Αφηρημένο

Ιστορικό

Συσσωρευμένα στοιχεία έδειχναν ότι τα επιθηλιακά -mesenchymal μετάβασης (EMT) και του καρκίνου βλαστικών κυττάρων (CSC) χαρακτηριστικά, τα οποία συμβάλλουν στην εισβολή και μετάσταση όγκου, αλληλένδετη με miR-21. MiR-21 είναι μία από τις σημαντικές microRNAs που συνδέονται με την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση, αλλά οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν ΕΜΤ και φαινότυπο CSC κατά την διάρκεια miR-21 συμβάλλει στην μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων του μαστού παραμένουν να διευκρινισθούν.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Σε αυτή τη μελέτη, MDA-MB-231 /αντι-miR-21 κύτταρα συστάθηκε με επιμολυσμένα HSA-miR-21 antagomir σε κύτταρα καρκίνου του μαστού MDA-MB-231. EMT αξιολογείται με τις αλλαγές των δεικτών μεσεγχυματικών κυττάρων (Ν-cadherin, βιμεντίνη, και άλφα-SMA), δείκτης επιθηλιακών κυττάρων (Ε-καδερίνης), καθώς και τις ικανότητες της κυτταρικής μετανάστευσης και εισβολής? CSC φαινότυπος μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τις αλλαγές των επιφανειακών δεικτών CSC (ΑΙ_ϋΗ1 και CD44), και την ικανότητα των sphereforming (mammospheres). Βρήκαμε ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 αντιστρέφεται EMT και CSC φαινότυπο, που συνοδεύεται με PTEN up-ρύθμιση και AKT /ERK1 /2 αδρανοποίηση. Είναι ενδιαφέρον ότι, κάτω ρύθμιση των PTEN από siPTEN κατέστειλε τις επιπτώσεις των miR-21 antagomir για EMT και φαινότυπο CSC, επιβεβαιώνοντας ότι η ΡΤΕΝ είναι ένας στόχος του miR-21 στην αναστροφή EMT και CSC φαινότυπο. Οι αναστολείς της PI3K-AKT και ERK1 /2 μονοπάτια, LY294002 και U0126, τόσο σημαντικά κατέστειλε EMT και CSC φαινότυπο, υποδεικνύοντας ότι οι ΑΚΤ και ERK1 2 μονοπάτια /απαιτούνται για miR-21 μεσολάβηση EMT και φαινότυπο CSC.

συμπεράσματα /Σημασία

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 αντιστρέφει EMT και CSC φαινότυπο μέσω της στόχευσης PTEN, μέσω απενεργοποίησης της ΑΚΤ και ERK1 /2 μονοπάτια, και έδειξε ένα νέο μηχανισμό των οποίων θα μπορούσε να ανακουφίσει το κακοήθη βιολογική συμπεριφορά του καρκίνου του μαστού

Παράθεση:. Χαν Μ, Liu Μ, Wang Υ, Chen X, Xu J, Sun Υ, et al. (2012) Ο ανταγωνισμός του miR-21 Αντιστρέφει Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση και καρκινικά βλαστικά κυτταρικό φαινότυπο μέσω AKT /ERK1 /2 αδρανοποίηση από Στόχευση PTEN. PLoS ONE 7 (6): e39520. doi: 10.1371 /journal.pone.0039520

Επιμέλεια: Αμπντελιλάχ Aboussekhra, βασιλιά Faisal Specialist Νοσοκομείο & amp? Ερευνητικό κέντρο, τη Σαουδική Αραβία

Ελήφθη: 26 Σεπτέμβρη του 2011? Αποδεκτές: 26 Μαΐου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιουνίου 2012 |

Copyright: © 2012 Han et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (NSFC 81072147, 31171336 NSFC), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών του Chongqing Επιστήμης & amp? Τεχνολογίας της Επιτροπής, την Κίνα. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) συνδέεται με αυξημένη επιθετικότητα και μετάσταση σε καρκινώματα, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, καθώς επιτρέπει στα κύτταρα να μεταναστεύουν και εισβάλλουν γύρω ζητήματα και να ξεφύγει στην κυκλοφορία του αίματος, καθ ‘οδόν προς την ίδρυση μετάσταση. Μόλις αυτά τα μεταστατικά κύτταρα φθάσουν στον προορισμό τους, μπορούν να υποβληθούν σε mesenchymal- επιθηλιακά μετάβασης (ΚΟΑ) για τη δημιουργία δευτερογενείς όγκους, με αποτέλεσμα ο καρκίνος εξαπλώνεται και της αποτυχίας της θεραπείας [1] – [3]. Στο μοριακό επίπεδο, κύτταρα που υφίστανται ΕΜΤ προς μια πιο μεσεγχυματικά φαινότυπο συνεπάγεται απώλεια ή μείωσε την έκφραση των επιθηλιακών δεικτών όπως Ε-καδερίνης, και αύξησε την έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών όπως Ν-cadherin, βιμεντίνη, και α-SMA [2] , [4], [5]. Υπάρχουν μελέτες πρότειναν ότι η EMT στον καρκίνο του μαστού είναι στενά συνδεδεμένη με τις υποομάδα φαινότυπο του καρκίνου του μαστού και τα βλαστικά κύτταρα καρκίνου βασικοκυτταρικό-όπως (ΚΕΠ) [6] – [8].

