Αφηρημένο

Ιστορικό και Σκοπός

Αν και το γονίδιο-τροποποίηση των Τ κυττάρων να εκφράσουν τον υποδοχέα όγκου που σχετίζονται με το αντιγόνο-ειδικών Τ-κυττάρων (TCR) ή χιμαιρικό υποδοχέα αντιγόνου (CAR) έχει κλινικά αποδεδειγμένη υπόσχεση, εξακολουθεί να υπάρχει περιθώριο να βελτιωθεί η κλινική αποτελεσματικότητα του νέου κατευθυνόμενης T β-κυττάρου που βασίζεται αντικαρκινική θετή θεραπεία. Για την επίτευξη του πιο αντικειμενική κλινικές αποκρίσεις με χρήση ex vivo-επεκτάθηκε όγκου-απόκρισης Τ κυττάρων, τα Τ κύτταρα εγχέονται πρέπει να δείξει επαρκή τοπική διείσδυση εντός του όγκου.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Ανθρώπινο πνεύμονα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν ποικιλοτρόπως ένα αντιγόνο όγκου, του Wilms προϊόν Tumor γονίδιο 1 (WT1), και μια φλεγμονώδης χημειοκίνης, CCL2. Ωστόσο, CCR2, η σχετική υποδοχέας για CCL2, σπάνια εκφράζεται σε ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα. Ένα HLA-A2402

+ ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα γραμμή, LK79, που εκφράζει μεγάλες ποσότητες και των δύο

CCL2

και

WT1

mRNA, χρησιμοποιήθηκε ως στόχος. Κανονική CD8

+ Τ κύτταρα ήταν ρετροϊούς γονίδιο-τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν τόσο CCR2 και HLA-A * 2402-περιορισμένο και WT1

235-243 εννεαπεπτίδιο-ειδικό TCR ως τελεστή. λειτουργικότητα Αντι-όγκου με τη μεσολάβηση αυτών των κυττάρων τελεστών εναντίον κυττάρων LK79 εκτιμήθηκε τόσο in vitro όσο και in vivo. Τέλος, η επίδραση του CCL2 επί WT1 επίτοπο αποκρίνονται TCR σηματοδότηση που διαμεσολαβείται από τα κύτταρα-τελεστές μελετήθηκε. Εισήχθη CCR2 ήταν λειτουργικά επικυρωθεί με τη χρήση γονιδιακής-τροποποιημένα κύτταρα Jurkat και τα ανθρώπινα CD3

+ Τ κυττάρων τόσο in vitro όσο και in vivo. Διπλό γονίδιο-τροποποιημένων CD3

+ Τ κύτταρα απέδειξαν επιτυχώς τόσο διακίνησης όγκου CCL2-τροπικά και κυτταροκτόνο δραστικότητα έναντι κυττάρων LK79 in vitro και in vivo. CCL2 αύξησε τη WT1 επίτοπο αποκρίνονται σηματοδότηση TCR φαίνεται από σχετική παραγωγή λουσιφεράσης σε διπλό γονίδιο-τροποποιημένων Jurkat /ΜΑ κυττάρων να εκφράζουν λουσιφεράση και WT1-ειδικά TCR, και CCL2 επίσης δοσοεξαρτώμενο επαυξημένης παραγωγής επίτοπο αποκρίνονται ΙΡΝ-γ WT1 και έκφραση CD107a με τη μεσολάβηση αυτών διπλό γονίδιο-modifiedCD3

+ Τ κύτταρα.

Συμπέρασμα /σημαντικότητα

Εισαγωγή του άξονα CCL2 /CCR2 ενισχύεται επιτυχώς in νίνο αντι-πνεύμονα αντιδραστικότητα καρκίνος διαμεσολαβείται από CD8

+ Τ κύτταρα διπλό γονίδιο-τροποποιημένα για να εκφράζουν WT1-ειδικά TCR και CCR2 όχι μόνο μέσω της διακίνησης CCL2-τροπικός όγκου, αλλά επίσης CCL2-ενισχυμένη WT1-αποκρισιμότητα

Παράθεση:. Asai Η, Fujiwara ώρα, J , Όχη Τ, Μιγιαζάκι Υ, Nagai K, et al. (2013) Co-Εισήχθη Λειτουργική CCR2 ενισχύει εν ζωή anti-καρκίνο του πνεύμονα λειτουργικότητα διαμεσολαβείται από τα Τ κύτταρα διπλό Gene-τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν υποδοχέα των Τ-κυττάρων WT1-Ειδικές. PLoS ONE 8 (2): e56820. doi: 10.1371 /journal.pone.0056820

Επιμέλεια: Nupur Gangopadhyay, Πανεπιστήμιο του Pittsburgh, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Σεπτέμβρη 2012? Αποδεκτές: 14η Ιανουαρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 του Φεβρουαρίου του 2013

