Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ρετινοειδή 4-οξο-Ν- (4 -υδροξυφαινυλ) ρετιναμίδη (4-οξο-4-HPR) είναι ένας πολικός μεταβολίτης της φενρετινίδης (4-HPR) πολύ αποτελεσματική στη θανάτωση καρκινικών κυττάρων διαφορετικών histotypes, ικανή να αναστείλει 4-HPR ανθεκτική κυτταρική ανάπτυξη και να δρουν συνεργιστικά σε συνδυασμό με το μητρικό φάρμακο. Σε αντίθεση με 4-HPR και άλλα ρετινοειδή, 4-οξο-4-HPR αναστέλλει τον πολυμερισμό της τουμπουλίνης, που οδηγεί σε σχηματισμό πολυπολικός ατράκτου και μιτωτική σύλληψη. Εδώ ερευνήσαμε αν 4-οξο-4-HPR, όπως 4-HPR, προκάλεσε κυτταρικό θάνατο και μέσω αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και αν Antimicrotubule δραστηριότητα του ήταν συνδεδεμένος με ROS-εξαρτώμενο μηχανισμό ωοθηκών (Α2780), του μαστού ( T47D), του τραχήλου της μήτρας (HeLa) και νευροβλάστωμα (SK-N-BE) καρκινικές κυτταρικές σειρές.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Έχουμε στοιχεία που αποδεικνύουν ότι 4-οξο-4-HPR, εκτός από υποκριτική ως ένας παράγοντας, η απόπτωση που επάγεται μέσω ενός καταρράκτη σηματοδότησης ξεκινώντας από την παραγωγή ROS και η συμμετοχή ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) αντίδραση στο στρες, Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) ενεργοποίηση, και προς τα πάνω ρύθμιση της προαποπτωτικών μορφογενετική πρωτεΐνη του πλακούντα οστών (PLAB). Μέσω της ανάλυσης χρονικής πορείας και αναστολή της ROS σχετίζονται οδό σηματοδότησης (ανάντη από τη βιταμίνη C και κατάντη με ΡΙΑΒ αποσιώπηση), αποδείξαμε ότι η αντιμιτωτική δράση της 4-οξο-4-HPR ήταν ανεξάρτητη από το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από την ρητινοειδούς . Στην πραγματικότητα, η παραγωγή ROS εμφανίστηκαν νωρίτερα από μιτωτική σύλληψη (εντός 30 λεπτών και 2 ωρών, αντίστοιχα) και την κατάργηση της ROS σχετίζονται οδού σηματοδότησης δεν εμπόδισε το 4-οξο-4-HPR επαγόμενη μιτωτική ανακοπή.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η 4-οξο-4-HPR αντικαρκινική δραστικότητα οφείλεται σε τουλάχιστον δύο ανεξάρτητους μηχανισμούς και να παρέχει μια εξήγηση της ικανότητας του 4-οξο-4-HPR να είναι πιο ισχυρός από το μητρικό φάρμακο και για να είναι αποτελεσματική και σε 4-HPR-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές. Επιπλέον, το διπλό μηχανισμό δράσης θα μπορούσε να επιτρέψει 4-οξο-4-HPR να στοχεύσετε αποτελεσματικά όγκου και να εξουδετερώσει τελικά την ανάπτυξη της ανθεκτικότητας στα φάρμακα

Παράθεση:. Tiberio P, Cavadini Ε, Abolafio G, Formelli F , Appierto V (2010) 4-οξο-Ν- (4-υδροξυ) ρετιναμίδη: Δύο ανεξάρτητες τρόποι για να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 5 (10): e13362. doi: 10.1371 /journal.pone.0013362

Επιμέλεια: Αντρέι Λ Gartel, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 του Ιουλίου του 2010? Αποδεκτές: 20, Σεπτεμβρίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 14 Οκτωβρίου 2010

