Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) που προκαλείται από υποξία είναι ένα από τα κρίσιμα αιτίες της αποτυχίας της θεραπείας σε διάφορους τύπους ανθρώπινων καρκίνων. NF-κΒ εμπλέκεται στενά στην εξέλιξη της EMT. Σε σύγκριση με HIF-1α, ο συσχετισμός μεταξύ της NF-κΒ και EMT κατά τη διάρκεια της υποξίας έχει λιγότερο μελετηθεί, και παρόλο που παρατηρήθηκε το φαινόμενο κατά το παρελθόν, οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται παρέμεινε ασαφής.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εδώ, αναφέρουμε ότι η υποξία ή υπερέκφραση του υποξία παράγοντα-1α (HIF-1α) προωθεί EMT σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Στις μοριακές ή φαρμακολογική αναστολή του NF-κΒ, υποξικά κύτταρα ανέκτησε έκφραση της Ε-καδερίνης, έχασε την έκφραση του Ν-καδερίνης, και εξασθενημένα ιδιαίτερα επεμβατική και ανθεκτικά στα φάρμακα φαινότυπο τους. Η εισαγωγή ενός pcDNA3.0 /HIF-1α σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες ορθοξικές αυξημένη δραστικότητα ΝΡ-κΒ, phenocopying επιδράσεις ΕΜΤ που παράγεται από την υποξία. Αντίθετα, αναστέλλοντας την αυξημένη δραστηριότητα NF-κΒ σε αυτή τη ρύθμιση εξασθενημένο το φαινότυπο EMT.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η υποξία ή υπερέκφραση του HIF-1α επάγει την EMT που εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό για NF-κΒ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Cheng ZX, Κυρ Β, Wang SJ, Gao Υ, Zhang ΥΜ, Zhou ΗΧ, et al. (2011) πυρηνικού παράγοντα κΒ-Εξαρτημένη Τα επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά Μετάβαση Induced από HIF-1α ενεργοποίηση σε κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος κάτω από συνθήκες υποξίας. PLoS ONE 6 (8): e23752. doi: 10.1371 /journal.pone.0023752

Επιμέλεια: Σ Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Απρ 2011? Αποδεκτές: 23, Ιουλίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 22 Αυγούστου 2011

Copyright: © 2011 Cheng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Στήριξης New Century για ελιτίστικη του κινεζικού υπουργείου Παιδείας (NCET-07-0248), η επιστημονική Ίδρυμα Επιφανείς Νεολαίας της επαρχίας Heilongjiang, Κίνα (JC200717), του Επιστημονικού και Τεχνολογικού Έργου της επαρχίας Heilongjiang, Κίνα (GC09C407-2), και το Εθνικό Φυσικό Επιστημονικό Ίδρυμα της Κίνας (30571808, 30872987). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος, η οποία είναι μία από τις πιο επιθετικές και θανατηφόρες καρκίνους παγκοσμίως, είναι εξαιρετικά ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία [1]. Ακόμη και συστηματική θεραπεία με γεμσιταβίνη, η τρέχουσα θεραπεία πρώτης γραμμής για προχωρημένο καρκίνο του παγκρέατος προσφέρει μόνο μέτρια οφέλη, λόγω των εγγενών ή επίκτητη χημειοαντίσταση [2], [3]. Επιπλέον, πρόσφατες κλινικές μελέτες δείχνουν ότι μόνο το 12% των ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του παγκρέατος έχουν μια απάντηση σε γεμσιταβίνης [4]. Το χαμηλό ποσοστό ανταπόκρισης δείχνει ότι ο καρκίνος του παγκρέατος είτε γρήγορα αναπτύσσεται ή έχει γεμσιταβίνη χημειοαντίσταση. Οι μηχανισμοί με τους οποίους χημειοαντίσταση προκύπτει σε καρκίνο του παγκρέατος είναι άγνωστες? Έτσι, μια καλύτερη κατανόηση του τρόπου προκύπτει αντίστασης και ποιες μοριακές αλλαγές προκαλούν ή συσχετίζονται με αντίσταση είναι πιθανό να οδηγήσει σε νέες θεραπευτικές στρατηγικές για τον καρκίνο του παγκρέατος.

Η υποξία είναι μια περιβαλλοντική ερέθισμα που παίζει καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου . Όγκων υποξία ή έκφραση του HIF-1 (υποξία παράγοντα-1) έχει συνδεθεί με μια επιθετική φαινότυπο που σχετίζεται με κακή απόκριση σε χημειοθεραπεία και σε χειρότερη συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο [5], [6]. HIF-1 είναι μία ετεροδιμερής πρωτεΐνη αποτελούμενη από HIF-1β, ένα ιδιοσυστατικά εκφραζόμενο υπομονάδα, και HIF-1α, οξυγόνο ευαίσθητη διεγέρσιμη υπομονάδας. Κάτω από συνθήκες ορθοξικές, HIF-1α πρωτεΐνη υδροξυλιώνεται από μια οικογένεια υδροξυλασών προλυλ οξυγόνο εξαρτώμενη (PHD1-3)? αυτό στοχεύει για polyubiquitination από μια σύνθετη πρωτεΐνη που περιέχει πρωτεΐνη von Hippel-Lindau (pVHL) και, στη συνέχεια, την υποβάθμιση. Υπό συνθήκες υποξίας, υδροξυλάσες προλίνης είναι απενεργοποιημένο, και η υποβάθμιση του HIF-1α είναι αποκλεισμένη? Αυτό επιτρέπει HIF-1α να συσσωρεύονται και να συνδεθούν με HIF-1β για να σχηματίσουν ένα λειτουργικό σύμπλεγμα μεταγραφής που ενεργοποιεί τη μεταγραφή ενός ξενιστή των γονιδίων υποξίας-διεγέρσιμο [7].

Τα επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβασης (ΕΜΤ) είναι η διαδικασία με την οποία προσκολλημένα επιθηλιακά κύτταρα να μετατραπούν σε κινητικά μεσεγχυματικών κυττάρων και είναι απαραίτητη στην εμβρυϊκή ανάπτυξη. EMT είναι τώρα γνωστό ότι εμφανίζονται επίσης σε μια ποικιλία ασθενειών, συμπεριλαμβανομένης της εξέλιξης του καρκίνου του [8]. Σε πρόσφατη μελέτη, προσκομίζεται απόδειξη που υποδηλώνει ότι μέτριες συνθήκες υποξίας μπορεί να προκαλέσει, ως ανεξάρτητος παράγοντας, ένα πρόγραμμα EMT που οδηγεί διαφορετικά ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα για να αυξήσει σημαντικά εισβολής [9]. Εν τω μεταξύ, μερικές μελέτες ανέφεραν επίσης ότι η ενεργοποίηση του NF-κΒ συμμετέχει ενεργά στην εξέλιξη της EMT [10] – [13]. Λεπτομερείς εξετάσεις των πολλαπλών πτυχών του προγράμματος EMT έχουν αποκαλύψει τη συμμετοχή της σε κάτι περισσότερο από την εισβολή και τη μετάσταση? πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι ο φαινότυπος του EMT συνδέεται με χημειοαντίσταση σε διάφορους στερεούς όγκους [14] – [17]

πυρηνικός παράγοντας-κάπα Β (ΝΡ-κΒ) αντιπροσωπεύει μια οικογένεια παραγόντων μεταγραφής που ρυθμίζουν την έκφραση του. γονίδια με διαφορετικές λειτουργίες. Η δραστικότητα του ΝΡ-κΒ ρυθμίζεται από την ανασταλτική πρωτεΐνη ΝΡ-κΒ (ΙκΒ), η οποία δεσμεύει και διαχωρίζει τα μέλη της οικογένειας του ΝΡ-κΒ στο κυτταρόπλασμα. Όταν η οδός ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται, ΙκΒ φωσφορυλιώνεται από ΙκΒ κινάσης (ΙΚΚ), η οποία φωσφορυλιώνει την ΙκΒ. Η φωσφορυλιωμένη ΙκΒ υποβάλλεται σε ουβικιτινίωση και αποικοδόμηση πρωτεασώματος μεσολάβηση, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την μετατόπιση του ΝΡ-κΒ στον πυρήνα. ΝΡ-κΒ είναι ένας πανταχού παρών παράγοντας μεταγραφής ρυθμίζεται από πολλά ερεθίσματα, συμπεριλαμβανομένων υποξία, κυτοκίνες και χημειοθεραπευτικά φάρμακα, και έχει πρόσφατα αναδειχθεί ως ένα στόχο για τον καρκίνο. NF-κΒ ενεργοποιείται ιδιοσυστατικά στα περισσότερα ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και δείγματα πρωτογενούς όγκου, αλλά όχι σε φυσιολογικούς ιστούς ή παγκρεατικών μη καρκινογενής κυτταρικές γραμμές [18] – [20]. Ορισμένες πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η υποξία μπορεί να ενεργοποιήσει το ΝΡ-κΒ και επάγουν αντίσταση του παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα στη γεμσιταβίνη [21] – [23]. Προηγουμένως, αναφέραμε ότι η χρήση διϋδροαρτεμισινίνης ή μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) απενεργοποιεί NF-κΒ και ενισχύει την αντικαρκινική δράση της γεμσιταβίνης επί καρκίνου του παγκρέατος τόσο in vitro όσο και in vivo [24], [25].

Σε αυτό μελέτη, επιδιώξαμε ενδείξεις ότι καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος (PANC-1, BxPC3) υπό συνθήκες υποξίας υποστούν τη διαδικασία της ΕΜΤ και να αποκτήσουν επεμβατική και ανθεκτικές στα φάρμακα φαινοτύπων σε ένα ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενο τρόπο. Εδώ, δείξαμε ότι η υποξία ή η υπερέκφραση του HIF-1α ενεργοποιημένων ΝΡ-κΒ και προωθούνται EMT σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Στις μοριακές ή φαρμακολογική αναστολή του NF-κΒ, υποξικά κύτταρα ανέκτησε έκφραση της Ε-καδερίνης, έχασε την έκφραση του Ν-καδερίνης, και εξασθενημένα ιδιαίτερα επεμβατική και ανθεκτικά στα φάρμακα φαινότυπο τους. Η εισαγωγή ενός pcDNA3.0 /HIF-1α σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες ορθοξικές αυξημένη δραστικότητα ΝΡ-κΒ, phenocopying επιδράσεις ΕΜΤ που παράγεται από την υποξία. Αντίθετα, αναστολή της αυξημένη δραστηριότητα ΝΡ-κΒ σε αυτή τη ρύθμιση αντιστραφεί το φαινότυπο EMT. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η υποξία ή η υπερέκφραση του HIF-1α επάγει την ΕΜΤ που εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από ΝΡ-κΒ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

Αποτελέσματα

Η υποξία έχει ως αποτέλεσμα την μορφολογική και κύτταρο βιολογικές αλλαγές χαρακτηριστικές της ΕΜΤ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

για να ανακεφαλαιώσουμε τις επιδράσεις της υποξίας όπως συμβαίνει σε καρκίνο του παγκρέατος, εκθέσαμε 55-60% υποσυμβάλλουσες παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (PANC-1, BxPC-3) σε υποξικές συνθήκες (1% O

2, 5% CO

2, και 94% Ν

2) έως και 48 ώρες. Παρατηρήσαμε σημαντικές διαφορές στη μορφολογία και την τάση να σχηματίζουν την κυτταρική φωλιές ή clusters μεταξύ των παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας και ορθοξικές ομολόγους τους (95% αέρα και 5% CO