Copyright: © 2013 Asai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας να HF και ΜΟΥ, και μια Grant-in-ενισχύσεις για την Έρευνα του Καρκίνου από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας για να ΜΟΥ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς, εκτός από ΑΑ, JM και HS έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικές ενδιαφέρον. ΑΑ και JM είναι υπάλληλος της Takara Bio, Inc .. ΕΣ παρέχεται με τη χρηματοδότηση της έρευνας από την Takara Bio, Inc .. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Παρά την πρόσφατη θεραπευτική πρόοδο, η συνολική επιβίωση των ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα παραμένει φτωχή [1], και ως εκ τούτου η διερεύνηση νέων θεραπειών παραμένει ένας επιθυμητός στόχος. Τα αποτελέσματα από κλινικές δοκιμές κατά του όγκου θετή θεραπεία με χρήση ex vivo-επεκτάθηκε όγκων αποκρίνονται τα Τ κύτταρα, κυρίως ογκο-διηθητικά λεμφοκύτταρα Τ (ΤΙΕ), για τη θεραπεία του προχωρημένου μελανώματος επέδειξαν μια εντυπωσιακή κλινική ανταπόκριση. Από την άλλη πλευρά, υπάρχουν ορισμένα μειονεκτήματα, όπως η πολυπλοκότητα των διαδικασιών και τη δυσκολία στη διατήρηση της θεραπευτικής ποιότητα της μακροχρόνιας-καλλιεργημένα Τ κύτταρα [2]. Πρόσφατες τεχνικές πρόοδοι περιλαμβάνουν γονίδιο τροποποιήσεις για να εισαγάγει τους υποδοχείς όγκου που αποκρίνονται σε θεραπευτική Τ κύτταρα – όπως ο υποδοχέας όγκου αντιγόνου-ειδικών Τ-κυττάρων (TCR) και το χιμαιρικό υποδοχέα αντιγόνου (CAR) – σε μεγάλο βαθμό έχουν ξεπεράσει αυτά τα μειονεκτήματα [3] – [5 ]. Ωστόσο, καθώς το φάσμα των κατάλληλα απόκρισης όγκων εξακολουθεί να είναι περιορισμένη, έχουμε προτείνει κάποιες νέες επιλογές, όπως το HLA-A * 2402-περιορισμένο WT1-ειδικά ΤΟΚ [6] και HLA-A * 0201-περιορισμένο κινάσης Aurora Α (AURKA) -ειδικές TCR [7], για τη θεραπεία της ανθρώπινης λευχαιμίας. Μια άλλη τεχνική πρόοδο που έχουμε προτείνει είναι ένα νέο σύστημα TCR φορέα που παραδίδει ταυτόχρονα Τα siRNAs για ενδογενών TCR γονιδίων α /β (φορέας siTCR) [8], μειώνοντας έτσι το σχηματισμό mispaired TCR, ο δυνητικός κίνδυνος θανατηφόρου οξείας GVHD [9].

WT1 είναι ένα πολύ γνωστό αντιγόνο όγκου που εκφράζεται σε διάφορους βαθμούς από ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα [10], και η έκφραση WT1 έχει αποδειχθεί κλινικά ότι έχουν προγνωστική αξία σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα [11]. Χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ποντικού ξενομόσχευμα, έχουμε διερευνηθεί προηγουμένως την αντι-πνεύμονα καρκίνος θεραπευτικό δυναμικό του ένα ex νίνο επεκταμένη κλωνική κυτταροτοξική κυτταρική σειρά Τ (CTL) [12], ΤΑΚ-1, το οποίο αναγνωρίζει ειδικά το WT1

235-243 εννεαμερές επίτοπο στο πλαίσιο του HLA-α * 2402 [13].

από την άλλη πλευρά, η ανεπαρκής διείσδυση θεραπευτικών κυττάρων Τ σε εντοπισμένες θέσεις όγκου είναι ένα εμπόδιο για την επιτυχή θεραπεία [14]. Προκειμένου να αυξηθεί η δραστικότητα της διακίνησης όγκου εγχυθεί θεραπευτικών κυττάρων Τ, απαιτείται η ανταπόκριση τους σε κατάλληλες χημειοκίνες που παράγονται από τα κύτταρα του όγκου ή κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος όγκο διεισδύσει. Πρώτα από Kershaw et al. [15], μια σειρά προκλινικών μελετών βασίζεται στην έννοια αυτή έχουν διεξαχθεί [16] – [19]. Ωστόσο, το κύριο θέμα της οποίας θα πρέπει να επιλεγεί ζεύγος υποδοχέα χημειοκινών-χημειοκινών για κλινική εφαρμογή απομένουν να διευθετηθούν. Στην παρούσα μελέτη, για να εξετάσει τα πιθανά πλεονεκτήματα της συν-εισαγωγή ενός άξονα υποδοχέα χημειοκίνης-χημοκίνης για αντικαρκινική ανοσοθεραπεία, χρησιμοποιήσαμε ως μοντέλο γενετικά ανακατευθύνεται Τ κύτταρα στόχευσης WT1 για τη θεραπεία του καρκίνου του ανθρώπινου πνεύμονα.

σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι CC χημειοκινών 2 ​​(CCL2) παρήχθη σε ποικίλους βαθμούς από τις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, και ότι LK79, ένα HLA-A * 2402

+ καρκίνο του πνεύμονα μικρών κυττάρων (SCLC) κυτταρική σειρά που υπερεκφράζουν

WT1

mRNA, που παράγονται εξαιρετικά υψηλές ποσότητες CCL2. LK79 σκοτώθηκε από CD8

+ Τ κύτταρα γονίδιο-τροποποιημένα να εκφράζουν το WT1-ειδικά TCR που προέρχονται από ΤΑΚ-1. Από την άλλη πλευρά, CCR2, ο ειδικός υποδοχέας για CCL2, ήταν σχεδόν εκφράζονται σε αυτά τα προϊόντα επιμόλυνσης. Στο σύνολό τους, τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι, προκειμένου να αποδείξει την απόδειξη της ιδέας μας, θα ήταν λογικό να απασχολούν τον άξονα CCR2-CCL2 στη ρύθμιση των ανακατεύθυνση Τ κυττάρων που στοχεύουν WT1 και τον καρκίνο του πνεύμονα. Επειδή η θεραπεία του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα παραμένει πρόκληση [20], θεωρήσαμε ότι η χρήση του LK79, ένα SCLC κυτταρική γραμμή, ως στόχος, θα μπορούσε να ανοίξει μια νέα λεωφόρο της θεραπείας για SCLC.

Στην παρούσα μελέτη, εξέτασε λεπτομερώς η λειτουργικότητα καρκίνος αντι-πνεύμονα που προκαλείται από διπλό επιμολυσμένα CD8

+ Τ κύτταρα για να εκφράσουν το WT1-ειδικά TCR και CCR2 κατά LK79 κυττάρων, τόσο in vitro όσο και in vivo. Με βάση τις παρατηρήσεις μας, συζητήσαμε την κλινική σκοπιμότητα αυτής της στρατηγικής για την θετή ανοσοθεραπεία κατά του καρκίνου του πνεύμονα ανθρώπου.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Ηθική Δήλωση

Η έγκριση για τη μελέτη αυτή λήφθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ehime. Γραπτή συγκατάθεση δόθηκε από όλους τους υγιείς εθελοντές, σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Όλα τα in vivo πειράματα ποντίκι εγκρίθηκαν από την επιτροπή φροντίδα των ζώων του Πανεπιστημίου Ehime.