Copyright: © 2010 Tiberio et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τον Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (https://www.airc.it), Μιλάνο, Ιταλία, μέσω επιχορηγήσεων και υποτροφιών (Π Tiberio). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα ρετινοειδή είναι μια κατηγορία χημικών ενώσεων που σχετίζονται δομικά με την βιταμίνη α που διαμορφώνουν βασικές κυτταρικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση [1]. Το συνθετικό φενρετινίδη ρετινοειδούς ή Ν- (4-υδροξυφαινυλ) ρετιναμίδη (4-HPR) είναι ένας μη τοξικό ανάλογο του all-trans ρετινοϊκό οξύ [2] που έχει ήδη δείξει ελπιδοφόρα αποτελέσματα σε προ-νεοπλασματικών [3] – [5] και νεοπλαστικών καταστάσεων [6], [7]. Σε καλλιεργημένα κύτταρα, 4-HPR έχει δειχθεί ότι επάγουν την αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές και διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης έχουν προταθεί, συμπεριλαμβανομένης της παραγωγής δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) και επακόλουθη οξειδωτικού στρες [8], [9 ]. Έχουμε αναφέρει πρόσφατα ότι στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, 4-HPR-επαγόμενη απόπτωση προκαλείται από την προαποπτωτική μορφογενετική πρωτεΐνη του πλακούντα οστών (ΡΙΑΒ), και ότι προς τα πάνω ρύθμιση της από 4-HPR λαμβάνει χώρα μέσω της ενεργοποίησης ενός καταρράκτη σηματοδότησης που αρχίζουν από την αύξηση της παραγωγής ROS , που οδηγεί σε επαγωγή του ενδοπλασματικού δικτύου (ER) αντίδραση στο στρες και Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) ενεργοποίηση [9], [10]. Από την ανάλυση των δειγμάτων των ασθενών 4-HPR επεξεργασμένου πλάσματος, έχουμε εντοπίσει ένα νέο 4-πολικό HPR μεταβολίτη, 4-οξο-Ν- (4-υδροξυφαινυλ) ρετιναμίδη (4-οξο-4-HPR) [11], το οποίο είναι προικισμένο με πολλά υποσχόμενο βιολογικές ιδιότητες [12]. 4-οξο-4-HPR εκμαιεύει αντιπολλαπλασιαστική και αποπτωτικά αποτελέσματα σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές (δηλαδή των ωοθηκών, του μαστού, και νευροβλαστώματος κυτταρικές γραμμές όγκου) και είναι δύο έως τέσσερις φορές πιο αποτελεσματικό από 4-HPR στην αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων [12]. Είναι ενδιαφέρον ότι, το 4-οξο-4-HPR είναι επίσης αποτελεσματικό σε 4-HPR ανθεκτικά κύτταρα και, σε συνδυασμό με 4-HPR, έχει μία συνεργιστική επίδραση [12]. Παρομοίως με 4-HPR, ο όγκος της ανάπτυξης-ανασταλτικά αποτελέσματα της 4-οξο-4-HPR είναι ανεξάρτητες των πυρηνικών υποδοχέων ρετινοειδών (RARs). Επιπλέον, το 4-HPR και 4-οξο-4-HPR μοιράζονται διάφορα ενδιάμεσα σηματοδότησης, όπως η παραγωγή ROS, αύξηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων κεραμιδιού, και ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και κασπάσης-9 [12]. Παρά τις ομοιότητες αυτές, 4-οξο-4-HPR φαίνεται να έχει επιπλέον μηχανισμούς δράσης σε σύγκριση με το μητρικό φάρμακο, πρότεινε επίσης από την ικανότητά της να είναι αποτελεσματική σε 4-HPR ανθεκτικά κύτταρα [12]. Στην πραγματικότητα, σε αντίθεση με 4-HPR, 4-οξο-4-HPR προκαλεί σημαντική συσσώρευση των κυττάρων στην μιτωτική φάση, ειδικώς σε προ-ανάφαση, σε συνδυασμό με την ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου της ατράκτου [13]. Το 4-οξο-4-HPR επαγόμενη σύλληψη στην μίτωση σχετίζεται με το σχηματισμό παρεκκλίνουσα ατράκτου (δηλαδή πολυπολική οργάνωση χωρίς απώλεια της κεντροσωμάτων ακεραιότητα), λόγω της ικανότητας του 4-οξο-4-HPR να στοχεύουν μικροσωληνίσκους και να αναστέλλουν τον πολυμερισμό τουμπουλίνης μέσω άμεσης μοριακή αλληλεπίδραση με τουμπουλίνη [13] .Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να τεμαχίσει περαιτέρω 4-οξο-4-HPR μηχανισμούς δράσης υποκείμενων αντιπολλαπλασιαστική επίδραση του, διερεύνηση κατά πόσο η αντικαρκινική δράση του ρετινοειδούς μπορεί να προκύψει επίσης από την ικανότητά της να αυξήσει παραγωγή ROS και αν η αντιμιτωτική δραστηριότητα του ρετινοειδούς σχετίζεται με το οξειδωτικό στρες. Έχουμε εδώ έδειξαν ότι, όπως και 4-HPR, 4-οξο-4-HPR προκαλεί αύξηση της παραγωγής ROS, ακολουθούμενη από επαγωγή απόκρισης ER στρες, η ενεργοποίηση των ΙΝΚ και ΡΙΑΒ αυξορρύθμιση και ότι αυτό το καταρράκτη σηματοδότησης εμπλέκεται εν μέρει στην αντιπολλαπλασιαστική επίδραση του ρετινοειδούς. Επιπλέον, το 4-οξο-4-HPR αντιμιτωτική δράση είναι λειτουργικά ανεξάρτητη από την προαναφερθείσα αποπτωτικό καταρράκτη, υποδεικνύοντας έτσι ότι η 4-οξο-4-HPR αντικαρκινική επίδραση οφείλεται σε τουλάχιστον δύο ανεξάρτητους μηχανισμούς δράσης.

Αποτελέσματα

παραγωγή ROS συμμετέχει σε 4-οξο-4-HPR-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα Α2780

Έχουμε αναφέρει πρόσφατα ότι η 4-HPR πυροδοτεί την απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης ενός καταρράκτη σηματοδότησης που ξεκινά από ROS γενιάς και ότι περιλαμβάνει απαντήσεις στρες ER, η ενεργοποίηση της JNK και ΡΙΑΒ ρύθμιση προς τα πάνω [9]. Για να διερευνηθεί αν η καταρράκτη σηματοδότησης υπεύθυνο για 4-HPR επαγόμενη απόπτωση επίσης εμπλέκονται στην απόπτωση που επάγεται από 4-οξο-4-HPR, αναλύσαμε πρώτα την εμπλοκή της παραγωγής ROS στην απόπτωση που επάγεται από 4-οξο-4-HPR σε Α2780, μία ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκινώματος των ωοθηκών, που επιλέγεται επειδή είναι ήδη γνωστό ότι είναι αποκρίνονται στην ρετινοειδών (IC

50 = 0,6 μΜ σε μια δοκιμασία 72 ωρών) και για τη δημιουργία ROS σε απόκριση προς 4-οξο-4- θεραπεία HPR [12]. Η εμπλοκή της παραγωγής ROS προσδιορίστηκε με την αξιολόγηση της επίδρασης της αντιοξειδωτική βιταμίνη C επί 4-οξο-4-HPR επαγόμενη απόπτωση. Πέντε θεραπεία μΜ 4-οξο-4-HPR για 4 ώρες προκάλεσε αύξηση της παραγωγής ROS, που εμποδίστηκε από την προσθήκη 100 μΜ βιταμίνης C (Σχήμα 1Α). Κατάργηση της παραγωγής ROS από τη βιταμίνη C προκάλεσε μείωση (1,7 φορές) επί 4-οξο-4-HPR επαγόμενη απόπτωση, αξιολογήθηκε ως κατακερματισμού του DNA με ELISA δοκιμασίας (Σχήμα 1Β). Μια παρόμοια μείωση απόπτωσης έχει παρατηρηθεί μέσω του καθορισμού της υπο-G

1 πληθυσμός με χρώση ιωδιούχου προπιδίου που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (βλέπε Σχήμα 5 και τη σχετική παράγραφο αποτέλεσμα). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η παραγωγή ROS επάγονται από 4-οξο-4-HPR ενεπλάκη σε 4-οξο-4-HPR επαγόμενη απόπτωση.

(Α) ανάλυση της παραγωγής ROS στα κύτταρα Α2780 αγωγή για 4 ώρες με 5 μΜ 4-οξο-4-HPR, με ή χωρίς 100 μΜ βιταμίνη C. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά την προσθήκη της οξειδοαναγωγικής ευαίσθητη χρωστική CM-H

2DCFDA. Το γράφημα δείχνει εκπρόσωπος κυτταρομετρία ροής προφίλ φθορισμού σε διαφορετικές συνθήκες θεραπείας (έναν εκπρόσωπο πείραμα των τριών). Μια στροφή προς τα δεξιά από τον έλεγχο υποδεικνύει αυξημένα επίπεδα ROS. (Β) κύτταρα Α2780 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 24 ώρες με 5 μΜ 4-οξο-4-HPR, με ή χωρίς 100 μΜ βιταμίνη C και την απόπτωση, αξιολογείται ως κατάτμηση του DNA, μετρήθηκε με μία δοκιμασία ELISA. Τα δεδομένα είναι τα μέσα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? κάθετες μπάρες είναι τυπικές αποκλίσεις. Αστερίσκος υποδηλώνει σημαντική διαφορά (P & lt? 0,05).

Η

4-οξο-4-HPR προκαλεί αντίδραση ER στρες στα κύτταρα Α2780

Αναλύσαμε αν 4-οξο-4-HPR, όπως 4-HPR [9], ενεργοποιείται, κατάντη της γενιάς ROS, ένα ER αντίδραση στο στρες, αξιολογώντας ειδικά σήματα ER-στρες: μετα-μεταγραφικό μάτισμα του παράγοντα μεταγραφής πρωτεΐνης δέσμευσης-1 (XBP-1) X-box, η έκφραση των πρωτεϊνών συνοδών της γλυκόζης ρυθμίζεται πρωτεΐνη 78 KD (GRP-78) /σύνδεσης ανοσοσφαιρίνης πρωτεΐνη (Μπιπ) και η πρωτεΐνη θερμικού σοκ 70 (HSP70), και η κατάσταση φωσφορυλίωσης της αλφα-υπομονάδα του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης 2 ( eIF2α) [14]. Στο Α2780 κύτταρα, 5 αγωγή μΜ 4-οξο-4-HPR για 24 ώρες προκάλεσε την μάτισμα ενός 25 bp ιντρόνιο από το mRNA προδρόμου XBP-1, προκάλεσε αυξητική ρύθμιση του GRP78 /Bip και HSP70 και φωσφορυλίωση eIF2α (Εικόνα 2Α). Η ενεργοποίηση αυτών των ER γεγονότων που σχετίζονται με άγχος καταργήθηκε (XBP-1, GRP78 /Bip και HSP70) ή να μειωθεί έντονα (eIF2α) με την προσθήκη της βιταμίνης C (Σχήμα 2Α). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η 4-οξο-4-HPR προκάλεσε επαγωγή της ER απόκρισης στρες, ως κατάντη περίπτωση γενιάς ROS.

(Α) κύτταρα Α2780 θεραπεία για 24 ώρες με 5 μΜ 4-οξο-4-HPR , με ή χωρίς 100 μΜ βιταμίνη C, υποβλήθηκαν σε δοκιμασία RT-PCR για να αναλυθεί η ματίσματος του ιντρονίου 25 bp από XBP-1 μεταγραφή και ανάλυση κηλίδας Western για την έκφραση της GRP-78 /Bip, peIF2α, eIF2α. Για αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ, β-ακτίνη ενισχύθηκε ως εσωτερικό έλεγχο. Για ανάλυση στυπώματος Western, ως έλεγχος για τη φόρτωση, το στύπωμα επωάστηκε με αντίσωμα ακτίνης. (Β) Κύτταρα επεξεργασία όπως στο (Α) υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western για την έκφραση pJNK και JNK.

Η

4-οξο-4-HPR επάγει ενεργοποίηση JNK σε κύτταρα Α2780

Αναλύσαμε αν 4-οξο-4-HPR, όπως 4-HPR [9], που προκαλείται από την ενεργοποίηση της JNK. ανάλυση Western blot, σε Α2780 κύτταρα, έδειξε ότι το 5 αγωγή μΜ 4-οξο-4-HPR για 24 ώρες προκάλεσε φωσφορυλίωση JNK και ότι η προσθήκη της βιταμίνης C μειώνονται έντονα την ενεργοποίηση της κινάσης (Σχήμα 2Β). Τα δεδομένα έδειξαν ότι η 4-οξο-4-HPR προκάλεσε την ενεργοποίηση των JNK και ότι αυτό το γεγονός συνέβη μέσω μιας ROS-εξαρτώμενο μηχανισμό.

ΡΙΑΒ αυξορρύθμιση λειτουργικά εμπλέκεται στην απόπτωση που επάγεται από 4-οξο-4-HPR

Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι ΡΙΑΒ ρυθμίζεται αυξητικά κατά 4-HPR κατά τρόπο εξαρτώμενο από τα ROS [9], και ότι παίζει ένα λειτουργικό ρόλο στην απόπτωση που επάγεται από το ρητινοειδούς στα κύτταρα Α2780 [10]. έτσι Αξιολογήσαμε αν επίσης 4-οξο-4-HPR διαμορφωμένου έκφραση ΡΙΑΒ. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι 5 μΜ θεραπεία 4-οξο-4-HPR για 24 ώρες επαγόμενη ΡΙΑΒ ανοδική ρύθμιση και ότι αυτή η επίδραση ήταν έντονα μειωμένος από την προσθήκη βιταμίνης C (Σχήμα 3Α). Για να διερευνηθεί αν ΡΙΑΒ αυξορρύθμιση έπαιξε λειτουργικό ρόλο στην απόπτωση που επάγεται από 4-οξο-4-HPR, επωφεληθήκαμε από ΡΙΑΒ σίγηση σε Α2780 κύτταρα, που δημιουργούνται προηγουμένως από σταθερή επιμόλυνση [10]. Όπως ήταν αναμενόμενο, ΡΙΑΒ upmodulation επάγεται από 4-οξο-4-HPR μειώθηκε ισχυρά σε κύτταρα επιμολυσμένα με το πλασμίδιο ΡΙΑΒ siRNA σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με ένα περιπλεγμένο πλασμίδιο που χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος (Σχήμα 3Β). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, η απόπτωση που επάγεται από 4-οξο-4-HPR σε κύτταρα επιμολυσμένα με ΡΙΑΒ siRNA ήταν περίπου 2-φορές μειωμένη έναντι των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με το περιπλεγμένο πλασμίδιο. Η μείωση της απόπτωσης που επάγεται από 4-οξο-4-HPR σε ΡΙΑΒ σιγήσει κυττάρων έχει επίσης επιβεβαιωθεί από την αξιολόγηση των υπο-G

1 πληθυσμού μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η 4-οξο-4-HPR επαγόμενης ΡΙΑΒ αυξορρύθμιση ως γεγονός κατάντη της παραγωγής ROS και ότι ΡΙΑΒ συνέβαλε σε 4-οξο-4-HPR επαγόμενη απόπτωση. Όλα τα παραπάνω στοιχεία πρότειναν ότι η 4-οξο-4-HPR προκάλεσε την ενεργοποίηση του ROS που σχετίζονται με καταρράκτη σηματοδότησης ήδη δειχθεί ότι ενεργοποιείται από 4-HPR (ROS → ER στρες → JNK → ΡΙΑΒ) [9].

(Α) ανάλυση κηλίδας Western για έκφραση ΡΙΑΒ σε κύτταρα Α2780 θεραπεία για 24 ώρες με 5 μΜ 4-οξο-4-HPR, με ή χωρίς 100 μΜ βιταμίνη C. Ως μάρτυρας για τη φόρτωση, η κηλίδα επωάστηκε με αντίσωμα ακτίνης . (Β) ανάλυση κηλίδας Western για έκφραση ΡΙΑΒ σε Α2780 κύτταρα σταθερώς επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο που περιέχει ένα ΡΙΑΒ siRNA ή ένα κωδικοποιημένο nonsilencing siRNA μετά την προσθήκη 5 μΜ 4-οξο-4-HPR για 24 ώρες. Ως μάρτυρας για τη φόρτωση, το στύπωμα επωάστηκε με αντίσωμα ακτίνης. (C) Ανίχνευση του 4-οξο-4-HPR-επαγόμενη απόπτωση σε Α2780 σταθερά επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο που περιέχει ένα ΡΙΑΒ siRNA (μαύρες στήλες) ή ένα κωδικοποιημένο siRNA nonsilencing (γκρι στήλες). Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 24 ώρες με 5 μΜ 4-οξο-4-HPR και την απόπτωση, αξιολογείται ως κατάτμηση του DNA, μετρήθηκε με μία δοκιμασία ELISA. Τα δεδομένα είναι μέσα από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα? κάθετες μπάρες είναι τυπικές αποκλίσεις. Αστερίσκος υποδηλώνει σημαντική διαφορά (P & lt? 0,01).

Η

4-οξο-4-HPR προκαλεί Bcl-2 και Mcl-1 ρύθμιση προς τα κάτω σε ένα ROS-ανεξάρτητο τρόπο

Δεδομένου ότι έχει έχει αναφερθεί ότι η 4-HPR μπορεί να διεγείρει απόπτωση μέσω της ρύθμισης των μελών της οικογένειας Bcl-2, οι μεταγενέστεροι περίπτωση γενιάς ROS [15] – [17], αναλύσαμε την επίδραση της 4-οξο-4-HPR επί αντιαποπτωτικού πρωτεΐνες Β κυτταρικού λεμφώματος γονίδιο-2 (Bcl-2) και μυελοειδούς λευχαιμίας κυττάρων-1 (Mcl-1) και σχετικά με την προαποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 σχετίζεται Χ πρωτεΐνη (Βαχ). Στο Α2780 κύτταρα, 5 μΜ θεραπεία 4-οξο-4-HPR για 24 ώρες προκάλεσε μείωση του επιπέδου έκφρασης Bcl-2 και Mcl-1 πρωτεΐνη, ενώ δεν είχε επίδραση στην έκφραση Bax (Σχήμα S1). Η ρύθμιση προς τα κάτω των δύο Bcl-2 και Mcl-1 δεν εμποδίστηκε από την προσθήκη βιταμίνης C (Σχήμα S1), υποδηλώνοντας έτσι ότι η 4-οξο-4-HPR προκάλεσε τέτοια μείωση σε ROS-ανεξάρτητο τρόπο.

μίτωσης και σχηματισμού του πολυπολικού αδράχτια είναι ανεξάρτητες από ROS που σχετίζονται με καταρράκτη σηματοδότησης σε κύτταρα Α2780

Αντίθετα με 4-HPR, η οποία επηρεάζει μόνο ελαφρά το G

1 φάση του κυτταρικού κύκλου, 4- οξο-4-HPR προκαλεί σημαντική συσσώρευση των κυττάρων σε G

2-M φάσεις [12]. Έχουμε αναφέρει πρόσφατα ότι η 4-οξο-4-HPR επαγόμενη διαταραχή κυτταρικού κύκλου οφειλόταν στην ικανότητα του ρετινοειδούς να αναστέλλουν τον πολυμερισμό της τουμπουλίνης, συλλαμβάνοντας κύτταρα σε μίτωση [13]. Επιπλέον, η αντιμιτωτική δράση του ρετινοειδούς αποδείχθηκε να γίνουν σε συνδυασμό με το σχηματισμό παρεκκλίνοντα σχήματος ατράκτους (δηλ multipolars) λόγω των συνεπειών του στην πολυμερισμού τουμπουλίνης [13]. Για να διερευνηθεί κατά πόσο η 4-οξο-4-HPR επαγόμενη μιτωτική σύλληψη και ο σχηματισμός του πολυπολικού άτρακτοι συνδέονται με την καταρράκτη ROS προκαλούμενη σηματοδότησης πραγματοποιήσαμε πρώτη ανάλυση χρονικής πορείας των δύο ROS παραγωγής και του κυτταρικού κύκλου διαταραχή που προκαλείται από 4- οξο-4-HPR. γενιά ROS παρατηρήθηκε ήδη 30 λεπτά μετά τη θεραπεία ρετινοειδή (Εικόνα 4Α) και έμεινε όλη τη 24-ωρη χρονική πορεία. Αντίθετα, μια μικρή G

συσσώρευση κυττάρων 2-Μ παρατηρήθηκε μόνο σε 2 ώρες και η αύξηση του ποσοστού του G

2-Μ συλληφθεί κυττάρων ήταν χρονικά εξαρτώμενη μέχρι 16-24 ώρες (Εικόνα 4Β) . Έτσι, η ανάλυση της χρονικής πορείας έδειξε ότι η οξειδωτικό στρες που προκαλείται από 4-οξο-4-HPR εμφανίστηκαν νωρίτερα από την αναστολή του κυτταρικού κύκλου και ότι τα δύο γεγονότα που παρουσιάζονται διαφορετικές κινητικές. Για να διερευνηθεί κατά πόσο η 4-οξο-4-HPR επαγόμενη παραγωγή ROS έπαιξε ρόλο στην μιτωτική σύλληψη, αναλύσαμε τα αποτελέσματα της βιταμίνης C σε διαταραχή του κυτταρικού κύκλου και του σχηματισμού ανώμαλων ατράκτους που προκαλείται από το ρετινοειδές. Σε Α2780 κύτταρα εκτέθηκαν για 24 ώρες σε 5 μΜ 4-οξο-4-HPR, την προσθήκη 100 μΜ βιταμίνης C δεν εμπόδισε την συσσώρευση του G

2-M κυτταρικού πληθυσμού (Σχήμα 5 και S2) ή τον σχηματισμό πολυπολικό ατράκτους (Σχήμα 5). Συνεπής αποτελέσματα στη διανομή του κυτταρικού κύκλου και το σχηματισμό του πολυπολικού ατράκτων ελήφθησαν αναστέλλοντας την καταρράκτη ROS σχετίζονται σηματοδότησης σε ένα επόμενο στάδιο, μέσω ΡΙΑΒ αποσιώπηση: διαμόλυνση με ΡΙΑΒ siRNA δεν εμπόδισε 4-οξο-4-HPR επαγόμενη σύλληψη μιτωτική και το σχηματισμό του πολυπολικό ατράκτους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε Α2780 κύτταρα, ο μιτωτικός σύλληψης που επάγεται από 4-οξο-4-HPR δεν ήταν ούτε ένα γεγονός κατάντη της γενιάς ROS, ούτε ένα βήμα της ROS που σχετίζονται με καταρράκτη σηματοδότησης.

(Α) Ανάλυση της παραγωγής ROS στα κύτταρα Α2780 σε επεξεργασία με 5 μΜ 4-οξο-4-HPR για 30 λεπτά, 1 ώρα, 2 ώρες, 4 ώρες, 6 ώρες, 16 ώρες και 24 ώρες. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά την προσθήκη της χρωστικής οξειδοαναγωγικά ευαίσθητη CM-H

2DCFDA. Τα γραφήματα δείχνουν αντιπροσωπευτικά κυτταρομετρία ροής προφίλ φθορισμού σε διαφορετικές συνθήκες θεραπείας (έναν εκπρόσωπο πείραμα των τριών). Μια στροφή προς τα δεξιά από τον έλεγχο υποδεικνύει αυξημένα επίπεδα ROS. (Β) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων προπίδιο Α2780 ιωδιούχο κηλιδωθεί σε επεξεργασία με όχημα ή 5 μΜ 4-οξο-4-HPR για 30 λεπτά, 1 ώρα, 2 ώρες, 4 ώρες, 6 ώρες, 16 ώρες και 24 ώρες. Οι αριθμοί στο σχήμα δείχνουν το ποσοστό των κυττάρων στη φάση του κυτταρικού κύκλου, σύμφωνα με την ανάλυση που πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό ModFit LT. αντιπροσωπευτικό Ένα πείραμα από τρία δείχνεται.

Η

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων προπίδιο Α2780 ιωδιούχο χρώση θεραπεία για 24 ώρες με 5 μΜ 4-οξο-4-HPR με ή χωρίς 100 C. Αριθμοί μΜ βιταμίνη στο σχήμα δείχνουν το ποσοστό των κυττάρων στη φάση του κυτταρικού κύκλου, σύμφωνα με την ανάλυση που πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό ModFit LT. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία δείχνεται. Στη δεξιά απεικονίζεται ένα αντιπροσωπευτικό μιτωτική κυτταρική εικόνα για κάθε θεραπεία, που λαμβάνεται με ανοσοχρώση με το αντίσωμα α-τουμπουλίνης (

πράσινο

) και πυρηνική χρώση με Hoechst 33342 (

μπλε

). μπαρ Κλίμακα = 5 μm.

Η

4-οξο-4-HPR δρα μέσω ενός διπλού μηχανισμού δράσης και σε κυτταρικές σειρές καρκίνου των διαφορετικών histotypes

Για να καθοριστεί αν η συμμετοχή του δύο ανεξάρτητων μηχανισμών σε 4-οξο-4-HPR δραστηριότητα αυτή περιορίστηκε σε κύτταρα Α2780 ή αντιπροσωπεύονται το διακριτικό τρόπο δράσης του ρετινοειδούς, επεκτείναμε την ανάλυση του 4-οξο-4-HPR εφέ σε άλλα τρία ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές αποκρίνεται σε το ρητινοειδές: κύτταρα δΚ-Ν-ΒΕ (νευροβλάστωμα) (Σχήμα 6Α) T47D (αδενοκαρκίνωμα του μαστού), HeLa (επιθηλιακό τραχηλικό αδενοκαρκίνωμα) και. Εκτιμήσαμε πρώτα την ενδοκυτταρική παραγωγή των ROS που επάγεται από 4-οξο-4-HPR δείχνει ότι, στις κυτταρικές σειρές τριών καρκίνος, 5 μΜ 4-οξο-4-HPR για 4 ώρες αυξημένη παραγωγή ROS πάνω έλεγχοι και ότι η προσθήκη του 100 μΜ βιταμίνη C ανέστειλε την παραγωγή ROS που επάγεται από το ρητινοειδές (Σχήμα 6Β). Στις τρεις κυτταρικές γραμμές δοκιμάστηκαν, 4-οξο-4-HPR θεραπεία επαγόμενης ανοδική ρύθμιση ΡΙΑΒ και αυτό το αποτέλεσμα μειώθηκε με την προσθήκη βιταμίνης C (Σχήμα 6C). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανάλυση κυτταρικού κύκλου επιδεικνύοντας ότι η θεραπεία 4-οξο-4-HPR προκάλεσε μια σήμανση G

2-Μ διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε όλες τις δοκιμασμένες κυτταρικές γραμμές καρκίνου (Σχήμα 7 και S2). Παρομοίως με ό, τι παρατηρείται σε Α2780 κύτταρα, σε αυτές τις κυτταρικές σειρές Η αναστολή της παραγωγής ROS με βιταμίνη C προκάλεσε αξιοσημείωτη μείωση της υπο-G

1 πληθυσμού, αλλά δεν μείωσε το ποσοστό των κυττάρων που συνελήφθησαν το G

2- Μ φάση (Σχήμα 7 και S2). Επιπλέον, το 4-οξο-4-HPR θεραπεία προκάλεσε το σχηματισμό πολυπολικού ατράκτων σε T47D, HeLa και SK-N-BE κύτταρα (Σχήμα 7), και σε όλα αυτά η προσθήκη βιταμίνης C δεν εμπόδισε το σχηματισμό των μη-φυσιολογικών ατράκτων που προκαλείται από το ρητινοειδές (Σχήμα 7). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, ακόμη και σε T47D, HeLa και SK-N-BE κύτταρα, το ROS εξαρτώμενη καταρράκτη σηματοδότησης συμμετείχε σε 4-οξο-4-HPR επαγόμενη απόπτωση. Επιπλέον, το 4-οξο-4-HPR επαγόμενη αναστολή του κυτταρικού κύκλου και ο σχηματισμός του πολυπολικού ατράκτων ήταν ανεξάρτητες από την ROS σχετιζόμενη καταρράκτη σηματοδότησης, όχι μόνο σε ωοθηκών, αλλά και στο στήθος, του τραχήλου της μήτρας και του καρκίνου του νευροβλαστώματος κυτταρικές σειρές, αποκαλύπτοντας το διακριτικό γνώρισμα 4-οξο-4-HPR να έχουν ένα διπλό μηχανισμό δράσης.

(Α) κυτταροτοξική δράση του 4-οξο-4-HPR σε Τ47ϋ (□), HeLa (▵) και SK-Ν- BE (○) κυτταρική ανάπτυξη εκτιμήθηκε με την χρησιμοποίηση της δοκιμασίας Β σουλφοροδαμίνης. Η αντιπολλαπλασιαστική δραστικότητα των 4-οξο-4-HPR σε κάθε κυτταρική σειρά εξετάστηκε σε τρία ανεξάρτητα πειράματα με τέσσερα φρεάτια πανομοιότυπα για κάθε ανάλυση? κάθετες μπάρες είναι τυπικές αποκλίσεις. (Β) Ανάλυση της παραγωγής ROS σε T47D, HeLa και SK-N-BE κύτταρα σε αγωγή για 4 ώρες με 5 μΜ 4-οξο-4-HPR, με ή χωρίς 100 μΜ βιταμίνης C. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά την προσθήκη της οξειδοαναγωγής ευαίσθητη χρωστική CM-H

2DCFDA. Τα γραφήματα δείχνουν αντιπροσωπευτικά κυτταρομετρία ροής προφίλ φθορισμού σε διαφορετικές συνθήκες θεραπείας (έναν εκπρόσωπο πείραμα των τριών). Μια στροφή προς τα δεξιά από τον έλεγχο υποδεικνύει αυξημένα επίπεδα ROS. (C) αναλύσεις κηλίδας Western για έκφραση ΡΙΑΒ σε T47D, HeLa και SK-N-BE κύτταρα κατεργασμένα με 5 μΜ 4-οξο-4-HPR για 24 ώρες, με ή χωρίς 100 μΜ βιταμίνη C. Ως μάρτυρας για τη φόρτωση, η στύπωμα επωάστηκε με αντίσωμα ακτίνης.

η

ανάλυση κυτταρομετρίας ροής ιωδιούχου προπιδίου-βάφονται Τ47ϋ (Α), HeLa (Β) και SK-N-Be κύτταρα (C) σε θεραπεία για 24 ώρες με 5 μΜ 4-οξο-4-HPR με ή χωρίς 100 μΜ βιταμίνης C. Οι αριθμοί στο σχήμα δείχνουν το ποσοστό των κυττάρων στη φάση του κυτταρικού κύκλου, σύμφωνα με την ανάλυση που πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό ModFit LT. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία δείχνεται. Στο κάτω μέρος κάθε ιστόγραμμα, ανάλυση ανοσοφθορισμού με αντίσωμα α-τουμπουλίνης (

πράσινο

) των κυττάρων σε επεξεργασία με τον ίδιο τρόπο. Η πυρηνική μορφολογία οπτικοποιήθηκε με χρώση με Hoechst 33342 (

μπλε

). μπαρ κλίμακας = 10 μm.

Η

Συζήτηση

4-οξο-4-HPR είναι ένα πολικό μεταβολίτης της συνθετικής ρετινοειδών 4-HPR που ανιχνεύθηκε στα δείγματα των γυναικών που έλαβαν θεραπεία με πλάσμα 4-HPR συμμετέχουν σε δοκιμή φάσης την πρόληψη του καρκίνου του μαστού ΙΙΙ [11]. προηγούμενο

in vitro μελέτες μας

διεξάγονται με 4-οξο-4-HPR έχουν δείξει ότι το ρετινοειδές είναι προικισμένο με πολύ ελπιδοφόρα αντικαρκινικές ιδιότητες, όπως ανασταλτικά αποτελέσματα ανάπτυξης όγκου υψηλότερη από 4-HPR (όντας του IC

50 τιμές δύο έως τέσσερις φορές μικρότερη από ό, τι το πατρικό φάρμακο στην πλειοψηφία των δοκιμαζόμενες κυτταρικές γραμμές), η έλλειψη διασταυρούμενης αντίστασης και συνεργιστική αλληλεπίδραση με το μητρικό φάρμακο [12], υποδηλώνοντας ότι θα μπορούσε να προταθεί ως νέος παράγοντας για τη θεραπεία του καρκίνου. Διαφορετικά από 4-HPR και άλλα ρετινοειδή, 4-οξο-4-HPR στοχεύει μικροσωληνίσκους και αναστέλλει τον πολυμερισμό της τουμπουλίνης προκαλούν μιτωτική σύλληψη και ο σχηματισμός του πολυπολικού ατράκτους χωρίς απώλεια της ακεραιότητας κεντροσωμάτων [13]. Από την άλλη πλευρά, παρόμοια με το μητρικό φάρμακο, το 4-οξο-4-HPR επάγει αύξηση της παραγωγής ROS [12].

Δεδομένου ότι η 4-HPR επαγόμενη παραγωγή ROS έχει δειχθεί ότι ενεργοποιεί ένα αποπτωτικό καταρράκτη που περιλαμβάνει αντίδραση ER στρες, η ενεργοποίηση JNK και αυξορρύθμιση της προαποπτωτική πρωτεΐνη ΡΙΑΒ [9], αποφασίσαμε να διερευνήσει κατά πόσον 4-οξο-4-HPR ενεργοποιείται απόπτωση επίσης μέσω παραγωγή ROS και αν αντιμιτωτική δραστηριότητα του ήταν συνδεδεμένος με αυτόν τον ROS-εξαρτώμενη οδό. 4-οξο-4-HPR επαγόμενη παραγωγή ROS συνέβαλαν στην αποπτωτική δραστικότητα του ρητινοειδούς, επειδή η αγωγή με την αντιοξειδωτική βιταμίνη C προκάλεσε μείωση του 4-οξο-4-HPR επαγόμενη απόπτωση. Σε προηγούμενη μελέτη μας για 4-οξο-4-HPR χαρακτηρισμό [12], δεν ήμασταν σε θέση να δείξει μια σαφή αιτιώδη σχέση μεταξύ παραγωγής των ROS και τη δραστηριότητα αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων του ρετινοειδών. Μια πιθανή εξήγηση θα μπορούσε να είναι ότι το αντιοξειδωτικό που χρησιμοποιείται στην προηγούμενη ανάλυση (δηλαδή

N

-ακετυλ-L-κυστεΐνη) δεν απέτρεψε εντελώς την οξειδωτικό στρες που προκαλείται από 4-οξο-4-HPR, αλλά μόνο προκάλεσε μερική μείωση της παραγωγής ROS [12].

Κατάντη της γενιάς ROS, 4-οξο-4-HPR ενεργοποιούνται άλλα ενδιάμεσα σηματοδότησης του αποπτωτικού καταρράκτη 4-HPR, όπως απόκριση ER στρες (που ανιχνεύεται από XBP-1 μάτισμα, GRP78 /Μπιπ και HSP70 ρύθμιση προς τα άνω, και eIF2α φωσφορυλίωση) και JNK φωσφορυλίωση, τόσο αποτραπεί με προσθήκη βιταμίνης C. Η έκφραση της πρωτεΐνης προαποπτωτικών ΡΙΑΒ δραματικά αυξήθηκε κατά 4-οξο-4-HPR και προς τα πάνω ρύθμιση του μειώθηκε με προσθήκη βιταμίνης C, γεγονός που υποδηλώνει ότι η διαμόρφωση της έκφρασης πρωτεΐνης ήταν μεταγενέστερος περίπτωση του οξειδωτικού στρες που προκαλείται από την ρετινοειδές. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι ΡΙΑΒ έπαιξε λειτουργικό ρόλο στην 4-οξο-4-HPR αποπτωτική δραστηριότητα, διότι σίγηση του μείωσε την απόπτωση που επάγεται από το ρετινοειδές. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι 4-οξο-4-HPR, εκτός του ότι δρα ως ένας παράγοντας, η απόπτωση που επάγεται μέσω του καταρράκτη σηματοδότησης που έχουμε ήδη δείξει ότι ενεργοποιείται από 4-HPR (ROS → ER στρες → JNK → ΡΙΑΒ) [ ,,,0],9]

ΡΙΑΒ αποπτωτική επαγωγής δραστηριότητα έχει παρατηρηθεί και αναφερθεί από άλλους συγγραφείς σε διάφορες κυτταρικές πλαίσια και μετά από θεραπεία με διάφορα αντικαρκινικά φάρμακα [9], [18] – [21].. Ωστόσο, οι ειδικοί κατάντη γεγονότα με τα οποία ΡΙΑΒ μεσολαβεί τέτοιο αποτέλεσμα μένει να καθοριστεί. Από τα αποτελέσματά μας, η εμπλοκή των πρωτεϊνών Bcl-2 και Mcl-1, ένα μέλος της οικογένειας Bcl-2, σε ΡΙΑΒ αποπτωτική δραστηριότητα μπορεί να αποκλειστεί, ενδεχομένως. Στην πραγματικότητα, ακόμα κι αν θεραπεία 4-οξο-4-HPR προκάλεσε μειορύθμιση του επιπέδου έκφρασης των δύο αντιαποπτωτικών πρωτεΐνες, μια τέτοια μείωση δεν παρεμποδίστηκε από την αναστολή της ROS μεσολάβηση αποπτωτικού καταρράκτη που περιλαμβάνουν ΡΙΑΒ.

είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι η 4-οξο-4-HPR είναι μια οξειδωμένη μορφή του 4-HPR και ότι η τροποποίηση στην θέση 4 του δακτυλίου κυκλοεξενίου είναι πιθανώς υπεύθυνο για 4-οξο-4-HPR δραστηριότητα μικροσωληναρίων, αλλά δεν επηρεάζουν την ικανότητα του ρετινοειδούς να επάγει την παραγωγή ROS και για την ενεργοποίηση του ROS που σχετίζονται με καταρράκτη σηματοδότησης. Τέτοια χημική τροποποίηση θα μπορούσε να είναι επίσης υπεύθυνος για τη διαφορετική σφιγγολιπίδιο μεταβολισμό παρατηρείται μεταξύ των δύο ρετινοειδή. Τόσο 4-HPR και 4-οξο-4-HPR έχουν δειχθεί να επάγουν μια δραματική αύξηση του dihydroceramide παραγωγής? Ωστόσο, η συμβολή των διακριτών μοριακών ειδών στο συνολικό αύξηση αναφέρθηκε για να είναι αισθητά διαφορετική, από την άποψη της σφιγγοσίνης /σφινγκανίνης και περιεκτικότητα λιπαρών οξέων. Επιπλέον, το 4-οξο-4-HPR, αντίθετα από το μητρικό φάρμακο, έχει δειχθεί ότι αυξάνει ελαφρώς επίσης την παραγωγή κηραμιδίου [22].

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι η 4-οξο-4-HPR δρα ασυνήθιστα σε σύγκριση με 4-HPR και άλλα ρετινοειδή, λόγω της ικανότητάς της να αναστέλλει τον πολυμερισμό της τουμπουλίνης, οδηγώντας στο σχηματισμό πολυπολικού ατράκτων και μιτωτική σύλληψη [13]. Σε αυτή τη μελέτη έχουμε βρει ότι η μιτωτική σύλληψη και ο σχηματισμός των συζευγμένων ατράκτων πολυπολικού επάγεται από 4-οξο-4-HPR ήταν ανεξάρτητες από την ROS που σχετίζονται με καταρράκτη σηματοδότησης. Στην πραγματικότητα, έχουμε δείξει ότι η 4-οξο-4-HPR επαγόμενη παραγωγή ROS σημειώθηκε νωρίτερα από την μιτωτική σύλληψη, υποδηλώνοντας έτσι ότι η αντιμιτωτική δραστικότητα του ρητινοειδούς δεν ήταν ένα γεγονός ανοδικά του οξειδωτικού στρες. Από την άλλη πλευρά, η αναστολή της ROS σχετίζονται οδού από τη βιταμίνη C ή με ΡΙΑΒ σίγηση δεν εμπόδισε την ικανότητα του 4-οξο-4-HPR να ασκήσει μικροσωληναρίων δραστηριότητα, υποδηλώνοντας έτσι ότι η μιτωτική σύλληψη δεν ήταν ROS- εξαρτάται μηχανισμό. Η εμφάνιση ενός διπλού μηχανισμού δράσης θα μπορούσε εύλογα να είναι ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του τρόπου δράσης των 4-οξο-4-HPR, δεδομένου ότι αυτά τα δύο άσχετα μονοπάτια βρέθηκαν σε καρκινικές κυτταρικές σειρές διαφορετικής histotypes (ωοθηκών, μαστού, καρκίνωμα του τραχήλου και νευροβλάστωμα).

ακόμα κι αν ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο 4-οξο-4-HPR δραστηριότητα των μικροσωληνίσκων πυροδοτεί τον κυτταρικό θάνατο δεν έχει ακόμη καθοριστεί, βάσει των ανωτέρω στοιχείων, μπορούμε να υποθέσουμε ότι τόσο η ROS- συναφείς καταρράκτη σηματοδότησης και οι δραστηριότητες Antimicrotubule ανεξάρτητα συμβάλλουν στην 4-οξο-4-HPR αντιπολλαπλασιαστική δράση και προτείνουμε ότι οι ρετινοειδές δρα ως παρουσιάζεται σχηματικά στο Σχήμα 8. Παρ ‘όλα αυτά, η ανάλυση των μηχανισμών 4-οξο-4-HPR της δράσης θα πρέπει περαιτέρω μελέτες για να διερευνηθεί πώς τα δύο μονοπάτια μοριακά οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο. Είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι η ROS-ανεξάρτητη ρύθμιση προς τα κάτω της Bcl-2 και Mcl-1, που παρατηρείται μετά από 4-οξο-4-HPR θεραπεία, θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα ρόλο στην απόπτωση που επάγεται από την μικροσωληναρίων δραστηριότητα του ρετινοειδούς, αν και προς το παρόν καμία απόδειξη υποστηρίζει αυτή την υπόθεση. Σύμφωνα με τις παρατηρήσεις μας, έχει αναφερθεί ότι η θεραπεία με άλλους παράγοντες μικροσωληνίσκων παρεμβολής μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της Bcl-2 και Mcl-1 ενδοκυτταρικής ποσά που συμβάλλουν στην απόπτωση [23] – [25].

4 -οξο-4-HPR επάγει κυτταρικό θάνατο μέσω δύο ανεξάρτητων μηχανισμών δράσης: 1) ένα ROS που σχετίζονται με καταρράκτη σηματοδότησης που περιλαμβάνει αντίδραση στο στρες ER, ενεργοποίηση JNK και αυξορρύθμιση της προαποπτωτική πρωτεΐνη ΡΙΑΒ? και 2) δραστηριότητες μικροσωληναρίων που συνίσταται σε αναστολή του πολυμερισμού της τουμπουλίνης, μιτωτική σύλληψη και ο σχηματισμός του πολυπολικού ατράκτους.

Η

Είναι αξιοσημείωτο ότι οι άλλοι παράγοντες μικροσωληνίσκων στοχευμένες δειχθεί ότι προάγει την παραγωγή ROS σε καρκινικά κύτταρα, αλλά η σχέση μεταξύ της δυναμικής τουμπουλίνης και το οξειδωτικό στρες παραμένουν ασαφείς [26] – [33]. Πρόσφατα, η αντικαρκινική δράση της πακλιταξέλης έχει συνδεθεί με την παραγωγή ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών ROS και έχει προταθεί ότι η διατάραξη της κρατικής πολυμερισμού μικροσωληνίσκων που προκαλείται από αυτόν τον παράγοντα, καθώς και από ταξοτέρη ή βινκριστίνη, θα μπορούσε να ενισχύσει την παραγωγή ROS μέσω σταθεροποίηση του ενεργό οξειδάση του ΝΑϋΡΗ [31], [32]. γενιά ROS συνέβαλε επίσης στην αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του patupilone, μέλος των μικροσωληνίσκων-σταθεροποιητικούς παράγοντες εποθιλόνες, και η αιτιώδης σχέση μεταξύ του οξειδωτικού στρες και οι τροποποιήσεις της δυναμικής των μικροσωληνίσκων έχει προταθεί [30]. Αντίθετα, η παραγωγή ROS που επάγεται από στιλβενίου 5γ, έναν αναστολέα μικροσωληνίσκων στη θέση κολχικίνη, έχει δειχθεί ότι είναι άσχετη με την διαταραχή του κυτταρικού κύκλου που προκαλείται από φάρμακα [29], παρομοίως με αυτό που έχουμε βρει για 4-οξο-4- HPR.

Η ικανότητα της 4-οξο-4-HPR να δράσει μέσω τουλάχιστον δύο ανεξάρτητες μεταξύ τους μηχανισμούς που θα μπορούσαν πιθανώς να επιτρέψει να αντισταθμίσει την ανάπτυξη της ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Στην πραγματικότητα, έχουμε δείξει ότι εάν μία οδός αναστέλλεται (δηλ ROS σχετίζονται οδού σηματοδότησης), το ρετινοειδές είναι σε θέση να δρα μέσω του άλλου μηχανισμού (δηλ μιτωτική ανακοπή) για να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα.