Αφηρημένο

όγκου-ειδικά φορείς αδενοϊού περιλαμβάνουν μια γόνιμη διαγνωστική απεικόνιση και θεραπεία περιοχή του γονιδίου που βασίζονται σε έρευνα για προχωρημένο στάδιο του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της μεταστατικής νόσου. Εντούτοις, η κλινική μετάφραση ιικών φορέων έχει αντιμετωπίσει σημαντικά εμπόδια, σε μεγάλο βαθμό λόγω φιλοξενήσει ανοσοαποκρίσεις κατά του ιού. Εδώ, θα διερευνηθεί η αξιοποίηση της ανοσοκατασταλτικό, ραπαμυκίνη, για να παρακάμψουν την αντι-αδενοϊού ανοσία σε ανοσοεπαρκή μοντέλα καρκίνου του προστάτη ποντικού. Η ραπαμυκίνη μειωμένη αδενοϊικά προκαλούμενη οξεία ανοσολογική αντίδραση με αναστολή της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ? μείωσε επίσης την κλίμακα και καθυστέρησαν την έναρξη της φλεγμονώδους έκκριση κυτταροκινών. Περαιτέρω, βρήκαμε ότι η ραπαμυκίνη ακύρωσε παραγωγή αντι-αδενοϊού αντισώματος και καθυστέρησε την λειτουργία μυελοειδών κυττάρων και λεμφοκυττάρων που ενεργοποιήθηκαν κατά ιικών χορήγηση σε προ-ανοσοποιημένα ξενιστές. Έτσι, η συν-χορήγηση ραπαμυκίνης παρατεταμένη και αυξημένη έκφραση του διαγονιδίου αδενοϊού υπολειπόμενων

in vivo

, και με αυτόν τον τρόπο αυξάνεται η ικανότητα απεικόνισης αδενοϊικών φορέων σε αμφότερες bioluminescent και ποζιτρονίων λεπτομέρειες τομογραφία εκπομπής. Επιπλέον, δείξαμε ότι παρά την εξαιρετική απόκριση των καρκινικών κυττάρων σε έναν κυτταροτοξικό γονίδιο θεραπευτικού φορέα

in vitro

, παρατηρήθηκαν μόνο ελάχιστες θεραπευτικά αποτελέσματα

in vivo

σε προ-ανοσοποιημένους ποντικούς. Ωστόσο, όταν συνδυαστεί γονιδιακή θεραπεία με παροδική ανοσοκαταστολή, επιτεύχθηκε πλήρης διακοπή της ανάπτυξης του όγκου. Συνολικά, παροδική ανοσοκαταστολή από ραπαμυκίνη ήταν σε θέση να ενισχύσει τη διαγνωστική χρησιμότητα και θεραπευτικές δυνατότητες των φορέων αδενοϊού

Παράθεση:. Jiang ZK, Johnson Μ, Moughon DL, Kuo J, Sato M, L Wu (2013) ραπαμυκίνη Ενισχύει αδενοϊό τη μεσολάβηση του καρκίνου απεικόνιση και θεραπεία σε προ-ανοσοποιημένα ποντικού οικοδεσπότες. PLoS ONE 8 (9): e73650. doi: 10.1371 /journal.pone.0073650

Επιμέλεια: Μαρία G Κάστρο, του Πανεπιστημίου του Michigan Ιατρική Σχολή, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 31, 2013? Αποδεκτές: 19, Ιουλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 2η Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Jiang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου χορηγεί RO1CA101904 να LW. ZKJ υποστηρίζεται από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας στο Λος Άντζελες (UCLA) ΜΕΤΣ predoctoral συντροφικότητα και UCLA Διατριβή Έτος υποτροφία. DLM υποστηρίχθηκε από το Υπουργείο Άμυνας των ωοθηκών Ερευνητικό Πρόγραμμα? MJ και DLM υποστηρίχθηκαν από επιχορήγηση Κατάρτισης Tumor Cell Biology (Τ32-CA009056). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

οι αδενοϊικοί φορείς (διαφημίσεις) χρησιμοποιούνται ευρέως ως

in vivo

παράγοντες παράδοσης γονιδίων σε προκλινικές και κλινικές ρυθμίσεις, τόσο για τον καρκίνο διαγνωστικούς και θεραπευτικούς σκοπούς [1,2]. Πρόσφατα, η ομάδα μας έχει αποδείξει την ικανότητά του να ανιχνεύει αγγελίες συγκεκριμένα μετάσταση του καρκίνου μετά από ιογενή διοίκηση του λεμφικού-κατευθυνόμενη ή συστημική [2,3]. Παρά τα ενθαρρυντικά αυτά αποτελέσματα σε ζωικά μοντέλα, πολλά εμπόδια πρέπει να ξεπεραστούν πριν από την εφαρμογή των διαφημίσεων σε κλινικές εφαρμογές, το πιο ανυπέρβλητο εμπόδιο είναι οι ξενιστές ανοσολογικές αποκρίσεις έναντι διαφήμισης (επανεξετάζονται από [4]). Προηγούμενες μελέτες με τρωκτικά και πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου έχουν δείξει ότι η συστηματική ένεση διαφήμισης (ορότυπος 5) εντοπίζεται κυρίως στο ήπαρ και τα μολυσμένα κύτταρα Kupffer, τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα ηπατοκύτταρα [5-7]. μόλυνση Ad αυτών των κυττάρων και δενδριτικών κυττάρων σπληνός (DCS) ξεκινά μια χιονοστιβάδα φλεγμονωδών κυτοκινών και χημειοκινών που χαρακτηρίζεται από πρόωρη επαγωγή της ιντερλευκίνης (IL) -1 και παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF) -α [8,9] που ακολουθείται από την IL-2 , IL-6, φλεγμονώδης πρωτεΐνη μακροφάγων-2 (IL-8), που ρυθμίζεται και φυσιολογικό κύτταρο Τ που εκφράζεται και εκκρίνεται (RANTES), IL-12 και ιντερφερόνη (IFN-γ) [10-15]. Οι παράγοντες αυτοί με τη σειρά τους θα μπορούσαν να προσλαμβάνουν και να ενεργοποιήσει τα κύτταρα τελεστές συμπεριλαμβανομένων των ουδετερόφιλων, μονοκυττάρων, πολυμορφοπυρηνοκύτταρα και

κύτταρα V α14 αμετάβλητα φυσικοί φονείς (ΝΚ), η οποία θα μπορούσε να οδηγήσει σε ιστό (κυρίως στο ήπαρ) ζημιές, άσηπτη σοκ, ακόμα και θάνατο [16-18 ].