2. Κύτταρα

κύτταρα Jurkat (ATCC) και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα θετική είτε HLA-Α * 2402

+, WT1 mRNA, ή και τα δύο χρησιμοποιήθηκαν. Ο τελευταίος περιλαμβάνεται LC99A (μεγάλο προέλευση καρκίνωμα) [21], LK79 (μικροκυτταρικό καρκίνωμα) [21], ΕΚΦΤ-LC-Α1 (καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων) [21] και LC11-18 (αδενοκαρκίνωμα) [22]. PC-9 (αδενοκαρκίνωμα) [21] ήταν θετικό για HLA-A * 2402

+ αλλά αρνητική για WT1 mRNA, Sq-1 (καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων) [21], LC65A (καρκίνωμα μικρών κυττάρων) [21], QG56 (πλακώδες καρκίνωμα) [21], LK87 (αδενοκαρκίνωμα) [21], και 1-87 (αδενοκαρκίνωμα) [21] ήταν αρνητικά για το HLA-A * 2402. Όλα αυτά τα προγενέστερα δημοσιευθείσες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα έγιναν ευγενώς από τον Dr. Akio Hiraki (Okayama University Graduate School, Okayama, Japan), και καλλιεργήθηκαν όπως έχει ήδη αναφερθεί [12]. Η κυτταρική σειρά Jurkat /ΜΑ (ευγενική προσφορά από τον καθηγητή Erik Hooijberg, Vrije Universiteit Medisch Centrum, Άμστερνταμ, Ολλανδία) είναι ένα Jurkat κλώνου κυττάρων που είχαν καθοριστεί προηγουμένως από τον καθηγητή Erik Hooijberg και οι συνεργάτες του που στερείται την έκφραση ενδογενών TCR και σταθερά εκφράζει τόσο την ανθρώπινη γονίδιο CD8α (

hCD8α

) και ένα

κατασκεύασμα

γονίδιο NFAT-λουσιφεράσης για την ανίχνευση της σηματοδότησης μέσω νεοεισαχθέντα TCRs [23]. Η

HLA-A * 2402

γονίδιο-μετασχηματισμένων κυτταρική γραμμή C 1 R (C 1 R-A24) ήταν επίσης καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου και 0.5 mg /mL υγρομυκίνη Β (Invitrogen). κυτταρικές σειρές Β-λεμφοβλαστοειδών (Β-LCLs) έχουν συσταθεί μέσω μετατροπής του περιφερικού αίματος Β λεμφοκυττάρων με ιό Epstein-Barr. Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) από υγιείς εθελοντές απομονώθηκαν και αποθηκεύεται σε υγρό άζωτο μέχρι τη χρήση.

3. Ποντίκια

Έξι εβδομάδων NOD /SCID /γο

null (NOG) θηλυκά ποντίκια αγοράστηκαν από το Κεντρικό Ινστιτούτο Πειραματικής Ζώα [24] και διατηρήθηκε στην εγκατάσταση θεσμικό ζώων στο Πανεπιστήμιο Ehime.

4. Η κυτταρομετρία ροής

δείκτες Επιφανειακή επιμολύνσεων ή μη-γονίδιο-τροποποιημένα Τ κύτταρα σημάνθηκαν με αντι-CD8, αντι-CD4, αντι-CD3 και αντι-CD45 mAbs (BD Biosciences), αντι-CD25 και αντι CD69 mAbs (BioLegend), αντι-Vβ5.1 mAb (Beckman Coulter), αντι-CCR2 mAb (R &? D Systems), και HLA-A * 2402 /WT1

235-243 τετραμερές-ΡΕ ή HLA-A * 2402 /HIV-1 Εην

584-592 τετραμερές-ΡΕ, ως αρνητικός έλεγχος. Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ροής Γάλλιο κυτταρόμετρο (Coulter), και η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Flow Jo Έκδοση 7.2.2 λογισμικού (TreeStar).

5. WT1-siTCR ρετροϊικού φορέα και CCR2 ρετροϊικού φορέα

Το HLA-A * 2402-περιορισμένο και WT1

235-243-ειδικό TCR-α (Vα20 /J33 /Οα) και TCR-β (Vβ5. 1 /J2.1 /γονίδια Cβ2), η οποία προήλθε από ΤΑΚ-1 [13], κλωνοποιήθηκαν σε νέα ρετροϊικού φορέα siTCR μας (φορέας WT1-siTCR), μετά να μεταχθεί σε κύτταρα Τ χρησιμοποιώντας αυτό το φορέα όπως περιγράφεται προηγουμένως [6], [8]. Το cDNA πλήρους μήκους του ανθρώπινου

CCR2

γονίδιο (1083 bp) (NM_001123396.1) κλωνοποιήθηκε και βελτιστοποιημένων κωδικονίων (GeneArt), στη συνέχεια εισάγεται εντός του φορέα pRetroX-IRES-DsRed Express (Clontech). Οικοτροπικού ρετροϊικοί φορείς ελήφθησαν δια παροδική συν-επιμόλυνση με άλλα συστατικά (Takara Bio) στην κυτταρική σειρά ΗΕΚ293? στη συνέχεια, GaLV-ρετροϊικοί φορείς ψευδότυποι λήφθηκαν με διαδοχική επιμόλυνση αυτών των φορέων στην κυτταρική σειρά PG13 (Takara Bio).

6. Μεταγωγή του

ΤΟΚ

και

CCR2

γονίδια

κύτταρα Jurkat /ΜΑ και υγιούς δότη Τ κύτταρα το γονίδιο-τροποποιημένα για να εκφράζουν WT1-ειδικά TCR και CCR2 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],6]. Εν συντομία, την ημέρα 1, 1 × 10

