Οι

Abstract

Tumor σχετιζόμενη μακροφάγα είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την πρόοδο του καρκίνου με διαμόρφωση της λειτουργίας του ανοσοποιητικού, η αγγειογένεση, και μετάσταση των κυττάρων, όμως, λίγα είναι γνωστά για την χημειοκίνη δίκτυα που ρυθμίζουν αυτή τη διαδικασία σηματοδότησης. Αξιοποιώντας CT26 κύτταρα καρκίνου κόλου και RAW 264.7 μακροφάγα ως ένα κυψελοειδές σύστημα μοντέλο, αποδεικνύουμε ότι η θεραπεία των κυττάρων CT26 με RAW 264.7 ρυθμισμένο μέσο επάγει κυτταρική μετανάστευση, εισβολή και μετάσταση. Φλεγμονώδεις ανάλυση μικροσυστοιχιών γονίδιο έδειξε CT26-διεγερμένα RAW 264.7 μακροφάγα upregulate SDF-1α και VEGF, και ότι αυτές οι κυτοκίνες συμβάλλουν στην CT26 μετανάστευση

in vitro

. RAW 264.7 μακροφάγα έδειξε επίσης μια ισχυρή χημειοτακτική ανταπόκριση προς CT26 που προέρχονται χημειοκινών. Ειδικότερα, η ανάλυση μικροσυστοιχιών και λειτουργικές δοκιμές αποκάλυψαν CSF-1 ως το μείζον χημειοελκτικό για RAW 264.7 μακροφάγα. Είναι ενδιαφέρον ότι, στο μοντέλο CAM όρνιθας της εξέλιξης του καρκίνου, RAW 264.7 μακροφάγα εντοπισμένη ειδικά στην περιφέρεια του όγκου όπου βρέθηκαν να αυξήσει την ανάπτυξη CT26 όγκου, πυκνότητα μικροαγγειακή, αγγειακή διαταραχή, και μετάσταση πνεύμονα, υποδεικνύοντας αυτά τα κύτταρα στο σπίτι για να εισβάλλει ενεργά περιοχές της όγκου, αλλά όχι το υποξικό πυρήνα της μάζας του όγκου. Προς στήριξη αυτών των ευρημάτων, συνθήκες υποξίας τα κάτω ρύθμιση της παραγωγής CSF-1 σε διάφορες κυτταρικές σειρές όγκων και μείωσε RAW μετανάστευσης 264.7 μακροφάγων

in vitro

. Μαζί τα ευρήματά μας προτείνουν ένα μοντέλο όπου η απελευθέρωση ορθοξικές καρκινικά κύτταρα CSF-1 για την πρόσληψη μακροφάγων στην περιφέρεια του όγκου όπου εκκρίνουν κινητικότητα και αγγειογενετικών παραγόντων που διευκολύνουν την εισβολή καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση

Παράθεση:. Πράσινη CE, Liu Τ, Montel V, Χσιάο G, Lester RD, Subramaniam S, et al. (2009) Χημειοελκτικής σηματοδότηση μεταξύ όγκου κυττάρων και μακροφάγων Ρυθμίζει Cancer κυτταρική μετανάστευση, μετάσταση και νεοαγγείωση. PLoS ONE 4 (8): e6713. doi: 10.1371 /journal.pone.0006713

Επιμέλεια: Derya Unutmaz, New York University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 22, 2009? Αποδεκτές: ένατης, Ιουλίου 2009? Δημοσιεύθηκε: 21, Αυγ του 2009

Copyright: © 2009 Green et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. CEG, TL και R.L.K υποστηρίζονται από επιχορηγήσεις NIH R01CA097022 και R01GM068487. V. Μ, R.D.L και S.L.G. υποστηρίζονται από το NIH επιχορήγησης R01CA94900. Ο.Η. και S.S. υποστηρίζονται από NIH επιχορήγησης R01GM078005. www.nih.gov. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η τάση για όγκους με την πρόοδο και μεταστάσεις αντικατοπτρίζει όχι μόνο τις ογκογονικές μεταλλάξεις στα καρκινικά κύτταρα, αλλά και δυναμικές αλληλεπιδράσεις που περιλαμβάνουν μη κακοήθη κύτταρα στο κύτταρο στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Μη-κακοήθη κύτταρα που διηθούν μια ανάπτυξη καρκίνου περιλαμβάνουν ινοβλάστες, λιποκύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα, περιαγγειακή κύτταρα και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, τα οποία μπορεί να συνεισφέρουν σε καρκίνο εξέλιξη [1]. Μεταξύ των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, έχουν μακροφάγα δειχθεί ότι παίζουν ένα υποστηρικτικό ρόλο, προάγουν επιβίωση κυττάρου όγκου, τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση [2]. Τα μακροφάγα όγκων που σχετίζονται με (ΤΑΜ) που προέρχονται από κυκλοφορούντα μονοκύτταρα περιφερικού αίματος που έλκονται από το αγγειακό σύστημα του όγκου, όπου εξαγγειώνονται στον διάμεσο και διαφοροποιούνται [3]. Αν και παλιννόστησης των μακροφάγων σε όγκους είναι ελάχιστα κατανοητή, τα καρκινικά κύτταρα είναι γνωστό ότι απελευθερώνουν χημειοελκτικά μακροφάγων περιλαμβανομένων CCL2, CCL5, CCL7, CCL8, CXCL12, VEGF και CSF-1 [4]. Σε σύγκριση με κλασικά ενεργοποιημένα μακροφάγα (Μ1) που λειτουργούν ως κύρια κύτταρα τελεστές στο έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα, Μ2 ΤΑΜ υποστήριξη επιβίωση του όγκου, με την προώθηση των τοπικών αγγειογένεση και την αναδιαμόρφωση του ιστού, ενώ καταστέλλει την ανοσολογική απόκριση [5]. ΤΑΜ εντοπίζονται στις επεμβατικές περιοχές του όγκου, όπου εκκρίνουν μια ποικιλία κυτοκινών και πρωτεάσες που εμπλέκονται στην εισβολής καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση [6], [7]. Σε αυτό το ρόλο, ΤΑΜ συμβάλλει ενεργά στην εξέλιξη του όγκου και τη μετάβαση σε κακοήθεια που συχνά συσχετίζεται με κακή κλινική έκβαση. Ωστόσο, αποκρυπτογράφηση των δικτύων χημειοκίνης καρκινικών κυττάρων που ρυθμίζουν την εξέλιξη του καρκίνου

in vivo

παραμένει σημαντική πρόκληση.

Η αγγειογένεση, η οποία είναι κρίσιμη για την εξέλιξη του καρκίνου, ελέγχεται από μια ποικιλία παραγόντων που είναι γνωστό ότι διεγείρουν την ανάπτυξη αιμοφόρων αγγείων ή /και ωρίμανσης, συμπεριλαμβανομένων VEGF, ΤΟΡ-β, EGF, bFGF και ΤΝΡ-α. ΤΑΜ αντιπροσωπεύουν πρωταρχική πηγή πολλών από αυτές τις αγγειογενετικές πρωτεΐνες στο microenvironement όγκου [8], [9], [10]. Ειδικότερα, ο VEGF που απελευθερώνεται από ΤΑΜ και είναι ένα ισχυρό ερέθισμα για την ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων, αυξημένη πυκνότητα μικροαγγειακή, αγγειακή διαταραχή, και διαρροή [11]. Τα αιμοφόρα αγγεία που υφίστανται αναδιαμόρφωση είναι πορώδη και εύθραυστα και επομένως πιο επιρρεπείς σε κύτταρο όγκου ενδαγγείωση [12]. Ως εκ τούτου, στο μεταναστευτικό μέτωπο, ΤΑΜ μπορεί να προάγει την μετάσταση του όγκου με διέγερση του σχηματισμού των πυκνών μικροαγγειακών δικτύων διαρροής σκαφών που είναι επιτρεπτό να κυττάρου όγκου ενδαγγείωση, ενώ ταυτοχρόνως ενεργοποιεί μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή απελευθερώνοντας μία ποικιλία χημειοκινών, μιτογόνα και πρωτεάσες.

Εκτός από το μεταναστευτικό μέτωπο, ΤΑΜ μπορεί επίσης να εντοπίζεται στο χωρίς αγγεία υποξικό πυρήνα του όγκου [13], [14]. VEGF απελευθερώνεται από ΤΑΜ στον πυρήνα του όγκου σε απόκριση προς υποξία και τη σταθεροποίηση της HIF1α και HIF2α [15], [16]. VEGF μπορεί επίσης να εμπλέκονται στην πρόσληψη ΤΑΜ στον πυρήνα του όγκου, εκτός από τα άλλα ακαθόριστα παράγοντες που υπάρχουν στο κυτταρικό απόρριμμα που προκύπτει από νέκρωσης όγκου [13]. Μόλις εντοπισμένη στον πυρήνα, ΤΑΜ μπορεί όχι μόνο σαφές κυτταρικά υπολείμματα αλλά επίσης ρυθμίζουν νεοαγγείωση και την επιβίωση του όγκου. Έτσι, υπάρχουν υποσύνολα TAMs που διαφορικά κατανεμημένα στο μικροπεριβάλλον του όγκου που μπορούν να χρησιμεύσουν εξειδικευμένους ρόλους κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του [2]. Υποθέτουμε ότι η οξυγόνωση του όγκου είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της μακροφάγων δράση σε καρκίνους. Για παράδειγμα, στην υποξική πυρήνα του όγκου, ΤΑΜ μπορεί να είναι κυρίως αγγειογόνες και φαγοκυτταρική, ενώ κάτω από νορμοξικές συνθήκες στην περιφέρεια του όγκου, ΤΑΜ μπορεί να συμβάλει στην μετάσταση όγκου, αυξάνοντας την αναδιαμόρφωση των ιστών και των αγγειακών πυκνότητα. Στην τελευταία περίπτωση, ο VEGF απελευθέρωση με ΤΑΜ μπορεί να ρυθμίζεται ανεξάρτητα από υποξία μέσω αλληλεπιδράσεων με επεμβατικές καρκινικά κύτταρα ή στρωματικά κύτταρα.

Η κατανόηση του ρόλου των ΤΑΜ στην πρόοδο του καρκίνου

in vivo

περιπλέκεται από η εν δυνατότητα να αποκρυπτογραφήσει το πλήθος των παραγόντων που είναι παρόντες στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Ως εκ τούτου, τα συστήματα μοντέλο που ανακεφαλαιώνουν

in vivo

όγκου των κυττάρων-TAM αλληλεπιδράσεις

in vitro

είναι αναγκαία για να διαλευκάνουν την πολυπλοκότητα της εξέλιξης του όγκου και των μεταστάσεων υπό καθορισμένες συνθήκες. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε αναπτύξει ένα σύστημα μοντέλου για τη διερεύνηση απευθείας σηματοδότηση κυτοκίνης μεταξύ CT26 κύτταρα καρκίνου κόλου και RAW 264.7 μακροφάγα. Χρησιμοποιώντας αυτό το μοναδικό σύστημα μοντέλο, δείχνουν ότι RAW 264.7 μακροφάγα και καρκινικά κύτταρα CT26 είναι αμοιβαία έλκονται μεταξύ τους και ότι τα μακροφάγα επάγουν μία άκρως μεταναστευτικών και προεξέχων φαινότυπο στα κύτταρα του όγκου. Φλεγμονώδεις ανάλυση συστοιχίας γονιδίων και λειτουργικές δοκιμές αποκάλυψαν ότι καρκινικών κυττάρων που προέρχονται από CSF-1 είναι ο κύριος χημειοελκτικό για RAW 264.7 μακροφάγα ενώ προέρχονται από μακροφάγα SDF-1α και VEGF συμβάλλει στην CT26 εισβολή των καρκινικών κυττάρων. Περαιτέρω, ένα σύνολο 270 γονιδίων σε RAW 264.7 μακροφάγα και 85 γονιδίων σε καρκινικά κύτταρα CT26 ήταν επέκτασης ή υποβιβασμού ρυθμίζονται κατά τη διάρκεια της επώασης σε ρυθμισμένα μέσα, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι πρόσθετες οδούς πέραν αυτών που δοκιμάζονται είναι πιθανό ενεργοποιούνται κατά τη διάρκεια αμφίδρομης σηματοδότησης. Σε CAM όρνιθας εμβολιάστηκαν με καρκινικά κύτταρα, RAW 264.7 μακροφάγα εντοπίζονται στην περιφέρεια του όγκου, εφόσον διευκολύνουν αγγειακή αναδιαμόρφωση και ενισχύουν τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων στους πνεύμονες όρνιθας. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν ένα μοντέλο στο οποίο παρακρινούς σηματοδότηση μεταξύ των κυττάρων του όγκου και των μακροφάγων ρυθμίζει τον εντοπισμό των μακροφάγων εντός του όγκου και την τάση των καρκινικών κυττάρων να κάνουν μετάσταση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές σειρές, αντιδραστήρια και αντισώματα

CT26 γραμμή καρκίνου του παχέος εντέρου ποντικού, RAW 264.7 γραμμή μακροφάγων ποντικού και MDA-MB-468 σειρά καρκίνου του μαστού ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). CL16, μια μεταστατική παραλλαγή των κυττάρων MDA-MB-435, προήλθε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. κύτταρα CT26 διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad CA) και 1% γλουταμίνη. RAW 264.7, MDA-MB-468 και CL16 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Invitrogen, Carlsbad CA) συμπληρωμένο με 10% FBS, 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη και 1% glutamax (Invitrogen, CA). RAW 264.7 εκφράζουν GFP έγιναν με μόλυνση κυττάρων με Lenti-Πράσινο υπερκείμενο (BioGenova, Rockville, MD). Τα υψηλότερα 0,1% κύτταρα που εκφράζουν στη συνέχεια ταξινομούνται με FACS. κύτταρα CT26 που εκφράζουν DsRed παρήχθησαν με μόλυνση κυττάρων με τον φακοϊό, pEF1-DsRed-PUR, που ακολουθείται από επιλογή σε πουρομυκίνη (1 μg /ml). Όπου υποδεικνύεται, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το κλείδωμα αποκλεισμού αντι-ΕΟΡ-Κ (Millipore, Billerica, ΜΑ), ανασυνδυασμένου ποντικού CSF-1 (R & αντι-CSF-1R mAb (AFS98, eBioscience, San Diego, CA),? D Systems, Minneapolis, ΜΝ), ανασυνδυασμένο EGF ποντικού (R &?. D Systems, Minneapolis, ΜΝ), ανασυνδυασμένο ποντίκι SDF-1α (Millipore, Billerica, ΜΑ) ή ανασυνδυασμένου VEGF165 (Millipore, Billerica, ΜΑ)

Ποσοτική κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή δοκιμασίες

για time-lapse απεικόνιση της κυτταρικής μετανάστευσης σε συγκαλλιέργεια, RAW 264.7-GFP επωάστηκαν σε ινονεκτίνη (10 μg /ml, Sigma-Aldrich) με επικάλυψη διαφάνειες θαλάμου Lab-Tek (Nunc, Rochester, ΝΥ) για 30 λεπτά στους 37 ° C πριν από την προσθήκη του CT26-DsRed (10

7 κύτταρα /ml). Μόλις προστέθηκαν CT26, η διαφάνεια θάλαμος τοποθετήθηκε αμέσως σε ένα Inc 2000 Incubator System (20/20 Technology Inc., Wilmington, NC) κατόπιν απεικονίζεται στο 20Χ (NA = 0.75) για 15 ώρες στους 4 καρέ /hr χρησιμοποιώντας ένα Nikon C1-Si ανεστραμμένο ομοεστιακό μικροσκόπιο (Nikon Instruments Inc., Melville, Νέα Υόρκη) είναι εξοπλισμένα με ανιχνευτές PMT και τα λέιζερ κατάλληλο για GFP (488 nm) και DsRed (561 nm). Descanned εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας Nikon λογισμικό EZ-C1, στη συνέχεια παρέχονται για την παρακολούθηση των κυττάρων και την ανάλυση σχήμα χρησιμοποιώντας Imaris (Bitplane, Αγίου Παύλου, MN). Μετά την προσκόλληση, οι συντεταγμένες θέσης των centroids για μεμονωμένα κύτταρα CT26-DsRed καταγράφηκαν σε κάθε καρέ κατά τη διάρκεια της χρονικής πορείας της μετανάστευσης. Αυτές οι συντεταγμένες στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν κομμάτια μετανάστευση από την οποία προσδιορίστηκε η μετανάστευση ευθύτητα, μετατόπισης και συνολική απόσταση. ευθύτητα μετανάστευση είναι αδιάστατη τιμή που αφορά τον αριθμό των σημείων διακλάδωσης ή μετατρέπεται σε καλό δρόμο για την συνολική απόσταση της μετανάστευσης. Συνολικό μήκος της διαδρομής της μετανάστευσης προσδιορίστηκε αθροίζοντας τις αποστάσεις βήμα της μετανάστευσης κάθε καρέ σε όλη την ακολουθία βίντεο. Καθαρή μετατόπιση διαδρομή μετανάστευσης ποσοτικοποιείται ως η άμεση απόσταση μεταξύ της έναρξης της μετανάστευσης και του τέλους της μετανάστευσης. Ο δείκτης σχήμα είναι ο λόγος του μήκους μείζονος άξονα πάνω από τον ελάσσονα άξονα μήκους για μεμονωμένα κύτταρα παρακολουθούνται κατά τη διάρκεια της χρονικής πορείας της μετανάστευσης.

δοκιμασίες χημειοταξίας εκτελέστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως με ελάσσονες τροποποιήσεις [18]. Εν συντομία, τροποποιημένους θαλάμους Boyden (Transwell, 6,5 mm διαμέτρου? Corning, Lowell, ΜΑ) που περιέχει πολυανθρακικές μεμβράνες με 8 μm πόρους επιστρώθηκαν στις δύο πλευρές με ινονεκτίνη (10 μg /ml, Sigma-Aldrich) για 2 ώρες στους 37 ° C, ξεπλύθηκαν μία φορά με PBS, και στη συνέχεια τοποθετείται μέσα στο κάτω θάλαμο που περιέχει 500 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος προσφύσεως μετανάστευση (ΜΑΒ? ϋΜΕΜ με 0,1% κλάσμα RIA-grade V BSA (Sigma-Aldrich), 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη και 1% γλουταμίνη), πλήρη μέσα (DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS, 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη και 1% γλουταμίνη), προσαρμοσμένα μέσα ή ρυθμιστικό μετανάστευσης περιέχουν SDF-1α (100 ng /ml), VEGF165 (10 ng /ml), EGF (100 ng /ml) ή CSF-1 (40 ng /ml), όπως υποδεικνύεται. Ρυθμισμένα μέσα ενημέρωσης συλλέχθηκαν από CT26 ή RAW 264.7 καλλιέργειες μετά από 48 ώρες επώασης στους 37 ° C. Οι αραιώσεις των ρυθμισμένων μέσων ενημέρωσης έγιναν σε κατάλληλα μέσα βάση του πολιτισμού. Όπου ενδείκνυται, αντι-CSF-1R (20 μg /ml) και αντι-EGF-R (20 μg /ml) ήταν παρόντα σε αμφότερα τα άνω και κάτω φρεάτια όλη την δοκιμασία. Στερούνται ορού RAW 264.7 ή κύτταρα CT26 απομακρύνθηκαν από δίσκους καλλιέργειας με εξισορροπημένο διάλυμα άλατος του Hanks που περιέχει 5 mM EDTA και 25 mM Hepes, ρΗ 7,2, και 0,01% θρυψίνη, πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό μετανάστευση, και μετά επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό μετανάστευσης στα 10

6 κύτταρα /ml. 10

5 κύτταρα σε 100 μλ ρυθμιστικού μετανάστευση προστέθηκαν μετά στο πάνω μέρος κάθε θαλάμου μετανάστευσης και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν στην κάτω πλευρά της πορώδους μεμβράνης για διάφορους χρόνους εις τριπλούν. RAW 264.7 μετανάστευσαν για 24 ώρες σε όλες τις συνθήκες και CT26 μετανάστευσαν επί 3 ώρες σε όλες τις συνθήκες. Τα μεταναστεύει κύτταρα στην επιφάνεια ανώτερη μεμβράνη απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα, και οι μεταναστευτικές κύτταρα που συνδέονται με την κάτω επιφάνεια της μεμβράνης χρωματίσθηκε με 0,1% κρυσταλλικό ιώδες σε 0,1 Μ βορικό, ρΗ 9,0, και 2% αιθανόλη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου θερμοκρασία. Ο αριθμός των κυττάρων ανά chemotaxing μεμβράνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ανεστραμμένο μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης σε 40Χ. Για RAW 264.7 χημειοταξίας υπό συνθήκες υποξίας, ο κατώτερος θάλαμος συμπληρώθηκε με πλήρες DMEM που περιέχει 10% FBS για να δημιουργήσει ένα χημειοτακτικό κλίση. RAW 264,7 στη συνέχεια αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες υπό ορθοξικές (21% οξυγόνο) ή υποξικά (1% οξυγόνο) συνθήκες χρησιμοποιώντας μια συσκευή επώασης IsoTemp (Fisher Scientific, Pittsburgh, ΡΑ). Τα μεταναστευτικά κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη για 5 λεπτά και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες σε 0,1 Μ βορικό, ρΗ 9,0, 2% αιθανόλη για 20 λεπτά. Οι μεμβράνες κόπηκαν από το Transwell και τοποθετήθηκαν σε οξικό 200 mL 10% οξύ για την έκλουση του λεκέ στη συνέχεια η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm.

Για να εξεταστεί μακροφάγων εισβολή σε κολλαγόνο, CT26-DsRed ή κόκκινη φθορίζουσα (580 nm διέγερση /605 nm εκπομπή) μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου (10 μm? Molecular Probes, Carlsbad, CA) ενσωματωμένο σε στείρο διηθημένο τύπου 1 γέλη κολλαγόνου (PureCol? Nutacon, Leimuiden, The Netherlands) που περιείχε 1Χ RPMI (Sigma-Aldrich), 25 mM νάτριο διττανθρακικό και ρυθμίστηκε σε ρΗ 7,4 με τη χρήση 0,1 Μ υδροξειδίου του νατρίου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Το διάλυμα κολλαγόνου που περιέχει κύτταρα CT26-DsRed (10

7 κύτταρα /ml) ή σφαιρίδια (10

7 χάντρες /ml) αφέθηκε να πήξει σε κλάσματα 10 μΐ επί φιβρονεκτίνης (10 μg /ml, Sigma-Aldrich) επιχρισμένη διαφάνειες θάλαμος Lab-Tek (Nunc, Rochester, ΝΥ) για 30 λεπτά πριν από την προσθήκη του RAW 264.7-GFP (10

5 κύτταρα /ml). Αρχικές μετανάστευση των RAW 264.7-GFP στη διεπαφή με την πτώση κολλαγόνου απεικονίζεται στο 20Χ (NA = 0.75) για 12 ώρες στους 4 καρέ /hr χρησιμοποιώντας ένα Nikon C1-Si ανεστραμμένο συνεστιακό μικροσκόπιο (Nikon Instruments Inc., Melville, ΝΥ) εξοπλισμένα με ανιχνευτές ΡΜΤ και τα λέιζερ κατάλληλο για GFP (488 nm) και DsRed (561 nm). Descanned εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας Nikon λογισμικό EZ-C1, στη συνέχεια παρέχονται για την παρακολούθηση των κυττάρων χρησιμοποιώντας Imaris (Bitplane, Αγίου Παύλου, MN). συντεταγμένες θέση των centroids για μεμονωμένες RAW 264.7-GFP καταγράφηκαν σε κάθε καρέ κατά τη διάρκεια της χρονικής πορείας της μετανάστευσης. Αυτές οι συντεταγμένες στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της μετατόπισης και συνολική απόσταση μετανάστευσαν για τα κύτταρα εντός και πέραν των 100 μm του οριακού πτώση κολλαγόνου. Τα πλακίδια επωάστηκαν για επιπλέον 7 ημέρες, στη συνέχεια απεικονίζονται χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία (10Χ? ΝΑ = 0,45). Στο 1 μm προσαυξήσεις σε ολόκληρο το Ζ-άξονα της πτώσης κολλαγόνου

Chicken CAM Δοκιμασία

Η δοκιμασία μετάστασης εμβρύου κοτόπουλου διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20], [21]. Εν συντομία, CT26-DsRed (2 × 10

6 κύτταρα) μόνο του ή σε συνδυασμό με RAW 264.7-GFP (2 × 10

5 κύτταρα) κύτταρα ανεστάλησαν επί πάγου σε Matrigel (BD Bioscience) στη συνέχεια εμβολιάζονται σε χοριοαλλαντοϊκή γκόμενα μεμβράνη (CAM) στις αναπτυξιακές ημέρα 9. Μετά από 11 μέρες, στις αναπτυξιακές ημέρα 20, τα έμβρυα θυσιάστηκαν και πρωτογενείς όγκοι αφαιρέθηκαν, απεικονίζεται σε 0.63X και 2Χ με στερεοσκοπικής, ζυγίστηκαν και μετρήθηκαν ως προς τη διάμετρο. Η καρδιά και οι πνεύμονες απομονώθηκαν, και τη διάδοση των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με απαρίθμηση συστάδες κυττάρων χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία στο 10Χ (NA = 0,45), με απόσταση βήματος από 1 μm. Οι όγκοι στη συνέχεια τεμαχίστηκαν και τοποθετήθηκαν απευθείας σε μια γυάλινη καλυπτρίδα για απεικόνιση με συνεστιακή μικροσκοπία (10Χ? ΝΑ = 0,45). Οι όγκοι απεικονίστηκαν 0 έως 0,5 cm από την περιφέρεια ή άκρο (περιφέρεια του όγκου), 0,5 cm έως 1 cm από την περιφέρεια (τοίχος του όγκου) και 1,0 cm έως 3 cm από την περιφέρεια του όγκου (πυρήνα του όγκου). Η ποσοτικοποίηση των RAW 264.7 διανομής-GFP εντός των όγκων CT26-DsRed προσδιορίστηκε με μέσο όρο χάρτες bit GFP pixel πάνω από ένα οπτικό πεδίο για να παραχθεί ένα μέση ένταση φθορισμού για κάθε περιοχή του όγκου χρησιμοποιώντας Image Pro Plus v4.5 (Media Cybernetics, Bethesda , MD). Φωτεινότητα και την αντίθεση προσαρμογές έγιναν εξίσου σε όλα τα κανάλια και δεν τροποποιεί τις σχετικές διαφορές μεταξύ της έντασης GFP εικονοστοιχείων σε διάφορες περιοχές του όγκου.

qPCR

CT26, MDA-MB-468 ή CL16 κύτταρα όγκου επωάστηκαν στους 37 ° C στο κατάλληλο πλήρες μέσο για 24 ώρες κάτω από υποξικές (1,0% οξυγόνο) ή ορθοξικές (21% οξυγόνο) συνθήκες. Ολικό RNA στη συνέχεια εκχυλίσθηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA), σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. cDNA συντέθηκε από 2 μg ολικού RNA χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης cDNA iScript (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας όργανο System 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA) και ένα πρόγραμμα ενός σταδίου: 95 ° C, 10 λεπτά? 95 ° C, 30 ×, 60 ° C, 1 λεπτό για 40 κύκλους. επίπεδα του CSF-1 και GAPDH mRNA μετρήθηκαν εις τριπλούν και κανονικοποιημένη κατά HPRT-1 mRNA.

μικροσυστοιχιών ανάλυση

Για να εξετάσει φλεγμονώδη έκφραση των γονιδίων, κλιματισμό ρυθμιστικά συλλέχθηκαν από CT26 ή RAW 264.7 πολιτισμών παρακάτω 48 ώρες επώασης στους 37 ° C και εφαρμόζονται σε καλλιέργειες απέναντι τύπου κυττάρου για 24 ώρες. mRNA στη συνέχεια απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy (Quiagen, Valencia, CA), αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης iScript cDNA (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) και αναλύθηκαν εις τριπλούν με υβριδισμό με το Codelink θηλαστικών Φλεγμονή Bioarray περιέχει μονόκλωνο 30 -mer ανιχνευτές ολιγονουκλεοτιδίου (GE Healthcare, Piscataway, NJ), σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. έκφραση Πρώτες γονίδιο για επαναλήψεις ήταν κατά μέσο όρο και ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την CodeLink Gene Expression Ανάλυση v5.0 Λογισμικό (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Για τον προσδιορισμό στατιστικά σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση ή αρνητική ρύθμιση της γονιδιακής μεταγραφές, θα εφαρμοστεί η διακύμανση πρότυπο Οπίσθια Συμπερασμός με το Περιφερειακό Exponentials (βαμπίρ) ανάλυση μικροσυστοιχιών σουίτα web σε πρώτες τιμές έκφρασης μεταγραφής, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22], [23]. Ομάδα-σοφός σφάλματος που σχετίζονται με τις πολλαπλές συγκρίσεις διορθώθηκε χρησιμοποιώντας μια συντηρητική Bonferroni διορθωθεί όριο του 5% (α = 0.05). Ιεραρχική ομαδοποίηση των τυποποιημένων δεδομένων συστοιχίας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση dChip (απόσταση: συσχέτιση, διασύνδεση: κεντροειδές) με βάση τους σχολιασμούς του γονιδίου οντολογία για την αγγειογένεση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την χημειοταξία [24]. Για την ανάλυση θερμικός χάρτης, βαθμολογίες έντασης υπολογίστηκαν με βάση τη σημασία των γονιδίων πάνω ή προς τα κάτω ρύθμιση, όπως καθορίζεται από την ανάλυση βαμπίρ. Τα γονίδια αυτά, οργανώθηκε με βάση τις επισημάνσεις του γονιδίου οντολογία για την αγγειογένεση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την χημειοταξία χρησιμοποιώντας dChip (απόσταση μετρικό: συσχέτιση, Μέθοδος σύνδεσης: κατά μέσο όρο).

Η στατιστική ανάλυση

Η ανάλυση των δεδομένων έγινε χρησιμοποιώντας GraphPad Prism έκδοση 4.0 του λογισμικού (GraphPad Software, San Diego, CA). Όλα τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση ± SE. δεδομένα Απαραμετρική ομάδα αναλύθηκαν με ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) και μετα-τεστ Neuman-Keuls. Gaussian διανεμηθέντα μέσες τιμές αναλύθηκαν από Φοιτητής

t

τεστ. συγκρίσεις Ομίλου θεωρείται σημαντική για 2-tailed

P

τιμές κάτω από 0,05.

Αποτελέσματα

Μετανάστευση και μορφολογική ανάλυση των καρκινικά κύτταρα CT26 συν-καλλιεργήθηκαν με RAW 264.7 μακροφάγα

Σας παρουσιάστηκε για πρώτη φορά μια κινηματική ανάλυση της συμπεριφοράς της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων και αποφασισμένοι αλλαγές στο σχήμα του κυττάρου ως απάντηση σε συγκαλλιέργεια με μακροφάγα. Για να εξεταστεί άμεσα το πώς μακροφάγα μεταβάλλει τη μεταναστευτική συμπεριφορά και την επιμονή του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων, CT26 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου ποντικού απεικονίστηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία κατά την διάρκεια συν-καλλιέργειας για 15 ώρες παρουσία ή απουσία RAW 264.7 μακροφάγα ποντικού (Σχ. 1

Μια

). κύτταρα CT26 και μόνο εμφάνισαν ένα συνολικό μήκος μετανάστευση των 199 ± 78 μm (μέσος όρος ± SD) (Εικ. 1

B

). Αυτή η τιμή δεν μπορούσε να διακριθεί από CT26 συν-καλλιεργήθηκαν με RAW 264.7 κύτταρα, τα οποία παρουσίασαν μήκος μετανάστευση των 154 ± 46 μm. Ωστόσο, παρά παρόμοια μήκη μετανάστευση, CT26 που ήταν συν-καλλιεργήθηκαν με RAW 264.7 κυττάρων που μετανάστευσαν κατά μήκος μιας σημαντικά ίσια διαδρομή, με τιμές ευθύτητα του 0,34 για CT26 συν-καλλιεργήθηκαν με RAW 264.7 κύτταρα σε σύγκριση με το 0,15 για CT26 μόνο (Σχ. 1

Β

). Αυτή 2-πλάσια αύξηση στην ευθύτητα συνοδεύτηκε από μία σημαντική αύξηση της συνολικής μετατόπισης ή επιμονή της μετανάστευσης από κύτταρα CT26 συν-καλλιεργήθηκαν με RAW 264.7 κύτταρα. κύτταρα CT26 συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα εμφάνισαν κατά μέσο όρο μετατόπιση του 49 ± 24 μm σε σύγκριση με 28 ± 20 μm για τα κύτταρα CT26 μόνο (Σχ. 1

B

). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι RAW 264.7 μακροφάγα προωθούν τη μετανάστευση των κυττάρων CT26

in vitro

. Σημαντικά, τα κύτταρα CT26 καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς τα μακροφάγα παρουσίασαν παρόμοια βιωσιμότητα. Στην πραγματικότητα, η ανάλυση των κυττάρων του όγκου ανάπτυξης κατά τη διάρκεια αρκετών ημερών έδειξε ότι τα κύτταρα CT26 αυξήθηκε ταχύτερα με την παρουσία μακροφάγων (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται). Συν-καλλιέργεια των RAW 264.7 κυττάρων με κύτταρα CT26 δεν άλλαξαν RAW 264.7 προσκόλληση κυττάρου προς πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας. Επιπλέον, η αξιολόγηση των RAW συμπεριφορά 264.7 κυττάρων σε αυτόν τον προσδιορισμό δεν αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στην απόσταση μετανάστευσης, μετατόπισης, ευθύτητα, ή κυτταρικό σχήμα όταν τα κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα CT26 (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται), γεγονός που υποδηλώνει την έλλειψη χημικής κλίσεις επαρκής για μακροφάγων χημειοταξία. Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι RAW 264.7 μακροφάγα διεγείρουν επίμονη μετανάστευση καρκινικών κυττάρων CT26 σε επιφάνειες 2-D.

Α, Β) CT26-DsRed (10

5 /ml) επωάστηκαν σε ινονηκτίνη με RAW 264.7 -ΟΡΡ (10

5 /ml), όπως υποδεικνύεται, επί 12 ώρες στους 37 ° C. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, ο ευθύτητα, ολικό μήκος που διανύθηκε και συνολική αθροιστική μετατόπιση των μεμονωμένων centroids κυττάρων CT26 παρακολουθήθηκαν (κίτρινες γραμμές) στους 4 καρέ /hr υπό την παρουσία και απουσία του RAW 264.7 μακροφάγα χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία 20Χ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μεμονωμένα ποσοτικοποίηση τροχιά για 55-75 κύτταρα πάνω από 3 πειράματα, με μέση υποδεικνύεται από bar. κλίμακα μεγέθυνσης ράβδος αντιπροσωπεύει 30 μm. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά στην πορεία μετάβασης ευθύτητα (p & lt? 0,0001). ** Υποδηλώνει σημαντική διαφορά στην εκτόπιση πορεία μετάβασης (ρ & lt? 0,0001).

Η

Η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να σχηματίσουν invadapodia και μεμβράνη προεξοχές έχει συνδεθεί με αυξημένη μετανάστευση και διεισδυτικότητα ιστό [25]. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε τη μορφολογία των κυττάρων CT26 απαντώντας σε συν-καλλιέργεια με RAW 264.7 μακροφάγα. Μέσα σε 6 ώρες, η συν-καλλιέργεια με τα RAW 264.7 μακροφάγα προώθησε μια βελτιωμένη φαινότυπο μεσεγχυματικά στα κύτταρα CT26, η οποία χαρακτηρίζεται από πολυάριθμες μακρά προεξοχές μεμβράνη που ακτινοβολείται προς τα έξω από το σώμα του κυττάρου (Εικ. 2

A

). Αυτή η μορφολογία διατηρήθηκε για περισσότερο από 12 ώρες και ήταν εμφανής σε όλα τα κύτταρα CT26 εντός του συν-καλλιέργεια που ήταν σε επαφή με ένα ή περισσότερα μακροφάγα (Εικ. 2

B

). Για τον προσδιορισμό του ελάχιστου χρόνου που απαιτείται για RAW 264.7 κύτταρα να εκμαιεύσει CT26 αλλαγές μορφολογία, μετρήσαμε την κινητική της αλλαγής σχήματος (Σχ. 2

C

). Αρχίζοντας με την αρχική προσκόλληση των κυττάρων στο τρυβλίο, οι μείζονες και ελάσσονες άξονες που μεταναστεύουν κύτταρα CT26 προσδιορίστηκαν κάθε 20 λεπτά καθ ‘όλη 12 ώρες καλλιέργειας με ή χωρίς 264.7 κύτταρα RAW χρησιμοποιώντας ένα φορείο θαλάμου και συνεστιακής μικροσκοπίας. Όπως αναμενόταν, τα κύτταρα CT26 μόνο του ή σε συν-καλλιέργεια ήταν αποτελεσματικά γύρο κατά την αρχική προσκόλληση στο πιάτο με δείκτες σχήμα ~ 1. κύτταρα CT26 επωάζονται με RAW 264.7 κύτταρα υπέστησαν επιμήκυνση ταχεία κυττάρων, όπως ο κύριος άξονας κατά μήκος των πολωμένων επεκτάσεις μεμβράνη ήταν ~ 4-φορές μεγαλύτερη από το μικρό άξονα συντομότερο 4 ώρες μετά την αρχική προσκόλληση των κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα που καλλιεργήθηκαν εν απουσία RAW 264.7 μακροφάγα (Εικ. 2

C

). Η αλλαγή σχήματος φτάσει σε ένα οροπέδιο σε ~5.5 μετά από 8 ώρες της συγκαλλιέργειας. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα CT26 τα οποία καλλιεργήθηκαν μόνα επέδειξαν επίσης μία αρχική αύξηση σε επέκταση σχήμα όπως αυτοί τηρούνται και εξάπλωση. Ωστόσο, στην περίπτωση αυτή, τα κύτταρα παραταθεί μόνο βραχυπρόθεσμα προεξοχές και απέτυχε να επιμηκυνθεί σημαντικά, όπως ο δείκτης σχήμα έφθασε μόνο ένα μέγιστο ~ 2 μετά από 6 ώρες καλλιέργειας (Σχ. 2

C

). Στο σύνολό τους, ποσοτική ανάλυση των CT26 μετανάστευση των κυττάρων και η μορφολογία της δυναμικής δείχνουν ότι RAW 264.7 μακροφάγα προκαλούν μια ταχεία και σταθερή αύξηση στη μετανάστευση των κυττάρων που σχετίζεται με αυξημένο σχηματισμό των προεξοχών μεμβράνης.

DsRed-CT26 (10

5 /ml) επωάστηκαν σε ινονηκτίνη με GFP-RAW 264.7 (10

5 /ml), όπως υποδεικνύεται, για 15 ώρες στους 37 ° C. Φθορισμού εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία (20Χ) σε 4 καρέ /hr. Α) Χρονική πορεία της δυναμικής Ds-Red-CT26 πάνω από 12 ώρες, όταν επωάζεται μόνο του ή με RAW μακροφάγα 264.7-GFP. Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές της CT26 κίνησης πάνω από 3 ξεχωριστά πειράματα. κλίμακα μεγέθυνσης ράβδος αντιπροσωπεύει 20 μm. Β) Αθροιστική κατανομή CT26-DsRed και προεξοχή μετά από 15 ώρες επώασης μόνα τους (δεξιά) ή με RAW μακροφάγα 264.7-GFP (αριστερά και στο κέντρο, με πράσινο κανάλι απενεργοποιημένο). Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές των 3 ξεχωριστά πειράματα. κλίμακα μεγέθυνσης ράβδος αντιπροσωπεύει 30 μm. Γ) Ο δείκτης σχήμα (μείζων άξονας /μικρός άξονας) κυττάρων CT26 με την παρουσία ή απουσία RAW 264.7 κυττάρων παρακολουθούνται επί 12 ώρες της μετανάστευσης. Δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± SEM για 10 κύτταρα σε 3 ξεχωριστά πειράματα.

Η

RAW 264.7 μακροφάγα και CT26 όγκου κύτταρα απελευθερώνουν Διαλυτό χημειοτακτικούς παράγοντες που προάγουν την αμοιβαία χημειοταξία

εξεταστεί αν η επαγωγή της μια επεμβατική φαινότυπο σε κύτταρα CT26 με RAW 264.7 κύτταρα οφειλόταν σε άμεση αλληλεπίδραση με τα μακροφάγα ή απάντηση σε διαλυτή χημειοτακτικούς παράγοντες που απελευθερώνονται από τα μακροφάγα με μία τυπική δοκιμασία θαλάμου Boyden [18]. κύτταρα CT26 επέδειξε μια δοσοεξαρτώμενη και ισχυρή χημειοτακτική απόκριση προς μία διαβάθμιση RAW 264.7 κυττάρων ρυθμισμένα μέσα (CM), ενώ η έκθεση για τον έλεγχο βασικό μέσο μόνο του δεν προκάλεσε μία μεταναστευτική απόκριση (Σχ. 3

A

). Είναι σημαντικό ότι, η κυτταρική μετανάστευση ήταν κυρίως κατεύθυνσης προς την κλίση συγκέντρωσης, όπως η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων μειώθηκε κατά -60% όταν RAW 264.7 κυττάρων CM προστέθηκε ομοιόμορφα πάνω και από κάτω θαλάμους (Σχ. 3

A

). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι RAW 264.7 μακροφάγα απελευθερώνουν διαλυτή παράγοντες που προωθούν κατευθυντική μετανάστευση των CT26 κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου.

Α) CT26 (10

5 /ml) προστέθηκαν στο άνω ενός θαλάμου Boyden με RAW 264.7 ρυθμισμένα μέσα, ρυθμιστικό έλεγχο ή πλήρες DMEM προστίθενται στο χαμηλότερο φρεάτιο. CT26 αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 3 ώρες στους 37 ° C πριν από τη χρώση και ποσοτικοποίηση της χημειοταξίας. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο ± SEM για 15-30 τυχαίως επιλεγμένα πεδία πάνω 3-6 ξεχωριστά πειράματα. * Υποδηλώνει τη σημασία μεταξύ 50% RAW CM και τον έλεγχο των μέσων ενημέρωσης (p & lt? 0.001) και 50% RAW CM και 100% RAW CM πάνω /κάτω (p & lt? 0.001). Β) RAW 264.7 (10

5 /ml) προστέθηκαν στο ανώτερο φρεάτιο ενός θαλάμου Boyden με CT26 ρυθμισμένα μέσα, ρυθμιστικό αναφοράς ή πλήρες DMEM προστίθενται στο χαμηλότερο φρεάτιο. RAW 264.7 αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες στους 37 ° C πριν από τη χρώση και ποσοτικοποίηση της χημειοταξίας. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο ± SEM για 15-30 τυχαίως επιλεγμένα πεδία πάνω 3-6 ξεχωριστά πειράματα. ** Υποδηλώνει τη σημασία μεταξύ 25% CT26 CM και τον έλεγχο των μέσων ενημέρωσης (p & lt? 0.001) και 25% CT26 CM και 100% CT26 CM πάνω /κάτω (p & lt? 0.001). C) GFP-RAW 264.7 (10

5 /ml) επωάστηκαν σε ινονηκτίνη επικαλυμμένα πλακίδια θαλάμου με 10 μΐ σταγόνες κολλαγόνου που περιέχει Ds-Red-CT26 (10

7 /ml) ή 10 μm σφαιρίδια κόκκινη φθορίζουσα (10

7 /ml). Μακροφάγων εισβολή εντός του όγκου ενσωματωμένο ή χάντρα ενσωματωμένα κολλαγόνου σταγόνα απεικονίσθηκε μετά από 7 ημέρες στους 10Χ με συνεστιακή μικροσκόπηση. Πλάγια όψη και την κορυφή εικόνες άποψη είναι αντιπροσωπευτικό της μέσης απόκρισης μακροφάγων πάνω από 6 όγκους κολλαγόνου. Μεγέθυνση κλίμακας γραμμή για την κορυφαία εικόνες άποψη αντιπροσωπεύει 200 ​​μm. Δ) Η διασύνδεση μεταξύ των μακροφάγων και η πτώση του όγκου κολλαγόνου απεικονίζονται χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία (20Χ) για 12 ώρες στους 4 καρέ /hr μετά την προσθήκη του RAW 264.7 στην πλάκα του θαλάμου. Πάνω από αυτό το διάστημα, η δυναμική της μετανάστευσης μακροφάγων μετρήθηκε ποσοτικά με την παρακολούθηση μεμονωμένων κεντροειδή των κυττάρων σε 4 καρέ /hr. Τα μακροφάγα έναρξη της μετανάστευσης σε απόσταση 100 μm του ορίου όγκου (διακεκομμένη λευκή γραμμή) παρουσιάζουν κίτρινο κομμάτια. Τα μακροφάγα έναρξη της μετανάστευσης πέρα ​​από τα 100 μm από το όριο όγκου εμφανίζουν λευκά κομμάτια. Εικόνα είναι αντιπροσωπευτική του μέσου όρου των μακροφάγων απάντηση σε 6 ξεχωριστές όγκους κολλαγόνου. κλίμακα μεγέθυνσης ράβδος αντιπροσωπεύει 30 μm. Ε) μετατόπιση Track και το συνολικό μήκος διαδρομής μετρήθηκε ποσοτικά για την μετανάστευση μακροφάγων εντός και εκτός των 100 μm του ορίου όγκου κολλαγόνου. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο ± SEM για 15 μακροφάγα εντός 100 μm και 15 μακροφάγα πέραν των 100 μm του ορίου του όγκου κολλαγόνου. #denotes μια σημαντική διαφορά στην μετατόπιση πορεία μετάβασης (p & lt? 0,05). ## Υποδηλώνει μία σημαντική διαφορά στο συνολικό μήκος της διαδρομής της μετανάστευσης (p & lt? 0.0001)

Η

RAW 264.7 μακροφάγα εμφάνισαν ισχυρή και δοσοεξαρτώμενη χημειοτακτική απάντηση σε μια κλίση του CM κυττάρων CT26 (Σχήμα 3

Β

). Πράγματι, η έκταση της κυτταρικής μετανάστευσης στην μη αραιωμένη CM ήταν ~ 10-φορές μεγαλύτερη από τα βασικά επίπεδα της μετανάστευσης που παρατηρείται σε απόκριση είτε από ορό μέσο που περιέχει ή ρυθμιστικό μετανάστευσης που περιέχει μόνο βόεια λευκωματίνη. RAW μετανάστευση 264.7 κυττάρων ήταν άκρως κατεύθυνσης και δεν οφείλεται σε τυχαία χημειοκινητικές κίνηση η προσθήκη CT26 CM τόσο τα άνω και κάτω θαλάμους κατήργησε εντελώς την απόκριση της μετανάστευσης (Εικ. 3

Β

). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αντίθεση με το σύστημα συν-καλλιέργειας όπου RAW 264,7 δεν παρουσίασαν αύξηση σε απόσταση μετανάστευσης ή μετατόπισης, η κλίση των χημειοτακτικών παραγόντων στο θάλαμο Boyden ήταν επαρκώς απότομο για να εκμαιεύσει ισχυρή χημειοταξία των μακροφάγων RAW 264.7.

για να διερευνηθεί περαιτέρω χημειοταξία μακροφάγων προς κύτταρα όγκου, έχουμε αναπτύξει μια νέα δοκιμασία 3D μετανάστευση στην οποία τα κύτταρα CT26 εγκλείστηκαν σε πηκτή κολλαγόνου και θέση στάγδην σε καλυπτρίδα με RAW 264.7 κύτταρα κατανέμονται ομοιόμορφα κατά μήκος της περιφέρειας της μήτρας γέλης. Όπως φαίνεται στο Σχ.