Αν και διαφήμισης αναλαμβάνει φλεγμονώδεις προσβολές κατά οικοδεσπότες πυροδοτώντας έμφυτο ανοσοποιητικό αντιδράσεις [5,7,19], το προσαρμοστικό ανοσοποιητικό σύστημα μπορεί επίσης σαφές από τον ιό και ιούς μεταγωγή κύτταρα, παρεμποδίζοντας την αποτελεσματικότητα της διαφήμισης με βάση απεικόνισης και θεραπευτικές προσεγγίσεις [18,20,21]. Επιπλέον, η πλειονότητα του ανθρώπινου πληθυσμού έχει αντισώματα αντι-Ad λόγω πανταχού παρούσα έκθεση σε αυτό το παθογόνο? κατά συνέπεια, η επανειλημμένη χορήγηση Ad φορείς θα εκκινήσει την επέκταση των κυττάρων πλάσματος Ad-ειδική, οδηγώντας σε έντονη δευτερεύουσα έκκριση αντισώματος και επακόλουθη ιική κάθαρση, μειώνοντας τη βιοδιαθεσιμότητα φορέα και δυναμικοποίηση της τοξικότητας ξενιστή [12,20]. Επιπλέον, τα κύτταρα που εκφράζουν το διαγονίδιο θα συναντήσει κυτταρική ανοσολογική κάθαρση [22-24]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, όπως αποβολή δεν περιορίζεται σε Ad κατευθύνεται ανοσία αλλά μπορεί επίσης να συνδέεται με την εισαχθείσα ξένες διαγονίδιο εάν το γονιδιακό προϊόν είναι ανοσογόνος [19]. Δεδομένου ότι οι περισσότεροι απεικόνισης και θεραπευτικά γονίδια είναι εξωγενείς προς τον ξενιστή, το θέμα αυτό ανοσογονικότητα αποτελεί μια σημαντική πρόκληση για την επίτευξη επιτυχούς έκβασης της διάγνωσης Ad-βάση και τη γονιδιακή θεραπεία.

Σε αυτή τη μελέτη, υιοθετήσαμε ένα FDA-εγκεκριμένο ανοσοκατασταλτικό, ραπαμυκίνη (RAPA), για να εκτιμήσει την αξία των παροδική ανοσοκαταστολή στη συμφιλίωση αυτές τις συγκρούσεις μεταξύ διαφήμισης και του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή. RAPA δεσμεύεται με FKBP12 (FK πρωτεΐνη 12 δέσμευσης) και αναστέλλει τη δράση του mTOR συμπλόκου κινάσης 1, ενός ενζύμου σύμπλεγμα ζωτικής σημασίας για ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών λειτουργιών που απαιτούνται για την ταχέως πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα [25,26]. RAPA παρεμποδίζει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου (G1 /S), τον πολλαπλασιασμό, την ενεργοποίηση και την διαφοροποίηση των Τ και Β λεμφοκυττάρων που προκαλείται εις ανταπόκριση σε μία ποικιλία διεγερτικών, καθώς και η ανταπόκριση των DCs και άλλων έμφυτη κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος σε φλεγμονώδη ερεθίσματα [27-30]. Επιπλέον, RAPA επιδεικνύει αξιόλογη αντι-αγγειογένεσης και αντικαρκινικές ιδιότητες [20,31]. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε ότι η ραπαμυκίνη επιτυχώς μειωμένη Ad-σχετίζεται έμφυτη και προσαρμοστική ανοσοαποκρίσεις σε ανοσοεπαρκείς ξενιστές χρησιμοποιώντας δύο προ-ανοσοποιηθεί στελέχη ποντικού. Η στρατηγική που ακολουθούμε θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως πλατφόρμα για τη βελτίωση του προφίλ ασφάλειας και αποτελεσματικότητας της έκφρασης του διαγονιδίου για τη διαφήμισή μεσολάβηση μοριακή απεικόνιση και θεραπείες.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων, αδενοϊό και τα ναρκωτικά

ποντικού κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη RM-9 (ένα είδος δώρο από τον Dr. Timothy C. Thompson, Baylor College of Medicine [32]) και MycCaP (ένα είδος δώρου από τον Dr. Charles Sawyers [33]) καλλιεργήθηκαν σε DMEM μέσο που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Η ενδοπεριτοναϊκή (ε.π.) δόση ραπαμυκίνης (LC Laboratories, Woburn, ΜΑ) διαλύθηκε σε αποστειρωμένο DMSO και χρησιμοποιήθηκαν στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Το στόμα εφαρμόζονται Rapamune αγοράστηκε από την Wyeth Pharmaceuticals Inc, Philadelphia, PA. Ganciclovir (GCV) (Cytovene-IV? Genentech, ομάδα Roche, South San ΡΓβηοίεσο, CA) ανασυστάθηκε με αποστειρωμένο νερό, αραιώνεται με στείρο αλατόνερο και χρησιμοποιήθηκε σε 50 mg /kg /ημέρα για

in vivo πειράματα

ή υποδεικνυόμενη δόση για

in vitro πειράματα

ορότυπο Ad 5 φορείς κατασκευάστηκαν με βάση ένα τροποποιημένο σύστημα AdEasy -. το σύστημα AdNUEZ, στο οποίο διαγονίδια μπορούν να τοποθετηθούν μέσα στην Ε3 περιοχή με πολλαπλές θέσεις κλωνοποίησης . Ο ομόλογος ανασυνδυασμός του pAdEZ και pShuttle πραγματοποιήθηκε στο

Ε. Coli

BJ5183 ικανά κύτταρα. Viral κλώνοι υποβλήθηκαν σε διαλογή, πολλαπλασιάζονται, καθαρίστηκαν και τιτλοποιήθηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [3]. Όλα Διαφημίσεις που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη είναι ελλιπούς αναδιπλασιασμού. Το άδειο Ad περιέχει Ε1 και Ε3-διαγράφονται ιογενή σπονδυλική στήλη, χωρίς διαγονίδια. Ο τίτλος όλων των φορέων Ad προσδιορίστηκε με δοκιμασίες πλάκας, εξ ου και η μονάδα σχηματισμού πλάκας (PFU).

Για GCV

in vitro δοκιμασία

ευαισθησία, RM-9 και MycCap κύτταρα μολύνθηκαν με διαφημίσεις σε πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 100 και υποβάλλεται σε επεξεργασία με GCV από την ημέρα 2 έως την ημέρα 7 μετά την μόλυνση (ρί). Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Kit-8 κυττάρων Μετρώντας (CCK-8) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Dojindo Laboratories, Japan).

πειράματα σύμφυτη ανοσοαπόκριση

Όλα τα ζωικά πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με η φροντίδα και χρήση επιτροπής UCLA Θεσμικών των ζώων, που είναι γνωστή ως επιτροπή της Καγκελαρίας ζώων Έρευνας (ARC), τις κατευθυντήριες γραμμές (ARC # 2002-049-33? εγκριθεί μέσω της 03/20/2014). 4-5 εβδομάδων ποντικούς BALB /c (Taconic Farms, Germantown, ΝΥ) δόθηκαν ημερησίως από του στόματος θεραπεία της Rapamune (30 mg /kg? Wyeth, Madison, NJ) 3 ημέρες πριν την ενδοφλέβια (i.v.) ιική ένεση. Τα δείγματα ορού από ποντικούς συλλέχθηκαν και κυτοκινών ELISA διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (κυτοκίνης Mouse ELISA Kit, BD Biosciences). Οι ποντικοί ιστοί ήπατος λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε στύπωμα western. Rabbit anti-ΙκΒ-α (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-β ακτίνης (Sigma, St. Louis, ΜΟ), χρησιμοποιήθηκαν αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας (Santa Cruz) .

SCID και να πειραματιστούν με φυσιολογικό ανοσοποιητικό σύστημα σύγκρισης των ζώων

5-6 εβδομάδων αρσενικά SCID και BALB /C129 ποντίκια (Taconic Farms) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Rapamune ημερησίως από του στόματος για 3 ημέρες και στη συνέχεια intraprostatically ένεση με 2 × 10

8 PFU του Firefly λουσιφεράσης (FL) εκφράζοντα διαφημίσεων. Η έκφραση λουσιφεράσης παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας ένα IVIS ψύχεται κάμερα CCD (Xenogen, Alameda, CA). Εικόνες αναλύθηκαν με τον Igor-PRO Λογισμικό LivingImage (Xenogen).

πείραμα απεικόνισης PET

RM-9 κύτταρα εμφυτεύθηκαν υποδορίως στο δεξιό ώμο των αρσενικών C57BL /6 ποντίκια (Taconic Farms), η οποία, 7 ημέρες αργότερα, που ελήφθη από το στόμα φυσιολογικό ορό ή θεραπεία Rapamune για 4 ημέρες. 5 × 10

8 PFU sr39tk εκφράζουν διαφήμισης στη συνέχεια εντός του όγκου ένεση και 6 ημέρες αργότερα τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε απεικόνιση ΡΕΤ με

18F-FHBG όπως περιγράφηκε προηγουμένως [3]. Μια συνεδρία απεικόνισης CAT 10 λεπτών που ακολουθείται για την παροχή δομικές πληροφορίες.

πειράματα απεικόνισης σε προ-ανοσοποιηθεί μοντέλα

4 έως 5 εβδομάδων C57BL /6 και FVB ποντικούς (Taconic Farms) εμφυτεύθηκαν με RM-9 ή MycCaP όγκων, αντίστοιχα. Και στα δύο μοντέλα, τα ζώα προ-εκτεθεί σε Ad με ε.π. ένεση του 1 × 10

8 PFU του κενού ιού. Τρεις εβδομάδες μετά την πρωτογενή ιική έκθεση, 2,5 × 10

5 RM-9 κύτταρα ή 3 × 10

6 κύτταρα MycCaP στη συνέχεια εμφυτεύονται υποδορίως στη δεξιά λαγώνα των ζώων σε matrigel (1: 1 ν /ν? BD βιοεπιστήμες). Ενδείκνυται δόση (για C57BL /6) ή 5 mg /kg (για FVB) ημερησίως ε.π. RAPA ή αραιωτικά θεραπεία ξεκίνησε όταν όγκου ήταν ψηλαφητοί (~ (5 mm)

3) και 3 ημέρες αργότερα, τα ζώα έλαβαν ένεση εντός του όγκου 1 × 10

8 PFU (για C57BL /6) ή 5,42 × 10

8 PFU (για FVB) Ads FL-έκφραση. Τα ζώα έλαβαν συνεχίστηκε καθημερινά RAPA ή θεραπεία αραιωτικά μέχρι το τέλος της μελέτης. Απεικόνιση βιοφωταύγειας διεξήχθη σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία, όπως περιγράφεται παραπάνω.

χρώση ανοσοφθορισμού

Υποδόρια όγκοι ανατμήθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε κασέτα ιστολογία σε 3% παραφορμαλδεΰδη στους 4

° C όλη τη νύκτα. Ενσωματωμένα σε παραφίνη τμήματα όγκων (5 μm) έγιναν στο εργαστήριο παθολογίας στο UCLA. Αντι-F4 /80 (1: 500? Serotec, Raleigh, NC) και αντι-CD31 (1: 300? BD Biosciences, Bedford, ΜΑ) αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για τη χρώση των τμημάτων του όγκου. Ελήφθησαν εικόνες χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Eclipse 90i από Nikon

Η κυτταρομετρία ροής των όγκων

Υποδόρια όγκοι ανατμήθηκαν και διαχωρίστηκαν με σωματικά κοπής και επεξεργασίας κολλαγενάσης (Invitrogen, Carlsbad, CA?. 80 μονάδες /mL σε μέσο ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS) στους 37

° C για 1,5 ώρες. Τα μυελοειδή κύτταρα ορίζονται με χρώση CD11b και CSF1R ενώ τα λεμφοκύτταρα ορίζονται ως CD11b- CD4 + ή CD8 + CD11b-. Για να γίνει η «διέγερση» μέσο που χρησιμοποιείται στο πείραμα αντιδραστικότητα των κυττάρων Τ, 7.6 × 10

6 κύτταρα MycCaP μολύνθηκαν με 3,8 × 10

7 PFU FL εκφράζουν Ad? 36 ώρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε 200 μL ρυθμιστικό λύσης παθητική (Promega, Madison, WI), υποβάλλεται σε τρεις κύκλους ψύξης-απόψυξης και-και φυγοκεντρήθηκε. Το μέσο διέγερσης περιείχε 120 μg /mL λύμα των κυττάρων και 3 × 10

7 PFU /mL άδειο ιό. Τα κυτταρικά εναιωρήματα από διαχωρισμένο όγκους μετά επωάστηκαν με απλό ή αυτό το μέσο διέγερσης σε 37

° C για 3,5 ώρες. Όλα κυτταρομετρίας ροής αντισώματα αγοράστηκαν από την BD Biosciences.

