Αφηρημένο

miRNAs διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση. Αυτή η μελέτη επικεντρώθηκε στη διερεύνηση της επιπτώσεις και τη ρύθμιση του μηχανισμού των miRNA-137 για τις βιολογικές συμπεριφορές του καρκίνου του στομάχου. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από ιστούς 100 ασθενών με καρκίνο του στομάχου και από τέσσερις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Η έκφραση του miR-137 ανιχνεύθηκε με PCR πραγματικού χρόνου από 100 ασθενείς. Τα αποτελέσματα του miR-137 υπερέκφραση στον πολλαπλασιασμό, απόπτωση, μετανάστευση και εισβολή ικανότητα γαστρικά καρκινικά κύτταρα »διερευνήθηκαν in vitro και in vivo. Το γονίδιο στόχος του miR-137 είχε προβλεφθεί από Targetscan στο λογισμικό γραμμή, διαλογή με διπλή δοκιμασία γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης και αποδεικνύεται από κηλίδα western. Ως αποτέλεσμα, η έκφραση του miR-137 ήταν σημαντική μειωμένη σε γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή HGC-27, HGC-803, SGC-7901 και ΜΚΝ-45, καθώς και στα γαστρικά καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με GES-1 κυττάρου ή συμφωνημένα παρακείμενες μη -neoplastic ιστούς (

σ

& lt? 0.001). Η εκ νέου εισαγωγή του miR-137 σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα ήταν σε θέση να αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή. Οι in vivo πειράματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση miR-137 μπορεί να μειώσει τη γαστρική τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση. Bioinformatic και ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι το miR-137 έδρασε ως ρόλους ογκοκατασταλτικό στην γαστρική καρκινικά κύτταρα μέσω της στόχευσης ΑΚΤ2 και περαιτέρω επηρεάζει την Bad και GSK-3β. Εν κατακλείδι, το miR-137 το οποίο είναι συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε καρκίνο του στομάχου είναι δυνητικά εμπλέκονται σε γαστρικό καρκίνο ογκογένεση και τη μετάσταση με τη ρύθμιση που σχετίζονται ΑΚΤ2 μονοπάτια σήμα

Παράθεση:. Wu L, Chen J, Ding C, Wei S, Zhu Υ, Yang W, et al. (2015) microRNA-137 Συμβάλλει στην βρεγμένο Ογκογένεση σε ανθρώπινα καρκινικά γαστρική από Στόχευση ΑΚΤ2. PLoS ONE 10 (6): e0130124. doi: 10.1371 /journal.pone.0130124

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Ιρίνα Β Λεμπέντεβα, το Πανεπιστήμιο Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 15 Αυγούστου 2014? Αποδεκτές: 18 Μαΐου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 23 Ιουνίου, 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:.. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την ιατρική επιστήμη και την τεχνολογία ερευνητικών έργων της επαρχίας Henan, Κίνα (2011030004)

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς έχουν δήλωσε ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι η δεύτερη συχνότερη αιτία θανάτου από καρκίνο στον κόσμο [1]. Μέχρι σήμερα, ο μηχανισμός της γαστρικής καρκινογένεσης είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Οι ερευνητές έχουν προσπαθήσει να μελετήσουν GC από την άποψη της βιοχημείας και της μοριακής βιολογίας που έχουν ορισμένα γονίδια καταστολής όγκου και όγκου γονιδίων που σχετίζονται έχουν αναφερθεί σε GC. Τα microRNAs (miRNAs) είναι ενδογενώς μικρά μη-κωδικοποίησης RNA των 18 ~ 22 νουκλεοτιδίων που έχουν αναγνωριστεί ως μεταγραφικούς ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης [2, 3]. MiRNAs παίζουν κρίσιμους ρόλους σε πολλές βιολογικές διεργασίες, όπως ο πολλαπλασιασμός, ανάπτυξη, διαφοροποίηση και απόπτωση. Εν τω μεταξύ, έχουν miRNAs επικυρωθεί να ενεργεί ως ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκου κατά την διάρκεια ογκογένεσης. Για παράδειγμα, miR-31 ταυτοποιήθηκε ως ογκογονίδιο σε οισοφαγικό καρκίνωμα πλακώδους κυττάρου [4] και miR-451 λειτουργεί ως καταστολέας όγκων σε ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [5]. Υπάρχουν επίσης πολλά microRNAs εντοπίστηκαν σχετίζονται με καρκίνο του στομάχου συμβαίνει και ανάπτυξη [6-13]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι η υπερ-έκφραση του miR-1, miR-20a, miR-27a, miR-34a και miR-423-5p μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως διαγνωστικά κριτήρια του γαστρικού καρκίνου [14] .Ως εκ τούτου, miRNAs είναι δυνητικοί υποψηφίων νέων διαγνωστικών βιοδεικτών ή θεραπευτικούς στόχους του γαστρικού καρκίνου.

microRNA-137 (mIR-137) έχει αναφερθεί ότι είναι κάτω ρυθμιζόμενα και παίζουν ρόλους ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο του παχέος εντέρου και του καρκίνου του στόματος [15, 16]. Ωστόσο, η λειτουργία των miR-137 και του μηχανισμού υποκείμενη γαστρική καρκινογένεση του δεν είναι ακόμα πολύ σαφής. Chen et al αποκάλυψε ότι το miR-137 μπορεί παίζει ως καταστολέας όγκου με στόχευση CDC42 για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου σε γαστρικό καρκίνο [17]. Ακόμα κι έτσι, είναι σαφώς σε μας ότι το microRNA ρυθμίζει βιολογική συμπεριφορές από πολλαπλές τρόπο μονοπάτι που θα μπορούσε να υπάρξει πιο μηχανισμό ρύθμισης του miR-137 προς την ογκογένεση GC. Σε αυτή τη μελέτη, μετρήθηκε η έκφραση του miR-137 σε 100 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου και διερευνήθηκαν οι ρόλοι των miR-137 στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Βρήκαμε κάποιες άλλες λειτουργίες του miR-137 στο GC, καθώς και έναν άλλο τρόπο μονοπάτι με την οποία miR-137 έπαιξε ρόλο των ογκοκατασταλτικών στην ογκογένεση GC.