6 Τ κύτταρα ανά φρεάτιο σε GT-T503 (Takara Bio) με ανθρώπινο ορό 5%, 0,2% ανθρώπινη λευκωματίνη, 50 U /mL ανασυνδυασμένης ανθρώπινης IL-2 (R &? D Systems ), 10 ng /mL ανασυνδυασμένης ανθρώπινης IL-15 (PeproTec Inc.), και 100 ng /mL ανασυνδυασμένης ανθρώπινης IL-21 (Shenandoah Biotechnology Inc.) προστέθηκαν σε μια πλάκα καλλιέργειας των 24 φρεατίων προκατεργάστηκαν με αντι-ανθρώπινο CD3 mAb ( BioLegend). Jurkat κύτταρα /ΜΑ καλλιεργήθηκαν σε IMDM με 8% FCS και 50 mg /mL υγρομυκίνη Β Την ημέρα 3, τα καλλιεργημένα Τ κύτταρα ή κύτταρα Jurkat /MA μεταφέρθηκαν σε ένα ρετροϊό-προεγκατεστημένο RetroNectin επικαλυμμένα πλάκα 24 φρεατίων, σε φυγοκέντρηση σε 2000 ×

g

για 2 ώρες και ξεπλένονται με PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια εφαρμόστηκε πάλι σε ένα άλλο παρόμοιο προ-αγωγή 24-φρεατίων για το δεύτερο μεταγωγή. Το WT1-σι

ΤΟΚ

και

CCR2

-transduced Τ κύτταρα διεγείρονται σε εβδομαδιαία βάση με μιτομυκίνη-C (MMC) (Kyowa Hakko) κατεργασμένους και heteroclitic WT1

235-243 πεπτιδίου (CYTWNQMNL)-παλμού HLA-A * 2402-θετικά LCLs. Σε μερικά πειράματα, CD8

+ Τ κύτταρα επιμολυσμένα για να εκφράζουν WT1-ειδικά TCR απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας αντι-Vβ5.1-FITC mAb (Beckman Coulter) και αντι-FITC-συζευγμένο ανοσομαγνητικά σφαιρίδια (Miltenyi Biotec), και

CCR2

επιμολύνσεις απομονώθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας αντι-CCR2-ΡΕ mAb (R &? D Systems). και αντι-ΡΕ-συζευγμένα ανοσομαγνητικά σφαιρίδια (Miltenyi Biotec)

7. Εκτίμηση των χημειοκινών που παράγονται από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα

Όλα τα εναύσματα για ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση της 12 επιλεγμένων χημειοκινών που παράγεται από 10 ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών πνεύμονα που παρατίθενται στον Πίνακα 1. Εν συντομία, ολικό RNA εκχυλίστηκε από κάθε κυτταρική γραμμή με μια RNeasy Mini Kit (Qiagen) και cDNA συνετέθη. qRT-PCR για χημειοκίνης mRNA εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας κιτ QuantiTect Syber Πράσινη PCR (Qiagen) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7]. Ανθρώπινα φωσφοριβοσυλτρανσφεράση υποξανθίνης 1 (

hHPRT1

) mRNA (NM_000194) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι συνθήκες PCR ήταν 50 ° C για 2 λεπτά, 95 ° C για 15 λεπτά, 50 κύκλοι των 95 ° C για 15 s, 60 ° C για 1 λεπτό, 95 ° C για 15 s και στη συνέχεια 60 ° C για 1 λεπτό. Αυτά τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ΑΒΙ PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Η έκφραση του mRNA κάθε χημειοκίνης διορθώθηκε σε σχέση με εκείνο του

hHPRT1

mRNA, και η σχετική ποσότητα του κάθε mRNA χημειοκίνης υπολογίστηκε με τη συγκριτική ΔΟ

t μέθοδο. πρωτεΐνη CCL2 που παράγεται από κάθε κυτταρική γραμμή αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ELISA (R &? D Systems). Στρεπταβιδίνη-HRP χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη του χρώματος, και luminointensity μετρήθηκε χρησιμοποιώντας IMMUNO-MINI (NJ-2300? Microtec).

Η

8. WT1-απόκρισης παραγωγή λουσιφεράσης διαμεσολαβείται από διπλό επιμολυσμένα κύτταρα /ΜΑ Jurkat

Για να μετρηθεί ο αντίκτυπος των CCL2 απολίνωση να συν-εισαχθεί CCR2 για WT1 επιτόπου απόκρισης σηματοδότηση TCR, η MA κυττάρων /γραμμή Jurkat, η οποία στερείται των ενδογενών TCR, και σταθερά εκφράζει

hCD8α

και

γονίδιο

ρεπόρτερ NFAT-λουσιφεράσης (Jurkat /MA /CD8α /luc) χρησιμοποιήθηκε. Εν συντομία, το WT1-σι

TCR

και

CCR2

γονίδια ρετροϊικώς σε Jurkat /MA /CD8α /luc κύτταρα όπως περιγράφεται προηγουμένως [7]. Διπλό γονίδιο-τροποποιημένων Jurkat /MA /CD8α /Ιυο κύτταρα, διπλά θετικά για Vβ5.1 και CCR2, απομονώθηκαν, επεκτάθηκαν και υποβλήθηκαν σε λειτουργική ανάλυση. Δύο εκατομμύρια διπλό επιμολυσμένα Jurkat /MA /CD8α /luc κύτταρα συν-επωάστηκαν με 1 × 10

6 MMC-κατεργασμένα κύτταρα C 1 R-A24 με ή χωρίς φορτωμένο πεπτίδιο WT1 (20 μΜ) ως διεγέρτης σε διάφορες συγκεντρώσεις ανθρώπινης ανασυνδυασμένο CCL2 (Peprotech) για 12 ώρες σε μια effector:target αναλογία 2:01. Single-επιμολυσμένα Jurkat /MA /CD8α /luc κύτταρα μόνο εκφράζουν WT1-ειδικά TCR χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Στη συνέχεια, αυτά τα κύτταρα λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας ένα κιτ PICAGENE-Dual-SeaPansy (ΤΟΥΟ inki). Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Lumicounter 700 (Microtec ορισμός).

9.

51Cr αποδέσμευσης

δοκιμασία

Για να προσδιοριστεί η κυτταροτοξική δράση διαμεσολαβείται από

γονίδιο-μετάγονται WT1-siTCR

CD8

+ Τ κύτταρα, πρότυπο

προσδιορισμούς 51Cr αποδέσμευσης πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Εν συντομία, 10

4 unpulsed ή εμφυτευμένα πεπτίδια κύτταρα-στόχοι σημάνθηκαν με

51Cr (Na

2CrO

4: MP Bio Ιαπωνία) και επωάστηκαν σε διάφορες αναλογίες με κύτταρα τελεστές σε 200 μΙ μέσου καλλιέργειας σε πλάκες 96 φρεατίων με στρογγυλό πυθμένα. Για ανάλυση αναστολής, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία είτε ενός αντι-HLA mAb πλαισίου τάξης Ι (W6 /32? ATCC) ή έναν έλεγχο αντι-HLA-DR mAb (L243? ATCC). Μετά από 5 ώρες επώασης με κύτταρα τελεστή, 100 μι υπερκειμένου συλλέχθηκε από κάθε φρεάτιο. Το ποσοστό της ειδικής λύσης υπολογίστηκε ως:. (Πειραματική απελευθέρωση cpm-αυθόρμητη απελευθέρωση cpm) /(μέγιστη απελευθέρωση cpm-αυθόρμητη απελευθέρωση cpm) χ 100 (%)

10. IFN-γ δοκιμασία έκκρισης

Πεντακόσιες χιλιάδες διπλό επιμολυσμένα φυσιολογικό περιφερικό CD8

+ Τ κύτταρα που εκφράζουν τόσο WT1-ειδικά TCR και CCR2 συν-επωάστηκαν με 1 × 10

5 WT1 πεπτίδιο παλμική (1 μΜ) ή unpulsed κύτταρα C 1 R-A24 για 24 ώρες σε διάφορες συγκεντρώσεις CCL2. IFN-γ στο υπερκείμενο καλλιέργειας παρομοίως μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ELISA (R &? D Systems).

11. CD107a δοκιμασία

CD107a έκφραση που διαμεσολαβείται από διπλό επιμολυσμένα CD8

+ Τ κυττάρων σε απόκριση σε διέγερση με το πεπτίδιο WT1 εξετάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Εν συντομία, 1 × 10

5 κύτταρα C 1 R-A24 σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων με στρογγυλό πυθμένα και επωάστηκαν με ή χωρίς το πεπτίδιο WT1 για 2 ώρες σε διάφορες συγκεντρώσεις CCL2. Στη συνέχεια, 2 × 10

5 από αυτά τα διπλά επιμολυσμένα CD8

+ Τ κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο με FITC-συζευγμένο CD107a mAb (BioLegend), και επωάστηκαν για 3 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιπροσθέτως σημάνθηκαν με αντι-CD3, αντι-CD8 mAbs (BD Biosciences) και ΡΕ-συζευγμένα HLA-A * 2402 /WT1

235-243 τετραμερές, και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

12. πειράματα φρεατίων

Λειτουργική επικύρωση της μετάγονται CCR2 διεξήχθη σε πειράματα φρεατίων vitro απασχολούν. Εν συντομία, 2 χ 10

5 /φρεάτιο

CCR2

επιμολυσμένα Jurkat κύτταρα τοποθετήθηκαν στο ανώτερο φρεάτιο, και 500 μL RPMI 1640 με 10% FCS μέσο καλλιέργειας που περιείχε διάφορες συγκεντρώσεις CCL2 προστέθηκε στο φρεατίων πυθμένα ενός 3-μm μεγέθους πόρων 24 φρεατίων transwell πλάκα (Coster). Μετά από 4 ώρες επώασης, τα κύτταρα στο κάτω μέρος και μετρήθηκαν με τη χρήση της τρυπάνης μέθοδο αποκλεισμού μπλε βαφής. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και ανεξάρτητα τρεις φορές. Όταν ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα σπάρθηκαν σε φρεάτια πυθμένα, Transwell πειράματα παρομοίως διεξήχθησαν μετά από 24 ώρες προ-επώασης. Ένα πείραμα αποκλεισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας μυρμήγκι-CCR2 mAb (R &? D Systems). Τέλος, τόσο η εμπορία του όγκου και κυτταροκτόνο δραστηριότητες που προκαλούνται από διπλό γονίδιο-τροποποιημένων CD8

+ Τ κύτταρα εξετάστηκαν στο ίδιο πείραμα transwell. Εν συντομία, χρησιμοποιώντας ένα 3-μm μεγέθους πόρων 6 φρεατίων Transwell πλάκα, τα κύτταρα σπάρθηκαν LK79 στον πυθμένα φρεατίων σε 10

6 /φρεάτιο και επωάστηκαν για 24 ώρες. Στη συνέχεια, διπλή-επιμολυσμένα CD8

+ Τ κύτταρα φορτώθηκαν επί της άνω φρεατίων σε 2 × 10

6 /φρεάτιο. WT1-ειδικά

TCR

single-επιμολυσμένα CD8

+ Τ κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Μετά από 12 ώρες επώασης, το κάθε υπερκείμενο στον πυθμένα καλά συλλέχθηκε. Μετά από φυγοκέντρηση στις 1200 rpm για 5 λεπτά για την απομάκρυνση των υπολειμματικών κυττάρων, 100 μL από κάθε υπερκείμενο υποβλήθηκε σε δοκιμασία ELISA (Roche) για γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) που έχει διαρρεύσει από τα κύτταρα διασπάστηκαν με LK79 μετανάστευσε WT1-ειδικά Τ κύτταρα τελεστές. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Δεδομένου ότι οι ρετροϊικοί

CCR2

φορέα έκφρασης γονιδίου που παραδίδεται ταυτόχρονα κόκκινου χρώματος φθορίζουσα πρωτεΐνη (Ds-Red), τα διπλά επιμολυσμένα κύτταρα τελεστές που έχουν μεταναστεύσει στον πυθμένα καλά ανιχνεύθηκαν επίσης με συνεστιακή μικροσκοπία (Α-1 R, Nikon , Ιαπωνία).