Τα ΚΕΠ προβλέπεται να είναι κρίσιμη οδηγούς προόδου των όγκων λόγω των χαρακτηριστικών CSC συμπεριλαμβανομένου του δυναμικού αυτο-ανανέωση, απεριόριστες πολλαπλασιαστικό δυναμικό και μετάσταση δυναμικό, γεγονός που υποδηλώνει ότι η στόχευση χαρακτηριστικά CSC θα ήταν πιθανόν εξαλείψει ΚΕΠ τα οποία είναι οι «σπόροι» του επανεμφάνιση του όγκου και της μετάστασης. Αν και η υπόθεση CSC προτείνει ότι οι όγκοι μπορεί να προκύψουν από βλαστικά /προγονικά κύτταρα, μελέτες από πολλά εργαστήρια κατέδειξαν ότι EMT μπορεί να προσδώσει κύτταρα τα οποία έχουν χαρακτηριστικά CSC, καθώς και μια πιο κινητικά επεμβατική φαινότυπο [7] – [10]. Προηγουμένως οι μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι ο καρκίνος του μαστού περιέχει ένα CSC-διαμέρισμα [11] – [13], το οποίο μπορεί να εμπλουτιστεί με καθαρισμό Αλδεΰδη αφυδρογονάσης 1 (ΑΙ_ϋΗ1) -θετικό κύτταρα [13] ή CD44

+ /CD24

– /χαμηλή κύτταρα [11] από τη διαλογή, καθώς επίσης και από τον καθαρισμό sphereforming κύτταρα (mammospheres) από μητρικά κύτταρα [12]. Υπάρχουν μελέτες έδειξαν ότι η EMT φαινότυπος είναι υψηλότερη στην CD44

+ /CD24

– /χαμηλή ΚΕΠ του καρκίνου του μαστού (7), και ΚΕΠ εμπλουτίζεται από όγκους του μαστού και μεταστατικό καρκίνο του μαστού υπεζωκοτικές συλλογές εκφράζουν δείκτες παρόμοια με τα κύτταρα που έχουν υποστεί μια EMT [7], [14]. Ομοίως, ΕΜΤ και CSC δεικτών είναι επίσης συχνά σχετίζονται με καρκίνους του μαστού που έχουν την τάση να μετάσταση, όπως βασικοκυτταρικό-όπως υποομάδα φαινότυπο του καρκίνου του μαστού [15] και μεταπλαστικών [16] καρκίνων του μαστού.

Τα microRNAs (miRNAs) αποτελούν μια οικογένεια μικρών μη κωδικοποιητικού RNA μόρια τα οποία ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση με ζευγάρωμα βάσεων στο 3′-UTR του mRNA στόχου. Πρόσφατα, μια σειρά από miRNAs έχουν δειχθεί ότι παίζουν κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη και τη μετάσταση του ανθρώπινη κακοήθεια [17], [18], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού. MiR-21 είναι ένα από τα πρώτα miRNAs ανιχνεύεται στο ανθρώπινο γονιδίωμα, το οποίο επίσης είναι ένα από miRNAs είναι γνωστό ότι είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε όλους τους τύπους ανθρώπινων κακοηθειών [19]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι διάφοροι καταστολείς όγκων συμπεριλαμβανομένων φωσφατάση και tensin ομόλογο διαγράφονται στο χρωμόσωμα δέκα (ΡΤΕΝ) [20], του όγκου γονίδιο καταστολής tropomyosin 1 (TPM1) [21], ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος 4 (PDCD4) [22], maspin [23] , και αναστολείς μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας RECK και Timp3 [24] ήταν οι στόχοι του miR-21, γεγονός που υποδηλώνει ότι το miR-21 είναι ένα σημαντικό ογκογόνο miRNA που είναι στενά συνδεδεμένη με την ανάπτυξη του όγκου και των μεταστάσεων.

υπάρχουν μελέτες έδειξαν ότι το miR -21 είναι ένα σημαντικό συστατικό του κυκλώματος κυτταρικής σηματοδότησης που ρυθμίζει το πρόγραμμα ΕΜΤ [25] – [27], καθώς και συνεργάτες με υπογραφές CSC [26], [28], υποδηλώνοντας ότι miR-21 παίζει ένα ρόλο κλειδί στην διαδικασία της EMT και την απόκτηση των χαρακτηριστικών CSC, η οποία συνάδει με μας προηγουμένως μελετήσει [29], αλλά οι υποκείμενοι μηχανισμοί παραμένουν ασαφείς.

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων miR-21 αυξήσεις των όγκων, τη μετανάστευση και την εισβολή μέσω στόχευση ΡΤΕΝ [20], ένα καταστολέα γονίδιο όγκο που είναι ένας ανταγωνιστής της phosphatidylinotidol 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) με απομάκρυνση της φωσφορικής 3′-UTR του φωσφατιδυλινοσιτόλης 3,4,5-τριςφωσφορικής (ΡΙΡ3). Αλλά ο ρόλος του PTEN στην miR-21 που επάγουν EMT και CSC φαινοτύπου μένει να διευκρινιστεί. Είναι γνωστό ότι το ΡΤΕΝ ρυθμίζει αρνητικά την κινάση ΡΙ3Κ-πρωτεΐνη Β (ΑΚΤ) μονοπατιού [30] και ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) /εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται kinase1 /2 (/2 ERK1) μονοπατιού [31], καθώς και τόσο AKT και ERK1 /2 μονοπάτια θεωρήθηκαν ότι σχετίζονται με τη συντήρηση του EMT και CSC χαρακτηριστικά [32] – [36]

Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι το miR-21 τη δύναμη μέσω της ΑΚΤ και τα μονοπάτια ERK1 /2. στοχεύοντας PTEN ρυθμίζει EMT και CSC φαινότυπο. Στην παρούσα μελέτη, έχουν αποκαλύψει ότι ο ανταγωνισμός του miR-21reversed EMT συνεπής με CSC φαινότυπο μέσω της ΑΚΤ και ERK1 /2 μονοπάτια στοχεύοντας PTEN, δείχνει ένα μοριακό μονοπάτι το οποίο θα μπορούσε να ανακουφίσει τα κακοήθη βιολογικές συμπεριφορές των καρκίνων του μαστού.

Αποτελέσματα

Τα επιμολυσμένα HSA-miR-21 Antagomir Μειώθηκε η έκφραση του miR-21 στο MDA-MB-231 κύτταρα

Για να διερευνήσουν κατά πόσον HSA-miR-21 antagomir μπορεί να μειώσει την έκφραση του miR -21, HSA-miR-21 antagomir ή αρνητικό μάρτυρα του επιμολύνθηκε σε MDA-MB-231 κύτταρα για 48 ώρες, στη συνέχεια η σχετική έκφραση του miR-21 μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Η σχετική έκφραση του miR-21 ήταν 0,10711 ± 0,01272 σε MDA-231-MB /αντι-miR-21 κύτταρα, τα οποία ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται, όπως συγκρίνει με 1.07862 ± 0,09722 σε αρνητικό ομάδες ελέγχου (p = 0,0015? Εικ. 1Α ). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι HSA-miR-21 antagomir θα μπορούσε να μειώσει την έκφραση του miR-21 σε MDA-MB-231 κύτταρα.