Υλικά και Μέθοδοι

δήλωση Δεοντολογίας

Όλες οι μελέτες σε ανθρώπους έχουν εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας κατάλληλη και επομένως έχουν πραγματοποιηθεί σύμφωνα με τα ηθικά πρότυπα. Όλα τα πρόσωπα που έδωσαν την συγκατάθεση τους πριν από την ένταξή τους στη μελέτη.

Ασθενείς και δείγματα

Ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο δείγματα συλλέχθηκαν από χειρουργικά δείγματα από 100 ασθενείς (αρσενικό 56, θηλυκό 44) με GC στο Ινστιτούτο Καρκίνου και το νοσοκομείο, Πρώτη συνδεδεμένες νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Χενάν? το Δεύτερο Νοσοκομείο του Λαϊκού Απελευθερωτικού Στρατού της Κίνας? Hebei Αντικαρκινικό Νοσοκομείο. Δείγματα μη-όγκου από τη μακροσκοπική περιθώριο όγκου απομονώθηκε κατά τον ίδιο χρόνο και χρησιμοποιούνται ως συμφωνημένα παρακείμενες μη νεοπλασματικών ιστών. Όλα τα δείγματα χωρίστηκαν σε δύο μέρη. Δείγματα ιστού συλλέχθηκαν αμέσως καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι την εκχύλιση του RNA. Η χρήση των δειγμάτων ιστού για όλα τα πειράματα εγκρίθηκε από την ηθική του διοικητικού συμβουλίου του Ινστιτούτου Βασικών Ιατρικών Επιστημών, Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών. Όλοι οι συμμετέχοντες παρέχεται προφορική συγκατάθεση τους να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη, και λεκτική πληροφορημένες συγκαταθέσεις τους γράφτηκαν κάτω. Αυτό onsent διαδικασία εγκρίθηκε επίσης από το διοικητικό συμβούλιο δεοντολογίας. Τέσσερις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 και ΜΚΝ-45) ήταν όλα διατηρούνται στο εργαστήριο μας και διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ ή 1640 με 10% FBS.

εκχύλιση RNA, σύνθεση cDNA , και προσδιορισμούς PCR πραγματικού χρόνου

Ολικό RNA από ιστούς και κύτταρα εκχυλίστηκε με τη μέθοδο ΤπζοΙ (Ambion, USA) εντελώς ακολουθώντας τις οδηγίες. cDNA Single κλώνος συντέθηκε από την M-MLV (Ambion, USA) με χρήση 2 μg ολικού RNA ως εκμαγείο. Ολίγο (dT) 18 χρησιμοποιήθηκε για mRNA αντίστροφης μεταγραφής ενώ στέλεχος βρόχος που χρησιμοποιείται για miRNA. Real time-PCR (RT-PCR) πραγματοποιήθηκε με Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA) χρησιμοποιώντας μείγμα SYBR (Tiangen, Κίνα). Η προϋπόθεση PCR ήταν: 95 ° C χ 30s, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C χ 5s, 60 ° C χ 34s. Για mRNAs, GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως κανονικοποιημένη ελέγχου. Για miRNAs, U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο miRNA. Η σχετική έκφραση του miR-137 υπολογίστηκε με τη μέθοδο 2-ΔΔCT. Οι αλληλουχίες εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα 1.

Η

κατασκευή πλασμιδίου

Η αλληλουχία προδρόμου miR-137 που παράγεται από ανόπτηση και miR-137-προδρόμου-F και miR-137-πρόδρομος-R παράταση εν τω μεταξύ σε πέψη με BamHI και BglII, τα προϊόντα της οποίας ήταν ένθετα στο θραύσμα BamHI-BglII του φορέα pcDNA-GW /EmGFP-miR (GenePharma, Κίνα). Στο μεταξύ, αρνητικός έλεγχος κατασκευάστηκε επίσης.

Κυτταρική καλλιέργεια και miRNA επιμόλυνση

Οι κυτταρικές σειρές HGC-27, SGC-7901 ΜΚΝ-45 και GES-1 αγοράστηκε από την Resource τηλέφωνα κέντρο Ινστιτούτο Βασικών Ιατρικών Επιστημών, κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών και του Πεκίνου Ένωσης Ιατρικό Κολέγιο (Πεκίνο, Κίνα). Οι ανθρώπινες γαστρικού κυτταρικές σειρές HGC-27, SGC-7901 και ΜΚΝ-45 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) μέσα συμπληρωμένα με 10% εμβρυϊκό ορό βοοειδούς και ανθρώπινη γαστρικού επιθηλίου κυτταρική γραμμή GES-1 διατηρήθηκε σε DMEM ( Gibco, BRL, Ηνωμένο Βασίλειο) μέσα μαζικής ενημέρωσης. Το miR-137 μιμούνται και το μιμητικό σκαρφάλωμα το οποίο είναι μη ομόλογη με το ανθρώπινο γονιδίωμα συντέθηκαν με GenePharma (Σαγκάη, Κίνα) και επιμολύνθηκε στα κύτταρα σε μια τελική συγκέντρωση ολιγονουκλεοτιδίου 10nmol /L. Όλες οι επιμολύνσεις κυττάρων εισήχθησαν με Αντιδραστήριο DharmaFECT1 (Dharmacon, TX, USA) σύμφωνα με χρησιμοποιηθούν οδηγίες του κατασκευαστή. Για κάθε επιμόλυνση κυττάρων διεξήχθησαν δύο ή τρία πειράματα αντιγραφής. Δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και προσδιορισμός απόπτωσης

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με CCK8 μέθοδο (Dojindo, Ιαπωνία). Εν συντομία, τα περίπου 5000 miR-137 μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα και τα κύτταρα σκαρφάλωμα αντιστοίχως σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν. ρυθμούς πολλαπλασιασμού προσδιορίστηκαν σε 0, 12, 24, 48, 72, 96 ώρες μετά την επιμόλυνση με την προσθήκη 10μl CCK8 αντιβασιλέας και ελεγχθεί σύμφωνα με τα χειρόγραφα. Οι δοκιμασίες απόπτωσης δοκιμάστηκαν σε HGC-27 και SGC-7901 κύτταρα γραμμές με ή χωρίς miR-137 υπερέκφραση με κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Ι (BD Biosciences, USA) και C6 κυτταρομετρητή ροής (USA).