13. In vivo WT1 αντιγόνο-ανεξάρτητο μετανάστευσης

Σε μια ξενομοσχεύτηκε μοντέλο ποντικού, η δραστηριότητα διακίνησης όγκου CCL2-εξαρτώμενη μεσολάβηση

CCR2

και

λουσιφεράσης

διπλό επιμολυσμένα κανονική CD3

+ Τ κύτταρα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία απεικόνισης βιοφωταύγειας. Εν συντομία, 1 × 10

7 LK79 κύτταρα υποδορίως εμβολιάσθηκαν εντός του κοιλιακού τοιχώματος του 1 Gy-ακτινοβολημένα 9 εβδομάδων ποντικούς NOG (n = 6). Μία ομάδα (n = 3) έλαβαν ενδοφλέβια χορήγηση εφάπαξ

λουσιφεράσης

-επιμολυσμένα ανθρώπινο CD3

+ Τ κύτταρα (5 × 10

6 κύτταρα /ποντίκι) ως μάρτυρας, και η άλλη ομάδα ( n = 3) έλαβαν διπλά επιμολυσμένα CD3

+ Τ κύτταρα την ημέρα 0. στη συνέχεια όλοι οι ποντικοί έλαβαν ενδοπεριτοναϊκή σειριακή διοικήσεων των 500 IU ανασυνδυασμένης ανθρώπινης IL-2 (Roche) τις ημέρες 0, 2, 4, και 6 Serial απόκτηση του φωτονίου λουσιφεράσης μετράει χρησιμοποιώντας λουσιφερίνης (Promega Corporation) διεξήχθη τις ημέρες 1, 3, 5, και 7 χρησιμοποιώντας Aequoria (Hamamatsu Photonics, Ιαπωνία), και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό AQUACOSMOS (Hamamatsu Photonics).

14. In vivo ογκο-κατασταλτική δραστηριότητα που προκαλείται από εγχυόμενη διπλό επιμολυσμένα δραστικών Τ κυττάρων σε ένα θεραπευτικό μοντέλο ποντικού

Για θεραπευτική πειράματα μεταφοράς θετή, παρασκευάσαμε

λουσιφεράσης

-επιμολυσμένα LK79 κύτταρα (LK79 /luc) των οποίων η παραγωγή CCL2 ήταν ίση με εκείνη των γονικών κυττάρων LK79. Όλα τα 9 εβδομάδων ποντικούς NOG (n = 18) ήταν 1 Gy-ακτινοβολημένα και στη συνέχεια εμβολιάστηκαν υποδορίως με 5 χ 10

6 LK79 /Ιυο κυττάρων εντός του κοιλιακού τοιχώματος κατά την ημέρα 0. Αυτοί οι ποντικοί χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες: i) εκείνες χορηγείται ενδοφλεβίως 5 × 10

6 ΟΚΤ-3 /IL-2 ενεργοποιημένων CD8

+ Τ κυττάρων, χωρίς καμία τροποποίηση γονίδιο (n = 6), ii) που έλαβαν αγωγή με 5 × 10

6 μόνο WT1-ειδικά

ΤΟΚ

επιμολυσμένα CD8

+ Τ κυττάρων από τον ίδιο δότη (n = 6), και iii) αυτών που έλαβαν θεραπεία με 5 × 10

6 διπλά επιμολυσμένα CD8

+ Τ κύτταρα επίσης από τον ίδιο δότη (n = 6). Τα ποντίκια σε κάθε ομάδα έλαβε την ίδια κυτταρική θεραπεία εβδομαδιαία τρεις φορές συνολικά (κατά τις ημέρες 4, 11, και 18). Serial εξαγορά της λουσιφεράσης μετράει φωτονίων για εμβολιάστηκαν LK79 Luc κύτταρα /διεξήχθη. Οι μετρήσεις φωτονίων σε σχέση με εκείνη την πρώτη ημέρα της κυτταρικής θεραπείας, η οποία έδειξε την υπολειμματική μάζα του όγκου βάρος, υπολογίστηκαν σε κάθε ποντικό.

15. Η στατιστική ανάλυση

Η αντιστοίχιση

t

test χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων, καθώς και μια μονόδρομη παραγοντική ανάλυση διακύμανσης ακολουθούμενη από post-hoc δοκιμασία κατά Tukey χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις μεταξύ των τριών ομάδες? διαφορές σε

σ

& lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

1. Παραγωγή διαφόρων ποσοτήτων CCL2 από την ανθρώπινη καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές, και σπάνια έκφραση του αντίστοιχου CCR2 υποδοχέα στα Τ κύτταρα ενεργοποιούνται χρησιμοποιώντας ΟΚΤ-3 και IL-2

Τα προφίλ έκφρασης των 12 επιλέγονται mRNAs χημειοκίνης που παράγεται από κάθε μία από τις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα εκτιμήθηκε με qRT-PCR συνοψίζονται στον πίνακα 2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, διάφορες ποσότητες πρωτεΐνης CCL2 παρήχθησαν σε όλες τις καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές αξιολογούνται, μεταξύ των οποίων LK79, μια κυτταρική γραμμή SCLC , που παράγεται κυρίως υψηλές ποσότητες CCL2. Το αντίστοιχο υποδοχέα, CCR2, σπάνια εκφράζεται στην επιφάνεια των δύο ηρεμούντα Τ κύτταρα ή εκείνες που ενεργοποιούνται χρησιμοποιώντας ΟΚΤ-3 /IL-2 (n = 5). Τα ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα διαχωρίστηκαν με CD69 θετικότητα. Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα μεταξύ 5 περιπτώσεις φαίνεται στο Σχήμα 1Β. Τα επίπεδα έκφρασης για ανάπαυση και ενεργοποιημένα κύτταρα ήταν: CD8, 0,83 ± 0,72% και 0,75 ± 0,51%, και CD4, 0,66 ± 0,45% και 0,5 ± 0,26% (μέσος όρος ± SD), αντίστοιχα. Επιπλέον, qRT-PCR αποκάλυψε ότι τα επίπεδα έκφρασης του

CCR2

mRNA σε ενεργοποιημένα και ηρεμούντα Τ κύτταρα (n = 5) δεν διαφέρουν είτε CD4

+ ή CD8

+ Τ κύτταρα (τα δεδομένα δεν φαίνεται). Από την άλλη πλευρά, τελεστή CD8

+ Τ κύτταρα διπλά επιμολυσμένα για να εκφράσουν HLA-A * 2402-περιορισμένο και WT1

235-243-ειδικό-ΤΟΚ σκότωσε επιτυχώς υποψήφιες κυτταρικές γραμμές καρκίνου ανθρώπινου πνεύμονα σε ένα HLA-A * 2402-περιορισμένο τρόπο (Σχ. 1C και 1D). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα πρότειναν ότι η επιλογή του άξονα CCR2-CCL2 και η αντιστοίχιση των CTLs που περιλαμβάνει κύτταρα τελεστές γονίδιο-τροποποιημένα για να εκφράζουν WT1-ειδικά TCR με κύτταρα στόχους LK79 που ήταν ευαίσθητα στην κυτταροκτόνο δραστικότητα που προκαλείται από το διαμολυνθέν CTL ήταν εύλογα κατάλληλο για την απόδειξη της proof-of-concept αυτής της μελέτης. Συνεπώς, αυτά τα διπλά επιμολυσμένα τελεστή CD8

+ Τ κύτταρα σε συνδυασμό με τα κύτταρα-στόχους LK79 χρησιμοποιήθηκαν στα επόμενα πειράματα.

δοκιμασίας (Α) ELISA αποκάλυψε ότι 10 ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα που εξετάστηκαν παρήγαγε διάφορες ποσότητες CCL2 στο υπερκείμενο της καλλιέργειας. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SDS. (Β) Ομοίως με μεταγωγή του WT1-ειδικά

TCR

γονίδιο, CD69-θετικά CD8

+ και CD4

+ Τ κύτταρα ενεργοποιούνται χρησιμοποιώντας IL-2 και ΟΚΤ-3 σπανίως εμφανίζονται κυτταρικής επιφάνειας CCR2. Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα του 5 περιπτώσεις εμφανίζεται. (Γ) CD8

+ Τ κύτταρα γονίδιο-τροποποιημένα για να εκφράζουν HLA-A * 2402-περιορισμένο και WT1

235-243 εννεαμερές-ειδικό TCR εμφανίζονται επιτυχώς κυτταροκτόνο δραστικότητα έναντι των κυττάρων του πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου σε ένα HLA-A * 2402-περιορισμένο τρόπο, όπως προσδιορίζεται με πρότυπη δοκιμασία απελευθέρωσης

51Cr. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SDS. MFI δείχνει μέση ένταση φθορισμού, μ.π. δείχνει λιγότερο από ανιχνεύσιμες. (Δ) Η δραστηριότητα κατά του καρκίνου του πνεύμονα (vs. LK79 και LC99A) αναστάλθηκε από αντι-ΗΙΑ τάξης Ι-πλαίσιο mAb (κλώνος W6 /32), αλλά όχι από αντι-HLA-DR mAb (κλώνος L243), και πάλι δείχνουν ότι το εισαγόμενο WT1-ειδικά ΤΟΚ-διαμεσολαβούμενη ογκοκτόνο δραστικότητα ήταν HLA-κατηγορίας Ι-περιορισμένων. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SDS. (Ε) δοκιμασία τετραμερούς έδειξαν ότι κύτταρα τελεστές που χρησιμοποιούνται σε αυτά τα πειράματα ήταν θετικό για WT1 /HLA-A * 2402-τετραμερές. HIV /HLA-A * 2402 τετραμερούς χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας.

Η

2. Λειτουργική επικύρωση εισήγαγε CCR2

Πρώτον, λειτουργική επικύρωση εισήγαγε CCR2 διεξήχθη χρησιμοποιώντας το

CCR2

-επιμολυσμένα Jurkat κύτταρα (Jurkat /CCR2) σε πειράματα φρεατίων. Jurkat /CCR2, αλλά όχι γονικών κυττάρων Jurkat, εμφανίζεται επιτυχώς δραστικότητα μετανάστευσης CCL2 μεσολάβηση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Το Σχήμα 2 παρουσιάζει τους αριθμούς των κυττάρων που μεταναστεύουν σε σχέση με εκείνη σε συγκέντρωση CCL2 12,5 ng /mL. κύτταρα Jurkat /CCR2 παρομοίως εμφανίζεται δραστικότητα μετανάστευσης προς LK79, LK87, LC11-18, LC65A και LC99A κύτταρα σπάρθηκαν σε φρεάτια πυθμένα σύμφωνα με το επίπεδο των CCL2 που παράγονται από κάθε κυτταρική γραμμή (Σχ. 1Α). Τέλος, αυτή η χημειοταξία που προκαλείται από Jurkat /CCR2 προς LK79 ανεστάλη πλήρως από αντι-CCR2 mAb (Σχ. 2Β). Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύτηκε NOG, όγκου αντιγόνο ανεξάρτητο in vivo διακίνησης όγκου που προκαλείται από

CCR2

και

λουσιφεράσης

διπλό επιμολυσμένα κανονική CD3

+ Τ κύτταρα εξετάστηκε με τη χρήση απεικόνισης βιοφωταύγεια . Μία ημέρα μετά την ενδοφλέβια έγχυση, αυτές λουσιφεράσης-επισημασμένο CCR2 εκφράζουν CD3

+ Τ κύτταρα άρχισαν να συσσωρεύονται στη θέση του εμβολιασμένου κυττάρων LK79 στο πρόσθιο κοιλιακό τοίχωμα, ενώ λουσιφεράσης-επισημασμένο CD3

+ Τ κύτταρα που στερούνται CCR2 ήταν διασπείρεται σε όλο το σώμα κατά τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης (Εικ. 2C). Στη συνέχεια, η επικύρωση της λειτουργίας του διπλού επιμολυσμένα κανονική CD8

+ Τ κύτταρα για να εκφράσουν τόσο WT1-ειδικά TCR και CCR2 εκτελέστηκε. Πρώτον, αξιολογήσαμε κατά πόσο η ταυτόχρονη εισαγωγή του CCR2 έβλαψε την WT1-ειδικά κυτταροκτόνο δραστικότητα κατά του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων που προκαλείται από διπλό επιμολυσμένα τελεστή CD8

+ Τ κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α και 3Β, WT1 πεπτίδιο αποκρίνεται κυτταροκτόνο δραστικότητα και δραστικότητα κατά του καρκίνου του πνεύμονα έναντι HLA-A * 2402

+ LK79 κυττάρων (αλλά όχι ότι κατά HLA-A * 2402

– LK87 κύτταρα ως αρνητικός ελέγχου) που προκαλείται από αυτά τα κύτταρα, είναι διπλά θετικά για Vβ5.1 και CCR2 (Σχ. 3C), δεν ήταν σε κίνδυνο σε σχέση με εκείνη που προκαλείται από WT1-ειδικά