MDA-MB-231 κύτταρα επιμολύνθηκαν με HSA-miR-21 antagomir ή HSA- miR-21 ελέγχου antagomir σε μια τελική συγκέντρωση 50 nmol για 48 ώρες. (Α) κύτταρα MDA-MB-231 υποβλήθηκαν σε αγωγή με HSA-miR-21 antagomir μείωσε την έκφραση του miR-21, σε σύγκριση με ομάδες ελέγχου (n1 = n2 = 3? Ρ = 0.0015), με πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση. (ΒΕ) Τα επίπεδα mRNA των μεσεγχυματικών βιοδείκτες (Ν-καδερίνης, βιμεντίνη και άλφα-SMA) και επιθηλιακά βιοδεικτών (Ε-καδερίνης) σε MDA-MB-231 miR αντι–21 κύτταρα /και MDA-MB-231 κύτταρα /έλεγχος , όπως μετράται με πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση. Οι σε πραγματικό χρόνο RT-PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν σε ένα όγκο αντίδρασης 20 μΙ εις τριπλούν, ταυτόχρονα. (F, G) Τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης των δεικτών ΕΜΤ σε υποδεικνύεται κύτταρα δείχνεται με ανάλυση κηλίδος Western, και ζώνες ήταν ημι-ποσοτικά χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. Βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Η, Ι) Τα μεταναστευτικά και επεμβατική ιδιότητες που αναφέρονται κύτταρα ελέγχθηκαν στη μετανάστευση και δοκιμασία εισβολής σε ένθετα Transwell. Διεισδύσει κύτταρα μετρήθηκαν και αναλύθηκαν σε ιστόγραμμα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον τριών πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. (* Υποδηλώνει ρ & lt? 0,05?

★ δηλώνει ρ & lt? 0.001).

Η

Ο ανταγωνισμός των miR-21 αντίστροφης EMT, καθώς και μειωμένη μετανάστευση και την εισβολή στο MDA-MB-231 κύτταρα

για να ερευνηθούν τα αποτελέσματα της αναγκαστικής ανταγωνισμό του miR-21 για τη διαδικασία ΕΜΤ του MDA-MB-231 κύτταρα, η σχετική mRNA και πρωτεΐνης έκφραση των βιοδεικτών μεσεγχυματικού κυττάρου φαινότυπο (Ν-cadherin, βιμεντίνη, και α-SMA) , και επιθηλιακών βιοδεικτών κυτταρικό φαινότυπο (Ε-καδερίνης) σε MDA-MB-231 /αντι-miR-21 κύτταρα και τα αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου μετρήθηκαν. Ο ανταγωνισμός των miR-21 μειώθηκαν τα σχετικά επίπεδα mRNA του Ν-καδερίνης, βιμεντίνη, και άλφα-SMA (p = 0,0038, p = 0,0018, και ρ = 0.0023, αντίστοιχα? Σχ. 1Β, C, D), ενώ αύξησε τον σχετικό επίπεδο του mRNA της Ε-καδερίνης (p = 0,0017? Εικ. 1 Ε) σε MDA-MB-231 /κύτταρα αντι-miR-21, σε σύγκριση με αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου, σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 θα μπορούσε να μειώσει την έκφραση του mRNA του κυττάρου βιοδεικτών μεσεγχυματικών φαινότυπο, ενώ αυξάνουν την έκφραση του mRNA του επιθηλιακού κυτταρικού φαινοτύπου βιοδείκτη. Τα αποτελέσματα από την ανάλυση κηλίδος Western κατέδειξε ότι τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης του Ν-καδερίνης, βιμεντίνη, και αλφα-SMA ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σημαντικά (ρ = 0,0003, p = 0,0026, και ρ = 0,04, αντίστοιχα? Σχ. 1F, G) , ενώ εκείνη του Ε-καδερίνης ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σημαντικά (ρ = 0.0053? Σχ. 1F, G) σε MDA-MB-231 /αντι miR-21-κύτταρα, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 θα μπορούσε να μειώσει την πρωτεΐνη έκφραση των βιοδεικτών κύτταρο μεσεγχυματικού φαινότυπο, ενώ αυξάνουν ότι επιθηλιακών κυττάρων φαινοτύπου βιοδείκτη. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 θα μπορούσε να αντιστρέψει την EMT, στηριζόμενη στην αναστολή EMT φαινοτυπική βιοδείκτες. Λειτουργικά, η σχετική μετεγκατεστημένα και εισέβαλαν αριθμούς των κυττάρων του /αντι-miR-21 κύτταρα MDA-MB-231 ήταν σημαντικά κατώτερα από αρνητικό μάρτυρα (ρ & lt? 0,0001, ρ & lt? 0,0001, αντίστοιχα? Εικ. 1Η, Ι), πρότεινε ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 θα μπορούσε να μειώσει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε MDA-MB-231 κύτταρα, η οποία τονίζεται περαιτέρω τη λειτουργία του miR-21 κατά την εισβολή και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του μαστού.

ανταγωνισμός της miR-21 αντίστροφης CSC φαινότυπου σε MDA-MB-231 κύτταρα

για να εξετάσει τις επιπτώσεις του ανταγωνισμού των miR-21 για CSC φαινότυπο σε MDA-MB-231 κύτταρα, η αναλογία των κυττάρων με ΑΙ_ϋΗ1

+ (ALDH

φωτεινά ) και CD44

+ /CD24

– /χαμηλή σε MDA-MB-231 /αντι-miR-21 κύτταρα και κύτταρα αρνητικού ελέγχου μετρήθηκαν. Το ποσοστό των κυττάρων με ΑΙ_ϋΗ1

+ in-miR-21 αντι κύτταρα MDA-MB-231 /ήταν 0,85

±

0.092, σημαντικά μικρότερη από 2.323 ± 0.315 σε αρνητικό ομάδες ελέγχου (ρ = 0.0051? Εικ . 2Α, Β), με δοκιμασία ALDEFLUOR? το ποσοστό των κυττάρων με CD44

+ /CD24

– /χαμηλή σε MDA-MB-231 /αντι-miR-21cells ήταν 0,543 ± 0,129, επίσης, σημαντικά χαμηλότερο από 4.807 ± 1.062 σε ομάδες ελέγχου (p = 0.0094? Σχ. 2C, D), με ανάλυση FACS. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 θα μπορούσε να μειώσει τον καρκίνο του μαστού CSC ποσοστό, το οποίο εκφράζει CSC βιοδείκτες επιφάνεια ΑΙ_ϋΗ1

+ και CD44

+ /CD24

– /χαμηλή. Επιπλέον, η σχετική mRNA και η πρωτεΐνη έκφρασης ΑΙ_ϋΗ1 και CD44 σε MDA-MB-231 /αντι-miR-21 κύτταρα και τα κύτταρα ελέγχου μετρήθηκαν επίσης. Τα σχετικά επίπεδα mRNA του ΑΙ_ϋΗ1 και CD44 σε MDA-231-ΜΒ /αντι-miR-21 κύτταρα ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (ρ = 0,0039, p = 0,0034, αντίστοιχα? Σχ. 2Ε, F), όπως εκτιμήθηκε από σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR, η οποία πρότεινε ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 θα μπορούσε να μειώσει την έκφραση του mRNA της ΑΙ_ϋΗ1 και CD44. Η έκφραση της πρωτεΐνης του ΑΙ_ϋΗ1 και CD44 μειώθηκαν επίσης αναλόγως (ρ = 0,0002, ρ = 0.0005, αντίστοιχα? Σχ. 2G, Η), με ανάλυση κηλίδος Western, πρότεινε ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 θα μπορούσε να μειώσει την πρωτεΐνη έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 και CD44 . Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 θα μπορούσε να αντιστρέψει CSC φαινότυπο σε MDA-MB-231 κύτταρα, τα οποία περαιτέρω ότι το miR-21 θα μπορούσε να περιλαμβάνει στη ρύθμιση των χαρακτηριστικών CSC. Πιο ενδιαφέρον, ο αριθμός mammosphere σε MDA-MB-231 /αντι-miR-21 κυττάρων ήταν σημαντικά κατώτερα και έχασε ομάδες (p = 0,0017? Σχ. 2Θ, J), έδειξαν ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 θα μπορούσε να μειώσει το σχηματισμό του mammospheres, η οποία πρότεινε, επίσης, ότι το miR-21 θα μπορούσε να ρυθμίσει τα χαρακτηριστικά CSC, συμπεριλαμβανομένων των δυνατοτήτων της αυτο-ανανέωσης και της ικανότητας κλωνισμού.

(Α, Β) ΑΙ_ϋΗ1 ενζυματική δραστηριότητα (ALDH

φωτεινή) σε καθιερωμένες καρκίνου του μαστού MDA-MB -231 /αντι-miR-21 κύτταρα και τα κύτταρα MDA-MB-231 /ελέγχου (n1 = n2 = 3) ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό ALDEFLUOR. (C, D) Το CD44

+ /CD24

– /χαμηλή φαινότυπο σε υποδεικνύεται κύτταρα (n1 = n2 = 3) ανιχνεύθηκαν με ανάλυση FACS. (Ε, F) Τα σχετικά επίπεδα mRNA του ΑΙ_ϋΗ1 και CD44 ανιχνεύθηκαν με πραγματικού χρόνου ανιχνεύσεως RT-PCR. (G, H) Τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης του ΑΙ_ϋΗ1 και CD44 ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. Βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (I, j) Ο αριθμός των mammospheres από 1000 /-miR-21 αντι κύτταρα ή MDA-MB-231 κυττάρων /ελέγχου MDA-MB-231 μετρήθηκε υπό μικροσκόπιο. Όλα τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον τριών πειραμάτων που έγιναν εις τριπλούν. (* Υποδηλώνει ρ & lt? 0,05?

★ δείχνει p & lt? 0.001).

Η

Ο ανταγωνισμός των miR-21 Induced Over-έκφραση της ΡΤΕΝ

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ΜΙΚ 21 αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή μέσω διαμόρφωσης ογκοκατασταλτικό γονίδιο ΡΤΕΝ [20], αλλά ο ρόλος του ΡΤΕΝ σε miR-21 ρυθμίζει ΕΜΤ όγκου και φαινότυπο CSC μένει να διευκρινιστεί. Για να διερευνηθεί κατά πόσον ο ανταγωνισμός του miR-21 ρυθμίζουν την έκφραση ΡΤΕΝ, το mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης ΡΤΕΝ μετρήθηκαν, με πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση και προσδιορισμό στυπώματος Western, αντιστοίχως. Όπως αναμένεται, τόσο η mRNA και πρωτεΐνη έκφραση της ΡΤΕΝ σε-miR-21 αντι κύτταρα MDA-MB-231 /ήταν έντονα πάνω ρυθμισμένα, σε σύγκριση με ομάδες ελέγχου (ρ = 0.003, p = 0,0437, αντίστοιχα? Σχ. 3Α, Β, D). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 θα μπορούσε να ρυθμίζουν την έκφραση της ΡΤΕΝ.

(Α) έκτοπη έκφραση της ΡΤΕΝ mRNA σε MDA-MB-231 miR αντι-21-κύτταρα και /MDA-MB- 231 κύτταρα /έλεγχος ελέγχθηκε από το πραγματικό χρόνο RT-PCR δοκιμασία (p = 0,003). (B, C, D) τα επίπεδα πρωτεΐνης του ΡΤΕΝ, ρ-ΑΚΤ, ΑΚΤ, ρ-ERK1 /2, και ERK1 /2 σε υποδεικνύεται κύτταρα ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western, και ζώνες ήταν ημι-ποσοτικά χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (* Υποδηλώνει ρ & lt? 0,05)

Η

Ο ανταγωνισμός των miR-21 Αδρανοποιημένο AKT και ERK1 /2

AKT και ERK1 /2 είναι δύο μεγάλα μονοπάτια σηματοδότησης στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, στη μετανάστευση. και την επιβίωση, και οι δύο, επίσης, ρυθμίζονταν από PTEN, αλλά οι ρόλοι της ΑΚΤ και /2 μονοπάτια ERK1 σε miR-21 που ρυθμίζει EMT όγκου και φαινότυπο CSC μένει να διευκρινιστεί. Για τον προσδιορισμό των μορίων σηματοδότησης που αφορούν σε ανταγωνισμό του miR-21 αντιστρέφοντας EMT και φαινότυπο CSC, τα επίπεδα της πρωτεΐνης του φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ (p-ΑΚΤ) και AKT, φωσφορυλιωμένη ERK1 /2 (p-ERK1 /2) και ERK1 /2 ήταν μετρήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του ρ-ΑΚΤ και ρ-ERK1 /2 σε MDA-MB-231 /-miR-21 αντι κύτταρα έντονα μειώθηκε σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (ρ = 0,0173, p = 0,0126, αντίστοιχα? Σχήμα 3C, D. ), επιβεβαίωσε ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 θα μπορούσε να καταστείλει ΑΚΤ και την ενεργοποίηση των ERK1 /2 στη διαδικασία της αντιστροφής EMT και φαινότυπο CSC.

Re-έκφραση του miR-21 Induced EMT και CSC φαινότυπο Συνοδεύεται με Down-έκφραση της PTEN, καθώς και ενεργοποίηση της ΑΚΤ και ERK1 /2

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ο ρόλος του miR-21 στη ρύθμιση EMT όγκου και φαινότυπο CSC, HSA-miR-21 μιμείται ή μιμείται αρνητικός μάρτυρας μετασκευάστηκε σε ιδρύθηκε MDA-MB-231 /-miR-21 αντι κύτταρα. Η έκφραση του miR-21 αυξήθηκε κατά περισσότερο από 22 φορές μετά την HSA-miR-21 μιμείται θεραπεία, σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα (ρ = 0,0037? Σχ. 4Α), έδειξε ότι HSA-miR-21 μιμείται την επιμόλυνση μπορεί να αυξήσει τον σχετική έκφραση του miR-21.

Ιδρύθηκε MDA-MB-231 κύτταρα /αντι-miR-21 διαμολύνθηκαν με HSA-miR-21 μιμείται σε συγκέντρωση 40 nmol για 72 ώρες. (Α) MDA-MB-231 /αντι-miR-21 κύτταρα κατεργάστηκαν με HSA-miR-21 μιμείται αυξημένα η έκφραση του miR-21, σε σύγκριση με ομάδες ελέγχου (n1 = n2 = 3? Ρ = 0,00373), με πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση. επίπεδα (BF) Protein σημειωτών μεσεγχυματικών (Ν-καδερίνης, βιμεντίνη και άλφα-SMA) (Β), επιθηλιακά δείκτη (Ε-καδερίνης) (Β), δείκτες CSC (ΑΙ_ϋΗ1 και CD44) (C), ΡΤΕΝ (D), ρ-ΑΚΤ και ΑΚΤ (Ε), καθώς επίσης και ρ-ERK1 /2 και ERK1 /2 (Ε) σε υποδεικνύεται κύτταρα μετρήθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western, και ζώνες ήταν ημι-ποσοτικά χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (F). Βήτα-ακτίνη ή GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (* Υποδηλώνει ρ & lt? 0,05?

★ δηλώνει ρ & lt? 0.001).

Η

Για να εξεταστεί εάν αναγκαστεί εκ νέου έκφραση του miR-21 μπορεί να προκαλέσει EMT και φαινότυπο CSC, κάτω-ρυθμίζουν την έκφραση ΡΤΕΝ , καθώς και την ενεργοποίηση ΑΚΤ και ERK1 /2 μονοπάτια, την πρωτεΐνη έκφραση του ΕΜΤ βιοδείκτες (Ν-cadherin, βιμεντίνη, αλφα-SMA, και Ε-καδερίνη), CSC δείκτες (ΑΙ_ϋΗ1 και CD44), ΡΤΕΝ, ρ-ΑΚΤ, ΑΚΤ , ρ-ERK1 /2, και ERK1 /2 μετρήθηκαν με δοκιμασία κηλίδος Western. Σε σύγκριση με τις αρνητικές ομάδες ελέγχου, αναγκάζεται επανέκφραση του miR-21 αύξησε την έκφραση πρωτεΐνης Ν-καδερίνης, βιμεντίνη, άλφα-SMA, ΑΙ_ϋΗ1 και CD44 (p = 0,0136, p = 0,0397, p = 0,0067, p = 0,0002 και ρ = 0.0006, αντίστοιχα? Σχ. 4Β, C, F), ενώ μείωσε την έκφραση της Ε-καδερίνης (p = 0,0014? Σχ. 4Β, F), πρότεινε ότι εκ νέου έκφραση του miR-21 θα μπορούσε να προκαλέσει ΕΜΤ και CSC φαινότυπο σε καθιερωμένες MDA-MB-231 /αντι-miR-21 κύτταρα. Εν τω μεταξύ, η εκ νέου έκφραση του miR-21 μείωσε την έκφραση της ΡΤΕΝ (p = 0,0081? Σχ. 4D, F), έδειξε ότι η εκ νέου έκφραση του miR-21 θα μπορούσε να επηρεάσει την έκφραση της άμεσης στόχου miR-21 στα κύτταρα. Επιπλέον, η εκ νέου έκφραση του miR-21 αύξησε επίσης την έκφραση της ρ-ΑΚΤ και ρ-ERK1 /2 στα κύτταρα (p = 0,0008, p = 0,0022, αντίστοιχα? Σχ. 4Ε, F), έδειξε ότι εκ νέου έκφραση του miR-21 θα μπορούσε να ενεργοποιήσει AKT και ERK1 /2 μονοπάτια. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ότι το miR-21 θα μπορούσε να ρυθμίσει EMT και CSC φαινότυπο, και συνοδεύουν με αλλοιώσεις του PTEN και AKT /ERK1 /2 μονοπάτια.

MiR-21 Στοχευμένες PTEN στην αναστροφή EMT και CSC Φαινότυπος

Για να προσδιορίσετε αν η εξάντληση του PTEN μπορούν να μπλοκάρουν miR-21 antagomir αντιστρέφοντας EMT και φαινότυπο CSC, siPTEN ή τον έλεγχο SsiPTEN μετασκευάστηκε σε MDA-MB-231 κύτταρα. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-21 antagomir ή αρνητικό μάρτυρα, και στη συνέχεια ΕΜΤ και φαινότυπο CSC εξετάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Βρήκαμε ότι siPTEN σημαντική προς τα κάτω ρυθμισμένη την έκφραση της ΡΤΕΝ (p = 0.002? Σχ. 5Α, Ε), σε σύγκριση με τις ομάδες SsiPTEN. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα του miR-21 antagomir επί ΕΜΤ και φαινότυπο CSC σε MDA-MB-231 κύτταρα (σχήμα 1 και σχήμα 2..), Ο ανταγωνισμός του miR-21 επίσης αντιστρέφεται EMT (Ν-cadherin, ρ = 0,0025? Βιμεντίνης, p = 0,0025? α-SMA, ρ = 0,0003? Ε-καδερίνης, ρ = 0,0308? Σχ. 5Β, E) και φαινότυπο CSC (ΑΙ_ϋΗ1, p = 0,0014? CD44, ρ = 0.002? Εικ. 5C, E) σε MDA κύτταρα -ΜΒ-231 /SsiPTEN (

SsiPTEN + miRNA antagomir αρνητικές ομάδες ελέγχου έναντι SsiPTEN + miR-21 ομάδες antagomir

)? εξάντληση του ΡΤΕΝ από siPTEN μπλοκάρει miR-21-antagomir αναστροφής EMT (Ν-cadherin, ρ = 0,0172? βιμεντίνης, ρ = 0,0113? α-SMA, ρ = 0,0015? Ε-καδερίνης, ρ = 0.016? Σχ. 5Β, E ) και CSC φαινότυπο (ΑΙ_ϋΗ1, p = 0,0042? CD44, p = 0,0004? Σχ. 5C, Ε) (

SsiPTEN + miR-21 ομάδες antagomir εναντίον siPTEN + miR-21 ομάδες antagomir

). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η εξάντληση των ΡΤΕΝ θα μπορούσαν να μπλοκάρουν miR-21-antagomir -reversing EMT και φαινότυπο CSC, η οποία περαιτέρω ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 θα μπορούσε να στοχεύσει PTEN στην αντιστροφή EMT και φαινότυπο CSC. Επιπλέον, η εξάντληση του PTEN ενεργοποιηθεί miR-21-antagomir αποκλεισμού AKT και ERK1 /2 μονοπάτια (π-ΑΚΤ, σ & lt? 0,0001? P-ERK1 /2, p = 0,0037? Σχ. 5D, Ε) (

SsiPTEN + miR-21 ομάδες antagomir εναντίον ομάδων siPTEN + miR-21 antagomir

), έδειξε ότι η ΑΚΤ και ERK1 /2 οδοί είναι προς τα κάτω μονοπάτια του PTEN στη ρύθμιση EMT και φαινότυπο CSC.

. MDA-MB-231 κύτταρα επιμολύνθηκαν με siPTEN ή το ανακατωμένο έλεγχο SsiPTEN σε μια τελική συγκέντρωση 50 nmol για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με HSA-miR-21 antagomir ή αρνητικό μάρτυρα σε μια τελική συγκέντρωση 50 nmol για 72 ώρες. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, και μετρήθηκαν τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης του ΡΤΕΝ (Α), δείκτες EMT (Β), δείκτες επιφάνειας CSC (C), ρ-ΑΚΤ και ΑΚΤ (D), καθώς επίσης και ρ-ERK και ERK (D) και ημι-ποσοτικά (Ε) όπως προαναφέρθηκε. Τα αντιπροσωπευτικά βύσματα από τις θεραπείες της SsiPTEN συν miR-21 ελέγχου antagomir, SsiPTEN συν miR-21 antagomir, και siPTEN συν miR-21 antagomir ήταν φαίνεται στην εικόνα. Βήτα-ακτίνη ή GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (* Υποδηλώνει ρ & lt? 0,05?

★ δηλώνει ρ & lt? 0.001).

Η

MiR-21 Ρυθμιζόμενης EMT και CSC φαινότυπο, καθώς και κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέσω ΑΚΤ και ERK1 /2 Pathways

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το ρόλο της ΑΚΤ και ERK1 /2 περιόδων miR-21 που ρυθμίζει EMT και CSC φαινότυπο, η MDA-MB-231 /κυττάρων αντι-miR-21 ήταν επιμολυσμένα με miR-21 μιμείται σε συγκέντρωση 40 nmol για 72 ώρες, και στη συνέχεια τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LY294002 (ο αναστολέας της ΡΙ3Κ-ΑΚΤ) στους 20 μmol /l ή U0126 (αναστολέα του ERK1 /2) σε 10 μmol /l για 24 ώρες. Επιβεβαιώσαμε ότι η θεραπεία LY294002 μπλοκαριστεί επανέκφραση του miR-21 επάγει ενεργοποίηση ΑΚΤ (ρ & lt? 0,0001? Σχ. 6Α, Ε), ενώ η θεραπεία U0126 καταργηθούν επανέκφραση του miR-21 επάγει 2 ενεργοποίηση ERK1 /(ρ & lt? 0,0001? Εικ . 6Α, E). Ακόμη πιο ενδιαφέρον, εκ νέου έκφραση του miR-21 επάγει ΕΜΤ και CSC φαινότυπο ανεστάλησαν με LY294002 (Ν-cadherin, ρ = 0,0005? Βιμεντίνης, ρ = 0,0005? Α-SMA, ρ = 0,0008? Ε-καδερίνης, ρ = 0,0002? ΑΙ_ϋΗ1, ρ & lt? 0,0001? CD44, ρ & lt? 0,0001? Σχ. 6Β, C, Ε) ή U0126 (Ν-cadherin, ρ & lt? 0,0001? βιμεντίνης, ρ = 0,0005? α-SMA, ρ = 0,0004? Ε-καδερίνης, σ = 0,0003? ΑΙ_ϋΗ1, σ & lt? 0,0001? CD44, p = 0.0005? Σχ. 6Β, C, E) στα κύτταρα, έδειξε ότι και οι δύο ΑΚΤ και ERK1 /2 πορείες που απαιτούν για miR-21 στην επαγωγή EMT και CSC φαινότυπο, η οποία επιπλέον, προτείνεται να ΑΚΤ και ERK1 /2 μονοπάτια είναι δύο παράλληλες προς τα κάτω μονοπάτια του miR-21 για τη ρύθμιση EMT και φαινότυπο CSC. Επιπλέον, τόσο LY294002 και U0126 δεν έχουν καμία αποδεδειγμένη επίδραση στην PTEN (p = 0,1208, p = 0,4361, αντίστοιχα? Σχ. 6D, E)., Η οποία υποστήριξε επίσης ότι η ΑΚΤ και ERK1 /2 οδοί είναι προς τα κάτω μονοπάτια του PTEN