μετανάστευση των κυττάρων και δοκιμασίες εισβολής

Πραγματοποιήσαμε τη δοκιμασία επούλωση της πληγής για να δοκιμάσουν την ικανότητα κυτταρικής μετανάστευσης, με ή χωρίς το miR-137 επιμόλυνση. Τα τεχνητά τραύματα παρήχθησαν στην μονοστοιβάδα των κυττάρων σε συρροή με FBS δωρεάν, χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας 200 μL σε 24 ώρες μετά την miR-137 διαμόλυνση. Οι εικόνες που λαμβάνονται αντιστοίχως σε 0, 12, 24 και 36 ώρες μετά τη δημιουργία τραύματος.

Στην συνέχεια εκτελείται Transwell δοκιμασίες για να αξιολογηθεί η ικανότητα εισβολής των κυττάρων ». 5 × 10

4 κύτταρα αιωρούνται σε 200 μΙ μέσου χωρίς FBS τοποθετήθηκαν στον ανώτερο θάλαμο του κάθε ενθέματος με 430 μΐ του 1 mg /ml matrigel (Millipore, USA). 600μL μέσο με 10% FBS ως θρεπτική προσελκυστικό τέθηκε στον κατώτερο θάλαμο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα που συνδέονται με την κάτω επιφάνεια του θαλάμου ήταν fi XED 20 λεπτά με 20% μεθανόλη και βάφτηκαν για 10 λεπτά με 10% maygruwald-Giemsa (MGG). Οι μεμβράνες εισβολή στη συνέχεια κόβονται και τα ενσωματωμένα κάτω από καλυπτρίδες. Μετρήσαμε τα κύτταρα σε 3 διαφορετικά πεδία όρασης fi σε κατάσταση με 20 × Magni fi κατιόν το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν ως ο μέσος αριθμός των κυττάρων. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

πείραμα των Ζώων

Τα πειράματα με ζώα εκτελέστηκαν σύμφωνα με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου και των θεσμικών ηθικές κατευθυντήριες γραμμές για τα πειράματα σε ζώα. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα της CAMS (Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών) (Αριθμός Άδειας: C72-14-0664). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Scramble-επιμολυσμένα και miR-137 υπερέκφραση HGC-27 κύτταρα (5 × 10

6 κύτταρα) εμβολιάστηκαν s.c. στη ραχιαία πλευρά των BALB /c γυμνά ποντίκια (θηλυκά, Νυ /Νυ, ηλικίας 6 εβδομάδων), το σύνολο των οποίων αγοράστηκαν από το Κέντρο Ζώων του Πανεπιστημίου Χενάν και μεγάλωσε σε συνθήκες χωρίς παθογόνα. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε για 5 εβδομάδες. Όλοι οι ποντικοί θανατώθηκαν και s.c. όγκοι αποκόπηκαν και το βάρος των όγκων ελέγχθηκε. Για in vivo πειράματα μετάσταση, HGC-27 κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα ΧΤΤ δοκιμασία kit24 ώρες μετά την επιμόλυνση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Roche, Tokyo, Japan). Στη συνέχεια, οι ποντικοί (θηλυκοί, Νυ /Νυ, ηλικίας 6 εβδομάδων) ενέθηκαν με HGC-27 κύτταρα με ή χωρίς miR-137 υπερέκφραση μέσω της φλέβας της ουράς με 2 χ 10

5 κύτταρα σε PBS. Τα κύτταρα HGC-27 τροποποιήθηκαν τα οποία μπορούν να εκφράζουν σταθερά λουσιφεράσης (χτίστηκε από GENECHEM, Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα ελέγχθηκαν με μικροσκόπιο για να βεβαιωθείτε ότι τα κύτταρα ήταν σε καλή κατάσταση. Μετά από έξι εβδομάδες, βιοφωταύγεια απεικόνιση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα IVIS Spectrum και τη λάμψη της εικόνας τιμές ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Ζώντας εικόνας (δαγκάνα Life Science, USA).

Η ανοσοϊστοχημεία

Οι ιστοί εγκλείστηκαν σε παραφίνη τμήματα και να αντιμετωπίζονται 2 ώρες στους 65 ° C και στη συνέχεια αφαιρείται η παραφίνη. Πριν από την εφαρμογή των πρωτογενών αντισωμάτων σε 4 ° C όλη τη νύκτα, θα πραγματοποιηθεί το βήμα ανάκτησης αντιγόνου. Μετά από αυτό, τα πλακίδια επωάστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα περίπου 2 ώρες στους 25 ° C συζευγμένο με HRP (1: 100? Zhongshanjinqiao, Κίνα). Το Liquid DAB + υπόστρωμα (zsgb-bio, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της δραστηριότητας HRP.

λουσιφεράσης miRNA δημοσιογράφος στόχο δοκιμασία

Το πλήρες μήκος των 3’UTRs των ανθρώπινων mRNAs ΑΚΤ2 ήταν κάθε PCR ενισχυμένο και κλωνοποιήθηκε εντός του pMIR-REPORTTM Luciferase Reporter Vector (Ambion, USA) για να δημιουργηθούν τα ρεπόρτερ. Μεταλλάξεις των προβλεπόμενων περιοχών σπόρων στις αλληλουχίες mRNA δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας εναρκτήρες συμπεριλαμβανομένων των μεταλλαγμένων sites. ΗΕΚ-293Τ κυττάρων σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες 24 φρεατίων (1 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο) μία ημέρα πριν εκτελέστηκαν επιμολύνσεις. Τα κύτταρα (~ 70% συρροή) μορφομετατράπηκαν με ρεπόρτερ λουσιφεράσης ρΡΙ_-ΤΚ (50 ng /φρεάτιο), pGL-3firefly λουσιφεράσης (10 ng /φρεάτιο), και μιμούνται-137 (50 nmol /L, GenePharma, Σαγκάη, Κίνα) ή σκαρφάλωμα (50 nmol /L) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 δραστηριότητες (Invitrogen) .Luciferase μετρήθηκαν με τη χρήση του Luciferase Assay Reporter Διπλή (Promega, USA).