ΤΟΚ

single-επιμολυσμένα CD8

+ Τ κύτταρα (Εικ. 1 C). Στη συνέχεια, το συνδυασμένο λειτουργικότητα αντικαρκινική κατά LK79 κυττάρων που προκαλείται από διπλό επιμολυσμένα CD8

+ Τ κύτταρα, η οποία περιλαμβάνει τόσο την αυξημένη δραστηριότητα της διακίνησης όγκου και WT1-ειδικά κυτταροκτόνο δραστικότητα, εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο Transwell πείραμα. Αυτά διπλά επιμολυσμένα CD8

+ Τ κύτταρα (n = 3), αλλά όχι το WT1-σι

TCR

single-επιμολυσμένα CD8

+ Τ κύτταρα (n = 3), στο άνω και αποτελεσματικά μετανάστευσαν στο κάτω μέρος και όπου LK79 κύτταρα είχαν σπαρθεί και προ-επωάστηκαν για 24 ώρες. Τόσο διπλής και WT1-σι

TCR

single-επιμολυσμένα κύτταρα τελεστές φορτώνονται στα ανώτερα φρεάτια ήταν εξίσου 90-92% θετικά για Vβ5.1, και 70-72% των διπλών-μορφομετατροπείς εκφράζεται CCR2 (δεδομένα δεν φαίνεται). Κατά συνέπεια, σημαντικά (

σ

& lt? 0,05) περισσότερα κύτταρα LK79 καταστράφηκαν από μετανάστευσαν διπλό επιμολυσμένα CD8

+ Τ κύτταρα παρά από WT1-σι

ΤΟΚ

single-επιμολύνσεις, όπως εκπροσωπείται από αυξημένα επίπεδα LDH στα υπερκείμενα καλλιέργειας (Σχ. 4Α). Στο τέλος αυτών των πειραμάτων Transwell, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι 3,4 φορές περισσότερο Vβ5.1-θετικά κύτταρα τελεστές παρέμεινε στον πάτο καλά σε επεξεργασία με διπλό επιμολυσμένα CD8

+ Τ κύτταρα 7,91 ± 0,51 (× 10

4 ) για τη διπλή-μορφομετατροπείς, και 2,35 ± 0,13 (× 10

4) για την απλή μορφομετατροπείς, αντίστοιχα), που υποστηρίζουν τα αποτελέσματα της δοκιμασίας LDH. Η μικροσκοπική εξέταση επιβεβαίωσε μεγαλύτερο βαθμό καταστροφής των κυττάρων LK79 στον πυθμένα καλά μετά την κατεργασία με διπλό επιμολυσμένα κύτταρα τελεστές, παρά με κυψελίδες μιας επιμολυνθεί. Επιπλέον, συνεστιακή μικροσκοπική εξέταση αποδεικνύεται κόκκινο-επισημασμένο μετεγκατάσταση CCR2 εκφράζουν κύτταρα τελεστές στον πυθμένα και μόνο μετά από επεξεργασία με διπλό κύτταρα τελεστές γονίδιο-τροποποιημένα. Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα μεταξύ τριών πειραμάτων φαίνεται στο Σχήμα 4Β.

(Α)

CCR2

-transduced Jurkat κύτταρα, αλλά όχι γονικών κυττάρων Jurkat, εμφανίζεται δοσοεξαρτώμενη transwell CCL2-χημειοταξία. Οι αριθμοί των κυττάρων που μεταναστεύουν φαίνεται σε σχέση με εκείνη σε συγκέντρωση CCL2 12,5 ng /mL. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SDS. (Β) Ομοίως, οι αριθμοί των μεταναστεύουν

CCR2

-transduced Jurkat κύτταρα για κάθε καρκινική κυτταρική γραμμή απεικονίζονται. Η μετανάστευση των

CCR2

-transduced Jurkat κύτταρα προφανώς αναστέλλεται από αντι-CCR2 mAb, υποδηλώνοντας ότι ο αριθμός των μεταναστευτικών κυττάρων εξαρτιόταν από το επίπεδο των CCL2 που παράγονται από κάθε κυτταρική γραμμή (στο Σχ. 1Α) και Mediated από το εισαχθέν CCR2 σε κύτταρα Jurkat. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SDS. (C) CCL2-based στόχο αντιγόνου-ανεξάρτητο in vivo διακίνησης όγκου προς εμβολιασμένα κύτταρα LK79 διαμεσολαβείται από

CCR2

επιμολυσμένα CD3

+ Τ κύτταρα επιτυχώς αποδειχθεί σε μια ξενομοσχεύτηκε μοντέλο ποντικού. Χορηγείται με ενδοφλέβια έγχυση λουσιφεράσης-επισημασμένο CD3

+ Τ κύτταρα που εκφράζουν CCR2 (CD3 /CCR2 /Luc) (κάτω), όχι όμως και εκείνες που στερούνται CCR2 (CD3 /luc) (επάνω), άρχισαν να μεταναστεύουν προς τα κύτταρα LK79 αμέσως την ημέρα 1 μετά έγχυση, και στοχευμένη μεταναστευτική τους διατηρήθηκε καθ ‘όλη τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης.

η

(A) Χρησιμοποιώντας το πρότυπο

δοκιμασία απελευθέρωσης 51Cr, αυτά τα διπλά επιμολυσμένα κύτταρα δράστες επαρκώς λύονται 1 μΜ WT1 πεπτίδιο-φορτωμένο, αλλά δεν εκφορτώνονται, τα κύτταρα C 1 R-A24 που εξέφρασαν HLA-A * 2402. αναλογία Ε /Τ υποδηλώνει effector:target αναλογία. μπαρ σφάλμα υποδηλώνει SDS. (Β) Οι εν λόγω διπλό επιμολυσμένα κύτταρα τελεστές επίσης επαρκώς λύθηκαν HLA-A * 2402

+ LK79 κύτταρα, αλλά όχι LK87 κύτταρα που στερούνται του HLA-A * 2402 μόριο που χρησιμοποιείται ως αρνητικός μάρτυρας. (C) Διπλή-επιμολυσμένα CD8

+ Τ κυττάρων εκφράζεται επιτυχώς τόσο της κυτταρικής επιφάνειας CCR2 και Vβ5.1, το συστατικό βλαστικής σειράς του WT1-ειδική αλυσίδα TCR β. [15].