Αφηρημένο

Ιστορικό

BIRC6 είναι μέλος των αναστολέων της απόπτωσης πρωτεΐνης (ΙΑΡ) της οικογένειας η οποία θεωρείται ότι προστατεύει μία ποικιλία καρκινικών κυττάρων από απόπτωση. Ο κύριος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί κατά πόσο BIRC6 παίζει ρόλο στον καρκίνο του προστάτη και θα μπορούσε να είναι χρήσιμη ως ένα νέο θεραπευτικό στόχο.

Μέθοδοι

έκφραση BIRC6 σε κυτταρικές σειρές αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας Δυτική κηλίδα ανάλυση και σε κλινικά δείγματα με χρήση ανοσοϊστοχημείας της μικροσυστοιχίες ιστού. Η βιολογική σημασία του BIRC6 προσδιορίστηκε με siRNA προκαλούμενη μείωση του

BIRC6

έκφραση σε κύτταρα LNCaP που ακολουθείται από λειτουργικές δοκιμασίες.

Αποτελέσματα

έκφραση πρωτεΐνης Αυξημένα BIRC6 βρέθηκε σε προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές και κλινικά δείγματα, όπως διακρίνεται από καλοήθη αντίστοιχά τους. Αυξημένη έκφραση BIRC6 συσχετίστηκε με καρκίνους Gleason 6-8 και αντίσταση ευνουχισμό. Μείωση της έκφρασης BIRC6 σε κύτταρα LNCaP οδήγησε σε σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων η οποία συνδέεται με την αύξηση στην απόπτωση και σε μείωση του σχηματισμού autophagosome. Doxorubicin απόπτωση βρέθηκε να συνδέεται με τη μείωση της έκφρασης πρωτεΐνης BIRC6.

Συμπέρασμα

Τα δεδομένα υποδηλώνουν ένα ρόλο για BIRC6 στην πρόοδο του καρκίνου του προστάτη και την αντίσταση θεραπεία, και να αναφέρει για πρώτη φορά ότι το

BIRC6

γονίδιο και το προϊόν της είναι πιθανό να αποδειχθούν πολύτιμες στόχοι για τη θεραπεία των καρκίνων του προστάτη

Παράθεση:. Χαμηλή CG, Luk ISU, Lin D, Fazli L, Yang Κ, Xu Υ, et al. (2013) Protein BIRC6, ένας αναστολέας της απόπτωσης: Ρόλος στην επιβίωση των κυττάρων Ανθρώπινα Καρκίνος του προστάτη. PLoS ONE 8 (2): e55837. doi: 10.1371 /journal.pone.0055837

Επιμέλεια: Kin Mang Lau, Η κινεζική Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 16, Αυγ 2012? Δεκτές: 2, Γενάρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Low et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνους του προστάτη συνήθως παρουσιάζονται ως όγκοι ανδρογόνο-εξαρτώμενη, ευαίσθητα στην ανάπτυξη σύλληψης /απόπτωση που προκαλείται από ανδρογόνων θεραπεία κατάλυσης [1]. Αν και αρχικά αποτελεσματικές, ανδρογόνων οδηγεί συχνά στην ανάπτυξη του ευνουχισμού ανθεκτικών (ανδρογονο-ανεξάρτητων) καρκίνο του προστάτη, το οποίο είναι γενικά επίσης ανθεκτικά σε άλλες διαθέσιμες θεραπείες. Ως εκ τούτου, η αντίσταση ευνουχισμός σηματοδοτεί συνήθως το τέλος μορφή στάδιο του καρκίνου του προστάτη και είναι το μεγαλύτερο εμπόδιο στη διαχείριση της νόσου. [1] Ανάπτυξη του ευνουχισμού ανθεκτικών καρκίνος του προστάτη χαρακτηριστικά σχετίζεται με σημαντικές αυξήσεις στην αντοχή σε απόπτωση, μια σημαντική οδός θανάτου για δράση φαρμάκου [1] – [3]. αντίσταση απόπτωση που προκύπτουν από τα πάνω ρύθμιση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων και των προϊόντων τους πιστεύεται ότι είναι ένα βασικό παράγοντα που συμβάλλει στην ανάπτυξη της αντίστασης ευνουχισμό, καθώς επίσης και γενική αντίσταση σε θεραπείες κατά του καρκίνου. Η διαλεύκανση του ρόλου των αντι-αποπτωτικών γονιδίων /πρωτεϊνών στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη είναι επομένως πιθανό να οδηγήσει σε βελτιώσεις στη θεραπεία της επίμονης νόσου.

Οι αναστολείς της απόπτωσης Πρωτεΐνη (IAP) οικογένεια έχει αναφερθεί για να παίξει ένα ρόλο στην αντίσταση απόπτωσης σε μία ποικιλία καρκινικών κυτταρικών σειρών και χαρακτηρίζεται από την παρουσία στις πρωτεΐνες από ένα έως τρία αντίγραφα ενός τομέα Βακιλλοϊική ΙΑΡ Επανάληψη (BIR). Τα ΙΑΡ έχει αποδειχθεί ότι δεσμεύονται σε και να αναστέλλουν μια ποικιλία από προ-αποπτωτικών παραγόντων, έτσι καταστέλλοντας αποτελεσματικά την απόπτωση που επάγεται από ένα ευρύ φάσμα των τελεστών, συμπεριλαμβανομένων χημειοθεραπευτικών και η ακτινοβόληση [4]. Η περιοχή BIR είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση των ΙΑΡ με προ-αποπτωτικά παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων κασπασών. Οι κασπάσες είναι μια οικογένεια πρωτεασών κυστεΐνης-ασπαρτικού οξέος-ειδική, που υπάρχει σε ένα προ-μορφή η οποία, όταν ενεργοποιηθεί μέσω διάσπασης, είναι υπεύθυνη για την αποικοδόμηση υποστρωμάτων θανάτου όπως πολυ-ΑϋΡ-ριβόζη πολυμεράση (PARP) πυροδοτώντας έτσι την απόπτωση. Διασπασμένη κασπάση-3 και διασπασμένη PARP μπορεί να ανιχνευθεί εύκολα με ανάλυση κηλίδος Western και χρησιμοποιούνται συνήθως ως δείκτες για την απόπτωση [5].