κηλίδωση Western

οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE και κατόπιν μεταφέρονται σε 0,45 μm μεμβράνες PVDF (Amersham, UK). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με 5% σκόνη άπαχου γάλακτος επί μία νύκτα στους 4 ° C και με αντι-ΑΚΤ2 μονοκλωνικό αντίσωμα (Proteintech, USA) σε αραίωση 1: 1000? αντι-Bad μονοκλωνικό αντίσωμα (Bioworld, USA) σε αραίωση 1: 500? αντι-GSK-3B πολυκλωνικό αντίσωμα (Bioworld, USA) σε αραίωση 1: 1000? αντι-GAPDH αντίσωμα (Proteintech, Chicago, USA) σε 1: 30,000 αραίωση. Μετά από πλύση δύο φορές με TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (zsgb-bio, Κίνα) σε 1: 5000 και 1:. 50000 αραιώσεις για 2 ώρες

Στατιστικά

Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. t δοκιμή Student (two-tailed) και το x

2 τεστ διεξήχθησαν, και στατιστικώς σημαντικό επίπεδο ορίστηκε σε α = 0.05 δυο-πλευρά). Η μέση ± SD εμφανίζεται στα σχήματα.

Αποτελέσματα

MiR-137 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα και κλινικά δείγματα

Εμείς εξέτασε πρώτα την έκφραση του ώριμου miR -137 σε 4 ανθρωπίνων κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 και ΜΚΝ-45) και το γαστρικό επιθηλιακών κυττάρων (GES-1). Αυτές οι κυτταρικές σειρές GC εμφάνισε εξαιρετικά χαμηλή έκφραση του miR-137 σε σύγκριση με την κυτταρική γραμμή GES-1 (Σχ 1Α). Για να μελετηθεί περαιτέρω η σχέση του miR-137 με εμφάνιση GC, ανιχνεύσαμε την έκφραση του miR-137 σε 100 κλινικές ασθενείς (αρσενικοί 56, γυναίκα 44? Μέση ηλικία 53 έτη) με Taqman ανιχνευτή-drived PCR πραγματικού χρόνου όπως περιγράφεται παραπάνω. Από τα 100 δείγματα GC, η έκφραση του miR-137 ρυθμισμένα προς τα κάτω σε 77 περιπτώσεις (77%) σε σύγκριση με τους γειτονικούς ιστούς, όταν το αποκοπή συστάθηκε ως 1,5. Εν τω μεταξύ, miR-137 ρυθμισμένα προς τα πάνω σε 23 περιπτώσεις (23%) (Σχήμα 1Β και 1Γ). Σε γενικές γραμμές, η έκφραση του miR-137 σε ιστούς GC ήταν χαμηλότερη από ότι σε γειτονικούς ιστούς στατιστικά σημαντικές διαφορές (ρ = 0,00079, paired t-test, δίπλευρη, Σχήμα 1 C). Επίσης, έχουμε βρει μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-137 και γαστρικό καρκίνο κλινικό στάδιο. Οι ασθενείς που έχουν τα χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης miR-137 συνδέθηκαν με υψηλής ποιότητας και προχωρημένου σταδίου όγκους (Σχήμα 1D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι μεταβολές του miR-137 θα μπορούσαν να συμμετέχουν σε γαστρικό εξέλιξη του καρκίνου.

Α. έκφραση ingastric καρκινικές κυτταρικές σειρές-137 MiR (HGC-27, ΓΓΕ-7901, ΓΓΕ-7901 και ΜΚΝ-45) και το γαστρικό επιθηλιακών κυττάρων (GES-1). B. Τέσσερις ασθενείς διαγνώστηκαν ως γαστρικό καρκίνο με Η &? Ε χρώση (αρχική μεγέθυνση, x100). CD. έκφραση MiR-137 σε 100 κλινικές ασθενείς. Ε Έκφραση levelsof miR-137 σε στάδια Ι-ΙΙ (n = 38) versusIII-IV στάδια (n = 62) των ασθενών με γαστρικό καρκίνο.

Η

MiR-137 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων in vitro και in vivo

επιμολυσμένα miR-137 μιμούνται σε κυτταρικές σειρές GC HGC-27 και SGC-7901, δύο από τα οποία έδειξαν μεγάλη αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης (Εικόνα 2Α). Τα αποτελέσματα των δοκιμασιών ανάπτυξης CCK8 σε 0, 1, 2, 3 και 4 d μετά miR-137 και διαμόλυνση σκαρφάλωμα φαίνεται στο Σχ 2Β. Σε σύγκριση με την επιμόλυνση σκαρφάλωμα, miR-137 μείωσε σημαντικά την επιμόλυνση τον πολλαπλασιασμό των δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Β). Στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση του miR-137 στην κυτταρική απόπτωση. Τα πρώτα αποπτωτικών κυττάρων στην ομάδα που αγωνίζομαι ήταν περίπου 10% σε HGC-27 και 2,9% το SGC-7901, ενώ μετά το miR-137 επιμόλυνση, το ποσοστό των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σε 17,5% το HGC-27 και 8,3% το SGC-7901, τα οποία έδειξαν σημαντικά διαφορά (Σχήμα 2C). Από αυτά τα αποτελέσματα, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι το miR-137 θα μπορούσε να καταστείλει την επιβίωση των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα με την πρόκληση πρώιμη απόπτωση.

Α. Real-time PCR διεξήχθη για την ανίχνευση της έκφρασης του miR-137 σε HGC-27 και SGC-7901 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με miR-137 μιμούνται ή αγωνίζομαι μιμούνται. B. Η ανάπτυξη της HGC-27 και SGC-7901 κύτταρα εμφανίζονται μετά την επιμόλυνση με miR-137 μιμούνται ή αγωνίζομαι μιμούνται ή καμία επιμόλυνση. Ο δείκτης ανάπτυξης εκτιμήθηκε στις 0, 1, 2, 3 και 4 ημέρες. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων (*** μέσα

P

& lt? 0.001). Γ HGC-27 και SGC-7901 κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΕ Annexin V και 7-AAD 72 ώρες μετά την αγωγή με miR-137mimics ή σκαρφάλωμα. Πρόωρη Τα αποπτωτικά κύτταρα φαίνονται στο δεξί τεταρτημόριο. Δ αντιπροσωπευτική εικόνα της in vivo πειράματα. Ο όγκος στην ομάδα υπερέκφραση miR-137 είναι πολύ μικρότερη από την σκαρφάλωμα. Ε HE χρώση των ποντικών όγκου. F /G. Ο όγκος του όγκου και του βάρους υπολογίστηκαν και όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τόσο ο όγκος του όγκου και το βάρος μειώθηκε σημαντικά από miR-137 υπερέκφραση. Αυτά αποτέλεσμα επαληθεύεται ότι η υπερέκφραση του miR-137, μπορεί να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου in vivo (*:

σ

& lt? 0,05? **:

σ

& lt? 0,01? ***:

σ

& lt?. 0.001)

η

Για να επαληθεύσετε περαιτέρω τα παραπάνω πορίσματα, ένα in vivo μοντέλο κατασκευάστηκε. Βρήκαμε ότι η ανάπτυξη του όγκου ήταν σημαντικά βραδύτερη στους ποντικούς υπερέκφραση miR-137 από ό, τι στους μάρτυρες (Σχήμα 2D, 2Ε και 2G). Σε συμφωνία με την καμπύλη ανάπτυξης του όγκου, τα βάρη των όγκων που διεγείρονται από τα κύτταρα σκαρφάλωμα ήταν σημαντικά υψηλότερες από ότι η υπερέκφραση miR-137 (Σχήμα 2F). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν επίσης ότι η υπερέκφραση miR-137 θα μπορούσε να περιορίσει το γαστρικό πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων in vivo.

MiR-137 αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή in vitro και in vivo

αξιολογηθούν περαιτέρω οι επιδράσεις του miR-137 για τη μετανάστευση των κυττάρων και την εισβολή, οι οποίες ήταν οι βασικοί παράγοντες που καθορίζουν την κακοήθη εξέλιξη και μετάσταση. Τα αποτελέσματα του miR-137 για τη μετανάστευση των κυττάρων αποδείχθηκε με δοκιμασία επούλωση τραυμάτων /το μηδέν σε HGC-27 και SGC-7901 κύτταρα. Τόσο των δύο κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με miR-137 μιμούνται ήταν αισθητά λιγότερο μεταναστευτικά από αγωνίζομαι έλεγχο ή μη επεξεργασμένα κύτταρα σε 12, 24, και 36 ώρες μετά το ξύσιμο (Σχήμα 3Α). Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε ανάλυση κυτταρικής εισβολής για τη μέτρηση των κατεύθυνσης ικανότητες εισβολή των κυττάρων μετά miR-137 υπερέκφραση. Ως αποτέλεσμα, η διεισδυτικότητα των κυττάρων επιμολυσμένων με miR-137 μιμητικό ήταν δραματικά μειωμένη σε σύγκριση με τα κύτταρα αγώνα στην HGC-27 και SGC-7901 (Σχήμα 3Β). Στη συνέχεια, in vivo πειράματα χρησιμοποιήθηκαν για την περαιτέρω επαλήθευση αυτού του αποτελέσματος. Εμείς πρώτον έδειξαν ότι κύτταρα επιμολυσμένα με miR-137 μιμούνται ή μιμητικό ελέγχου δεν δείχνουν σημαντική μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Επίσης, δεν υπάρχει καμία διαφορά στην βιωσιμότητα των κυττάρων μεταξύ των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με miR-137 σε σύγκριση με το μιμητικό αρνητικό έλεγχο (S2 Εικ). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, η απεικόνιση βιοφωταύγειας των ποντικών στην ομάδα υπερέκφραση miR-137 έδειξε μια πολύ μικρότερη εικόνα. Επίσης, ο αριθμός των πνευμόνων μετάστασης ανά ποντικούς στην ομάδα miR-137 έδειξε ένα σημαντικά χαμηλότερο επίπεδο σε σύγκριση με την ομάδα σκαρφάλωμα, η οποία έδειξε ότι το miR-137 θα μπορούσε να καταστείλει τη μετάσταση in vivo. Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι miR-137 έπαιξε σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της μετανάστευσης των κυττάρων και διεισδυτικότητα σε γαστρικό καρκίνο και πρότεινε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-137 θα μπορούσε να συμβάλει στην μετάσταση όγκου στο γαστρικό καρκινογένεση.

A. SGC-7901 και HGC-27 κύτταρα δεν επιμολύνονται ή επιμολυνθεί με miR-137 μιμείται ή αγωνίζομαι για 24 ώρες, και πληγές έγιναν. Η σχετική αναλογία του κλεισίματος του τραύματος ανά πεδίο εμφανίζεται. Ως αποτέλεσμα, τα κύτταρα επιμολυσμένα με miR-137 έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη ταχύτητα μεταναστεύσουν σε σύγκριση με τον έλεγχο. Β HGC-27 και SGC-7901 κύτταρα δεν επιμολύνονται ή επιμολυσμένο με miR-137 μιμείται ή σκαρφάλωμα για 24 ώρες, και transwell δοκιμασία εισβολή πραγματοποιήθηκε. Η σχετική αναλογία των μεταστατικών κυττάρων ανά πεδίο εμφανίζεται. Μεγέθυνση για την αναγνώριση της μετανάστευσης είναι × 400 και η εισβολή είναι × 40. Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι η ικανότητα μετανάστευσης των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα μπορεί να ανασταλεί με miR-137 υπερέκφραση. Γ Bioluminescentimaging (αριστερά) και ο αριθμός των πνευμόνων μετάστασης ανά ποντίκια (μεσαία) έδειξε ότι το miR-137 μπορεί να καταστείλει την μετάσταση in vivo. Η χρώση έδειξε ότι η μετάσταση σε ποντίκια πνεύμονα (δεξιά).