καθιερωμένων κυττάρων MDA-MB-231 /αντι-miR-21 διαμολύνθηκαν με HSA-miR-21 μιμείται σε συγκέντρωση 40 nmol για 72 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υπέστησαν κατεργασία τρυψίνης, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με LY294002 (20 μmol /l) ή U0126 (10 μmol /l) για 24 ώρες. Τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης του ρ-ΑΚΤ και ΑΚΤ (ΑΕ) (Α), π-ERK και ERK (Α), δείκτες EMT (Β), οι δείκτες CSC επιφάνεια (C), καθώς και ΡΤΕΝ (D) από μάρτυρα, LY294002, και U0126 ομάδες θεραπείας έδειξαν, και ημι-ποσοτικά (Ε) όπως προαναφέρθηκε. Βήτα-ακτίνη ή GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (* Υποδηλώνει ρ & lt? 0,05?

★ δηλώνει ρ & lt? 0.001?

▴ δείχνει p & gt? 0,05). . (F) Τα αποτελέσματα του ανταγωνισμού της miR-21, εκ νέου έκφραση του miR-21, LY294002, και U0126 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με απαρίθμηση κυττάρου (Α

vs

Β, ρ = 0,0077? Β + Γ

vs

Β + Δ, p = 0,0091?. Β + Δ

vs

Β + Δ + Ε, p = 0.0109?.. Β + Δ

vs

Β + Δ + F, p = 0,0031).

η

Εκτός αυτού, για την επαλήθευση των ρόλων της ΑΚΤ και /2 μονοπάτια ERK1 σε miR-21 που ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό στα κύτταρα που αναφέρθηκαν παραπάνω, οι αριθμοί ανάπτυξης των κυττάρων του κύτταρα υπολογίστηκαν σε 0, 12, 24, 36, 48, 60 και 72 ώρες μετά τις θεραπείες με μέτρηση κυττάρων. Βρήκαμε ότι η αναγκαστική ανταγωνισμός του miR-21 μειώθηκαν πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε MDA-MB-231 κύτταρα (p = 0,0077? Σχ. 6F), ενώ εκ νέου έκφραση των αυξημένων πολλαπλασιασμού των κυττάρων miR-21 σε MDA-MB-231 /αντι-miR -21 κύτταρα, κατά τη διάρκεια 0-72 h (p = 0,0091? Σχ. 6F). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι miR-21 θα μπορούσε να ρυθμίσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε έναν ορισμένο βαθμό σε MDA-MB-231 κύτταρα. Εν τω μεταξύ, τόσο ΑΚΤ και ERK1 /2 αναστολές μειώθηκαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (ρ = 0,0109, p = 0,0031, αντίστοιχα? Σχ. 6F)., Η οποία προτείνει ότι η ρύθμιση της ΑΚΤ ή ERK1 /2 συνδέεται με μεταβολές στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

οι

Συζήτηση

miRNAs μη-κωδικοποίησης μικρά RNAs που μπορούν να ενεργούν ως ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκων [37], [38]. Αυξανόμενες ενδείξεις έδειξαν ότι miR-21 υπερέκφραση ανιχνεύεται σε διάφορα είδη ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, και συνδέεται με EMT [25] – [27] και τα χαρακτηριστικά CSC [26], [28]. Αλλά οι άμεσες ρόλους και κεντρική μοριακών μηχανισμών της miR-21 στη ρύθμιση EMT καρκίνο του μαστού και του φαινοτύπου CSC μένει να διευκρινιστεί. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 σε MDA-MB-231 κύτταρα αντιστρέφονται ΕΜΤ και CSC φαινότυπο, επάνω ρυθμισμένη την έκφραση του ΡΤΕΝ, καθώς και αδρανοποιημένο ΑΚΤ και ERK1 /2 οδών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 είναι επαρκής για την αναστροφή ΕΜΤ και CSC φαινότυπο μέσω ρύθμισης της έκφρασης της ΡΤΕΝ και ΑΚΤ /ERK1 /2 πορείες, παρέχοντας κάποια άμεση απόδειξη και μοριακών μηχανισμών που miR-21 είναι σε θέση να ρυθμίζουν ΕΜΤ και CSC φαινότυπο .