Η απόπτωση συνδέεται συχνά με αυτοφαγία, μια διαδικασία που περιλαμβάνει λυσοσωμική αποικοδόμηση των ιδίων συστατικών ενός κυττάρου [6]. Περιλαμβάνει τη συσκευασία των πρωτεϊνών και των οργανιδίων εντός αυτοφαγοσώματα, ακολουθούμενη από σύντηξη με λυσοσώματα που οδηγούν σε υποβάθμιση των πρωτεϊνών και οργανιδίων. Ο ρόλος της αυτοφαγία στην ανάπτυξη του καρκίνου και της θεραπείας της είναι πολύπλοκη, διότι υπάρχουν ενδείξεις ότι autophagy μπορεί να προωθήσει και να καταστείλουν την ανάπτυξη του καρκίνου [7]. Αναστολή της autophagy με διάσπαση των βασικών γονιδίων autophagy έχει δειχθεί ότι προάγει την ογκογένεση και ως εκ τούτου autophagy μπορεί να έχει ένα όγκο-κατασταλτική επίδραση [8] – [11]. Ωστόσο, υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι autophagy μπορεί να λειτουργήσει ως μηχανισμός επιβίωσης για τα καρκινικά κύτταρα σε απόκριση σε ένα ευρύ φάσμα των τάσεων, συμπεριλαμβανομένης της θεραπείας με αντι-καρκινικούς παράγοντες [7].

Για να ανιχνευθεί δραστηριότητα αυτοφαγικά σε καλλιεργημένα κύτταρα , ανίχνευση με στύπωση Western των LC3B-ΙΙ χρησιμοποιείται συχνά. LC3B-ΙΙ συνδέεται ειδικά με αυτοφαγοσώματα και τα επίπεδα του LC3B-ΙΙ έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζεται με τον αριθμό των αυτοφαγοσώματα εντός κυττάρων [12] – [15]. Ωστόσο, δεδομένου ότι LC3B-ΙΙ αποικοδομείται κατά autophagosome-λυσόσωμα σύντηξης, τα επίπεδα LC3B-II προσφέρουν μόνο ένα στιγμιότυπο του αριθμού των αυτοφαγοσώματα στα κύτταρα σε ένα χρονικό σημείο και δεν υποδεικνύουν μια ανοδική ρύθμιση ή προς τα κάτω ρύθμιση των αυτοφαγία στα της όλα τα μέρη [13], [15]. Συνεπώς, μία μείωση του αριθμού των αυτοφαγοσώματα σε ένα κύτταρο μπορεί να συμβεί από μια μείωση στο σχηματισμό autophagosome ή σε αύξηση autophagosome αποικοδόμηση. Ανίχνευση άλλων κρίσιμων πρωτεϊνών αυτοφαγία όπως Beclin-1 μπορεί να προσφέρει περαιτέρω πληροφορίες για την ενεργοποίηση αυτοφαγία μέσα σε αυτά τα κύτταρα. Αυτή η πρωτεΐνη εμπλέκεται τόσο στην ενεργοποίηση αυτοφαγία οδό σηματοδότησης και στο αρχικό στάδιο του σχηματισμού autophagosome [12], [16]. Προς το παρόν δεν υπάρχουν στοιχεία που υποδηλώνουν ένα ρόλο για ΙΑΡ στη ρύθμιση της αυτοφαγία στους ανθρώπους.

Η πρωτεΐνη BIRC6 είναι στα 528 kDa, έναν ασυνήθιστα μεγάλο μέλος της οικογένειας ΙΑΡ. Αποτελείται από ένα μόνο Ν-τερματική περιοχή BIR και μία C-τερματική ουμπικουϊτίνης-σύζευξη (UBC) τομέα? ο τελευταίος έχει χιμαιρικό λιγάσης ουβικουϊτίνης Ε2 /Ε3 καθώς και αντι-αποπτωτική δραστηριότητα [17]. Μέσω περιοχή BIR του, BIRC6 είναι ικανό να συνδέεται με και να αναστέλλει την ενεργό κασπάσες, συμπεριλαμβανομένων κασπασών-3, 6, 7 και 9 και οι αλληλεπιδράσεις αυτές έχουν αποδειχθεί ότι αποτελούν τη βάση ικανότητα BIRC6 να αναστέλλει τον καταρράκτη κασπάσης και τελικά απόπτωση [17]. Μέσω τομέα του UBC, BIRC6 διευκολύνει την υποβάθμιση του πρωτεασώματος των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών κασπάσης-9 [18], SMAC /DIABLO [18], [19] και HTRA2 /ΟΜΙ [17], [20]. BIRC6 είναι επίσης ένας κρίσιμος ρυθμιστής του κυτταροκίνηση και επομένως παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [21].

Πρόσφατα στοιχεία υποστηρίζει μια ευρεία ρόλο για BIRC6 σε προσδίδει αντίσταση απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα, όπως υποδεικνύεται από

σε vitro

μελέτες με κύτταρα από γλοιώματα [22], καρκίνους του πνεύμονα [23], καρκίνους του τραχήλου της μήτρας [19], [21], [24], [25], ινοσαρκώματα [18], [24], οστεοσαρκώματα [21] , καρκίνοι του μαστού [24], [26] και του παχέος εντέρου [27]. Σε κύτταρα του μαστού και τον καρκίνο του πνεύμονα, η απόπτωση προκαλείται από την απώλεια της έκφρασης BIRC6 έχει αποδειχθεί να εμπλέξει σταθεροποίηση p53 [23], [26]. έκφραση BIRC6 σε κλινικά δείγματα καρκίνου έχει παρατηρηθεί για τον ορθοκολικό καρκίνο [28] και της παιδικής ηλικίας

de novo

οξεία μυελογενή λευχαιμία (AML) [29]. Στην τελευταία, η αυξημένη έκφραση του

BIRC6

mRNA συνδέθηκε με μια δυσμενή ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία και χαμηλά ποσοστά υποτροπής επιβίωση χωρίς [29]. Ένας ρόλος για BIRC6 στον καρκίνο του προστάτη, ωστόσο, δεν έχει αναφερθεί.

Στην παρούσα μελέτη, η ανάλυση των κυτταρικών σειρών καρκίνου ανθρώπινου προστάτη και κλινικών δειγμάτων έδειξαν σημαντικές αυξήσεις στην έκφραση BIRC6 από τα κακοήθη κύτταρα /ιστούς ως διακριτές από καλοήθεις ομολόγους τους. Συγκεκριμένα, αυξημένη έκφραση BIRC6 συσχετίστηκε με Gleason 6-8 καρκίνους και αντίσταση ευνουχισμό. Επιπλέον, siRNA επαγόμενη knockdown του BIRC6 οδήγησε σε αξιοσημείωτη μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων LNCaP κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι BIRC6 αντιπροσωπεύει μια νέα θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη πυρίμαχων.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Χημεία, ελήφθησαν διαλύτες, και λύσεις από Sigma-Aldrich Canada Ltd, Oakville, ON, Καναδάς, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Κλινική του καρκίνου του προστάτη οι ιστοί

τα δείγματα ελήφθησαν από ασθενείς, με ενημερωμένη συγκατάθεση τους, ακολουθώντας ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το κλινική Έρευνα Διοικητικό συμβούλιο Ηθικής του Πανεπιστημίου της βρετανικής Κολομβίας και του BC Cancer Agency του. Gleason-βαθμολογούνται μικροσυστοιχίες ιστού (TMAs) χρησιμοποιήθηκαν αποτελείται από 35 καλοήθη δείγματα προστάτη, 6 δείγματα νεοπλασίας του προστάτη-ενδοεπιθηλιακή και 157 ριζική προστατεκτομή δείγματα καρκίνου του προστάτη. Τα δείγματα καρκίνου του αποτελούνταν από 74 Gleason σκορ 6, 23 Gleason score 7, 43 Gleason σκοράρει 8, 2 Gleason σκορ 9, και 15 Gleason σκοράρει 10 ιστούς που δεν είχαν υποβληθεί σε νεο-επικουρική ορμονοθεραπεία και 10 ιστούς καρκίνου του προστάτη που είχαν υποβάλλονται σε ορμονοθεραπεία νεο-επικουρική και είχε προχωρήσει σε ευνουχισμό ανθεκτική νόσο. Οι τελευταίες 10 ιστοί είχαν Gleason βαθμολογίες 8 (n = 6) και 10 (n = 4) πριν από τη θεραπεία. Τα δείγματα για την κατασκευή TMA είχαν επιλεγεί τυχαία από συλλογές στο Προστάτη Κέντρο Βανκούβερ, Βανκούβερ Γενικό Νοσοκομείο (παρέχεται από το Τμήμα Παθολογίας του Πανεπιστημίου της Βρετανικής Κολομβίας, Vancouver, BC, Καναδάς). Παρασκευή ιστού και κατασκευή ΤΜΑ διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [30].

Ανοσοϊστοχημεία

Ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται [31] χρησιμοποιώντας ένα πολυκλωνικό κουνελιού αντι-BIRC6 αντίσωμα (Novus Biologicals, Littleton, CO ? NB110-40730) σε αραίωση 1:100. Όλα τα τμήματα που χρησιμοποιούνται για ανοσοϊστοχημεία ήταν αντίθετα με 5% (w /v) Harris αιματοξυλίνη.

BIRC6 Πρωτεΐνη Scoring

χρώση BIRC6 των ιστών αξιολογήθηκε από έναν παθολόγο και δίνεται μια βαθμολογία από 0, 1 , 2 ή 3, δεν αντιπροσωπεύει χρώση BIRC6, αδύναμα, μέτρια και ισχυρή ένταση χρώσης BIRC6, αντίστοιχα. Ποσοστό θετικότητα (ως μέτρο της συχνότητας χρώσης) υπολογίστηκε για κάθε ομάδα με βάση τον αριθμό των τμημάτων με εντάσεις χρώσης του «1» ή υψηλότερη.

Κυτταρικές Γραμμές

καρκινικό κύτταρο Έξι ανθρώπινου προστάτη γραμμές (LNCaP? PC3? PC3-M? DU145? C42? VCAP), δύο καλοήθη προστατική κυτταρικές γραμμές (BPH1, RWPE1) και δύο κυτταρικές σειρές είναι γνωστό ότι εκφράζουν BIRC6 (OVCAR-8, HeLa) διατηρήθηκαν σε μέσο συμπληρωμένο με FBS ( 10%), πενικιλλίνη G (100 IU /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /mL) σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C και 5% CO

2 [22]. Τα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας RPMI-1640, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν BPH1 χρησιμοποιώντας DMEM, και τα κύτταρα RWPE1 χρησιμοποιώντας κερατινοκύτταρα SFM (Gibco-BRL? Burlington ΟΝ, Canada). Οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Για να προσδιοριστεί η επίδραση της απόπτωσης επί της έκφρασης BIRC6 σε κύτταρα LNCaP, 600.000 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα και στη συνέχεια επωάστηκαν με δοξορουβικίνη (1 μg /mL).

Western Blotting

κυτταρολύματα παρασκευάσθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης (1% ΝΡ-40, 0.5% νάτριο δεοξυχολικό οξύ). Για την ανίχνευση του BIRC6 (528 kDa), 10 μg ολόκληρο προϊόν λύσης κυττάρου διεξήχθη σε δύο μέρη (5% και 12,5%) SDS-πολυακρυλαμιδίου. Τα πηκτώματα κόπηκαν και BIRC6 ηλεκτρομεταφέρθηκε σε μία μεμβράνη PVDF σε tris (25 mM), γλυκίνη (191,5 mM), μεθανόλη (10%), SDS (0,05%), χρησιμοποιώντας μία συσκευή ημι-ξηράς μεταφοράς. Οι μεμβράνες ανιχνεύτηκαν για BIRC6 με αντίσωμα αντι-κουνελιού πολυκλωνικό BIRC6 (1:500? Novus Biologicals). Για την ανίχνευση του PARP, κασπάσης-3, LC3B-Ι, LC3B-ΙΙ και η έκφραση πρωτεΐνης Beclin-1, 5-15 μg του προϊόντος λύσης ολικού κυττάρου διεξήχθη σε 10 ή 12,5% πηκτώματα SDS-πολυακρυλαμιδίου και, μετά τη μεταφορά της πρωτεΐνης, οι μεμβράνες ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας κουνελιού αντι-PARP και-κασπάση-3 αντι αντισώματα (1:1000? Cell Signaling? Beverly, ΜΑ), αντισώματα αντι-LC3B κουνελιού (0.85:1000? Abcam, Cambridge, ΜΑ) και κουνελιού αντι-Beclin-1 αντισώματα (1:1000? Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Ακτίνης ή βινκουλίνης χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες φόρτωσης και ανιχνεύονται σε μεμβράνες χρησιμοποιώντας αντι-ακτίνης πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (1:2000? Sigma-Aldrich) και αντι-βινκουλίνης αντίσωμα ποντικού. (1:3000? Sigma-Aldrich)

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) και κυττάρων η επιμόλυνση

Προσαρμοσμένη siRNA που συντίθεται από Dharmacon (Lafayette, CO) και είναι γνωστό για τη στόχευση

BIRC6

είχαν τις ακόλουθες αλληλουχίες: siRNA-1, την αίσθηση, 5′ Ουυ-UCA-ΑΑΟ-CAG-GAU-GAU-G-dTdT-3 ‘[23] και siRNA-2, η αίσθηση, 5′-CUC-ΑΟΟ-AGA-GUA-CUG-CUC-Α-dTdT-3’ [ ,,,0],21]. Μη στόχευση siRNA (siGENOME μη Στόχευση Smartpool? Dharmacon) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Για να εξεταστεί η επίδραση των siRNAs επί της έκφρασης πρωτεΐνης BIRC6, τα κύτταρα LNCaP επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε ελεύθερο αντιβιοτικών RPMI-1640 συμπληρωμένο με ορό εμβρύου μόσχου (10%). Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ siRNA σε αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen? Burlington, ΟΝ) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. ελέγχου του οχήματος και μη-στόχευση siRNA εφαρμόστηκαν για την αναπαραγωγή κυτταρικές καλλιέργειες.

Δοκιμασία ΜΤΤ βιωσιμότητα

Είκοσι πέντε χιλιάδες κύτταρα σπάρθηκαν ανά φρεάτιο ενός 24 φρεατίων τρυβλίο και επιμολύνθηκαν με siRNA-2 . Σε 0, 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, 50 μL ΜΤΤ (5 mg /mL) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και οι καλλιέργειες επωάστηκαν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C και 5% CO

2 για 4 ώρες . Πεντακόσια μλ διαλύματος 20% SDS προστέθηκε στη συνέχεια σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε θερμοκρασία δωματίου απουσία φωτός. Δείγματα (100 μΙ) στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm.

Κύκλου Κυττάρου

Η κατανομή του κυτταρικού κύκλου των LNCaP κυττάρων προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) χρωματισμένα κύτταρα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-10% FBS μέσο και στη συνέχεια κατεργάζεται με

BIRC6

siRNA. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την αγωγή με siRNA, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 70% αιθανόλη και στη συνέχεια αποθηκεύονται στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS. Μετά από φυγοκέντρηση, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 10 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ), 1 mg /ml ΚΝάση και 0,1% Triton Χ-100 για 30 λεπτά επί πάγου. ιστογράμματα DNA λήφθηκαν από την ανάλυση 10.000 κυττάρων. Η αναλογία των κυττάρων σε G1, S, G2 και Μ + του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε.

Annexin-V Δοκιμασίες

Η απόπτωση μετρήθηκε με φθορισμό ταξινομητή ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS) ανάλυση με αννεξίνη -V συζευγμένο με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (αννεξίνης-ν-ΡΙΤΟ) (BD Biosciences PharMingen) για πρώιμη απόπτωση και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) για καθυστέρηση χρώση απόπτωση ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-10% FBS μέσο και στη συνέχεια κατεργάζεται με

BIRC6

siRNA. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την αγωγή με siRNA, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με ψυχρό PBS και μετά επαναιωρήθηκαν σε 1Χ ρυθμιστικό δέσμευσης (BD PharMingen, San Diego, CA) σε συγκέντρωση περίπου 1 × 10

6 κύτταρα /mL. Κυτταρικά εναιωρήματα (100 μΙ_? ~ 1 × 10

5 κύτταρα) μεταφέρθηκαν σε νέα σωληνάρια και προστέθηκαν 5 μL Annexin V-FITC και 5 μL κλάσματα ΡΙ. Τα κύτταρα επωάζονται στο σκοτάδι για 15 λεπτά στους 21 ° C. Αννεξίνη-FITC φθορισμός μετρήθηκε στο κανάλι FL1 (χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο 530/30 ζώνη) και PI στο κανάλι FL3 (660/20 ΒΡ ​​φίλτρο διέλευσης ζώνης του φίλτρου). Δέκα χιλιάδες γεγονότα συλλέχθηκαν. Η απόπτωση εκτιμήθηκε με μέτρηση του ποσοστού των Αηηβχίην-θετικά κύτταρα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD του τριπλούν καλλιέργεια.

LC3-GFP puncta Δοκιμασία Σχηματισμού και Ποσοτικοποίηση

κύτταρα LNCaP σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες σε πλάκες 6-φρεατίων και επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ μη στόχους siRNA ή BIRC6 siRNA-2 την επόμενη μέρα χρησιμοποιώντας Oligofectamine. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 3 μg LC3-GFP ανά φρεάτιο με XtremeGENE (Roche) και τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη 27 ώρες μετά την επιμόλυνση. σχηματισμός puncta LC3-GFP προκλήθηκε 6 ώρες πριν από την στερέωση με αγωγή με 10 υΜ χλωροκίνης σε μέσο ελεύθερο ορού. Μετά τη σταθεροποίηση, καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν με διάλυμα στερέωσης DAPI. Φθορισμού εικόνες ελήφθησαν με ομοεστιακό μικροσκόπιο. Ποσοτικοποίηση των κυττάρων αυτοφαγικά: αυτοφαγικά κύτταρα αναφέρονται ως κύτταρα που περιέχουν περισσότερο από 15 LC3-GFP puncta. Ποσοστό αυτοφαγικά κυττάρων υπολογίστηκε ως ο αριθμός των αυτοφαγικά κύτταρα διαιρείται με τον αριθμό των LC3-GFP θετικά κύτταρα × 100.

Στατιστική Ανάλυση

Η Φοιτητών

t-test

χρησιμοποιήθηκε και τα αποτελέσματα με ένα

P

-τιμή

P

= 0.10). Επίσης, η χαμηλή ένταση της έκφρασης που παρατηρείται σε Gleason σκορ 9-10 ιστούς του καρκίνου του προστάτη ήταν αντανακλαστική του μεγάλου ποσοστού των τυπικά αδύναμη BIRC6 εκφράζουν Gleason βαθμού 5 καρκίνοι που βρέθηκαν σε αυτήν την ομάδα.

Α, βέλη που δείχνουν αδύναμα κυτταροπλασματική χρώση BIRC6 στην καλοήθη προστατική αυλού κύτταρα (βαθμολογία «1»). Β, βέλη υποδεικνύοντας μέτρια χρώση κυτταροπλασματική BIRC6 στο Gleason βαθμού 3 κύτταρα καρκίνου του προστάτη (βαθμολογία «2»). C, βέλη που δείχνουν ισχυρή χρώση κυτταροπλασματική BIRC6 στο Gleason βαθμού 4 κύτταρα καρκίνου του προστάτη (βαθμολογία «3»). D, τα βέλη δείχνουν ασθενή χρώση κυτταροπλασματική BIRC6 στο Gleason βαθμού 5 κύτταρα καρκίνου του προστάτη (βαθμολογία «1»). Ε, μαύρες γραμμές αντιπροσωπεύουν μέση ένταση χρώσης BIRC6 σε καλοήθη επιθήλιο προστάτη (n = 35) και Gleason στείλει 6 (n = 74), 7 (n = 23), 8 (n = 43) και 9-10 (n = 17) ασθενής ιστούς καρκίνου του προστάτη. Γκρι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη συχνότητα της έκφρασης BIRC6 (βαθμολογία ≥1). Αυξημένα εντάσεις χρώση παρατηρήθηκε σε Gleason σκοράρει 6 (*

P

= 3,24 × 10-3), 7 (*

P

= 4,45 × 10-6) και 8 (*

P

= 1,63 × 10-3) σε ιστούς του καρκίνου του προστάτη σε σύγκριση με καλοήθη επιθήλιο του προστάτη. Οι ράβδοι σφάλματος απεικονίζουν τυπικές αποκλίσεις. F, μαύρες γραμμές αντιπροσωπεύουν μέση ένταση χρώσης BIRC6 στο μη επεξεργασμένο υψηλής ποιότητας (Gleason σκορ 8-10) σε ιστούς του καρκίνου του προστάτη (n = 60) και ο ευνουχισμός ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC) σε ιστούς που είχε αναπτυχθεί από Gleason σκορ 8-10 καρκίνους εξής νεο -adjuvant ορμονική θεραπεία (n = 10). Γκρι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη συχνότητα της έκφρασης BIRC6 (βαθμολογία ≥1). Ο ευνουχισμός ανθεκτικό ιστούς καρκίνου του προστάτη έδειξαν σημαντικά υψηλότερες μέσες BIRC6 ένταση χρώσης από μη επεξεργασμένο υψηλής ποιότητας ιστούς του καρκίνου του προστάτη (*

P

= 1,38 × 10-3). Οι ράβδοι σφάλματος απεικονίζουν τυπικές αποκλίσεις.

Η

Gleason σκορ 6, 7 και 8 κακοήθη επιθήλια πιο συχνά εκφράζεται BIRC6 (χρώση βαθμολογία ένταση ≥1) από καλοήθη επιθήλιο του προστάτη (Σχ. 2Ε). Όλες οι κακοήθεις ιστούς έδειξε μια υψηλή συχνότητα έκφρασης BIRC6 συζευγμένο με υψηλή ένταση BIRC6, εκτός από Gleason στείλει 9-10 ιστών οι οποίοι έδειξαν μια υψηλή συχνότητα έκφρασης BIRC6 συζευγμένο με ένα χαμηλό μέσο όρο ένταση. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία δείχνουν ότι η εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη από καλοήθεις έως Gleason σκοράρει 8 καρκίνοι του προστάτη συνδέεται με αυξήσεις στην έκφραση της πρωτεΐνης BIRC6.

Αυξημένα BIRC6 επίπεδα πρωτεΐνης στο Ευνουχισμός ανθεκτικά Κλινική του καρκίνου του προστάτη Οι ιστοί

τομές ιστού από καρκίνους του προστάτη ασθενών (Gleason στείλει 8-10) το οποίο είχε προχωρήσει σε αντίσταση ευνουχισμό μετά τη θεραπεία νεο-επικουρική ορμόνης (n = 10) βάφτηκαν και βαθμολογήθηκαν για έκφραση BIRC6 και συγκρίθηκαν με τα τμήματα του καρκίνων του προστάτη υψηλής ποιότητας (Gleason στείλει 8-10) το οποίο δεν είχε υποβληθεί σε ορμονοθεραπεία νεο-επικουρική (n = 60). Η μέση ένταση χρώση για BIRC6 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ευνουχισμό ανθεκτικά καρκίνων του προστάτη σε σχέση με δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής (2.30 ± 0.67 και 1.35 SD ± 0,84 SD αντίστοιχα?

P

= 1,38 × 10

-3) (Σχ . 2F). BIRC6 συχνότητα έκφραση ήταν πολύ υψηλή και στους δύο τύπους ιστών. Τα στοιχεία δείχνουν ότι η ανάπτυξη του ευνουχισμού-ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη συνδέεται με αυξήσεις στην έκφραση της πρωτεΐνης BIRC6.

Μείωση της έκφρασης BIRC6 Μειώνει τον καρκίνο του προστάτη κυττάρων Βιωσιμότητα και διάδοση των πυρηνικών όπλων

Έχει αναφερθεί ότι η μείωση της BIRC6 έκφραση επάγει απόπτωση (π.χ., σε κύτταρα καρκίνου του μαστού). Χρησιμοποιήσαμε την κυτταρική γραμμή LNCaP να μελετηθεί η επίδραση της μείωσης της έκφρασης BIRC6 στη βιωσιμότητα του προστάτη καρκινικών κυττάρων. Η επώαση των κυττάρων LNCaP επιμολυσμένα με

BIRC6

-targeting siRNA-1 και -2 (λωρίδες 3, 4, 7, 8, 11, 12) είχε ως αποτέλεσμα σημαντική απώλεια BIRC6 πρωτεΐνη, σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με λιποφεκταμίνη μόνο (λωρίδες 2, 6, 10), λιποφεκταμίνη + μη στόχευση siRNA (λωρίδες 5, 9, 13) ή καθόλου θεραπεία (Λωρίδα 1) (Σχ. 3Α). Η επίδραση ήταν εμφανής μετά από 30 ώρες από την επιμόλυνση και έγινε πιο εμφανή στους 54 και 78 ώρες. Πρέπει να σημειωθεί ότι τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με λιποφεκταμίνη μόνο, ή με λιποφεκταμίνη + μη στόχευσης siRNA, έδειξε μια μικρή αύξηση στην έκφραση BIRC6, πιθανώς οφείλεται στο όχημα. Όλες οι επόμενες knockdown πειράματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας siRNA-2.

Α, η θεραπεία των κυτταρικών καλλιεργειών LNCaP με siRNAs που στοχεύουν BIRC6 οδηγεί σε μείωση της πρωτεϊνικής έκφρασης BIRC6. έκφραση BIRC6 πρωτεΐνης σε μη επεξεργασμένα κύτταρα LNCaP (Λωρίδα 1? στους 78 h) και σε κύτταρα LNCaP επωάζονται μόνο με λιποφεκταμίνη (διαδρομές 2, 6, 10), siRNA-1 στόχευση BIRC6 (λωρίδες 3, 7, 11), siRNA-2 στόχευση BIRC6 (λωρίδες 4, 8, 12) ή μη-στόχευση siRNA (λωρίδες 5, 9, 13) για 30, 54 και 78 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Β, η θεραπεία των καλλιεργειών LNCaP κυττάρων με siRNA-2 στόχευση BIRC6 οδηγεί σε μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό όπως δείχνεται με δοκιμασία ΜΤΤ. Οι καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε αγωγή για 30 ώρες με μόνο ή με Λιποφεκταμίνη συν είτε siRNA μη στόχευση ή siRNA-2 στόχευση BIRC6 και έπειτα λιποφεκταμίνης επωάστηκε για 24, 48 και 72 ώρες σε φρέσκο ​​μέσο. Οι σχετικοί αριθμοί κυττάρων στα siRNA-2 πολιτισμούς ήταν σημαντικά χαμηλότερες από αυτές των μη στόχευση siRNA επεξεργασμένες καλλιέργειες με 2,85%, 10,78% και 25,88% στις 54, 78 και 102 ώρες, αντίστοιχα. Οι ράβδοι σφάλματος απεικονίζουν τυπικές αποκλίσεις.

Η

Μετά την επιμόλυνση, το siRNA-2 κύτταρα καλλιεργειών έδειξε αξιοσημείωτη μείωση στην κυτταρική βιωσιμότητα σε σχέση με τα μη-στόχευσης siRNA-επεξεργασμένες καλλιέργειες (Σχ. 3Β). Έτσι, η βιωσιμότητα κυττάρου των siRNA-2 καλλιέργειες ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη του μη-στόχευσης καλλιέργειες siRNA-επεξεργασία με 2.85%, 10.78% και 25.88% σε 54, 78 και 102 ώρες, αντίστοιχα. Υπήρχε μια τάση για τα κύτταρα siRNA-2-κατεργασία για να σχηματίσει συγκυτίων-όπως δομές στις οποίες ομάδες κυττάρων ενώθηκαν με το μεγάλο χρονικό ατρακτοειδόμορφα προεξοχές. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. Εξετάστηκε επίσης η επίδραση της BIRC6 φίμωση στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Η knockdown του BIRC6 σε κύτταρα LNCaP δεν είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αλλαγή στην κυτταρική ποδηλασία (Εικ. S1).

Η επίδραση της μείωσης BIRC6 μελετήθηκε επίσης σε PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα. Παρόμοια με κύτταρα LNCaP, siRNA-2 κύτταρα PC-3 κύτταρα έδειξαν μια σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων σε σύγκριση με τα μη-στόχευσης siRNA-κατεργασμένων κυττάρων 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (Εικ. S2).

Μείωση της Έκφρασης BIRC6 επάγει την απόπτωση και αναστέλλει Autophagosome Σχηματισμός

μείωση BIRC6 επάγει την απόπτωση σε κύτταρα LNCaP όπως αποδεικνύεται με χρώση Annexin-V και immmunoblotting. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, υπήρξε μια σημαντική αύξηση της Annexin-V θετικών κυττάρων σε κύτταρα siRNA-2 κύτταρα (12,19% ± 1,9%) σε σύγκριση με τα μη στοχευόμενα siRNA (3,65% ± 0,60%, ρ = 0,0104) και Lipofectamine κατεργασμένων κυττάρων (3.55% ± 0,0447%, ρ = 0.0123). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της ανάλυσης αννεξίνης-ν, BIRC6 κύτταρα knock-down έδειξε σαφείς αλλαγές στην έκφραση δεικτών απόπτωσης (Εικόνα 4Β). Μια αύξηση στην διασπασμένης κασπάσης-3, η απώλεια της πλήρους μήκους PARP και αύξηση σε διασπασμένη PARP παρατηρήθηκαν σε σύγκριση με τα κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με μη στόχευση siRNA (Λωρίδα 3, 4). Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε μια πλήρη μείωση PARP μήκους μετά από επιμόλυνση των κυττάρων LNCaP με λιποφεκταμίνη ή μη στόχευση (έλεγχος) siRNA (διαδρομές 2, 4), που θα μπορούσε να έχει προκληθεί από μη ειδική αποικοδόμηση του πλήρους μήκους PARP ιδιαίτερα σε κύτταρα LNCaP. Η απώλεια του πλήρους μήκους PARP σε αυτούς τους ελέγχους δεν συνδέθηκε με μια αντίστοιχη αύξηση της διασπασμένης ΡΑΚΡ και δεν συνδέεται με σημαντική αύξηση των διασπασμένης κασπάσης-3, δεικνύοντας ότι αυτοί οι έλεγχοι δεν είχε ως αποτέλεσμα επαγωγή απόπτωσης.