Η

miR-137 στοχεύει ΑΚΤ2 σε GC

miRNAs εκτελούνται βιολογικές λειτουργίες μέσω ρυθμίζουν αρνητικά γονίδια στόχους τους. Όπως είχε προβλεφθεί, δεν υπήρξε συμπληρωματικότητα μεταξύ έχει-miR-137 και ΑΚΤ2 3′-UTR (Σχήμα 4Α).

Α. Αλληλουχία από τις θέσεις σύνδεσης miR-137 μέσα στο ανθρώπινο ΑΚΤ2 3′-UTR και ένα σχηματικό διάγραμμα του ρεπόρτερ κατασκευασμάτων που δείχνει ολόκληρη την αλληλουχία ΑΚΤ2 3′-UTR (AKT2_WT) και την μεταλλαγμένη αλληλουχία ΑΚΤ2 3′-UTR (Μ1, Μ2) . δραστηριότητα Β λουσιφεράσης του ρεπόρτερ AKT2_WT και τον δημοσιογράφο AKT2_MUT παρουσία 10 nmol /L miR-137 μιμούνται ή αγωνίζομαι. Γ Σχετική έκφραση ΑΚΤ2 σε HGC-27 και SGC-7901 κύτταρα δεν επιμολύνονται ή επιμολυσμένα με miR-137 μιμείται ή αγωνίζομαι για 24 ώρες. Δ Ανοσοαποτύπωσης της ΑΚΤ2 σε HGC-27 και SGC-7901 κύτταρα δεν επιμολύνονται ή επιμολυσμένα με miR-137 μιμούνται ή αγωνίζομαι. Όλα τα δεδομένα δείχνονται ως μέση τιμή ± SD. Ε Ανοσοαποτύπωσης του Bad, GSK-3β, π-Bad και ανάλυση κηλίδος π-GSK-β.fWestern του επιπέδου της πρωτεΐνης ΑΚΤ2 σε 12 ασθενείς στους οποίους GC miR-137 ήταν κάτω regulatedin ιστούς GC τους.

Η

Για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι ΑΚΤ2 θα μπορούσε να είναι ένας στόχος miR-137, ένα πλασμίδιο αναφοράς που φέρει το αγρίου τύπου 3′-UTR περιοχή του ΑΚΤ2 κατάντη της περιοχής κωδικοποίησης λουσιφεράσης (Σχήμα 4Α, AKT2_WT) κατασκευάσθηκε. κύτταρα ΗΕΚ-293Τ συν-επιμολύνθηκαν με πλασμίδιο ανταποκριτή (AKT2_WT) και αγωνίζομαι. Ως αποτέλεσμα, miR-137 επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν μία αξιοσημείωτη μείωση (≈58%) της δραστικότητας της λουσιφεράσης (Σχήμα 4Β). Στη συνέχεια, η ίδια δοκιμασία διεξήχθη για ένα άλλο πλασμίδιο ρεπόρτερ που περιέχει μεταλλαγμένα ΑΚΤ2 3′-UTR σε θέσεις δέσμευσης miR-137. Όπως ήταν αναμενόμενο, η αναστολή της δραστηριότητας της λουσιφεράσης με miR-137 αφαιρέθηκε εν μέρει με θέση σύνδεσης 1 ή δεσμευτικές αναφέρω 2 μεταλλαγμένο και σχεδόν καταργηθεί στο διπλό μετάλλαγμα AKT2_MUT, γεγονός που υποδηλώνει ότι η συντηρημένη περιοχή ήταν πλήρως υπεύθυνη για miR-137 λειτουργία (Εικόνα 4Β) .

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η αλληλεπίδραση μεταξύ miR-137 και ΑΚΤ2, HGC-27 και SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-137. έκφραση ΑΚΤ2 mRNA προσδιορίστηκε με PCR πραγματικού χρόνου. Καμία σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε μεταξύ miR-137 επεξεργασμένο και σκαρφάλωμα-επεξεργασμένο ή HGC-27 και SGC-7901 κύτταρα (σχήμα 4Γ). Στη συνέχεια, κηλίδωση Western ανάλυση διεξήχθη για να μετρηθεί το επίπεδο της ΑΚΤ2 πρωτεΐνης. Βρήκαμε ότι η έκφραση της ΑΚΤ2 πρωτεΐνης ρυθμίζεται προς τα κάτω σε miR-137 αντιμετωπίζονται HGC-27 και SGC-7901 κύτταρα, αλλά όχι σε αγωνίζομαι ή μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 4D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι miR-137 αναγνωρίζει άμεσα την 3′-UTR του ΑΚΤ2 mRNA και αναστέλλει τη μετάφραση ΑΚΤ2. Έτσι, κάτω ρυθμίζονται miR-137 στο γαστρικό καρκίνο αναστέλλει την καταστολή της ΑΚΤ2, η οποία με τη σειρά της επιβραδύνει ογκογένεση.

ΑΚΤ2 είναι ένα μέλος της οικογένειας ΑΚΤ. Διαπιστώσαμε περαιτέρω κατάντη δράστες της Bad και GSK-B. Ως αποτέλεσμα, η ρ-Bad και π-GSK-Β προφανώς κάτω ρυθμίζεται miR-137 αγωγή HGC-27 και SGC-7901 κυττάρων σε σύγκριση με σκαρφάλωμα επεξεργασμένα ή μη επεξεργασμένα κύτταρα. Καμία σημαντική αλλαγή βρέθηκε σε μη φωσφορυλιωμένη Bad ή της GSK (Σχήμα 4Ε). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η επιτάχυνση της γαστρικής ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων ήταν εν μέρει λόγω της υπερ-actived μονοπάτια Akt. Εκτός από την προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, actived Akt θα μπορούσε επίσης να φωσφορυλιώνουν Bad σε Ser112 και Ser136, μπλοκάροντας Bad-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Σε περίπτωση απουσίας της φωσφορυλίωσης σε αυτές τις θέσεις, Bad πιστεύεται ότι αλληλεπιδρά με Βοΐ-XL να επάγει κυτταρικό θάνατο. Σε αντίθεση, μεσολαβεί η ΑΚΤ υπερφωσφορυλίωση της Bad μπορεί να προωθήσει την επιβίωση των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα. Κηλίδωση Western Τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσαν την ανωτέρω εικασίες ότι η αλλαγή του γαστρικού δραστηριότητες των καρκινικών κυττάρων σε κατάσταση του miR-137-μορφομετατραπέντα κύτταρα θα μπορούσε να είναι ένα αποτέλεσμα της μειωμένης φωσφορυλίωσης της Bad. Επίσης, αναλύσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης ΑΚΤ2 σε 12 GC patientsin οποίους ήταν κάτω-ρυθμίζονται miR-137. Μεταξύ αυτών των δειγμάτων, ΑΚΤ2 ήταν ρυθμισμένη in9patientsin ιστούς GC τους (Σχήμα 4F).

Η αποκατάσταση της ΑΚΤ2 οδήγησαν σε ενεργοποίηση της εισβολής και καταστολή της απόπτωσης

Για την περαιτέρω αποδείξει οι ρόλοι των miR-137 και ΑΚΤ2 παίζονται κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης, διερευνήσαμε την επίδραση της αποκατάστασης της ΑΚΤ2 σε miR-137 επιμολυσμένα κύτταρα. Το στύπωμα Western κατέδειξε ότι το επίπεδο της πρωτεΐνης ΑΚΤ2 σε ΑΚΤ2 δείγμα υπερέκφραση ήταν προφανώς υψηλότερη από εκείνη του αρνητικού μάρτυρα ακόμη και κάτω από την καταστολή του miR-137. Η αποκατάσταση της ΑΚΤ2 οδήγησαν στην ενεργοποίηση των εισβολής και μια καταστολή της απόπτωσης (Εικόνα 5).

A. πρωτεϊνικό επίπεδο ΑΚΤ2 αξιολογήθηκε σε κύτταρα GC αντιμετωπίζονται από υπερέκφραση του miR-137 ή /και ΑΚΤ2. αποκατάσταση Β ΑΚΤ2 οδηγεί σε καταστολή της απόπτωσης σε κύτταρα GC ενώ miR-137 προάγει την απόπτωση. αποκατάστασης Γ ΑΚΤ2 ενεργοποιεί τη απόπτωση και η εισβολή των κυττάρων GC ενώ miR-137 έδειξαν αντίθετα αποτελέσματα. Αντιπροσωπευτικά εικόνες. Η κανονικοποιημένη αναλογία των μεταστατικών κυττάρων παρουσιάζονται στα φύλλα πυθμένα. Στο Σχήμα 5, «miR-137» αντιπροσωπεύει τα κύτταρα επιμολυσμένα με miR-137 και pcDNA 3.1 κενό φορέα. «AKT2_oe» αντιπροσωπεύει τα κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα ΑΚΤ2 υπερέκφραση. «MiR-137 + AKT2_oe» αντιπροσωπεύει τα κύτταρα συν-επιμολυσμένα με miR-137 και του φορέα υπερέκφραση ΑΚΤ2. «Scr» αντιπροσωπεύει τα κύτταρα επιμολυσμένα με μιμούνται αρνητικό έλεγχο και pcDNA 3.1 κενό φορέα.

Η

Συζήτηση

έχουν miRNAs έχουν συχνά αναφέρεται να απορυθμίζεται συχνά σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους και μερικές miRNAs έχει ακόμη και έχουν χρησιμοποιηθεί χρησιμοποιούνται ως θεραπευτικοί στόχοι του καρκίνου. Οι έρευνες που αφορούν τη σχέση μεταξύ των miRNAs και καρκίνων θα μπορούσε να μας βοηθήσει με την κατανόηση του καρκίνου.

Υπάρχουν μόνο λίγες έρευνες παραπέμποντας το ρόλο miR-137 έπαιξε σε καρκίνο του στομάχου. Έχει αναφερθεί ότι το miR-137 είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής του Cdc42 και με τη στόχευση της οποίας επαγωγή της απόπτωσης και κυτταρικού κύκλου G1 σύλληψη στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα [17]. Ωστόσο, η ρύθμιση επίδραση των microRNA στον καρκίνο είναι αρκετά περίπλοκη. Φαίνεται αδύνατο ότι το miR-137 ρυθμίζει το γαστρικό καρκίνο από το ενιαίο μονοπάτι. Σε αυτή την έρευνα, τη λειτουργία και το μηχανισμό που miR-137, ρυθμίζονται καρκίνο του στομάχου ερευνήθηκε περαιτέρω.

Πρώτον, ανιχνεύσαμε την έκφραση του miR-137 σε 100 ασθενείς και διαπίστωσε ότι η έκφραση του miR-137 είναι σημαντικά κάτω -regulated σε δείγμα καρκίνου. Επίσης, έχουμε βρει μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-137 και γαστρικό καρκίνο κλινικό στάδιο. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι μεταβολές του miR-137 θα μπορούσε να συμμετάσχει σε γαστρικό εξέλιξης του καρκίνου. Προσπαθήσαμε να βρούμε τη σχέση μεταξύ miR-137 και ασθενών ηλικίας και φύλου, αλλά δεν στατιστικό αποτέλεσμα βρέθηκε. Δεδομένου ότι η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η έκφραση του miR-137 ρυθμισμένα προς τα κάτω στους περισσότερους των ιστών GC σε σχέση με γειτονικούς ιστούς (77%), θα μπορούσαμε να εξετάσουμε σχετικά με τη διάγνωση και την προγνωστική χρήση του miR-137. Περαιτέρω επικύρωσης σε προοπτικές μελέτες είναι δικαιολογημένη και πιο προσιτή δείγματα πηγές, όπως το miR-137-εμπλουτισμένο που προέρχονται από όγκους εξωσωμάτων από το αίμα, θα πρέπει να διερευνηθεί. Επίσης, θα πρέπει να σημειωθεί ότι σε κάποιο βαθμό η τιμή αποκοπής (cut off = 1,5) που επιλέξαμε μπορεί να είναι ακόμα αυθαίρετη. Όταν ορίστηκε υψηλότερο, θα μπορούσαν να υπάρξουν λιγότεροι ασθενείς με miR-137 κάτω ρυθμίζονται σε καρκινικούς ιστούς. Ωστόσο, ακόμη και σε αυτή την κατάσταση, υπήρξε περίπου 23% των καρκίνων έχουν υψηλή έκφραση του miR-137. Αυτό μπορεί να οφείλεται στην ατομική διαφορά μεταξύ των ασθενών ότι ορισμένα από τα άτομα μπορεί να έχουν διαφορετικό σχήμα έκφρασης του γονιδίου κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης ή καρκίνο πρόοδο.

Καθώς η έκφραση του miR-137 σε ιστούς GC ήταν χαμηλότερη από ότι σε γειτονικούς ιστούς σε στατιστικώς σημαντικές διαφορές (ρ = 0,00079), θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι αυτή η χαρακτηριστική έκφραση συσχετίστηκε με την ανάπτυξη καρκίνου. Αυτή η υπόθεση επιβεβαιώθηκε με in vitro και in vivo μελέτες ότι το miR-137 μπορεί να ρυθμίσει αρνητικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη μετανάστευση και εισβολή. Το επίπεδο έκφρασης του miR-137 μπορεί να κρατήσει σε υψηλό επίπεδο κατά τη διάρκεια μιας μακράς περιόδου μετά την επιμόλυνση, τόσο σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, οι όγκοι ξενομοσχεύματος τελικού σταδίου και inmetastatic θέση στους πνεύμονες (S1 Α Σχήμα-S1c σχήμα). Εντούτοις, η μέθοδος υπερέκφραση οδηγεί σε πολύ υψηλά επίπεδα έκφρασης του miR-137 (Σχήμα 2Α). Αυτό το υψηλό επίπεδο του miR-137 μπορεί να προκαλέσει επιπλέον επιδράσεις. Για παράδειγμα, miR-137 είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής του Cdc42 και με τη στόχευση που επάγει απόπτωση και κυτταρικό κύκλο G1 σύλληψη στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα [17]. Καθώς το miR-137 στη μελέτη μας ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω χιλιάδες φορές, μπορεί να οδηγήσει στην αναστολή άλλων στόχων όπως Cdc42. Προφανώς, σε αυτή τη μελέτη δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι τα αποτελέσματα ογκοκατασταλτικό του miR-137 διαμεσολαβείται από την καταστολή άλλα γονίδια-στόχους.

Στη συνέχεια, διαπιστώσαμε ότι το miR-137 δρα ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο μέσω ΑΚΤ2 στόχευσης , η οποία είναι μέλος της οικογένειας ΑΚΤ. Η αποκατάσταση της ΑΚΤ2 προκαλεί την επάνω ρύθμιση του ΑΚΤ2 σε miR-137 επιμολυσμένα κύτταρα, τα οποία είναι πολύ υψηλότερη από ότι σε σκαρφάλωμα. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε ότι η υπερέκφραση ΑΚΤ2 αντιστραφεί το επίπεδο της πρωτεΐνης miR-137 καταστέλλεται. Το πιο σημαντικό, η αποκατάσταση της ΑΚΤ2 ρυθμίζει την απόπτωση και εισβολή του γαστρικού καρκινικών κυττάρων, οδηγώντας σε μια ενεργοποίηση της εισβολής και μια καταστολή της απόπτωσης (Εικόνα 5). Αυτό το πείραμα διάσωσης παρέχει περαιτέρω ενδείξεις ότι η απόπτωση ενεργό κελί miR-137 και αρνητικά ρυθμίζουν την κυτταρική εισβολή με τη στόχευση ΑΚΤ2. In vivo πειράματα έδειξαν επίσης ότι η έκφραση του miR-137 είναι αρνητικά σε σχέση με την έκφραση ΑΚΤ2 (S1D σχήμα και S1E σχήμα). AKT είναι ένας κρίσιμος παράγοντας της PI3K /AKT τρόπο μονοπάτι. Η προς τα κάτω ρύθμιση των ΑΚΤ2 επηρεάζει περαιτέρω κατάντη πρωτεΐνη της Bad και GSK-3Β, ότι η p-Bad και p-GSK-Β προφανώς προς τα κάτω ρύθμιση. Bad μπορούν να παίξουν τους ρόλους της με φωσφορυλίωση και την περαιτέρω ρύθμιση της κυτταρικής τύχης [18]. GSK-3Β, η οποία είναι επίσης γνωστή ως GSK-3β συνήθως, ελέγχει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Εν κατακλείδι, έχουμε εντοπίσει μια σύνδεση μεταξύ των miR-137 και ΑΚΤ2 που είναι ένα μυθιστόρημα συστατικό του γαστρικού καρκίνου ογκογένεσης. Το miR-137 έχει αποδειχθεί ότι σχετίζεται με τη ρύθμιση ΑΚΤ2 [19]. Σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, miR-137 αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση μέσω ΑΚΤ2 απευθείας στόχευση [20]. Στην πραγματικότητα, έχουμε e έχουν προβληθεί 8 γονίδια ως πιθανοί στόχοι του miR-137 (S1 πίνακα).