Θεραπευτικές μελέτες

4 έως 5 εβδομάδων αρσενικά ποντίκια FVB (Taconic Farms) είχαν προ-εκτεθεί σε αγγελίες από ε.π. ένεση του 1 × 10

8 PFU του κενού ιού. 3 εβδομάδες αργότερα, 3 × 10

6 κύτταρα MycCap εμφυτεύθηκαν υποδορίως στη δεξιά λαγώνα των ζώων σε ένα 1: 1 ν /ν μίγμα αποστειρωμένο PBS και matrigel (BD Biosciences). Οι όγκοι έγιναν ψηλαφητή (~ (5 mm)

3), πέντε ημέρες αργότερα και καθημερινή ε.π. RAPA ή αραιωτικό θεραπεία ξεκίνησε για τέσσερις διαδοχικές ημέρες. Τα ζώα στη συνέχεια έλαβαν ένεση εντός του όγκου 6 × 10

8 PFU ελέγχου (FL-έκφραση) ή θεραπευτικό διαφημίσεων. RAPA ή θεραπεία αραιωτικό στη συνέχεια συνεχίστηκε για 7 ημέρες. 50 mg /kg /ημέρα GCV χορηγήθηκε στις θεραπευτικές ομάδες αρχίζοντας την ημέρα 1 μετά την ιική ένεση. Οι όγκοι μετρήθηκαν με παχύμετρο δύο φορές την εβδομάδα μέχρι το τέλος της μελέτης. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία 30 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου.

αντι-αδενοϊού τιτλοδότηση αντισωμάτων

ορός ποντικιού λήφθηκε πριν ιική χορήγηση και στο τελικό σημείο της μελέτης με οπισθοκογχική αφαίμαξη που ακολουθείται από φυγοκέντρηση σε μια επιτραπέζια φυγόκεντρο στις 8000 στροφές ανά λεπτό για 10 λεπτά. Πλάκες 96-φρεατίων επικαλύφθηκαν με 1,5 × 10

7 ΡΡυ /φρεάτιο αδενοϊό σε 100 μι του ρυθμιστικού διαλύματος ανθρακικού νατρίου (0,1 mol /L, ρΗ 8,8) και επωάστηκαν στους 4

° C όλη τη νύκτα. Κατά τη στιγμή της δοκιμασίας, το ιικό διάλυμα απομακρύνθηκε και η πλάκα επωάστηκε με 6% αντιδραστήριο αποκλεισμού (Roche, Indianapolis, ΙΝ) σε 0,05% PBS-Tween σε 37

° C για 1 ώρα. Διαδοχικές αραιώσεις ορού ποντικού έγινε εις διπλούν και επωάστηκαν σε 37

° C για 2 ώρες, ακολουθούμενη από 5 φορές πλύση του με 0,5% PBS-Tween. Βιοτινυλιωμένο κατσίκας αντι-ποντικού IgM και IgG (Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA) αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για επώαση της πλάκας σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα ακολουθούμενη από 5 φορές της πλύσης. Στρεπταβιδίνη-HRP (PerkinElmer, Boston, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για να επωαστεί η πλάκα σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, ακολουθούμενο από πλύσεις και ανάπτυξη με υπόστρωμα ΤΜΒ (Thermo επιστημονικές, Rockford, IL). Η οπτική πυκνότητα του τρυβλίο κατόπιν αναγνώστηκε σε μήκος κύματος 450 nm. Το αντι-αδενοϊού τίτλο αντισώματος προσδιορίστηκε ως η μεγαλύτερη αραίωση στην οποία η μετά-ιικά ορό έχει μια ανάγνωση του 0,05 μεγαλύτερη από την αντίστοιχη προ-ιική ορό.

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αταίριαστα ή σε συνδυασμό δύο-ουρά

t

τεστ. Για όλες τις αναλύσεις, η P & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Η ραπαμυκίνη μειωμένη Ad-προκάλεσε έμφυτο ανοσοποιητικό απαντήσεις

Ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου-στόχου και του μηχανισμού εισόδου κυττάρων, λοίμωξη Ad μπορεί να προκαλέσει ένα ευρύ ρεπερτόριο μορίων σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του λιπιδίου ΡΙ3Κ κινάσης, που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ), εστιακή προσκόλληση κινάση ERK1 /2, και τα μονοπάτια JAK-STAT [4,5,8,11]. Πυρηνικού παράγοντα (NF) -κB είναι μια κοινή καθοδικός τελεστής για την ενεργοποίηση των πολλαπλών οδών σηματοδότησης [8]. Ζητήσαμε πρώτα, με την υποβολή ερωτημάτων στη αποικοδόμηση του αναστολέα ΙκΒ του, αν θα μπορούσε να μειώσει RAPA Ad-επαγόμενη ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ. Εμείς εγχυθεί αλατόνερο ή 1 × 10

9 PFU του Ad ενδοφλεβίως (ί.ν.) σε έλεγχο αραιωτικό ή RAPA αγωγή BALB /c ποντίκια, που συγκομίζονται ιστό ήπατος σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία και τους υπέβαλαν σε western blot. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, Ad προκάλεσε έντονη αποικοδόμηση της ΙκΒ (και επομένως ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ) στις 6 και 12 ώρες μετά την ένεση (ρ.ί.)? RAPA καταργηθεί αυτό το αποτέλεσμα.