Α, απόπτωση των LNCaP κυττάρων που μορφομετατρέπονται με Lipofectamine (Lipo), μη-στόχευσης ελέγχου siRNA (ΝΤ) ή

BIRC6

siRNA2 και στη συνέχεια επωάστηκαν για 48 ώρες, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής αννεξίνης V /PI χρωματίζονται κύτταρα. Με βάση Q2 + Q3 τιμές (πληθυσμοί αποπτωτικό κυτταρικό),

BIRC6

siRNA σημαντικά αυξημένη απόπτωση των κυττάρων LNCaP σε σύγκριση με Lipo (p = 0,0104) ή ΝΤ siRNA επεξεργασμένα κύτταρα (p = 0,0123). (Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων)? Β, η θεραπεία των κυττάρων LNCaP με siRNA-2 στόχευση BIRC6 οδηγεί σε ενεργοποίηση της κασπάσης-3 (όπως φαίνεται από την εμφάνιση της διασπασμένης κασπάσης-3) και η υποβάθμιση του υποστρώματος της, PARP (όπως φαίνεται από την απώλεια του πλήρους μήκους PARP και την εμφάνιση μιας διασπασμένου προϊόντος PARP). κύτταρα Ανεπεξέργαστα LNCaP (Λωρίδα 1)? LNCaP κύτταρα επωάζονται με μόνο λιποφεκταμίνη (Λωρίδα 2), siRNA-2 BIRC6 στόχευσης (Διαδρομή 3) ή μη-στόχευση siRNA (λωρίδα 4) για 96 ώρες μετά την επιμόλυνση. C, κατεργασία των κυττάρων LNCaP με siRNA-2 BIRC6 στόχευση οδηγεί σε μειώσεις στις Beclin-1 έκφραση και τη μείωση των LC3B-ΙΙ. κύτταρα Ανεπεξέργαστα LNCaP (Λωρίδα 1)? LNCaP κύτταρα επωάζονται με μόνο λιποφεκταμίνη (Λωρίδα 2), siRNA-2 BIRC6 στόχευσης (Διαδρομή 3) ή μη-στόχευση siRNA (Διαδρομή 4) για 113 h μετά την επιμόλυνση. D, autophagosome σχηματισμό σε BIRC6-σιγήσει κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με έλεγχο μη στόχευση siRNA. Κύτταρα μετεμβολιασμένα με μη-στόχευσης ελέγχου siRNA (αριστερά) έδειξαν περισσότερο LC3-GFP puncta από τα κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA-2 στόχευση BIRC6 (δεξιά), η οποία έδειξε διάχυτο έκφραση του LC3-GFP. Ε, Μειωμένο BIRC6 κύτταρα που εκφράζουν LNCaP δείχνει σημαντικά λιγότερα κύτταρα αυτοφαγικά (33,6%) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (51%). κύτταρα αυτοφαγικά προσδιορίστηκαν ποσοτικά με μέτρηση των κυττάρων με περισσότερους από 15 LC3-GFP puncta κάτω από ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο.

Η

Η επιμόλυνση των κυττάρων LNCaP με siRNA-2 (Λωρίδα 3) οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές στην έκφραση δείκτη αυτοφαγία ( Σχ. 4C). Μια μείωση στην πρωτεΐνη LC3B-ΙΙ (η λιπιδιωμένη μορφή της LC3-I) παρατηρήθηκε με καμία επίδραση στα επίπεδα της πρωτεΐνης LC3B-I, καθώς και μια μείωση στο Beclin-1 έκφραση πρωτεΐνης (σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου? Λωρίδες 1, 2, 4) . Επιπλέον, autophagosome σχηματισμό των κυττάρων BIRC6-σιγήσει ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με μη-στόχευσης ελέγχου siRNA (

P

= 0,036), όπως αποκαλύφθηκε από φθορίζον συσσώρευση LC3 puncta στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 4D, E) . Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μείωση της έκφρασης πρωτεΐνης BIRC6 σε siRNA-2-αγωγή LNCaP κυττάρων έχει σαν αποτέλεσμα μια αύξηση στην απόπτωση και μείωση στο σχηματισμό autophagosome. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

δοξορουβικίνη-επαγόμενη απόπτωση σε LNCaP κύτταρα σχετίζεται με μείωση σε BIRC6 Έκφραση Πρωτεΐνης

δοξορουβικίνη, ένα φάρμακο που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη [32], έχει αναφερθεί ότι ενεργοποιούν την απόπτωση, μαζί με μια σημαντική συσσώρευση του ρ53 [33]. Για να διερευνηθεί η επίδραση της δοξορουβικίνης που επάγεται απόπτωση επί της έκφρασης BIRC6 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, LNCaP κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με ή χωρίς δοξορουβικίνη (1 μg /mL). Όπως φαίνεται με ανάλυση κηλίδος Western, η θεραπεία με δοξορουβικίνη είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση της έκφρασης BIRC6 (Εικ. 5Α). Επιπλέον, υπήρχε μια μείωση στην έκφραση πλήρους πρωτεΐνης ΡΑΚΡ μήκους και μια αύξηση σε μια διασπασμένης ΡΑΚΡ, ενδεικτική της απόπτωσης. Επιπλέον, υπήρχε μια μείωση στην πυκνότητα κυττάρου με ένδειξη επιδείνωσης των κυττάρων (Εικ. 5Β). Η επεξεργασία των κυττάρων LNCaP με δοξορουβικίνη εμφάνισαν δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη μείωση της έκφρασης BIRC6 (Εικ. S3). Για να καταλάβετε αν η μείωση BIRC6 ήταν μια αιτία ή ένα αποτέλεσμα της doxorubicin που προκαλείται-απόπτωση, χρονική έκφραση BIRC6 και PARP μετά τη θεραπεία δοξορουβικίνη μελετήθηκε.