2). Τα νορμοξικά κύτταρα παρουσίασαν ένα πολυγωνικό σχήμα και φύλλα λιθόστρωτα-όπως, ενδεικτικά ενός επιθηλιακού φαινοτύπου. Σε αντίθεση, τα υποξικά κύτταρα άρχισαν να χάνουν κύτταρο επαφές, που διαχέεται από κύτταρο συστάδες και απέκτησε ένα επίμηκες, ατρακτοειδές μορφολογία με δενδριτικά διεργασίες, συνεπείς με μεσεγχυματικά μετάβασης (Σχ. 1Β).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western επιθηλιακών δείκτη (Ε-καδερίνης) και δείκτες μεσεγχυματικών (βιμεντίνης, Ν-καντερίνη) και HIF-1α του PANC-1, BxPC-3 κύτταρα υπό ορθοξικές (Ν) ή υποξικά (h) συνθήκες για 48 ώρες. Ένας εκπρόσωπος κηλίδα από τρία ανεξάρτητα πειράματα φάνηκε. Το ιστόγραμμα έδειξε την μέση πυκνότητα όγκου διορθώνεται για τον έλεγχο φόρτωσης (β-ακτίνη). *,

σ

& lt? 0,05. (Β) Ανάλυση αντίθεσης φάσης (αρχική μεγέθυνση, χ 100) από μορφολογικές αλλαγές ανιχνεύθηκαν σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από νορμοξικές ή υποξικές συνθήκες επί 48 ώρες. (Γ) Immuofluorescence χρώση Ε-καδερίνης και βιμεντίνης σε PANC-1, BxPC-3 κύτταρα υπό ορθοξικές ή υποξικές συνθήκες επί 48 ώρες. Πράσινο αντιπροσωπεύει χρώση E-cadherin, ενώ το κόκκινο αντιπροσωπεύει χρώση βιμεντίνης. Μπλε σήμα αντιπροσωπεύει χρώση πυρηνικό DNA με DAPI. (Δ) Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε από την Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 δοκιμασίας και χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του δείκτη βιωσιμότητας. PANC-1 και BxPC-3 κύτταρα εκτέθηκαν σε γεμσιταβίνη (0 μmol /L) για 48 ώρες ως τη βασική γραμμή. *,

σ

& lt? 0,05. (Ε) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με προσδιορισμό κρυσταλλικό ιώδες. Σχήματα επελέγησαν ως αντιπροσωπευτικές σκηνές από τρία ανεξάρτητα πειράματα. δοκιμασία εισβολής (F) Matrigel. Αριστερά, μικροφωτογραφίες των κυττάρων που έχουν περάσει από Matrigel υπό ορθοξικές ή υποξικές συνθήκες επί 48 ώρες (αρχική μεγέθυνση, χ 100). Δεξιά, η ποσοτικοποίηση της εισβολής. *,

σ

& lt?. 0.05

Η

Για να επιβεβαιώσει εάν παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε EMT εκτίθενται σε υποξία, προσδιορίσαμε επίσης την έκφραση των δεικτών των επιθηλιακών και μεσεγχυματικών φαινοτύπων με ανάλυση Western blot . Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, υποξικά κύτταρα υποβλήθηκε σε μια «διακόπτη καντερίνης», με τις οποίες εκδηλώνεται μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης και αυξημένη έκφραση Ν-cadherin. Επιπλέον, η έκφραση του HIF-1α, ένας σημαντικός δείκτης του μονοπατιού υποξίας, βρέθηκε έντονα εκφράζεται κάτω από υποξικές συνθήκες για 48 ώρες (Εικ. 1Α). χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω EMT αλλαγές φαινοτύπου των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος υπό υποξικές συνθήκες. Αποδείχθηκε ότι η έκφραση Ε-καδερίνης μειώθηκε και η έκφραση του βιμεντίνης αυξήθηκε σε σύγκριση με εκείνες σε νορμοξικά κύτταρα (Σχ. 1C).

Τα καρκινικά κύτταρα που έχουν υποστεί EMT τείνουν να επιδεικνύουν μεγαλύτερη αντοχή φαρμάκου και διεισδυτικότητα . Ως εκ τούτου, εξετάσαμε τις ιδιότητες αυτές σε ορθοξικές κύτταρα έναντι υποξικά κύτταρα στο τηλέφωνο Μετρώντας Kit-8 δοκιμασία, δοκιμασία μοβ Crystal και δοκιμασία εισβολής Matrigel. παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές. Κυττάρων Μετρώντας Kit-8 δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί το ποσοστό βιωσιμότητας των κυττάρων. PANC-1 και BxPC-3 κύτταρα εκτέθηκαν σε κλίση δόσεις γεμσιταβίνης (0-200 mmol /L) για 48 ώρες. Τα δεδομένα δείχνονται στο Σχ. 1D, όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με συγκέντρωση gemcitabine μεγαλύτερα από 100 nmol /L, υποξικά κύτταρα έδειξαν σημαντικά υψηλότερο ποσοστό βιωσιμότητας των κυττάρων από τα νορμοξικά κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω από την Crystal δοκιμασία ιώδες (Σχ. 1Ε), όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη (10 mmol /L για PANC-1 και 500 nmol /L για το BxPC-3) κάτω από υποξικές ή ορθοξικές συνθήκες για 48 ώρες, υποξική κύτταρα έδειξαν σημαντικά υψηλότερο ποσοστό βιωσιμότητας των κυττάρων από ορθοξικές κύτταρα. δοκιμασία εισβολή Matrigel χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η κυτταρική διεισδυτικότητα. Τόσο PANC-1 και BxPC-3 κύτταρα υπό συνθήκες υποξίας για 48 ώρες εύκολα μετανάστευσαν διαμέσου του θαλάμου Matrigel σε σχετικά υψηλούς αριθμούς, ενώ ορθοξικές συνεργάτες τους επέδειξαν μια αξιοσημείωτη μείωση στην εισβολή (Εικ. 1 F).

Στο σύνολό τους , τα δεδομένα μας δείχνουν αλλαγές στην μορφολογία, πρότυπο ανάπτυξης, η έκφραση της πρωτεΐνης, αντοχή φαρμάκου και εισβολή υποστηρίζουν την ιδέα ότι η υποξία οδηγεί σε EMT σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας εμφανίζουν αυξημένη δραστηριότητα του ΝΡ-κΒ

Μερικές μελέτες έχουν δείξει στο παρελθόν ότι τα αποτελέσματα της υποξίας στην ενεργοποίηση του NF-κΒ [19], [20]. Έτσι, επιδιώξαμε να καθοριστεί αν η EMT που παρατηρείται σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας οφειλόταν σε αυξημένη δραστικότητα ΝΡ-κΒ. Πρώτον, τεκμηριωμένο ότι οι πρωτεΐνες ρ65 ΝΡ-κΒ και δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ ϋΝΑ πράγματι αυξήθηκαν σε υποξικά καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος σε σύγκριση με τους ομολόγους ορθοξικές όπως καθορίστηκε με ανάλυση Western blot και EMSA. Εν τω μεταξύ, ο HIF-1α αναλύθηκε επίσης με ανάλυση στυπώματος Western (Σχ. 2Α). PANC-1 και BxPC-3 κύτταρα επωάστηκαν υπό συνθήκες υποξίας για διαφορετικές χρονικές περιόδους (24 ώρες, 48 ώρες, 72 ώρες). Μετά από κάθε υποδεικνύεται περίοδο επώασης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, και η συνολική ή πυρηνικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α και Β, NF-κΒ ρ65 πρωτεΐνες και δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ DNA αυξήθηκαν 24 ώρες μετά την έναρξη της υποξίας και να διατηρούν υψηλά επίπεδα. Η εξειδίκευση των ζωνών πηκτώματος μετατοπίστηκε στην EMSA τεκμηριώθηκε με ψυχρή πειράματα ανταγωνισμού, στα οποία η περίσσεια κρύο άγριου τύπου αλλά όχι κρύο μεταλλαγμένου ανιχνευτή κΒ κατήργησε τα σήματα από τους μετατοπισμένες ζώνες.

PANC-1 και BxPC- 3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό ορθοξικές (Ν) ή υποξικές συνθήκες (h) για διάφορες χρονικές περιόδους (24 ώρες, 48 ώρες, 72 ώρες). Μετά από κάθε περίοδο επώασης υποδεικνύεται, τα κύτταρα συλλέχθηκαν. Πυρηνικά εκχυλίσματα και εκχυλίσματα ολικής πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν. (Α) ΝΡ-κΒ ρ65 και HIF-1α αναλύθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western από τις αντίστοιχες ομογενοποίημα κυττάρου. Το ιστόγραμμα έδειξε την μέση πυκνότητα όγκου διορθώνεται για τον έλεγχο φόρτωσης (β-ακτίνη). *,

σ

& lt? 0,05. (Β) EMSA για NF-κΒ δραστηριότητα DNA-δεσμευτικές για τα αντίστοιχα πυρηνικά εκχυλίσματα. Ανταγωνιστική δοκιμασία επιβεβαίωσε την εξειδίκευση του ΝΡ-κΒ πρόσδεσης στο DNA (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι για λεπτομέρειες). Δικαίωμα δύο λωρίδες κυκλοφορίας, κατά βάρος, άγριου τύπου? m, μεταλλαγμένα. (Γ) VEGF αναλύθηκε με ανάλυση κηλίδος Western από τις αντίστοιχες ομογενοποίημα κυττάρου. Το ιστόγραμμα έδειξε την μέση πυκνότητα όγκου διορθώνεται για τον έλεγχο φόρτωσης (β-ακτίνη). *,

σ

& lt? 0,05. ανάλυση (D) Western blot. Συνέπειες της ρ65 siRNA ΝΡ-κΒ από το VEGF έκφραση PANC-1 και τα κύτταρα BxPC-3 υπό συνθήκες υποξίας για 48 ώρες. Το ιστόγραμμα έδειξε την μέση πυκνότητα όγκου διορθώνεται για τον έλεγχο φόρτωσης (β-ακτίνη). *,

σ

& lt?. 0.05

Η

Εν τω μεταξύ, ο HIF-1α αναλύθηκε επίσης με ανάλυση Western blot. Όπως φαίνεται με κηλίδωση Western (Εικ. 2Α), ο HIF-1α επίπεδα πρωτεΐνης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ρυθμίστηκαν προς τα πάνω κατά την υποξία. Η αύξηση του επιπέδου της πρωτεΐνης HIF-1α ήταν πιθανώς οφείλεται σε επιδράσεις σταθερότητα της πρωτεΐνης όπως μελετηθεί προηγουμένως [7]. Δεδομένου ότι η έκφραση του HIF-1α VEGF γονιδίου στόχου, ένας αυξητικός παράγοντας που μπορεί να προωθήσει EMT, διαμεσολαβείται από ΝΡ-κΒ, προσδιορίζουμε επίσης αν υποξία διεγείρει την έκφραση του VEGF. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, κηλίδωση Western έδειξε ότι η έκφραση της πρωτεΐνης VEGF αυξήθηκαν σημαντικά μετά από 24 ώρες υποξίας και διατήρησαν υψηλά επίπεδα. Αντίθετα, η αυξητική ρύθμιση του VEGF καταστάλθηκε από φίμωση έκφραση ρ65 ΝΡ-κΒ σε υποξικά παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιώντας την ΝΡ-κΒ ρ65-ειδικό siRNA, ενώ καμία επίδραση παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA (Σχ. 2D) .

η αναστολή της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας μεσολαβεί ΕΜΤ

Αφού διαπιστώθηκε ότι υποξία καταλήγει σε αυξημένη δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε η δυνατότητα για αναστολή της NF-κΒ να μετριάσει τα χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά των υποξικών κυττάρων. Προς το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε και τις δύο μοριακές και φαρμακολογικές μέσο αναστολής ΝΡ-κΒ σε αυτά τα υποξικά κύτταρα και στη συνέχεια συγκρίνονται το προκύπτον φαινότυπο με κύτταρα μάρτυρα. Μοριακή αναστολή επιτεύχθηκε με siRNA να ρυθμίζουν προς τα κάτω την ρ65 υπομονάδα του ΝΡ-κΒ. Χρησιμοποιήσαμε επίσης ένα εμπορικά διαθέσιμο ΙΚΚ αναστολέα BAY 11-7082 έως φαρμακολογικά δραστηριότητα NF-κΒ μπλοκ. Η αναστολή της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ από είτε τον ρ65 siRNA ΝΡ-κΒ ή BAY 11-7082 υπό συνθήκες υποξίας για 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια μεταβολή στην έκφραση της πρωτεΐνης που χαρακτηρίζεται από αυξημένη Ε-καδερίνης και μειωμένη έκφραση Ν-καντερίνης όπως προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western (Εικ. 3Α), συνεπής με αναστροφή σε έναν επιθηλιακό φαινότυπο. Είναι σημαντικό ότι, η αναστολή της NF-κΒ είτε ΝΡ-κΒ ρ65 siRNA ή ΒΑΥ 11-7082 οδήγησε σε σημαντική μείωση της διηθητικότητας των υποξικών κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα επεξεργασμένα ελέγχου σε δοκιμασία εισβολής Matrigel υπό συνθήκες υποξίας για 48 ώρες (Σχ. 3Β) . Όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη (10 mmol /L για PANC-1 και 500 nmol /L για το BxPC-3) για 48 ώρες με την αναστολή της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ είτε ΝΡ-κΒ ρ65 siRNA ή αναστολέα ΙΚΚ υπό υποξικές συνθήκες, αυτοί έδειξαν επίσης σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό βιωσιμότητας από τους αντίστοιχους ελέγχους τους στο Crystal δοκιμασία ιώδες (Σχ. 3C) και τηλέφωνα Καταμέτρηση Kit-8 δοκιμασία (Εικ. 3D). Παρά αυτές τις αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης, διεισδυτικότητα και αντοχή φαρμάκου αποδίδεται σε αποκλεισμό του ΝΡ-κΒ, δεν παρατηρήσαμε καμία βαθιές αλλαγές στη μορφολογία ή την ανάπτυξη μοντέλων παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας, μια παρατήρηση που εμπλέκει NF-κΒ-ανεξάρτητο βιοχημικών γεγονότων ανάλυση ότι συμβάλλουν επίσης στην φαινότυπο EMT σε υποξικά καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

(Α) Western blot. Συνέπειες της ρ65 siRNA NF-κΒ και ΙΚΚ αναστολέας ΒΑΥ 11-7082 επί Ν-καντερίνης και της έκφρασης Ε-καδερίνης των PANC-1 και τα κύτταρα BxPC-3 υπό συνθήκες υποξίας για 48 ώρες. Το ιστόγραμμα έδειξε την μέση πυκνότητα όγκου διορθώνεται για τον έλεγχο φόρτωσης (β-ακτίνη). *,

σ

& lt? 0,05. δοκιμασίες εισβολής (Β) Matrigel. Αριστερά, μικροφωτογραφίες αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΝΡ-κΒ ρ65 siRNA ή ΒΑΥ 11-7082 (10 μmol /L) ή κατάλληλες αντίστοιχες ελέγχους. Αρχική μεγέθυνση, × 100. Δεξιά, η ποσοτικοποίηση της ανάλυσης εισβολής. *,

σ

& lt? 0,05. (Γ) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με προσδιορισμό ιώδες κρύσταλλο. Σχήματα επελέγησαν ως αντιπροσωπευτικές σκηνές από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Δ) Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε από την Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 δοκιμασίας και χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του δείκτη βιωσιμότητας. *,

σ

& lt?. 0.05

Η

Ο καρκίνος του παγκρέατος κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας έκθεμα NF-κΒ-εξαρτώμενη ρύθμιση προς τα πάνω Twist, μεταγραφικών ρυθμιστών του προγράμματος EMT

Το πρόγραμμα έκφραση γονίδιο που μεσολαβεί ΕΜΤ ρυθμίζεται από έναν ή περισσότερους παράγοντες μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένου Twist, Zeb1, Zeb2, και σαλιγκάρι [26]. Αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής να επηρεάσουν την έκφραση των καδερινών και μεταλλοπρωτεϊνασών, μεταξύ άλλων πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην EMT. Ότι αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής μεταγραφικά επάγονται από ανάντη μονοπάτια σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων του ΝΡ-κΒ [26], μας ώθησε να παρατηρήσουμε διαφορική έκφραση τους σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας έναντι ορθοξικές συνθήκες με ανάλυση κηλίδος Western. Υποξική παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του Twist, σαλιγκάρι, Zeb1, και Zeb2 σε σύγκριση με νορμοξικά κύτταρα (Σχ. 4Α). Η φαρμακολογική αναστολή της ΙΚΚ με BAY 11-7082 σε υποξικά κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στην έκφραση Twist αλλά δεν αξιοσημείωτες αλλαγές σε Zeb1, Zeb2 ή έκφραση Σαλιγκάρι, ένα εύρημα που τυχόν παραπέμπει την κατάσταση αυξημένης ΝΡ-κΒ ως αιτιολογικός βιοχημική δύναμη υποκείμενη υπερέκφραση Twist σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας (Εικ. 4Β). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η επαυξημένη έκφραση του Twist που συμβαίνει κατά τον καθορισμό των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων κάτω από συνθήκες υποξίας προκαλείται από αυξημένη δραστικότητα ΝΡ-κΒ.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western

της βασικής γραμμής έκφραση του ΕΜΤ-μεσολάβηση μεταγραφή παράγοντες: Twist, σαλιγκάρι, Zeb1, και Zeb2 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από νορμοξικές (Ν) έναντι υποξική (h) συνθήκες για 48 ώρες. Το ιστόγραμμα έδειξε την μέση πυκνότητα όγκου διορθώνεται για τον έλεγχο φόρτωσης (β-ακτίνη). *,

σ

& lt? 0,05. (Β) Ανάλυση Western blot. Δοσοεξαρτώμενες επιδράσεις ενός ανοίγματος 48-h του ΙΚΚ αναστολέα ΒΑΥ 11-7082 επί της έκφρασης του Twist, σαλιγκάρι, Zeb1, και Zeb2 υπό συνθήκες υποξίας. Ένας εκπρόσωπος κηλίδα από τρία ανεξάρτητα πειράματα φάνηκε. Το ιστόγραμμα έδειξε την μέση πυκνότητα όγκου διορθώνεται για τον έλεγχο φόρτωσης (β-ακτίνη).

Η

Η υπερέκφραση του HIF-1α σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες ορθοξικές επάγει EMT στο NF-κΒ-εξαρτώμενο τρόπο

Πρόσφατες εκθέσεις έχουν δημιουργήσει μια αιτιολογική σχέση μεταξύ της έκφρασης του HIF-1α σε καταστολή της E-cadherin και την απόκτηση ενός φαινοτύπου μεσεγχυματικών [27]. Έτσι, υποθέσαμε ότι η EMT ότι παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα υφίστανται σε απόκριση προς έκφραση HIF-1α συμβαίνει, τουλάχιστον εν μέρει, λόγω της HIF-1α-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση του μονοπατιού ΝΡ-κΒ. Πρώτον, παροδικά εισήγαγε ένα pcDNA3.0 /HIF-1α σε PANC-1 κάτω από ορθοξικές συνθήκες (HIF-1α

+ /N) χρησιμοποιώντας ένα LipofectamineTM 2000. Ενώ HIF-1α ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη σε PANC-1 κάτω από συνθήκες ορθοξικές μεταγωγή με έλεγχο κενό φορέα (pcDNA3.0 /N), οι HIF-1α επίπεδα σε HIF-1α

+ /Ν κύτταρα ήταν συγκρίσιμα με εκείνα τα κύτταρα υπό συνθήκες υποξίας για 48 ώρες (Εικ. 5Α). Στη συνέχεια, επιβεβαίωσε ότι η δραστηριότητα του NF-κΒ έκανε στην αύξηση πραγματικότητα σε αυτές τις HIF-1α

+ /N κύτταρα από pcDNA3.0 /Ν κυττάρων. Πράγματι, ο HIF-1α

+ /Ν κύτταρα επέδειξαν αυξημένη δραστικότητα ΝΡ-κΒ, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση Western blot και EMSA (Σχ. 5Α και Β).

Ανάλυση

(Α) Western στύπωμα της ΝΡ-κΒ p65 και HIF-1α έκφραση των κυττάρων PANC-1 κάτω από συνθήκες υποξίας για 48 h (h /48 ώρες), τα κύτταρα PANC-1 μεταγωγή με pcDNA3.0 άδειο φορέα (pcDNA3.0 /N) και pcDNA3.0 /HIF-1α (HIF-1α

+ /N) υπό ορθοξικές συνθήκες για 48 ώρες. Το ιστόγραμμα έδειξε την μέση πυκνότητα όγκου διορθώνεται για τον έλεγχο φόρτωσης (β-ακτίνη). *,

σ

& lt? 0,05. (Β) EMSAs για ΝΡ-κΒ δέσμευσης DNA δραστικότητα σε H /48 h, HIF-1α

+ /N, και pcDNA3.0 /N PANC-1 κύτταρα. Δικαίωμα δύο λωρίδες κυκλοφορίας, το κρύο ανταγωνισμό EMSA.

Η

Αφού διαπιστώθηκε ότι HIF-1α

+ /Ν κυττάρων πρόδηλη αυξημένη δραστηριότητα NF-κΒ, είμαστε δίπλα αξιολογούνται αυτά τα κύτταρα για την απόδειξη της EMT. Σε σύγκριση με pcDNA3.0 /Ν κύτταρα, HIF-1α

+ /Ν κύτταρα επέδειξαν μια αύξηση στην έκφραση Ν-καντερίνης και η καταστολή της Ε-καδερίνης υπό νορμοξικές συνθήκες για 48 ώρες, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση στυπώματος Western (Σχ. 6Α) . χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ένα ΕΜΤ επάγεται από HIF-1α υπό νορμοξικές συνθήκες, η έκφραση Ε-καδερίνης μειώθηκε και βιμεντίνης αυξήθηκε στην HIF-1α

+ /Ν κύτταρα σε σύγκριση με pcDNA3.0 κύτταρα /N κάτω από νορμοξικές συνθήκες για 48 ώρες (Εικ. 6Β). Αυτός ο διακόπτης καντερίνης συσχετίστηκε επίσης με αυξημένη Twist, σαλιγκάρι, Zeb1, και έκφραση Zeb2 (Σχ. 6Α), τα ευρήματα που θυμίζουν αυτά που παρατηρούνται σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας (Σχ. 4Α). Ο ρόλος του ΝΡ-κΒ στη ρύθμιση αυτών των αλλαγών έκφραση πρωτεΐνης απεικονίζεται από τα αποτελέσματα της αναστολής του ΝΡ-κΒ σε HIF-1α

+ κυττάρων /N από την έκθεση στο ΙΚΚ αναστολέα ΒΑΥ 11-7082 (0-10 μmol /L), η οποία αντέστρεψε το φαινόμενο μεταγωγής καντερίνης καθώς μείωσε την έκφραση του Twist σε έναν δοσο-εξαρτώμενο αλλά όχι αξιοσημείωτες αλλαγές στην Zeb1, Zeb2 ή έκφραση σαλιγκάρι (Εικ. 6C). Εισβολή και γεμσιταμπίνη αντίσταση του HIF-1α

+ κυττάρων /N και την εξάρτησή της από αυξημένη δραστηριότητα του NF-κΒ αξιολογήθηκαν σε δοκιμασία εισβολής Matrigel, κρυσταλλικό ιώδες δοκιμασία και κυττάρων Μετρώντας Kit-8 δοκιμασία. Για παράδειγμα, η εισβολή του HIF-1α

+ /Ν κύτταρα μέσω ενός θαλάμου Matrigel ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη του pcDNA3.0 /Ν κυττάρων υπό συνθήκες ορθοξικές για 48 ώρες (Εικ. 6D). Ομοίως, όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη (10 μmol /L) για 48 ώρες κάτω από νορμοξικές συνθήκες, σημαντικά υψηλότερο ποσοστό βιωσιμότητα κυττάρου έδειξαν σε HIF-1α

+ /Ν κύτταρα σε σύγκριση με pcDNA3.0 Ν κύτταρα /όπως προσδιορίζεται με κρύσταλλο δοκιμασία ιώδες (Σχ. 6Ε) και τηλέφωνα Καταμέτρηση Kit-8 δοκιμασία (Σχ. 6F). Η ενισχυμένη εισβολή και gemcitabine αντίσταση του HIF-1α

+ /Ν κύτταρα καταργήθηκαν με αποκλεισμό ΝΡ-κΒ μέσω της έκθεσης στον ΙΚΚ αναστολέα ΒΑΥ 11-7082 (10 μmol /L) υπό νορμοξικές συνθήκες για 48 ώρες (Εικ . 6D, Ε και F). Έτσι, η αύξηση στη διεισδυτικότητα και αντίσταση gemcitabine σε PANC-1, τα οποία χαρακτηρίζονται από την υποξία εμφανίζεται ως αποτέλεσμα της ενεργοποίησης του μονοπατιού ΝΡ-κΒ που προκαλείται από HIF-1α.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των επιπέδων του υποδεικνύεται πρωτεϊνών σε PANC-1 κύτταρα σε μεταγωγή με pcDNA3.0 κενό φορέα (pcDNA3.0 /N) και pcDNA3.0 /HIF-1α (HIF-1α

+ /N) υπό νορμοξικές συνθήκες για 48 ώρες. Το ιστόγραμμα έδειξε την μέση πυκνότητα όγκου διορθώνεται για τον έλεγχο φόρτωσης (β-ακτίνη). *,

σ

& lt? 0,05. (Β) αλλαγές φαινότυπο EMT επιβεβαιώθηκε με Immuofluorescence χρώση μικροσκόπιο της E-cadherin και βιμεντίνης. Πράσινο αντιπροσωπεύει χρώση E-cadherin, ενώ το κόκκινο αντιπροσωπεύει χρώση βιμεντίνης. Μπλε σήμα αντιπροσωπεύει χρώση πυρηνικό DNA με DAPI. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western. Δοσοεξαρτώμενες επιδράσεις ενός ανοίγματος 48 ώρες προς τη ΙΚΚ αναστολέα ΒΑΥ 11-7082 επί των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών. Το ιστόγραμμα έδειξε την μέση πυκνότητα όγκου διορθώνεται για τον έλεγχο φόρτωσης (β-ακτίνη). δοκιμασίες εισβολή (D) Matrigel. Αποτελέσματα μιας 48-h BAY 11-7082 (10 μmol /L) για την εισβολή των κυττάρων PANC-1 κάτω από ορθοξικές συνθήκες. Αριστερά, μικροφωτογραφίες στην αρχική μεγέθυνση × 100? Δεξιά, ιστόγραμμα για να απεικονίσουν τα αποτελέσματα του προσδιορισμού εισβολή. *,

σ

& lt? 0,05. βιολετί δοκιμασία (Ε) κρυστάλλου. Αποτελέσματα μιας 48-h BAY 11-7082 (10 mmol /L) σε γεμσιταβίνη ευαισθησία των κυττάρων PANC-1 κάτω από ορθοξικές συνθήκες. Σχήματα επελέγησαν ως αντιπροσωπευτικές σκηνές από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Στ) τα αποτελέσματα του αναστολέα επί ΙΚΚ γεμσιταβίνη επιδεκτικότητα των κυττάρων PANC-1 κάτω από συνθήκες ορθοξικές μετρήθηκε επίσης με Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 δοκιμασίας και χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του δείκτη βιωσιμότητας. *,

σ

& lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Τα τελευταία χρόνια, έχει γίνει όλο και πιο σαφές ότι η EMT παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου και είναι επίσης υπεύθυνη για το ανθεκτικό φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων με τα συμβατικά χημειοθεραπευτικά [8]. Διάφοροι παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της υποξίας, έχουν απαγγελθεί κατηγορίες, όπως την πρόκληση αυτού του φαινομένου μέσω της επαγωγής της Twist, σαλιγκάρι, Zeb1 και Zeb2 ανάλογα με τα κυτταρικά περιβάλλοντα [11], [26] – [28]. Μία υποξική μικροπεριβάλλον βρίσκεται συνήθως στην κεντρική περιοχή των συμπαγών όγκων. Η σύνδεση μεταξύ υποξία και EMT έχει αναφερθεί προηγουμένως, και HIF-1α έχει κατηγορηθεί ως διαμεσολάβηση αυτού του φαινομένου. Ωστόσο, οι μοριακές βάσεις του HIF-1α-επαγόμενη up ρύθμιση αυτών των παραγόντων μεταγραφής EMT επαγωγής ήταν σε μεγάλο βαθμό απροσδιόριστη, αν και οι ενδείξεις για την υποστήριξη της ικανότητας του HIF-1α για να επάγει άμεσα μεταγραφή Twist έχει περιγραφεί πρόσφατα σε ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα [27].

Προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η υποξία οδηγούν σε ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ και αυτή η ενεργοποίηση επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση φωσφορυλίωση ΙκΒα επί υπολειμμάτων τυροσίνης [28]. ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ είναι ένα κρίσιμο συστατικό στην μεταγραφική απόκριση σε υποξία. Τα δεδομένα μας παρουσιάζονται υποδεικνύεται στο παρόν ότι η ενεργοποίηση του NF-κΒ αυξάνεται υπό συνθήκες υποξίας, καθώς και παροδικά επιμολυσμένων με μια pcDNA3.0 /HIF-1α σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από νορμοξικές συνθήκες. Εν τω μεταξύ, η αυξημένη δραστικότητα ΝΡ-κΒ υπό υποξία αναστέλλεται από ΙΚΚ αναστολέας ΒΑΥ-11-7082, το οποίο μπορεί να αναστέλλει τη φωσφορυλίωση και αποικοδόμηση της ΙκΒα, και αποτρέπει τη μετατόπιση του p65 /p50. Τόσο τα δεδομένα μας και προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι βιοχημικά μονοπάτια που οδηγούν σε ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ συγκλίνει επί του συμπλόκου ΙΚΚ υπό συνθήκες υποξίας. Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι το ΝΡ-κΒ επάγει μεταγραφικά έκφραση HIF-1α σε μακροφάγα ποντικού, το ήπαρ και τον εγκέφαλο [29]. Βρήκαμε επίσης ότι η φαρμακολογική αναστολή της NF-κΒ, ΙΚΚ αναστολέας ΒΑΥ-11-7082, είχε ως αποτέλεσμα τη μειωμένη HIF-1α έκφραση σε δύο κύτταρα PANC-1 και BxPC-3 υπό συνθήκες υποξίας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν την ύπαρξη βιοχημικών βρόχο, σύμφωνα με την οποία ο HIF-1α ενεργοποιεί NF-κΒ και το αντίστροφο. Διακοπή αυτής της βρόχος σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε ένα ή περισσότερα από τα πολλά βιοχημικά βήματα που συνδέουν HIF-1α σε ΝΡ-κΒ είναι πιθανόν να έχει σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος. Ωστόσο, η σχέση μεταξύ HIF-1α και NF-κΒ στη διαδικασία της ανάπτυξης του όγκου είναι ιδιαίτερα πολύπλοκη και απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Επιπλέον, έχουμε δείξει ότι το πρόγραμμα ΕΜΤ αποδίδεται σε υποξία ή υπερέκφραση του HIF-1α είναι largly οδηγείται από την ενεργοποίηση του κλασικού μονοπατιού ΝΡ-κΒ. Αυτό το πρόγραμμα EMT χαρακτηρίζεται από βιμεντίνη και Ν-cadherin έκφρασης και καταστολής E-cadherin, εντυπωσιακές μορφολογικές αλλαγές, μια ιδιαίτερα επεμβατική και γεμσιταμπίνη ανθεκτικό μεσεγχυματικά φαινότυπο.

Η πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η έκφραση του στόχου HIF-1α γονίδιο VEGF, ένας αυξητικός παράγοντας που μπορεί να προωθήσει ΕΜΤ στον καρκίνο του προστάτη [30]. Σε αυτή τη μελέτη, τα δεδομένα έδειξαν επίσης ότι η έκφραση της πρωτεΐνης του VEGF αυξήθηκε σημαντικά σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας και την ανοδική ρύθμιση του VEGF, που προκαλείται από υποξία, καταργήθηκε με ΝΡ-κΒ ρ65 siRNA. Βρήκαμε επίσης ότι τα κύτταρα αυτά επωάζονται υπό συνθήκες υποξίας ή επιμολυσμένα με pcDNA3.0 /HIF-1α υπό νορμοξικές συνθήκες εμφανίζουν αυξημένη δραστικότητα ΝΡ-κΒ, η αναστολή των οποίων έχει σαν αποτέλεσμα αναστροφή του διακόπτη καντερίνης με εκείνη ενός επιθηλιακού φαινοτύπου χαρακτηρίζεται από μειωμένη εισβολή και αυξημένη ευαισθησία γεμσιταμπίνη, ευρήματα που εμπλέκουν NF-κΒ ως κύριος μεσολαβητής του HIF-1α που προκαλείται από το πρόγραμμα EMT σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας.

Άλλες μελέτες έχουν εντοπίσει στο παρελθόν Zeb1, Zeb2 και σαλιγκάρι ως κεντρικό ρυθμιστές της καταστολής Ε-καδερίνης και EMT σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [11], [31]. Ωστόσο, η έκφραση του Twist δεν ανιχνεύθηκε υπό νορμοξικές συνθήκες και το γονίδιο Twist ενεργοποιήθηκε μετά από έκθεση σε υποξία σε πέντε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [32]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η EMT επάγεται από υποξία ή υπερέκφραση του HIF-1α συσχετίστηκε με αυξημένη Twist, έκφραση σαλιγκάρι, Zeb1, ή Zeb2. Βρήκαμε επίσης ότι η φαρμακολογική αναστολή της ΙΚΚ με BAY 11-7082 σε υποξικά κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στην έκφραση Twist αλλά χωρίς αξιοσημείωτες αλλαγές στην Zeb1, Zeb2 ή έκφραση σαλιγκάρι, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι ειδικοί παράγοντες μεταγραφής που ρυθμίζουν EMT εξαρτηθεί από την κυτταρικό περιβάλλον και την ειδική κατάσταση των κυττάρων. Αυτή η μεταμόρφωση μεσεγχυματικά μπορεί σε μεγάλο μέρος να ελαττωθεί με την αναστολή της ΝΡ-κΒ μέσω είτε μοριακές ή φαρμακολογική προσεγγίσεις, αν και NF-κΒ αποκλεισμός δεν προωθεί μια πλήρη αναστροφή σε έναν επιθηλιακό φαινότυπο, όπως αποδεικνύεται από τη διατήρηση του σαλιγκαριού, Zeb1, ή Zeb2 έκφραση στο πρόσωπο του ΝΡ-κΒ ρ65 siRNA ή αναστολή ΙΚΚ. Αυτό το τελευταίο εύρημα υποδηλώνει την ύπαρξη του ΝΡ-κΒ-ανεξάρτητο EMT ρυθμιστικές οδούς σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας που απομένουν να καθοριστούν.