυκοζυλιωμένη MUC 1 που προέρχεται πεπτιδικές αλληλουχίες. Επιπλέον, εξετάσαμε την επίδραση της ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωσης ενός φυσιολογικού όγκου γλυκοπεπτίδιο συνδέεται MUC1 είναι γνωστό ότι επάγουν CD4 + και CD8 + αποκρίσεις κυττάρων Τ. Αυτό το πεπτίδιο (AHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNV) έχει στενή ομολογία αλληλουχίας με την διαδοχική επανάληψη του MUC1, αλλά περιέχει έναν επίτοπο HLA-A2 απουσιάζει από την διαδοχική επανάληψη. Σας παρουσιάζουμε τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ΟαΙΝΑο κατάλοιπα πρόσληψη αντιγόνου βοήθεια και MHC κατηγορίας II για την δημιουργία ενός ισχυρού απόκριση αντισωμάτων ειδική για τον καρκίνο, και η παρουσίαση μπλοκ σε CD8 + Τ κύτταρα.

Αποτελέσματα

GalNAc- γλυκοζυλίωσης Βελτιώνει αποκρίσεις CD4 + Τ κυττάρων

Ερευνήσαμε πρώτα το ρόλο της ΟαΙΝΑο-γλυκοζυλίωσης στην επεξεργασία αντιγόνου πεπτιδίου και παρουσίαση πεπτιδίου επί II μόρια (Εικόνα 1) MHC τάξης. Η ισχυρή Ι-Α

b δέσμευσης ΟνΑ πεπτίδιο συντηγμένο με αλληλουχία η προερχόμενη MUC1 με και χωρίς ΟαΙΝΑο-γλυκοζυλίωσης (Πίνακας 1) και φορτώθηκε σε δενδριτικά κύτταρα τα οποία είχαν συν-καλλιεργήθηκαν με ωοαλβουμίνη πεπτιδίου /MHC κατηγορίας II συμπλόκου ειδικά υβριδώματα Τ κυττάρων. DCs φορτώθηκαν με γλυκοπεπτίδια αύξησε την ΟνΑ ειδική απόκριση των κυττάρων υβριδιώματος CD4 + Τ στο πεπτίδιο που προέρχεται από OVA σε σύγκριση με μη-γλυκοζυλιωμένη πεπτιδίου, ανεξάρτητα από το πού το επιτόπιο ΟνΑ βρισκόταν στην πεπτιδική αλληλουχία (Σχήμα 1Β). Πεπτίδια που περιέχουν τέσσερα ΟαΙΝΑο-υπολείμματα που προκαλείται από μια υψηλότερη απόκριση από αυτές των πεπτιδίων που περιέχουν δύο υπόλοιπα ΟαΙΝΑο [62], [63] (Εικόνα 1Β). Ακόμη και πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις (30 ηΜ) γλυκοπεπτιδίων τόνωσε την υβρίδωμα CD4 + Τ κυττάρων, ενώ χαμηλές συγκεντρώσεις της μη γλυκοζυλιωμένη πεπτίδιο που προκαλείται καμία απόκριση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α) Ο-γλυκάνης επισκόπηση σύνθεσης. Β) παραγωγή IL-2 από OVA ειδικών υβριδώματος CD4 + Τ κυττάρων (BO.97.10) συν-καλλιεργήθηκαν με το μυελό των οστών προερχόμενα DCs πάλλονται με δύο παραλλαγές του πεπτιδίου με και χωρίς 2 και 4 γλυκάνης υπολείμματα (ΟαΙΝΑο). μήκος OVA Πλήρης χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Ατομικά καλλιεργημένα κύτταρα Τ και δενδριτικά κύτταρα είχαν μία τιμή OD ίσο με το φόντο.

Η

ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση Αναστέλλει την επεξεργασία και παρουσίαση ενός MHC Τάξης Ι πεπτίδιο σύνδεσης

in vitro

το ίδιο σύστημα μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για να διερευνηθεί η επίδραση της ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωσης σε MHC κατηγορίας Ι.

In vitro

δημιουργούνται, καθώς και καθαρίστηκε CD11c + σπλήνα DCs φορτώθηκαν με ΟαΙΝΑο γλυκοζυλιωμένα ή μη γλυκοζυλιωμένα πεπτίδια σύντηξης MUC1-SIINFEKL (Πίνακας 1). Σε αντίθεση με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με MHC παρουσίαση τάξης II, ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση MUC1-SIINFEKL είχε ως αποτέλεσμα χαμηλότερες ενεργοποίηση SIINFEKL /H2-K

b ειδικά υβριδώματα Τ κυττάρων σε σύγκριση με μη-γλυκοζυλιωμένα πεπτίδια, ανεξάρτητα από την προέλευση των DCs (Σχήμα 2Α-Β). Στη συνέχεια εξετάσαμε το πώς η τοποθεσία των υπολειμμάτων γλυκάνης σε σχέση με το MHC τάξης Ι δέσμευσης επιτόπου επηρέασε την απόκριση CD8 + Τ κυττάρων. DCs διεγέρθηκαν χρησιμοποιώντας πεπτίδια σύντηξης με SIINFEKL είτε πλευρίζεται από θέσεις γλυκοζυλίωσης ή εντοπισμένη στο Ο-τερματικό άκρο του πεπτιδίου. πεπτίδια σύντηξης με τερματικό SIINFEKL επέδειξε αυξημένη απόκριση κυττάρων υβριδώματος Τ σε σύγκριση με πεπτίδιο σύντηξης με SIINFEKL εντοπισμένο μέσα στο επανάληψη MUC 1 ανεξάρτητα από το εάν τα πεπτίδια γλυκοζυλιωμένη ή όχι. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του δΙΙΝΡΕΚΙ /H2-K

β συγκρότημα ΑΧ μετά την επεξεργασία του πεπτιδίου επιβεβαιώθηκε χαμηλότερη MHC τάξης Ι παρουσίαση των ΟαΙΝΑο-γλυκοζυλιωμένη πεπτιδίων σε σύγκριση με μη-γλυκοζυλιωμένη πεπτίδια (Σχήμα 2C-Ε).

παραγωγή IL-2 από OVA ειδικών υβρίδωμα CD8 + Τ κυττάρων (RF 33,70) συν-καλλιεργήθηκαν με το μυελό των οστών που προέρχεται DCs (Α) ή CD11c + DCs καθαρίζεται από σπλήνα ποντικού (Β). DCs σημάνθηκαν με δύο παραλλαγές του πεπτιδίου με και χωρίς 2 και 4 γλυκάνης υπολείμματα (ΟαΙΝΑο). Πλήρους μήκους OVA χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Ατομικά καλλιεργημένα κύτταρα Τ και δενδριτικά κύτταρα είχαν μία τιμή OD ίσο με το παρασκήνιο. C, D) Η επιφανειακή έκφραση με κυτταρομετρία ροής του SIINFEKL στο πεπτίδιο H2Kb αύλακα σύνδεσης επί DCs μετά πάλλεται με τις δύο παραλλαγές του πεπτιδίου (μη-γλυκοζυλιωμένη πεπτίδιο (λεπτή μοβ διακεκομμένη γραμμή), πεπτίδιο με 2 GalNAcs (παχιά πράσινη γραμμή) ή 4 GalNAcs (ροζ γραμμή)). Ε) Η επιφανειακή έκφραση της δΙΙΝΡΕΚΙ στο αυλάκι δέσμευσης H2Kb πεπτίδιο σε δενδριτικά κύτταρα, χωρίς να πάλλεται (μπλε γραμμή) και μετά από πάλλεται με τον έλεγχο OVA (μωβ γραμμή). Γκρι ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν κύτταρα χρωματίζονται μόνο με το δευτερογενές αντίσωμα.

Η

ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση ενός MUC Προέρχεται αντιγόνο προκαλεί ειδικές IgG αντισώματα και Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό

in vivo

Η

Η αμινοξέων αλληλουχίας αμινοξέων του 24 μερούς πεπτιδίου συνθετικές MUC 1 (degMUC1) μοιάζει με το MUC 1 διαδοχική επανάληψη, ωστόσο, αλληλουχία αμινοξέων του είναι ελαφρώς αλλαγμένη καταλήγοντας σε ένα επίτοπο HLA-A2 (ALGSTAPPV) [28]. DegMUC1 εκ τούτου, είναι η βέλτιστη για συμπερίληψη σε εμβόλια ανθρώπινο καρκίνο με σκοπό την επαγωγή MUC1 ειδικές αποκρίσεις CTL. Για να ερευνηθεί ο ρόλος της γλυκοζυλίωσης ΟαΙΝΑο

in vivo

για αυτό το μοντέλο MUC 1 αντιγόνο όγκου, έχουμε ανοσοποιημένα ποντίκια Balb /c και HLA-A2 διαγονιδιακά ποντίκια με degMUC1 με και χωρίς ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση. Balb /c ποντικοί ανοσοποιήθηκαν με ΟαΙΝΑο-γλυκοζυλιωμένη degMUC1 αναπτύξει μια ισχυρή IgG απόκριση ειδική για degMUC1, ενώ δεν υπήρχε απόκριση σε ποντικούς ανοσοποιημένους με το μη-γλυκοζυλιωμένη degMUC1 (Σχήμα 3Α). Οι ανοσοποιήσεις με ΚΕΗ-συζευγμένα γλυκοζυλιωμένη και μη γλυκοζυλιωμένη degMUC1 οδήγησε σε IgG απόκριση σε αμφότερα τα στελέχη ποντικού, αν και η γλυκοζυλιωμένη παραλλαγή είχε ως αποτέλεσμα μια πιο εμφανή απόκριση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε συμφωνία με την χυμική απόκριση IgG, Balb /c ποντίκια ανοσοποιημένα με ΟαΙΝΑο degMUC1 προκάλεσε σημαντικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ μετά την εκ νέου διέγερση είτε με ΟαΙΝΑο ή μη γλυκοζυλιωμένη degMUC1 (P≤0,0004). Αριθ Τ κυττάρου πολλαπλασιασμός ανιχνεύθηκε σε ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν με μη-γλυκοζυλιωμένη degMUC1 (Σχήμα 3Β). Παρόμοια, μια υψηλότερη πολλαπλασιαστική απόκριση παρατηρήθηκε σε HLA-A2 διαγονιδιακά ποντίκια ανοσοποιούνται με γλυκοζυλιωμένη συγκριτικά με μη γλυκοσυλιωμένη degMUC1 επαλήθευση τη θετική επίδραση της ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωσης από την αντιδραστικότητα των CD4 + Τ κυττάρων και χυμική ανοσολογική απόκριση (Σχήμα 3C). Ως παράγωγο φυματίνης ελέγχου καθαρισμένη πρωτεΐνη (PPD) διέγερση είχε ως αποτέλεσμα σε παρόμοιες πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων σε αμφότερες τις ομάδες του HLA-A2 διαγονιδιακά ποντίκια.

Α) στον ορό αντιδραστικότητα προς διαφορετικά βλεννίνη γλυκομορφές από ποντικούς Balb /c ανοσοποιημένους με degMUC1 + /- ΟαΙΝΑο με ELISA. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά μιας τουλάχιστον 4 ποντικούς Balb /c ανοσοποιημένους με κάθε αντιγόνο. (Β) του πολλαπλασιασμού των κυττάρων Τ από ποντικούς Balb /c ποντικούς ή (C) ποντικοί HLA-A2 ανοσοποιηθεί με ΟαΙΝΑο degMUC1 (λευκές ράβδοι) και μη γλυκοζυλιωμένη degMUC1 (γκρι ράβδοι) για κάθε πεπτίδιο που χρησιμοποιείται για

in vitro

επαναδιέγερση (100 μg /ml) όπως υποδεικνύεται στον χ-άξονα. Δ) Τα λεμφοκύτταρα από ανοσοποιημένους ποντικούς HLA-A2 παλλόμενα με το πεπτίδιο degMUC1 9 μερές, ALGSTAPPV, με και χωρίς γλυκοζυλίωση. DegMUC1 ειδικών CD8 + Τ κύτταρα επιλέχθηκαν με βάση την αντι-CD8 Ab (χ-άξονας) και αντι-ΙΡΝγ Ab (άξονας γ) μετά από 4 ώρες θεραπείας stop Golgi. Ε) Τα κύτταρα σπλήνας μετά από 24 ημέρες από την εκ νέου διέγερση με το μη γλυκοζυλιωμένη πεπτιδική ALGSTAPPV. Όλα τα δεδομένα των Τ κυττάρων δημιουργείται από σπλήνα ή λεμφαδένες από τουλάχιστον 4 ποντίκια, αλλά στις περισσότερες περιπτώσεις 6 ποντικούς.

Η

ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωσης ενός MUC1 Προέρχεται Block Antigen ο Τ κυττάρων CD8 + Response

σε vivo

η

Στη συνέχεια εξετάσαμε την απόκριση CD8 + Τ κυττάρων μετά την ανοσοποίηση του HLA-A2 διαγονιδιακά ποντίκια με degMUC1 (+/- ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση) που ακολουθείται από επανα-διέγερση με το degMUC1 9 μερές CD8 + επίτοπο ALGSTAPPV (+ /- ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση). Μόνο τα ποντίκια που είχαν ανοσοποιηθεί και επαναδιεγείρονται με την μη γλυκοζυλιωμένη πεπτιδική degMUC1 δημιουργείται ΙΡΝ-γ που παράγουν, ALGSTAPPV ειδικών, CD8 + Τ κύτταρα, ενώ δεν παρατηρήθηκε απόκριση σε ποντικούς ανοσοποιημένους με το ΟαΙΝΑο γλυκοζυλιωμένη degMUC1 (Σχήμα 3D). Τ κύτταρα από ανοσοποιημένους ποντικούς επεκτάθηκαν με την εκ νέου διέγερση

in vitro

για συνολικά 24 ημέρες, με ALGSTAPPV επιβεβαιώνοντας ότι μόνο οι ποντικοί που ανοσοποιήθηκαν με τα μη-γλυκοζυλιωμένη degMUC1 ανταποκρίθηκαν στην εκ νέου διέγερση με ALGSTAPPV (Σχήμα 3Ε) . Στη συνέχεια, αναλύσαμε σταθερότητα και συγγένεια του HLA-A * σύμπλεγμα 2:01-ALGSTAPPV με και χωρίς ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση. Το HLA-A * 2:01-ALGSTAPPV σύμπλοκο είχε χρόνο ημίσειας ζωής 19 ώρες και μια συγγένεια 100 ηΜ, ενώ η HLA-Α * 0201-ALGST [ΟαΙΝΑο] συγκρότημα APPV είχε έναν χρόνο ημιζωής 11 ώρες με ένα συγγένεια 300 ηΜ. Έτσι, ALGST [ΟαΙΝΑο] APPV εξακολουθεί να είναι ένα στερεό ενδιάμεσο συνδετικό και θα πρέπει να είναι σε θέση να αποσπάσει μια απόκριση CD8 + Τ κυττάρων με βάση τα δεδομένα πρόσδεσης MHC.

High Density ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση αυξάνει την πρόσληψη της MUC1 και MUC2 πεπτίδια προερχόμενα αλλά αναστέλλει MHC κατηγορίας Ι παρουσίασης

Πυκνότητα γλυκοζυλίωσης μπορεί να επηρεάσει την πρόσληψη που προκαλείται από λεκτίνης υποδοχείς, όπως MGL. Ως εκ τούτου, εικάζεται ότι η έλλειψη των αποκρίσεων CD8 + Τ κυττάρων έναντι πεπτιδίων ΟαΙΝΑο degMUC1 θα μπορούσε να προκληθεί από χαμηλή πρόσληψη των κοντών ΟαΙΝΑο τροποποιημένα πεπτίδια MUC1. Παρά το γεγονός ότι, ένας περιορισμένος αριθμός υπολειμμάτων ΟαΙΝΑο είναι αρκετά για να επάγουν ισχυρή απόκριση Ι-Ab, μπορεί να είναι ανεπαρκής για την εγκάρσια παρουσίαση που απαιτείται για να προκαλέσει μια H-2K

b απόκριση. Για να δοκιμαστεί η επίδραση της πυκνότητας ΟαΙΝΑο που πάλλονται ΑΧ με ΟαΙΝΑο-γλυκοζυλιωμένη βιοτινυλιωμένο 60 merMUC1-πεπτίδιο που καλύπτει τρεις διαδοχικές επαναλήψεις MUC1 (60 merMUC1). Ενώ ΟαΙΝΑο ενσωμάτωση δεν αύξησε την πρόσληψη της μορφής μονομερούς 60 merMUC1, αυξημένη πρόσληψη παρατηρήθηκε όταν σχηματισμού συμπλόκου προκλήθηκε με στρεπταβιδίνη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια, εξετάσαμε την πρόσληψη φθορίζοντα σφαιρίδια επικαλυμμένα με MUC1 με και χωρίς γλυκοζυλίωση. Σφαιρίδια επικαλυμμένα με ΟαΙΝΑο MUC1, τα οποία παρέχουν μια πολύ υψηλή πυκνότητα ΟαΙΝΑο MUC1, είχε ως αποτέλεσμα μια αξιοσημείωτη αύξηση στην πρόσληψη σε σύγκριση με μη-γλυκοζυλιωμένη MUC 1 (Σχήμα 4Α). Η επίδραση των πολλαπλών υπολειμμάτων ΟαΙΝΑο στην πρόσληψη DC μας ώθησε να εξετάσουμε εάν τα συνθετικά πεπτίδια που περιέχουν πολλαπλά υπολείμματα ΟαΙΝΑο θα μπορούσε να ξεπεράσει την έλλειψη διασταυρούμενης παρουσίαση των επιτόπων κυττάρων CD8 + Τ παρατηρήθηκε με τα μικρότερα πεπτίδια MUC1. Ένα πεπτίδιο σύντηξης MUC2 περιέχουν πολλαπλές θέσεις γλυκοζυλιώσεις ΟαΙΝΑο σχεδιάστηκε και

in vitro

γλυκοζυλιωμένη για να παραχθεί ένα πεπτίδιο με και χωρίς 9-10 υπολείμματα ΟαΙΝΑο εντοπισμένη στην αλληλουχία MUC2. Το πεπτίδιο σύντηξης ΟαΙΝΑο MUC2 έγινε εύκολα παραλαμβάνεται από το DCS (Σχήμα 4Β). Ωστόσο, ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση ακόμη ανέστειλαν την επιφανειακή έκφραση του SIINFEKL /H2-K

συμπλέγματα β και ενεργοποίηση των κυττάρων υβριδώματος Τ ήταν χαμηλότερη (Σχήμα 4C-D). Απεικόνιση εσωτερικεύεται πεπτίδιο σύντηξης MUC2 με και χωρίς ΟαΙΝΑο επιβεβαίωσε αυξημένη πρόσληψη του ΟαΙΝΑο γλυκοζυλιωμένη πεπτιδίου με το DCS (Σχήμα 4Ε-F). Το πεπτίδιο ΟαΙΝΑο MUC2 κυρίως συν-εντοπισμένη με δείκτη λυσοσωματικές LAMP-2, ενώ τα μη-γλυκοζυλιωμένη πεπτίδιο σύντηξης MUC2 κυρίως συν-εντοπισμένη με πρώιμη ενδοσωμική δείκτη ΕΟΧ-1 (Σχήμα 4Ε-F, Εικόνα S1). Εν κατακλείδι, ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση αυξάνει την πρόσληψη, αλλά παρεμποδίζει την επεξεργασία των δύο πεπτιδίων σύντηξης που περιέχει Ι επίτοπους δέσμευσης MHC τάξης.

Α) πρόσληψη DC των μη επικαλυμμένων σφαιριδίων φθορισμού, χάντρες MUC1-φθορίζοντα, ή φθορίζοντα σφαιρίδια ΟαΙΝΑο MUC1. DCs χωρίς σφαιρίδια χρησιμοποιήθηκαν ως αναφορά. Β) Η πρόσληψη του πεπτιδίου σύντηξης MUC2 +/- ΟαΙΝΑο αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από 48 ώρες πεπτιδίου πάλλεται. Μη προετοιμασμένο ΑΧ (μοβ συμπληρώθηκε) και ΑΧ χωρίς φορτίο πεπτίδιο (πράσινο) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρας φόντο. Γ) Αξιολόγηση της έκφρασης επιφανείας με κυτταρομετρία ροής του SIINFEKL στην αύλακα δέσμευσης H2Kb πεπτιδίου. DCs σημάνθηκαν με το πεπτίδιο σύντηξης MUC2 (υψηλότερη συγκέντρωση από D) με ΟαΙΝΑο (πράσινη γραμμή) και χωρίς ΟαΙΝΑο (μοβ συμπληρωμένο) 48 ώρες πριν από τη χρώση. Δ) παραγωγή IL-2 από SIINFEKL συγκεκριμένες υβρίδωμα CD8 + Τ κυττάρων (RF 33,70) συν-καλλιεργήθηκαν με προερχόμενο DCs μυελού των οστών παλμικά

in vitro

για δύο ημέρες με το πεπτίδιο MUC2 σύντηξη με και χωρίς γλυκοζυλίωση σε μία κλίση συγκέντρωσης . Πλήρους μήκους OVA χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα από δύο τουλάχιστον ανεξάρτητα πειράματα. E, F) Ομοεστιακή απεικόνιση της DC εσωτερικεύεται ΟαΙΝΑο MUC2 σύντηξης (Ε, πράσινο) και MUC2 σύντηξης (F, πράσινο) συν-χρώση με δείκτη ενδοσωματιακή ΕΟΧ-1 (κόκκινο) και LAMP-2 δείκτη λυσοσωμική (κόκκινο).

Συζήτηση

Ο καρκίνος που σχετίζεται παρεκκλίνουσα γλυκάνες αποτελούν ισχυρά αντιγόνα του όγκου [11], [12]. Χρησιμοποιώντας MUC1 και ωολευκωματίνη ως μόρια μοντέλο παρουσιάζουμε στοιχεία που υποδηλώνει ότι ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση αυξάνει την πρόσληψη αντιγόνου, MHC κατηγορίας II παρουσίαση, και την ενεργοποίηση των CD4 + Τ κυττάρων επάγει ισχυρές αποκρίσεις αντισωμάτων. Σε αντίθεση, ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση μπορεί να αναστείλουν αντιγόνο MHC τάξης Ι παρουσίαση και ενεργοποίηση ειδικών αντιγόνου CD8 + Τ κυττάρων.

Είναι σαφές ότι ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση ενισχύει αποκρίσεις αντισωμάτων και πολλαπλασιασμό Τ-κυττάρων μετά από ανοσοποίηση με ένα ΟαΙΝΑο τροποποιημένο MUC1 πεπτίδιο ( degMUC1) (Σχήμα 3Α). Μια εξήγηση για αυτό το επάγεται ΟαΙΝΑο απόκριση αντισώματος

in vivo

είναι πιθανό να είναι η αύξηση στην παρουσίαση αντιγόνου, και μετά την διέγερση των Τ-κυττάρων που παρατηρείται κατά ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωσης των degMUC1 μοντέλο πεπτιδίου που περιέχει ένα ωαρίων που προέρχονται IA

b δεσμευτικό πεπτίδιο (Σχήμα 1). Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενο εύρημα μας από ισχυρές IgG αποκρίσεις σε ΟαΙΝΑο MUC1 σε ανθρώπινο MUC 1 διαγονιδιακά ποντίκια [11], [12] και τους ασθενείς με καρκίνο [13], [14]. Επιπλέον, είναι συνεπής με βελτιωμένες αποκρίσεις CD4 + Τ κυττάρων σε ΟνΑ συζευγμένο σε υπολείμματα ΟαΙΝΑο σε άλλες μελέτες [59]. Η ικανότητα των ΟαΙΝΑο να σπάσει ανοσολογικής ανοχής και για να βοηθήσει την παραγωγή ενός CD4 + Τ κυττάρων που εξαρτάται χυμική ανοσολογική απόκριση έχει ιδιαίτερη σημασία στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου με σκοπό την παραγωγή αντισωμάτων IgG. Επιπλέον, η ειδική επαγωγή των CD4 + Τ κυττάρων έχει προταθεί ότι οδηγεί σε εξάλειψη του όγκου με αντιδράσεων υπερευαισθησίας καθυστερημένου τύπου [64] και πρόσφατα ασθενείς με καρκίνο έχουν θεραπευτεί μετά υιοθετούμενη μεταφορά των CD4 + Τ κυττάρων με την αντιδραστικότητα του όγκου [65].

Το ανοσοκυρίαρχο H2-K

b σύνδεσης πεπτιδίου SIINFEKL, που προέρχεται από ΟνΑ, χρησιμοποιήθηκε ως ένδειξη για παρουσίαση με MHC τάξης Ι. Εδώ, ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση των συνοδευτικών πεπτιδίου MUC 1 ανέστειλε MHC τάξης Ι παρουσίαση του SIINFEKL επί DCs, καθώς και την ενεργοποίηση των ειδικών κυττάρων CD8 + T (Σχήμα 2). Σύμφωνα με τα ευρήματα αυτά, αναστέλλεται ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση επαγωγή αποκρίσεων CD8 + Τ κυττάρων

in vivo

μετά την ανοσοποίηση του HLA-A2 διαγονιδιακά ποντίκια με ένα πεπτίδιο ΟαΙΝΑο γλυκοζυλιωμένη degMUC1 περιέχει το * 02:01 δέσμευσης επιτόπου HLA-A (ALGSTAPPV ) σε σύγκριση με τη μη-γλυκοζυλιωμένη παραλλαγή (Σχήμα 3D-E). Αυτό θα μπορούσε εν μέρει να εξηγηθεί από τη μειωμένη σταθερότητα του HLA-A * σύμπλεγμα 2:01-ALGSTAPPV όταν το πεπτίδιο είναι ΟαΙΝΑο-γλυκοζυλιωμένη. Ωστόσο, αν και HLA-A * 2:01 συγγένεια δέσμευσης και η σταθερότητα της ΟαΙΝΑο γλυκοζυλιωμένη πεπτιδίου είναι ελαφρώς μειωμένη ακόμη φαίνεται να δεσμεύει σε ένα επίπεδο που είναι επαρκές για ανοσογονικότητα. Έτσι, οι παρατηρήσεις μας προτείνουν εναλλακτικές εξηγήσεις. Μια πιθανότητα είναι ότι τα γλυκοπεπτίδια μεταβάλλουν την ενεργοποίηση DC, αλλάζοντας έτσι την ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων. Για την υποστήριξη αυτής έχει δειχθεί ότι η επιλεκτική γλυκομορφές MUC1 επάγουν ανοχή Τ κυττάρου [66]. Ωστόσο, η ανασταλτική επίδραση πιθανότατα λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας από το λιγότερο πεπτιδίου /ΜΗΟ φτάσει στην επιφάνεια των ΑΧ. Έτσι, η επίδραση της ΟαΙΝΑο στην CD8 + Τ κυτταρική απόκριση θα μπορούσε να οφείλεται στην αναστολή της διάσπασης του πρωτεασώματος. Αυτή η εξήγηση έχει επίσης επιβεβαιωθεί από βιοχημικές μελέτες της διάσπασης του MUC 1 πεπτίδια που προέρχονται από ένζυμα καθαρίστηκαν immunoproteosomal [60]. Σε αυτή τη μελέτη, γλυκοζυλίωση τόσο στο -VTS- και -GST- θέσεις στην διαδοχική επανάληψη αλληλουχία MUC 1 (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG) είχε σαν αποτέλεσμα συνολικό μπλοκ επεξεργασίας αντιγόνου, ενώ ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωσης σε μία μόνο από αυτές τις θέσεις ανέστειλε επεξεργασία αντιγόνου. Αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει τη μερική παρουσίαση μας του επιτόπου CD8 +, SIINFEKL, όταν μόνο δύο GalNAcs ήταν παρόντα στο πεπτίδιο σύντηξης SIINFEKL-MUC1, ενώ γλυκοζυλίωσης με τέσσερα GalNAcs ανά επανάληψη οδηγήσει σε σχεδόν πλήρη μπλοκ παρουσίασης. Σε συμφωνία με μας

in vitro

ευρήματα, έχει αποδειχθεί ότι η λειτουργία κυττάρων CD8 + Τ συσχετίζεται αντίστροφα με την έκταση της γλυκοζυλίωσης της πρωτεΐνης MUC1 χρησιμοποιείται για αστάρωμα των CD8 + Τ κυττάρων [67]. Αυτό ενισχύει την άποψη ότι η γλυκοζυλίωση μπορεί να αντιπροσωπεύουν ένα πρόβλημα σε επαγωγή CD8 + Τ κυττάρων.

Η αυξημένη πρόσληψη αντιγόνου από APCs έχει μεγάλη σημασία για τον προσδιορισμό αποκρίσεων Τ κυττάρου [19], [20]. Έχει αποδειχθεί ότι ΟαΙΝΑο MUC1 επικαλύπτει τα φθορίζοντα μικροσφαιρίδια εσωτερικεύονται από τα ανθρώπινα δενδριτικά κύτταρα μέσω της σύνδεσης προς μακροφάγων γαλακτόζη λεκτίνη τύπου C-τύπου (MGL) και παραδίδονται σε HLA τάξη 1 και 2 διαμερισμάτων μέσα στο DC [19], [20] . Έχει επίσης δειχθεί ότι ΟαΙΝΑο συζευγμένο OVA πρωτεϊνικούς στόχους MGL και παρέχει καλύτερη πρόσληψη και την απόκριση των κυττάρων CD8 + Τ [59]. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τα ευρήματα μας με μικρά πεπτιδικά αντιγόνα. Η πυκνότητα γλυκοζυλίωση μπορεί να εν μέρει να εξηγήσει αυτό. Από τα αποτελέσματά μας είναι σαφές ότι πυκνά γλυκοζυλιωμένη 60 mer MUC1 σε σύμπλοκο με στρεπταβιδίνη και επιστρώνεται πάνω μικροσφαιρίδια που επάγεται σημαντικά αυξημένη πρόσληψη (Σχήμα 4Α). Προκειμένου να ελεγχθεί εάν εισαγωγή πολλαπλών υπολειμμάτων ΟαΙΝΑο αυξημένη ενεργοποίηση CD8 + Τ κυττάρων, δημιουργήσαμε ένα πυκνά γλυκοσυλιωμένο πεπτίδιο σύντηξης MUC2 με ένα διασπώμενο συνδέτη μεταξύ των δύο πεπτιδικών στοιχείων [68], [69]. MUC2 επιλέχθηκε επειδή έχει πολλαπλές θέσεις γλυκοζυλίωσης με πολύ μεγαλύτερη πυκνότητα από MUC 1 με αποτέλεσμα ένα πεπτίδιο με πάνω από δύο φορές τόσο πολλά υπολείμματα ΟαΙΝΑο στην ακολουθία 25 αμινοξέων. Όπως ήταν αναμενόμενο, ΟαΙΝΑο MUC2 σύντηξη παρελήφθη πιο αποτελεσματικά από ό, τι το μη γλυκοζυλιωμένη ομόλογό (Σχήμα 4Β). Ωστόσο, αυτό δεν αντανακλάται στην ενεργοποίηση συγκεκριμένων κυττάρων CD8 + Τ ή επιφανειακή έκφραση /MHC πεπτιδίου (Σχήμα 4C-D). Προφανώς, τα μπλοκ γλυκοζυλίωσης πυκνά ΟαΙΝΑο ενεργοποίηση CD8 + Τ κυττάρων, είτε με αναστολή επεξεργασίας αντιγόνου ή κατευθύνοντας τον ανοσογόνο σε διαμερίσματα μη-MHC Ι. Υποστήριξη της τελευταίας, συνεστιακής απεικόνισης μικροσκόπιο αποδεικνύεται συν-εντοπισμό των εσωτερικεύεται πρωτεΐνη σύντηξης ΟαΙΝΑο MUC2 με LAMP-2. Σε αντίθεση, μη-γλυκοζυλιωμένη MUC2 συν-εντοπισμένη με την πρώιμη ενδοσωμική δείκτη ΕΑΑ-1 (Σχήμα 4Ε-F, Εικόνα S1). Θα πρέπει να σημειωθεί, ωστόσο, ότι μια ισχυρή επαγωγή της ΟαΙΝΑο-MUC1 και MUC1 ειδικά CTLs έχουν αναφερθεί σε ποντικού μελέτες χρησιμοποιώντας ένα ανοσοενισχυτικό αγωνιστή TLR-2 συνδέεται με ένα προερχόμενο πολιομυελίτιδας Τ βοηθού επίτοπο και ένα ενιαίο ΟαΙΝΑο γλυκοζυλιωμένη διαδοχική επανάληψη MUC1 [70 ]. Ο βαθμός και ο εντοπισμός των γλυκανών, συμπερίληψη βοηθητικών επιτόπων, και η διαδρομή της πρόσληψης είναι υψηλής σημασίας για την ανοσολογική απόκριση.

Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι παρεκκλίνουσα ΟαΙΝΑο Ο-γλυκοζυλίωση μπορεί να αναστέλλει την παραγωγή ενός καρκίνο συγκεκριμένη απάντηση CD8 + Τ κυττάρων παρά την αυξημένη πρόσληψη αντιγόνου από δενδριτικά κύτταρα. Αυτό θα μπορούσε να είναι μια πιθανή παγίδα για το σχεδιασμό της MUC1 στοχεύουν εμβολίων κατά του καρκίνου. Η δημιουργία των πεπτιδίων σύντηξης με δύο ή περισσότερα αντιγόνα των κυττάρων CD4 + και CD8 + Τ, στην οποία έχουν εισαχθεί ειδικές θέσεις διάσπασης και την επεξεργασία, θα μπορούσε να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα. Ωστόσο, αυτές οι προσεγγίσεις μπορεί να αποδειχθεί δύσκολη, λόγω αναστολή των αποκρίσεων CD8 + Τ κυττάρων έχει παρατηρηθεί ακόμη και όταν τα υπολείμματα ΟαΙΝΑο διαχωρίστηκαν από το επιτόπιο κυττάρου CD8 + Τ με συνδετική αλληλουχία. Εν κατακλείδι, ΟαΙΝΑο γλυκοζυλίωση των αντιγόνων πεπτιδίου μπορεί να ενισχύσει την παραγωγή των αποκρίσεων CD4 + Τ κυττάρων, αλλά αναστέλλουν αποκρίσεις CD8 + Τ κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα ζωικά πειράματα εγκρίθηκαν από την εγκατάσταση τοπικών ζώων και τη δανική διοίκηση κτηνιατρικής και τροφίμων με τον αριθμό έγκρισης: 2008/561-1460. Τα ζώα παρακολουθούνταν καθημερινά μετά την ένεση για να ανιχνεύσει τυχόν ανεπιθύμητες παρενέργειες και θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση στο τέλος του πειράματος.

Τα πεπτίδια

MUC1 60 mer-πεπτίδιο (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG

)

3 με και χωρίς βιοτινυλίωση (Bio) ελήφθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19], MUC2 (ITTTTTVTPTPTPTGTQTPTTTP), πεπτίδιο σύντηξης MUC2 (Βιοτίνη-PTTTPITTTTTVTPTPTPTGTQTPTAAAAAAPSIINFEKL), εκφυλίστηκε (deg) MUC1 24 mer (AHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNV), 9 Meric πεπτίδιο ALGSTAPPV και πεπτίδια σύντηξης OVA-MUC1 (Πίνακας 1) αγοράστηκαν από Schafer-Ν (Δανία) και γλυκοζυλιωμένη

in vitro

χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένη ανθρώπινη γλυκοζυλοτρανσφεράσες ΟαΙΝΑο-T2, -Τ4 και -T11 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Οι συγκεντρώσεις των πεπτιδίων εξισορροπήθηκαν με πρότυπες καμπύλες και αποικοδόμηση των πεπτιδίων στον ορό HPLC ήταν αμελητέα για τη σχετική περίοδο 48 h (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). KLH συζευγμένα πεπτίδια έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11].

Μέτρηση Peptide-ΜΗΟ-Ι Affinity και Σταθερότητα

Οι μετρήσεις * 0201-συγγένειας πεπτιδίου-ΗΙΑ-Α εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ομοιογενές AlphaScreen δοκιμασία με βάση [71]. pMHC-I σταθερότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία γειτονίας σπινθηρισμού ομοιογενές [72]

Κυτταρικές Γραμμές

Το ακόλουθο πεπτίδιο OVA /χρησιμοποιήθηκαν ΜΗΟ ειδικά υβριδώματα:. ISQAVHAAHAEINEAGR /ΙΑ

b συγκρότημα συγκεκριμένο κύτταρο υβριδώματος Τ BO-97.10 [73] ήταν ένα είδος δώρο από τον John Kappler και Philippa Marrack και την δΙΙΝΡΕΚΙ /H-2K

b συγκρότημα ειδικών β κυττάρων υβριδώματος 25- D1-16 [74] ήταν ένα είδος δώρο από τον Ronald Δ Germain (ΝΙΗ). σύμπλοκο SIINFEKL /Η-2Kb ΚΡ33.70 περιορίζεται κύτταρο υβριδώματος Τ [75] χρησιμοποιήθηκε επίσης. Όλα τα κύτταρα διατηρούνται σε RPMI 1640 με glutamax, 100 U /ml πενικιλλίνη και 0,1 mg /ml στρεπτομυκίνη, καθώς και 10% FCS (πρότυπο μέσο). Περαιτέρω 5% συμπλήρωμα εμπλουτισμό προστέθηκαν υβριδώματα Τ κυττάρων. Το συμπλήρωμα εμπλουτισμός περιέχει: γλυκόζη, απαραίτητα και μη απαραίτητα αμινοξέα, αιθανολαμίνη, Na.pyrovat, ινσουλίνη, τεστοστερόνη, 2-ΜΕ και το λινελαϊκό οξύ. Για την Β κυττάρων υβριδώματος 5% FCS, 0,1% του SSR-3 και 5% του εμπλουτισμού συμπλήρωμα προστέθηκε.

Ποντίκια και το πρωτόκολλο Ανοσοποίηση

Όλα τα ποντίκια κρατήθηκαν στο περίβλημα των ζώων εγκαταστάσεις της Σχολής Υγείας και Ιατρικών Επιστημών (Πανεπιστήμιο της Κοπεγχάγης). Όλα τα πειράματα έχουν εγκριθεί από τις δανικές αρχές.