(Α) Ποντικοί BALB /c έλαβαν ημερήσια στοματική ραπαμυκίνης (30 mg /kg) ή αλατούχο διάλυμα αγωγή 3 ημέρες πριν από την ί.ν. ένεση του 1 × 10

9 PFU Ad-CMV-FL ή φυσιολογικό ορό. Ήπαρ ιστοί από αυτούς τους ποντικούς συλλέχθηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία, λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε στύπωμα western για να εξετάσει την υποβάθμιση ΙκΒα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. m1, m2 και m3: ποντίκι 1, 2 και 3 σε κάθε ομάδα σε κάθε χρονικό σημείο. (Β) Οι οροί από αυτά τα ποντίκια συλλέχθηκαν σε 1, 6 ή 12 ώρες και τα επίπεδα κυτοκινών προσδιορίστηκαν με ELISA. Οι ράβδοι σφάλματος: μέση τιμή + SEM (n = 3). ns, δεν είναι σημαντική? *, P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0,001 από δίπλευρη

t

τεστ σε σύγκριση με το Ad μόνη ομάδα

Η

Καθώς η δράση της NF-κΒ συνδέεται με τη μεταγραφή πολλών φλεγμονωδών παραγόντων, η. αποτελέσματα στο Σχήμα 1Α πρότεινε ότι RAPA θα μπορούσε να μετριάσει αποτελεσματικά το Ad-προκάλεσε θύελλα κυτοκίνης στα ζώα. Για να ακολουθήσει περαιτέρω αυτό το θέμα, εξετάσαμε τα επίπεδα του ενός πάνελ κυτοκινών και χημειοκινών από αυτά τα ποντίκια ορό. IL-1 και TNF-α είναι μεταξύ των πρώτων κυτοκίνες που ενεργοποιούνται από Ad? οδηγούν σε έκφραση άλλων κατάντη παράγοντες και επίσης αναμεταδίδει σήματα στο προσαρμοστικό ανοσοποιητικό σύστημα [24]. IL-6 και IL-8 παίζουν ουσιώδη ρόλο στην στρατολόγηση των κυττάρων τελεστών, όπως τα ουδετερόφιλα, με το ήπαρ και συνδέονται άμεσα με Ad σχετίζονται ηπατική τραυματισμούς? IL-10 είναι ένας βασικός ρυθμιστής της ανάπτυξης του χυμική ανοσία [10,11,13,34]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, Ad σημαντικά αυξημένη ΤΝΡ-α, IL-6, MKC (ποντικού κερατινοκύτταρα που προέρχονται Cytokine, ανάλογο με την ανθρώπινη IL-8), IL-10 και IL-12p70 έκκριση στο 1- και 6-ώρες και IL -1β επίπεδο 6 ώρες pi? RAPA μπλοκάρει σημαντικά την επαγωγή αυτών των κυτοκινών. Επιπλέον, η έναρξη της παραγωγής IFN-γ καθυστέρησε κατά RAPA από 6 μέχρι 12 ώρες μμ. Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η θεραπεία RAPA μπορεί να μειώσει το μέγεθος ή να καθυστερήσει την έναρξη των συστατικών της Ad-επαγόμενης καταιγίδα κυτοκίνης.

Η ραπαμυκίνη ενισχυμένες Ad-παραδοθεί έκφραση του διαγονιδίου

Στιβαρή και επίμονη διαγονιδιακή έκφραση είναι ζωτικής σημασίας για τη διασφάλιση διαγνωστική και θεραπευτική αποτελεσματικότητα των διαφημίσεων. Ως εκ τούτου, στόχος μας ήταν να προσδιοριστεί η επίδραση του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή στην έκφραση διαγονιδίων Ad-μεσολάβηση. Εμείς εγχέεται λουσιφεράση της πυγολαμπίδας (FL) εκφράζοντα Ad στον προστάτη του ανοσοεπαρκείς BALBc /129 ή σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) και χρησιμοποιήθηκε

in vivo

απεικόνιση βιοφωταύγειας για την παρακολούθηση της έκφρασης FL επί 5 εβδομάδες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, τόσο η διάρκεια και το μέγεθος της έκφρασης διαγονιδίου ήταν κατά πολύ μειωμένη σε BALBc /129 ποντίκια που κατείχε άθικτο ανοσοποιητικό λειτουργίες σε σχέση με τα ποντίκια SCID. Στη συνέχεια, ρωτήσαμε αν RAPA θα μπορούσε να μετριάσει τέτοια ανασταλτικά αποτελέσματα που παρουσιάζονται από το ανοσοποιητικό σύστημα προσαρμοζόμενης υποδοχής. Καθώς ο τελικός στόχος της μελέτης αυτής είναι να διευκολύνει την κλινική μετάφραση των διαφημίσεων, εξετάσαμε αν RAPA θα μπορούσε να αυξήσει Ad-μεσολάβηση απεικόνισης καρκίνου χρησιμοποιώντας τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (ΡΕΤ), μια κλινικά σχετική μέθοδο απεικόνισης. Το γονίδιο αναφοράς απεικόνισης που χρησιμοποιούνται σε αυτό το πείραμα είναι η HSV1-sr39tk, μια βελτιωμένη μορφή παραλλαγής του γονιδίου κινάσης θυμιδίνης ιού απλού έρπη, και ο ανιχνευτής για το γονίδιο αυτό είναι το υπόστρωμα του

18F-FHBG [35]. RM-9 όγκων του προστάτη εμφυτεύθηκαν σε συγγενικούς, ανοσοεπαρκή C57BL /6 ποντίκια και τα ποντίκια που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με όχημα ή RAPA πριν από ενδοογκική Ad-CMV-sr39tk ένεση. ανάλυση PET έξι ημέρες μετά την ιογενή ένεση αποκάλυψε σαφώς αυξημένη sr39tk ειδικές

όγκων σήματος 18F-FHBG στα τέσσερα ποντίκια στην RAPA επεξεργασμένο ομάδα? Αντιθέτως, μόνο ένα ποντίκι στην ομάδα ελέγχου εμφάνισε ασθενές σήμα (Σχήμα 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι RAPA μπορεί να ενισχύσει την έκφραση του διαγονιδίου Ad-μεσολάβηση σε ξενιστές ανοσοεπαρκών, Boding καλά για την χρησιμότητα του συνδυασμού αυτής της μορφής παροδική ανοσοκαταστολή με διαγνωστικής απεικόνισης Ad προσεγγίσεις στο κλινικό πλαίσιο.

(Α) 2 × 10

8 PFU ειδικού προστατικού FL-εκφράζουν Ad είχε ορθοτοπικά εγχέεται στο προστάτη του ανοσοεπαρκείς BALBc /129 ή ανοσοανεπαρκείς SCID ποντικούς. FL απεικόνιση διεξήχθη σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά την ιογενή διοίκηση. bar Χρώμα: φωτόνια /δευτερόλεπτο /cm

2 /SR. (Β) Αρσενικοί C57BL /6 ποντικών που φέρουν υποδόριους όγκους RM9 δόθηκε φυσιολογικό ορό ή θεραπεία ραπαμυκίνης για 4 ημέρες ξεκινώντας στις 7 ημέρες μετά την εμφύτευση του όγκου. Στη συνέχεια, 5 × 10

8 PFU sr39tk εκφράζουν διαφήμισης εγχύθηκε εντός του όγκου. απεικόνισης PET έγινε 6 ημέρες αργότερα με

18F-FHBG. Υποδόρια όγκοι που υποδεικνύεται από κόκκινα βέλη.

Η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω το συνδυασμό φαρμάκων και την προσέγγιση μοριακή απεικόνιση σε κλινικά σχετικά σενάρια, ρωτήσαμε αν η επίδραση ενίσχυσης της RAPA μπορεί να επεκταθεί και σε ζώα με προϋπάρχουσα αντι -ad ασυλία. Χρησιμοποιήσαμε δύο στελέχη ποντικών ανοσοϊκανά, C57BL /6 και FVB, και να τους ανοσοποιηθεί με ένα δόση ενδοπεριτοναϊκή (ε.π.) 1 × 10

8 PFU άδειο Ad (πειραματική χρονοδιάγραμμα που φαίνεται στο Σχήμα 3Α). Αυτό το καθεστώς ιική ανοσοποίησης οδήγησε στην ανάπτυξη ισχυρών αντι-Ad χυμική ανοσολογική απόκριση σε αυτά τα ποντίκια (Σχήμα S1 στο File S1). Συγγενικών όγκων του προστάτη (RM-9 ή MycCaP [36]) στη συνέχεια εγκατεστημένος υποδορίως 3 εβδομάδες μετά την πρωτογενή ανοσοποίηση ιογενή. Η υποδόρια μοντέλο επελέγη κατά την ορθοτοπική ένα για αυτή την αρχική απόδειξη της κύρια μελέτη λόγω της δυνατότητας πρακτικής εντός του όγκου ιικού χορήγησης, την εκτίμηση του μεγέθους του όγκου, καθώς και την εξασθένηση των σημάτων βιοφωτισμού από τα βαθύτερα προστατικών όγκων. Όταν οι όγκοι έγιναν ψηλαφητή (4-5 ημέρες για RM9? 5-7 ημέρες για MycCaP), καθημερινή ε.π. ένεση RAPA ή αραιωτικό χορηγήθηκε. 3 ημέρες αργότερα, τα ζώα έλαβαν το δευτερεύον εντός του όγκου ένεση FL εκφράζουν διαφήμισης (1 × 10

8 PFU για RM9? 5 × 10

8 PFU για MycCaP). Απεικόνιση βιοφωταύγειας διεξήχθη για την παρακολούθηση της έκφρασης FL. Στο μοντέλο RM-9 όγκου, υψηλή (5 mg /kg), μέσο (1.5 mg /kg) και χαμηλή (0,5 mg /kg) δόσεις RAPA ελέγχθηκαν? Όλες οι δοσολογίες ενισχυμένη έκφραση FL την ημέρα 4 σε σχέση με τα ποντίκια που έλαβαν το αραιωτικό (έλεγχος). Η διαγονιδιακή έκφραση εξαφανίστηκε την ημέρα 7 σε ποντίκια ελέγχου, αλλά ήταν ακόμα ανιχνεύσιμη σε RAPA αγωγή ομάδες (Σχήμα 3Β). Στο μοντέλο όγκου FVB συμβατή MycCaP, μόνο 5 mg /kg RAPA ελέγχθηκε? ποντικοί που ακολουθείται από απεικόνισης για 21 ημέρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C-D, RAPA αυξημένο επίπεδο έκφρασης FL την ημέρα 4, και σημαντικά διευρυνθεί διαγονιδίου επιμονή για τουλάχιστον 21 ημέρες, η οποία ήταν το τελευταίο χρονικό σημείο που εξετάστηκαν. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι, ακόμη και κάτω από την πρόκληση της προϋπάρχουσα ανοσία, RAPA μπορεί να αυξήσει την έκφραση του Ad-παραδοθεί γονίδιο αναφοράς απεικόνισης και να παρατείνει τη διαγνωστική παράθυρο. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν, επίσης, ότι οι διευκόλυνση επιπτώσεις της RAPA δεν είναι καρκινικά Μοντέλο- ή ποντίκι στελέχους-ειδική.

(Α) Το χρονοδιάγραμμα για τα μοντέλα προ-ανοσίας. Τα ζώα ευαισθητοποιήθηκαν με μια ενδοπεριτοναϊκή δόση 1 × 10

8 PFU άδειο διαφημίσεων και 3 εβδομάδες αργότερα, υποδόρια όγκοι εμβολιάστηκαν. RM9 όγκων έγινε χειροπιαστή 4-5 ημέρες μετά την εμφύτευση? όγκοι MycCaP έγινε χειροπιαστή 5-7 ημέρες μετά την εμφύτευση. Σε αυτό το σημείο, η ραπαμυκίνη ή τον έλεγχο της θεραπείας που ξεκίνησε και φορείς απεικόνισης εντός του όγκου διαφήμισης χορηγήθηκαν 4 ημέρες αργότερα. Καθημερινή αγωγή ραπαμυκίνης συνεχίστηκε μέχρι το τέλος της μελέτης. FL απεικόνιση βιοφωταύγειας πραγματοποιήθηκε σε χρονικά σημεία που υποδεικνύονται στα Β και C. (Β) FL απεικόνιση βιοφωταύγειας του RM-9 που φέρει C57BL /6 ποντίκια την ημέρα 4 και 7. Υψηλή: 5 mg /kg /ημέρα ραπαμυκίνη? Μέσο: 1,5 mg /kg /ημέρα? Χαμηλή: 0,5 mg /kg /ημέρα. n = 3. (C) FL βιοφωταύγειας απεικόνιση MycCaP φέρουν FVB ποντικών (η = 3 ή 4) σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. (Δ) Ποσοτικοποίηση των σημάτων απεικόνισης από C. Χρώμα μπαρ της bioluminescent απεικόνισης: καταμέτρηση των φωτονίων. Οι ράβδοι σφάλματος: μέση τιμή ± SEM (n = 4 μόνο Ad? n = 3 για τη διαφήμισή + RAPA). * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01 από δύο-ουρά

t

τεστ

Η

Η ραπαμυκίνη κατέστειλε αντι-διαφήμισης προσαρμοστικές ανοσολογικές αποκρίσεις

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το υποκείμενος μηχανισμός αποτελέσματα προαγωγής RAPA για έκφραση διαγονιδίου Ad σε προ-ανοσοποιημένα ξενιστές, εξετάσαμε πρώτα τον τίτλο αντισωμάτων αντι-Ad στους ορούς των ποντικιών στο τέλος των προηγούμενων μελετών. Στο μοντέλο RM-9, και οι δύο μεσαίες και υψηλές δόσεις RAPA, αλλά όχι η χαμηλή δόση RAPA, εμπόδισε δευτερογενούς παραγωγής αντι-Ad IgG σε προ-ανοσοποιημένα ποντίκια C57BL /6 (Σχήμα S2 κατά αρχείου S1). Μια δοκιμή με το μεγαλύτερο μέγεθος ομάδα έδειξε ότι η υψηλή δόση RAPA μειωθεί IgG τίτλος από 1,36 ± 0,33 × 10