για να ερευνηθεί ο ρόλος του miR-21 στη ρύθμιση της ΕΜΤ και CSC φαινότυπος των καρκινικών κυττάρων του μαστού, antagomir του miR-21, η οποία μπορεί να δεσμεύονται ειδικά με και να αναστέλλει την ενδογενή μόρια miR-21, ή αρνητικό ολιγομερές ελέγχου του , επιμολύνθηκε σε MDA-MB-231 κύτταρα. Η antagomir μειώθηκε 90% της ενδογενούς έκφρασης miR-21 στα κύτταρα (Εικ. 1Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, η σχετική ΕΜΤ και φαινότυπο CSC αντιστράφηκαν με ανταγωνισμό του miR-21 (Σχήμα 1Β-G?. Το Σχ. 2Α-J), η οποία συνάδει με miR-21 περιλαμβάνει την προώθηση της ΕΜΤ και (ή) φαινότυπο CSC σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [26], [28], τα κύτταρα καρκίνωμα του θυρεοειδούς [27], και μας μελετούν προηγουμένως σε κύτταρα MCF-7 [29]. Συνοδεύεται με τα αποτελέσματα, ο ανταγωνισμός του miR-21 αύξησε σημαντικά την έκφραση του ΡΤΕΝ (Σχ. 3Α, Β, D), καθώς και μειωμένη ΑΚΤ και την ενεργοποίηση ERK1 /2 (Σχ. 3C, D). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι miR-21 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση ΕΜΤ και φαινότυπο CSC, συνοδεύει με τη ρύθμιση της έκφρασης του ΡΤΕΝ, καθώς και ΑΚΤ και την ενεργοποίηση ERK1 /2.

Στη συνέχεια, διερευνήσαμε των υποκείμενων μηχανισμών και σε σχέση με τα μόρια σηματοδότησης σε ανταγωνισμό του miR-21 αντιστρέφοντας EMT και φαινότυπο CSC. Σε συνεπής με την εν λόγω miR-21 καταστέλλει την λειτουργία της έκφρασης ΡΤΕΝ ογκοκατασταλτικών με σύνδεση 3′-UTR του [20], αποδείξαμε ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 επάνω ρυθμισμένη έκφραση ΡΤΕΝ (Σχ. 3Α, Β, D). Όπως ήταν αναμενόμενο, PTEN κάτω-έκφραση κυρίως μπλοκάρει miR-21 αναστροφής EMT και φαινότυπο CSC (Εικ. 5Β, C, E), επιβεβαίωσε ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 εκθέματα ρόλο της εν μέρει με την προώθηση της έκφρασης ΡΤΕΝ, και η ανάκαμψη της έκφρασης ΡΤΕΝ θα μειώσει τη λειτουργία του ογκοκατασταλτικών.

Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι η εκ νέου έκφραση του miR-21 με miR-21 μιμείται οδήγησε στην ενεργοποίηση της ΑΚΤ και ERK1 /2 οδών (Εικ. 4Ε, F) . Πιο ενδιαφέρον, αντιμετωπίζονται τα κύτταρα με PI3K-AKT /ή αναστολέα ERK1 2 (LY294002 ή U0126), απαγορεύεται miR-21 μιμείται την ανάκτηση της EMT και CSC φαινότυπο (Εικ. 6Β, C, E). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι επιπτώσεις της ΑΚΤ και (ή) (ή) ERK1 2 μονοπάτια /απαιτούνται ERK1 /2 στο miR-21-ρύθμιση EMT και φαινότυπο CSC, σύμφωνα με την εν λόγω ΑΚΤ και για την προώθηση της EMT και (ή) CSC φαινότυπο στον καρκίνο του μαστού MCF-7 κυττάρων [32], του μαστού επιθηλιακών κυττάρων [33], [34], ο καρκίνος του παχέος εντέρου κυττάρων [35], του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα [32], και καρκινώματα κυττάρων των ωοθηκών [36].

συνοπτικά, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι ο ανταγωνισμός του miR-21 αντιστρέφει ΕΜΤ και CSC φαινότυπο μέσω ΑΚΤ και ERK1 /2 οδοί αδρανοποίηση με διέγερση έκφρασης ΡΤΕΝ στα ΜϋΑ-ΜΒ-231 κύτταρα (Σχ. 7). Αυτή η μελέτη έδειξε άμεσο ρόλο και νέο μηχανισμό του miR-21 στο αντιστρέψουμε EMT και φαινότυπο CSC, και οι πληροφορίες μπορεί να είναι χρήσιμο να αναπτυχθεί μια νέα θεραπεία για τη θεραπεία των καρκίνων του μαστού στο μέλλον.

Ο ανταγωνισμός των ΜΙΚ 21 θα μπορούσαν να αδρανοποιήσουν AKT και ERK1 /2 μονοπάτια πιθανώς μέσω PTEN ρύθμιση προς τα πάνω, και τέλος αντίστροφη EMT και φαινότυπο CSC στο MDA-MB-231 κύτταρα.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Ανθρώπινο έχει-miR-21 (MIMAT0000076) antagomir και αρνητικό μάρτυρα, μιμείται και αρνητικού ελέγχου αγοράστηκαν από Ribobio (Guangzhou, Κίνα). Οι εκκινητές PCR συντέθηκαν από Sangon Biotech (Σαγκάη, Κίνα). Σε πραγματικό χρόνο κιτ δοκιμασίας RT-PCR αγοράστηκαν από την Takara (Dalian, Κίνα). Ειδικά siPTEN ακολουθία μεζονέτες και ελέγχου αγωνίζομαι siRNA (SsiPTEN) αγοράστηκαν από Ribobio. LY294002 και U0126 αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). Lipofectamine ™ 2000 αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). ALDEFLUOR® Kit αγοράστηκε από Aldagen (Durham, NC, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) -σημασμένου αντι-CD44 αντίσωμα και φυκοερυθρίνη (ΡΕ) -σημασμένου αντι-CD24 αντίσωμα αγοράστηκαν από BioLegend (San Diego, CA, USA). Πρωτογενή αντισώματα που περιλαμβάνουν κουνελιού αντιανθρώπινο αντίσωμα Ε-καδερίνης (αριθ: BS1098? Bioworlde, St. Louis, ΜΟ, USA), αντίσωμα Ν-καδερίνης (No: BS2224? Bioworlde), βιμεντίνη αντίσωμα (Νο: BS1776? Bioworlde), άλφα-SMA αντίσωμα (No: ab5694? Abcam, Cambridge, UK), ΑΙ_ϋΗ1 αντίσωμα (No: ab51028? Abcam), το αντίσωμα CD44 (No: BA0321? Boster, Wuhan, Κίνα), PTEN αντίσωμα (No: BS1304? Bioworlde), το αντίσωμα ΑΚΤ (