5 με 9,88 ± 2,02 × 10

3 (P = 0.0021, δίπλευρη

t

δοκιμή ? η = 8) (Σχήμα 4Α). Ομοίως, RAPA μειωμένη τελικού σημείου IgG τίτλος κατά σχεδόν 3-φορές σε προ-ανοσοποιημένα ποντίκια FVB (Ρ = 0,0368, δίπλευρη ζεύγη

t

δοκιμή? Η = 3 έως 4) (Σχήμα 4Α). Αυτά τα δεδομένα συμφωνούν με προηγούμενες μελέτες που δείχνουν αναστολή RAPA για Ad-προκάλεσε ενεργοποίηση Β κυττάρων και την παραγωγή IgG [20]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, επικεντρωθήκαμε σε τίτλους IgG πάνω IgM, επειδή η έκκριση IgM προηγηθεί εκείνη της IgG και ήταν ένα μικρότερου μεγέθους σε αυτές τις προ-ανοσοποιημένα ζώα. Επιπλέον, η δευτερογενής ιογενή έκθεση θα προκαλέσουν αλλαγή ισοτόπου σε IgG [37]. Παρ ‘όλα αυτά, Xu et al. ανέφεραν πρόσφατα τα ανασταλτικά αποτελέσματα των φυσικών αντισωμάτων IgM στην μεταγωγή Ad [38]? υπό το φως αυτών των αποτελεσμάτων, δείξαμε ότι RAPA παρουσίασαν επίσης κατασταλτική επίδραση στο επίπεδο των IgM που θα μπορούσε να συνδεθεί με Ad (Σχήμα S3 σε S1 File).

(Α) FVB και C57BL /6 ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή σύμφωνα με με το πρωτόκολλο που δείχνεται στο Σχήμα 3Α. δείγματα ορού ποντικού συλλέχθηκαν στο τέλος της μελέτης και υποβάλλονται σε ELISA για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων αντι-διαφήμισης (FVB: σημαίνει από 3 ανεξάρτητες δοκιμές? *, Ρ = 0,0368 από δύο-ουρά ζεύγη

t

τεστ C57BL /. 6: αντιπροσωπευτικά δεδομένα από 2 ανεξάρτητες δοκιμές (n = 10)? **, Ρ = 0.0021 από δύο ουρών

t

τεστ). Οι ράβδοι σφάλματος: μέση τιμή + SEM. (Β) χρώση ανοσοφθορισμού Εκπρόσωπος των λεπτών τομών από RM-9 όγκους με ενδεικνυόμενη θεραπεία. Ροζ, μακροφάγων F4 δείκτη /80? πράσινο, των αιμοφόρων αγγείων CD31 δείκτη? μπλε: DAPI. Κλίμακα bar = 200 μm. (C) RM-9 όγκου από υποδεικνύεται ομάδες αγωγής διαχωρίστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για μυελοειδή και Τ κύτταρα πληθυσμούς. Μυελοειδούς γραμμής κυτταρικού ορίστηκε με χρώση CD11b. Οι ράβδοι σφάλματος: μέση ± SEM (n = 5). ns, δεν είναι σημαντική? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001 σε σύγκριση με Ad μόνη ομάδα από δύο-ουρά αταίριαστο

t

τεστ. (Δ) όγκοι MycCaP από τον έλεγχο ή ζώα ραπαμυκίνη-αγωγή (η = 3) συλλέχθηκαν σε διάμετρο 1,5 cm, διαχωρίστηκαν, και στη συνέχεια επωάστηκαν με απλά μέσα ή μέσα που περιέχουν αδενοϊό και Ad-μολύνθηκαν κυτταρικό λύμα MycCaP για 3,5 ώρες στους 37 ° C , χρωματίστηκαν με ενδοκυτταρικά αντισώματα ΙΡΝ-γ και υποβλήθηκαν σε κυτταρομετρία ροής. IFN-γ έκφραση με διέγερση ήταν τότε ομαλοποιήθηκε ως προς τα αντίστοιχα μη-διεγερμένη ελέγχου (ορίζεται ως 100%). υποσύνολα Τ κυττάρων που οριοθετείται από χρώση CD4 και CD8. Οι ράβδοι σφάλματος: μέση τιμή + SEM (n = 3). *, P = 0.0431 από δύο-ουρά αταίριαστο

t

τεστ.

Η

Στη συνέχεια, θα διερευνηθεί ο ρόλος RAPA στη ρύθμιση που βασίζεται σε κύτταρα ανοσίας αντι-διαφήμισης [26,28]. Συγκεκριμένα, εκτιμήθηκε τόσο διείσδυση και ενεργοποίηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος σε Ad-εγχυθεί όγκους. Στο μοντέλο RM-9, ανοσοφθορισμού χρώση αποκάλυψε μεγαλύτερη διείσδυση του F4 /80 θετικά μακροφάγα ενεργοποιούνται με ένεση διαφημίσεων. Ωστόσο, η διήθηση των μακροφάγων ήταν σημαντικά κατασταλεί με RAPA (Σχήμα 4Β). Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε κυτταρομετρία ροής για να επιτευχθεί καλύτερη ποσοτικοποίηση των ενδοογκική πληθυσμών μυελοειδούς κυττάρου (CD11b + /CSF1R +). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα χρώσης ανοσοφθορισμού, θεραπεία RAPA μειώθηκε σημαντικά μυελοειδή διείσδυση στους όγκους (Σχήμα 4C, πρώτο τμήμα). Ιδιαίτερα, τα κύτταρα που εκφράζουν διέγερσης αποικιών υποδοχέα παράγοντα-1 (CSF1R), ένα κρίσιμο μόριο για τη διαφοροποίηση των μακροφάγων, DCS, και άλλα μονοκύτταρα μυελοειδή προερχόμενα [39], ήταν σχεδόν πλήρως εξαλειφθεί με RAPA (Σχήμα 4C, δεύτερο τμήμα) σε αυτά που διηθούν όγκο μυελοειδή κύτταρα. Επιπλέον, τόσο το ώριμο (CD69 +) και ανώριμα (CD62L +) φαινότυποι των CD4 + Τ κυττάρων (CD11b- /CD4 +) μειώθηκαν κατά RAPA (Σχήμα 4C, τρίτο τμήμα), υποδηλώνοντας ότι τόσο η στρατολόγηση και ενεργοποίηση των CD4 + Τ κύτταρα παρεμποδίζεται. CD8 + κυτταροτοξικά Τ κύτταρα (CD11b- /CD8 +) εμφανίστηκε επίσης να μειωθούν κατά RAPA (Σχήμα 4C, το τελευταίο πάνελ) αν και το περιεχόμενο CD8 + του RM-9 όγκους ήταν πολύ χαμηλή, και έτσι είναι δύσκολο να μετρηθεί με ακρίβεια. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε συμφωνία με άλλες αναφορές [20], RAPA μειωμένη αγγειογένεση όγκου, όπως αντανακλάται από τη μειωμένη χρώση του δείκτη αγγείωσης CD31 (Σχήμα 4Β), προσφέροντας έναν άλλο πιθανό μηχανισμό υποκείμενες αναστολή RAPA των ανοσοκυττάρων διήθηση και ενεργοποίηση που παρατηρείται σε αυτό το μοντέλο.

Στη συνέχεια, επιδιώξαμε να καθορίσει εάν RAPA θα μπορούσε να επηρεάσει τη δραστικότητα διηθητικών του όγκου κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος προς την κατεύθυνση διαφήμισης και Ad-μολυσμένα, διαγονιδίου που εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα. IFN-γ, ένας βασικός ρυθμιστική κυτοκίνη για την ανάπτυξη των κυττάρων Τ και την ενεργοποίηση, επιλέχθηκε ως ένδειξη για τη λειτουργικότητα του ανοσοποιητικού κυττάρου. όγκοι MycCaP, που ιδρύθηκε σε ποντίκια με προ-ανοσία σε διαφήμιση, όπως σημειώνεται στο σχήμα 3Α και C, συλλέχθηκαν σε διάμετρο 1,5 cm και διαχωρίζεται σε μεμονωμένα κύτταρα. Τα διαχωρισμένα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με μέσο ή με ένα κοκτέιλ «διέγερση» που αποτελείται από αδενοϊικών σωματιδίων και κυτταρολύματος από κύτταρα μολυσμένα με MycCaP FL-εκφράζουν ιό. παραγωγή ΙΡΝ-γ από τα Τ κύτταρα κατά τη διέγερση στη συνέχεια αξιολογούνται από ενδοκυτταρική χρώση και κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4D, στην κοόρτη χωρίς θεραπεία RAPA (-, έλεγχος), Ad-διαμεσολαβούμενη διέγερση είχε ως αποτέλεσμα μια αύξηση κατά 35% της ΙΡΝ-γ έκφραση σε CD4 + Τ κύτταρα κατά τη διάρκεια της μη διεγερμένα (απλό media) βασικής γραμμής? Ωστόσο, Τ κύτταρα από RAPA αγωγή όγκους δεν ήταν ανταποκρίνεται σε αυτά τα ερεθίσματα. Η αντιδραστικότητα των σπάνιων CD8 + Τ κυττάρων σε όγκους MycCaP φάνηκε να είναι αναλλοίωτη από RAPA. Συλλογικά, η προσθήκη του RAPA στο πρωτόκολλο μεταφοράς γονιδίου όγκου Ad μεσολάβηση μείωσε την διήθηση των μυελοειδών και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος Τ στο περιβάλλον του όγκου? αυτό αμβλύνθηκε επίσης αντιδραστικότητα Τ κυττάρου προς ερεθίσματα που σχετίζονται με ιούς.

Η ραπαμυκίνη ενισχυμένες /γονιδιακής θεραπείας GCV Ad-sr39tk σε προ-ανοσοποιημένα ποντίκια

Στη συνέχεια εξετάσαμε την ικανότητα της ραπαμυκίνης να αυξήσει Ad-διαμεσολαβούμενη γονιδιακή θεραπεία αυτοκτονίας μέσω της ενισχυμένης έρπητα κινάσης θυμιδίνης του ιού του απλού (HSV-tk) γονίδιο, sr39tk και γκανσικλοβίρη του προφαρμάκου (GCV) [40]. Για να επιλέξετε ένα κατάλληλο μοντέλο για τη μελέτη sr39tk /θεραπείας GCV-based, αξιολογήθηκαν η ευαισθησία των κυττάρων RM9 και MycCap. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές μολύνθηκαν με διαφημίσεις sr39tk εκφράζουν σε μια πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 100 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες δόσεις GCV από την ημέρα 2 έως την ημέρα 7 πίν. Η βιωσιμότητα των κυττάρων RM9 δεν αλλοιώθηκε από την έκφραση του sr39tk ή ο παρουσία GCV, ενώ τα κύτταρα MycCap ήταν ευαίσθητα σε αυτή τη θεραπεία (Σχήμα 5Α). Ως εκ τούτου, έχει επιλεγεί το μοντέλο MycCap? Επιπλέον, το ΨΕΣ-TSTA [3] προστάτη-ειδικό προαγωγό εμφάνισαν ισχυρή μεταγραφική δραστικότητα σε κύτταρα MycCap (Σχήμα 5Α και S4 στο S1 File) και έτσι, θα χρησιμοποιηθεί στα ακόλουθα θεραπευτικά πειράματα.

(Α ) MycCap και RM9 κύτταρα μολύνθηκαν με Ad-ΨΕΣ-TSTA-sr39tk, Ad-CMV-sr39tk ή χωρίς ιό σε ΜΟΙ = 100 και αντιμετωπίζεται από ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της GCV από την ημέρα 2 έως την ημέρα 7 π. η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με CCK- 8 δοκιμασία την ημέρα 7 και ομαλοποιούνται στη μη-ιό, μηδενική κατάσταση GCV (διακεκομμένη γραμμή). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν.