Abstract

Λανθάνουσα αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού β-πρωτεΐνης συνδέσεως 4 (LTBP4) είναι ένα εξωκυτταρικό μόριο μήτρα η οποία είναι μέλος σημαντικών δικτύων συνδετικού ιστού και είναι απαραίτητη για την σωστή αναδίπλωση και έκκριση του TGF-β1 . LTBP4 ρυθμίζεται μειωτικά σε καρκινώματα διαφόρων ιστών. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι LTBP4 επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω σε αδενοκαρκινώματα και καρκινώματα πλακωδών κυττάρων του οισοφάγου

in vitro

και

in vivo

. Re-έκφραση της LTBP4 σε καρκίνο του οισοφάγου κυτταρικές σειρές μειωμένη ικανότητα κυτταρική μετανάστευση, ενώ η βιωσιμότητα των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρέμειναν αμετάβλητες. Υπερμεθυλίωση των περιοχών υποκινητή των δύο κύριες ανθρώπινες LTBP4 μεταγραφική μορφές, LTBP4L και LTBP4S, βρέθηκε να εμπλέκεται στην LTBP4 αποσιώπηση. Λεπτομερής έρευνες των προτύπων μεθυλίωσης των περιοχών προαγωγού του LTBP4L και LTBP4S προσδιορίζονται GATA1, SP1, E2F4 και Smad3 ως πιθανοί παράγοντες μεταγραφής που εμπλέκονται στην έκφραση LTBP4. Σε

vitro

μελέτες δραστικότητας του παράγοντα μεταγραφής στο ανακαλύψαμε E2F4 ως νέα ισχυρή ρυθμιστική αρχή για την έκφραση LTBP4S

Παράθεση:. Bultmann Ι, Conradi Α, Kretschmer C, Sterner-Kock Α (2013) Λανθάνουσα Μετασχηματισμός Παράγοντας ανάπτυξης πρωτεΐνη β-Binding 4 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνο του οισοφάγου μέσω Ανάδοχος μεθυλίωσης. PLoS ONE 8 (5): e65614. doi: 10.1371 /journal.pone.0065614

Επιμέλεια: Klaus Roemer, του Πανεπιστημίου του Saarland Ιατρική Σχολή, Γερμανία

Ελήφθη: 19 Φλεβάρη του 2013? Αποδεκτές: 26 Απρίλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: May 31, 2013

Copyright: © 2013 Bultmann et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Μαρία Pesch-Ίδρυμα (Εθνικό Οργανισμό Επιστημών χρηματοδότησης). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το 2008 ο καρκίνος του οισοφάγου ήταν με την αναμενόμενη 482.000 νέες περιπτώσεις η όγδοη πιο συχνή κακοήθεια στον κόσμο και με 407.000 θανάτους το έκτο πιο κοινή αιτία θανάτου [1]. Στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής, η μέση ηλικία διάγνωσης του καρκίνου του οισοφάγου είναι 68 ετών και περίπου το 80% όλων των νέων περιπτώσεων διαγιγνώσκονται σε άνδρες. Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών αυξήθηκε από 5% το 1975 σε 19% το 2001 [2]. Στην Ευρώπη, η μέση ηλικία διάγνωσης είναι 70 ετών και το 67% των νέων διαγνωσμένων κρουσμάτων είναι άνδρες. Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι 9,8% πολύ χαμηλότερο από ό, τι στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής [3].

Οι δύο κυρίαρχες ιστολογικών τύπων καρκίνου του οισοφάγου είναι αδενοκαρκινώματα (ΑΗΚ) και καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (ESCC) . Τόσο προφανώς διαφέρουν ως προς τα πρότυπα τους πρόσπτωσης και να έχουν τη δική του ξεχωριστή αιτιολογία [4]. Στην Ευρώπη, η 1-έτους σε σχέση επιβίωση των ασθενών με ESCC είναι 33,9% και 37,9% της ΑΗΚ-ασθενείς, ωστόσο, η 5-ετή σχετική επιβίωση είναι 10,1% και 10,6%, αντίστοιχα, σχεδόν πανομοιότυπο [3]. Ένα τεκμηριωμένο παράγοντα κινδύνου για την ΑΗΚ και ΕΕΣΣ είναι το κάπνισμα τσιγάρων, ενώ η κατανάλωση αλκοόλ θεωρείται ως παράγοντας κινδύνου μόνο για ESCC [4]. Ότι, η παχυσαρκία, η γαστροοισοφαγική παλινδρόμηση και τον οισοφάγο Barretts είναι μόνο παράγοντες κινδύνου για την ΑΗΚ [4]. Η ημερήσια πρόσληψη φρέσκων φρούτων και λαχανικών σχετίζεται με μειωμένο κίνδυνο των δύο ιστολογικών τύπων καρκίνου του οισοφάγου [4].

Οι αλλαγές στην εξωκυτταρική μήτρα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση του καρκίνου του οισοφάγου. Αποδόμηση και μειωμένη έκφραση των πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας σχετίζονται με την εξέλιξη του όγκου, περιλαμβανομένης της εισβολής και των μεταναστευτικών δυναμικό, καθώς και μετάσταση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση [5].

Ο παράγοντας λανθάνουσα ανάπτυξης μετασχηματισμού εξωκυτταρική πρωτεΐνη μήτρας β-δέσμευσης πρωτεΐνη 4 (LTBP4) είναι μία από τις τέσσερις ισομορφές της LTBPs (LTBP1-4) και μέλος του fibrillin /LTBP οικογένεια γλυκοπρωτεϊνών. LTBP1, LTBP3 και LTBP4 δεσμεύονται ομοιοπολικά με μετασχηματισμό βδ αυξητικού παράγοντα (TGF-β) και είναι απαραίτητες για τη σωστή αναδίπλωση και έκκριση του ΤΟΡ-β [6], [7]. LTBP4 δεσμεύει μόνο ΤΟΡ-β1, ενώ LTBP1 και 3 συνδέονται οι τρεις ισομορφές ΤΟΡ-β [7].

ΤΟΡ-β1 είναι μια πολυδύναμη και πανταχού παρών κυτοκίνης που ανήκουν σε μία υπεροικογένεια δομικώς σχετικών παραγόντων ανάπτυξης με καλά τεκμηριωμένη ρόλους σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, την απόπτωση, προσκόλληση, και εναπόθεση εξωκυττάριας μήτρας [8], [9].

εκτός του ότι είναι κρίσιμης σημασίας για συνοδείας και μεταφορά του ΤΟΡ-β εκτός του κυττάρου, LTBPs έχει αποδειχθεί ότι είναι συνδεδεμένα μέλη των δικτύων του συνδετικού ιστού, όπως η μικροϊνώδους /δικτύου ελαστική ίνα και το δίκτυο ινονεκτίνης [10]. Η ενσωμάτωση της LTBPs στην ECM είναι ζωτικής σημασίας για τη ρύθμιση της λανθάνουσας αποθήκευσης και ενεργοποίησης [11] TGF-β

Διάφορα μεταγραφική μορφές LTBP4 υπάρχουν στον άνθρωπο και οι κύριες μορφές είναι μια μακρά. (LTBP4L? NM_001042544) και μια σύντομη (LTBP4S? NM_001042545) μορφή. Χρησιμοποιώντας δύο ανεξάρτητες υποκινητές και οι δύο μεταγραφικές μορφές εκφράζονται σε διαφορετικά πρότυπα έκφρασης σε έναν ιστό-ειδικό τρόπο [12].

Έχει αποδειχθεί ότι η απορυθμισμένη έκφραση των ισομορφών LTBP σχετίζεται με την εμφάνιση των επιθηλιακών νεοπλασμάτων [13] , [14], [15], [16], [17], [18]. LTBP1 ρυθμίζεται μειωτικά σε μια ποικιλία ανθρώπινων επιθηλιακών νεοπλασμάτων του ήπατος, των ωοθηκών και νευροενδοκρινών όγκων του πεπτικού συστήματος [14], [16], [18]. LTBP2 ρυθμίζεται μειωτικά σε ESCC και ρινοφαρυγγικά καρκινώματα [13], [15]. LTBP4 ρυθμίζεται μειωτικά σε καρκίνωμα ανθρώπου και ποντικού πόρου

in situ

και μαστικά αδενοκαρκινώματα [17].

Οι μηχανισμοί που οδηγούν σε ρύθμιση προς τα κάτω του LTBPs σε διάφορα επιθηλιακά νεοπλάσματα είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Ωστόσο, για LTBP2 είναι γνωστό ότι υπερμεθυλίωση του προαγωγού είναι υπεύθυνη για την ρύθμιση προς τα κάτω σε ESCC και ρινοφαρυγγικά καρκινώματα [13], [15].

Η παρούσα μελέτη ερευνά την πρωτεΐνη έκφραση της εξωκυτταρικής μήτρας πρωτεΐνης LTBP4 σε διαφορετικά στάδια της εξέλιξης του καρκίνου του οισοφάγου, καθώς και σε διάφορα αδενοκαρκινώματα του γαστρεντερικού σωλήνα. Επιπλέον, ερευνήσαμε την πιθανή ρυθμιστικό μηχανισμό υπεύθυνο για LTBP4 αδρανοποίηση σε καρκίνο του οισοφάγου.

Αποτελέσματα

LTBP4 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε διάφορα στάδια της εξέλιξης του καρκίνου του οισοφάγου

Στην παρούσα μελέτη διερεύνησε την πρωτεΐνη έκφραση του LTBP4 στη γαστρεντερική καρκινώματα και ιδίως στις νεοπλασίες και preneoplasias του οισοφάγου. Ως εκ τούτου, αξιολογούνται πρώτα την έκφραση των επιπέδων LTBP4 σε διαφορετικές μικροσυστοιχίες καρκινικού ιστού με ανοσοϊστοχημική χρώση.

Ανάλυση των ιστών του ασθενούς διαφόρων αδενοκαρκινώματα του γαστρεντερικού σωλήνα αποκάλυψε σημαντικές προς τα κάτω ρύθμιση των LTBP4 σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς του ίδιου οργάνου . Λεπτομερώς, τα αδενοκαρκινώματα του οισοφάγου έδειξε 37%, του στομάχου 17%, του παγκρέατος 9%, του λεπτού εντέρου 4% και του παχέος εντέρου στο 22% έκφραση LTBP4 (Σχήμα 1Α).

Α) Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης LTBP4 ήταν αξιολογείται με ανοσοϊστοχημεία σε μικροσυστοιχίες ιστό του ασθενούς αδενοκαρκινώματα (AC) του οισοφάγου, του στομάχου, του παγκρέατος, του λεπτού εντέρου και του παχέος εντέρου σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό του ίδιου οργάνου. Β) Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης LTBP4 αξιολογήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία σε ιστούς ασθενών του οισοφάγου εξέλιξης του καρκίνου σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς του οισοφάγου σε μικροσυστοιχίες ιστό. Γ) Ανοσοϊστοχημική αξιολόγηση της έκφρασης LTBP4 στην κανονική του οισοφάγου, του αδενοκαρκινώματος του οισοφάγου (ΑΗΚ) το στάδιο ΙΙ, ΑΗΚ σταδίου ΙΙΙ και σε μια μακρινή μετάσταση στους λεμφαδένες. Μαύρα βέλη δείχνουν LTBP4-θετική χρώση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ± τυπική απόκλιση και * ρ & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01 έναντι φυσιολογικού ιστού. ιστογράμματα: 50 μm

Η

Επίσης, έχουμε επικεντρωθεί με μεγαλύτερη ακρίβεια στην έκφραση LTBP4 σε νεοπλασίες και preneoplasias του οισοφάγου (Εικόνα 1Β).. Του καρκίνου παρακείμενο φυσιολογικό ιστό που εμφανίζεται στο 43%, υπερπλασία 22%, καρκινώματος

in situ

8%, ΑΗΚ 37%, μικρό κελί αδιαφοροποίητο καρκίνωμα 3%, ESCC 4% και μακρινή μετάσταση 4% έκφρασης LTBP4 σε σύγκριση με το φυσιολογικό οισοφαγικό ιστός. Σε σύγκριση με την κανονική έκφραση οισοφαγικός LTBP4 ιστού επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω σημαντικά σε ιστό παλινδρομικής οισοφαγίτιδας (38%) και τη χρόνια φλεγμονή (39%) των ασθενών, και οι δύο παράγοντες κινδύνου για την ΑΗΚ (Εικόνα 1Β).

φυσιολογικό οισοφαγικό ιστό σαφώς έκφραση LTBP4 στα επιθηλιακά κύτταρα του οισοφάγου και λιγότερο εμφανές στα λεμφοκύτταρα που κατοικούν στο χόριο (Σχήμα 1C και Υποστήριξη Πληροφορίες S1). LTBP4 δεν εκφράστηκε στο στάδιο ΙΙ και το στάδιο ΙΙΙ EACS (Σχήμα 1C). Στην μακρινή μετάσταση στους λεμφαδένες, τα καρκινικά κύτταρα έδειξαν επίσης καμία έκφραση LTBP4, ενώ η γύρω μεσεγχυματικά ιστό έδειξε ξεκάθαρα έκφραση LTBP4 (Σχήμα 1C). Ωστόσο, δεν συσχετίσεις μεταξύ των επιπέδων έκφρασης LTBP4 και κλινικές παραμέτρους, όπως παθολογικές στάδιο ή μεταστατική κατάσταση βρέθηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Re-έκφραση της LTBP4 σε οισοφαγικού κυτταρικές γραμμές καρκινώματος μειώνει την ικανότητα κυτταρικής μετανάστευσης

έκφραση LTBP4 σημαντικά προς τα κάτω σε ΑΗΚ και ESCC. Για να ερευνηθεί ο ρόλος του LTBP4 σε καρκίνο του οισοφάγου πιο λεπτομερή, OE33, μια κυτταρική σειρά που προέρχεται από την ΑΗΚ, και KYSE180, μία κυτταρική σειρά που προέρχεται από ESCC, αναλύθηκαν.

Και οι δύο κυτταρικές σειρές παρουσίασαν παρόμοιες έκφραση LTBP4 στο μεταγραφικό και πρωτεϊνικό επίπεδο (Υποστήριξη Πληροφορίες S1). Παροδική επανέκφραση του LTBP4 (αποτελεσματικότητας επιμόλυνσης 40-50%) σε OE33 και KYSE180 κύτταρα οδήγησε σε μια τεσσάρων και εννέα φορές προς τα πάνω ρύθμιση του LTBP4, αντίστοιχα (Στήριξη Πληροφορίες S1). Οι μικρότερες ζώνες μετά από παροδική επανέκφραση του LTBP4 μπορεί να αντικατοπτρίζει λείπει μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, ένα αποτέλεσμα που περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Μερική πρωτεόλυση μπορεί να αποκλειστεί, επειδή LTBP4 και c-myc μπορεί να ανιχνευθεί ως μία πρωτεΐνη σύντηξης. Η παροδική επανέκφραση του LTBP4 τροποποίησε την ικανότητα των κυττάρων OE33 και KYSE180 να μεταναστεύσουν. Μετά από 24 ώρες η απόσταση μετανάστευσης των κυττάρων OE33 μειώθηκε κατά 5% (p = n.s.) και των KYSE180 κυττάρων κατά 30% (ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2Α). χρώση ανοσοφθορισμού αποκάλυψαν ότι LTBP4 και c-myc θετικά κύτταρα ορίζονται τα σύνορα του ελεύθερου κενό κελί. Μόνο μη επιμολυσμένα κύτταρα μετανάστευσαν στο ελεύθερο διάκενο κυττάρων (Σχήμα 2Β). Η βιωσιμότητα των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων δεν άλλαξε μετά την εκ νέου έκφραση του LTBP4 σε OE33 και KYSE180 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α) απόσταση Μετανάστευση OE33 και KYSE180 κυττάρων μετά από παροδική επιμόλυνση με είτε pcDNA6 ως μάρτυρας ή pcDNA6-LTBP4 μέσα σε 24 ώρες. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές. Τα σύμβολα αντιπροσωπεύουν τα αποτελέσματα του κάθε πειράματος και τα γραφήματα τεκμηριώνουν τις αντίστοιχες μέσες τιμές. Οι δοθείσες σημασίες:

#p = n.s. και * ρ & lt? 0,05. Β) Αντιπροσωπευτικά χρώση ανοσοφθορισμού της δοκιμασίας μετανάστευσης πραγματοποιήθηκαν με KYSE180 κύτταρα εκ νέου εκφράζουν LTBP4. LTBP4 (πράσινο) και c-myc (κόκκινο) θετικά κύτταρα (κίτρινο) ορίζονται τα σύνορα του ελεύθερου κενό κελί. Μόνο μη επιμολυσμένα κύτταρα μετανάστευσαν στο ελεύθερο διάκενο κύτταρο. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (μπλε). Το βέλος δείχνει την κατεύθυνση της μετανάστευσης. Bar γράφημα:. 50 μm

Η

θεραπεία απομεθυλίωση με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης επάγει έκφραση LTBP4, ενώ η έκφραση του ΤΟΡ-β1 δεν αλλάζει

Επιγενετικές τροποποιήσεις, όπως μεθυλίωση των υπολειμμάτων κυτοσίνης στο αλληλουχίες CpG, τα λεγόμενα CpG νησίδες, είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν την απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε καρκινικά κύτταρα [20]. Μετά τη θεραπεία με απομεθυλίωση έκφραση LTBP4 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη προκλήθηκε σε OE33 και KYSE180 κύτταρα κατά περισσότερο από 150% και 60%, αντίστοιχα (Σχήμα 3Α), ενώ η αγωγή απομεθυλίωση με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης δεν το έκανε μεταβλήθηκε σημαντικά ΤΟΡ-β1 έκφραση σε αμφότερες οισοφάγου καρκινικές κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Β).

Α) ανάλυση έδειξε qPCR επαγωγή της έκφρασης LTBP4 σε OE33 και KYSE180 κυττάρων μετά κατεργασία απομεθυλίωση με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη. Β) Ανάλυση qPCR δεν έδειξαν σημαντικές μεταβολές στην έκφραση του ΤΟΡ-β1 σε OE33 και KYSE180 κυττάρων μετά κατεργασία απομεθυλίωση με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη. Μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησίμευσαν ως έλεγχος. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές και υπολογίστηκε η μέση τιμή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ± τυπική απόκλιση και * ρ & lt?. 0,05 έναντι ελέγχου

Η

Οι περιοχές LTBP4 προαγωγός υπερμεθυλίωση σε κυτταρικές σειρές οισοφαγικού καρκινώματος

Εμείς αναλύονται οι προβλεπόμενες ανεξάρτητες περιοχές υποκινητή της LTBP4L και LTBP4S στη Ν-τερματική περιοχή του γονιδιωματικού

LTBP4

αλληλουχία DNA [12]. Στην περιοχή αυτή έχουν οκτώ CpG νησίδες (I-VIII) έχουν βρεθεί, συμπεριλαμβανομένων δύο CpG νησίδες (Ι και II) εντός του προβλεπόμενου υποκινητή LTBP4L και τρία νησιά CpG (IV-VI) που βρίσκεται εντός της προβλεπόμενης υποκινητή LTBP4S. Νησίδες CpG III, VII και VIII βρίσκονται στο άμεσο περιβάλλον των δομών υποκινητή (Σχήμα 4).

Η κατάσταση μεθυλίωσης στις περιοχές υποκινητή υποθετική LTBP4 αναλύθηκε με κλωνική αλληλουχίας όξινο θειώδες στην OE33 και KYSE180 κύτταρα. Οκτώ CpG νησίδες αναγνωρίστηκαν και τουλάχιστον δέκα κλώνοι αλληλουχήθηκαν για κάθε κυτταρική γραμμή. Το ποσοστό της μεθυλίωσης σε κάθε νησί CpG απεικονίζεται ως γράφημα πίτας. Τα εξόνια απεικονίζονται με μαύρα κουτιά και υποστηρικτές LTBP4 με κόκκινες γραμμές. Η μετάφραση είναι θέσεις εκκίνησης υποδεικνύεται (ATG). Οι διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν εναλλακτικό μάτισμα του LTBP4.

Η

Λεπτομερής ανάλυση της κατάστασης μεθυλίωσης των νήσων CpG σε OE33 και KYSE180 αποκάλυψε ότι στα νησιά CpG (III, VII, VIII) μακρινές στις περιοχές υποκινητή μεθυλίωση ήταν σπάνια (& lt? 3%) βρέθηκε (Σχήμα 4)

Τα νησιά CpG που βρίσκονται εντός του υποκινητή LTBP4L ήταν υπερμεθυλίωση (Σχήμα 4).. Σε OE33 και KYSE180 κύτταρα νησί CpG μου έδειξε ένα μέσο μεθυλίωσης περίπου 50% και 80% και το νησί CpG ΙΙ 45% και 60%, αντίστοιχα (Σχήμα 4).

Τα νησιά CpG που βρίσκονται εντός του υποκινητή LTBP4S εμφανίζονται διαφορετικά πρότυπα μεθυλίωσης. CpG νησί V και VI παρουσίασαν λιγότερο από 2% μεθυλίωση, ενώ CpG νησί IV έδειξε OE33 και KYSE180 κύτταρα κατά μέσο όρο μεθυλίωση του περίπου 40% και 30%, αντίστοιχα (Σχήμα 4).

Αναγνώριση πιθανών παραγόντων μεταγραφής για LTBP4L και LTBP4S

Περαιτέρω

in silico

ανάλυση με βάση το διαδίκτυο εργαλεία αναζήτησης MatInspector [21], TFSEARCH [22] και υποστηρικτής 2.0 [23] έγιναν για να εξετάσει αν η αλληλουχία γονιδιώματος του CpG νησίδες I, II και IV εντός περιοχές προαγωγού LTBP4L και LTBP4S περιέχουν ρυθμιστικά στοιχεία. Κανένα από τα κοινά στοιχεία υποκινητή, όπως TATA- ή CCAAT-κουτιά βρέθηκαν, το οποίο είναι σύμφωνο με προηγούμενα ευρήματα [12]. Αποδείχθηκε ότι οι περιοχές υποκινητή της LTBP4L και LTBP4S περιέχουν αρκετές θέσεις XCPE καθώς και θέσεις σύνδεσης για διαφορετικούς παράγοντες μεταγραφής [12]. Νησίδες CpG I, II, IV και δεν περιέχουν θέσεις XCPE, αλλά υποθετικές θέσεις σύνδεσης για τους παράγοντες μεταγραφής GATA1, Smad3, E2F4, SP1, και MZF-1 βρέθηκαν (Υποστήριξη Πληροφορίες S1).

Η λεπτομερής εξέταση από τα μοτίβα μεθυλίωσης του νησιού CpG μου αποκάλυψε δύο εξαιρετικά μεθυλιωμένων δινουκλεοτιδίων CpG και στις δύο κυτταρικές σειρές ως μέρος μιας θέσης δέσμευσης υποτιθέμενη GATA1 (Σχήμα 5).

στο silico

ανάλυση των περιοχών υποκινητή LTBP4 εντόπισε υψηλά μεθυλιωμένη θέση δέσμευσης για GATA1 στον προαγωγό LTBP4L της OE33 και KYSE180 κύτταρα. Οι άκρως μεθυλιωμένα θέσεις σύνδεσης για το SP1 και E2F4 βρέθηκε στον προαγωγέα LTBP4S των δύο κυτταρικών σειρών. Μια θέση δέσμευσης για Smad3 εντοπίστηκε σε κοντινή απόσταση. Η κατάσταση μεθυλίωσης αναλύθηκε με αλληλούχιση κλωνική όξινο θειώδες και τουλάχιστον δέκα κλώνοι αλληλουχήθηκαν για κάθε κυτταρική γραμμή. Το ποσοστό της μεθυλίωσης απεικονίζεται ως γράφημα πίτας. Τα εξόνια απεικονίζονται με μαύρα κουτιά και υποστηρικτές LTBP4S και LTBP4L με κόκκινες γραμμές. Η μετάφραση είναι θέσεις εκκίνησης υποδεικνύεται (ATG). Οι διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν εναλλακτικό μάτισμα του LTBP4.

Η

CpG νησιού IV δύο εξαιρετικά μεθυλιωμένων δινουκλεοτιδίων CpG βρέθηκαν σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 5). Αυτά τα δινουκλεοτίδια CpG ταυτοποιήθηκαν ως μέρος της υποθετικής θέσεως συνδέσεως είτε του παράγοντα μεταγραφής SP1 ή E2F4. Επιπλέον, 13 νουκλεοτίδια ανοδικά από το εξαιρετικά μεθυλιωμένων CpG δινουκλεοτιδίων θέση δέσμευσης για Smad3 ταυτοποιήθηκε (Σχήμα 5).

Χρησιμοποιήσαμε

in vitro μελέτες

δραστικότητα του παράγοντα μεταγραφής για να αξιολογηθεί κατά πόσο η μεταγραφή παράγοντες GATA1 , SP1, Smad3 και E2F4, αναγνωρίζονται ως πιθανά ρυθμιστικά στοιχεία σε νησίδες CpG Ι και IV, ήταν σε θέση να τροποποιούν τη δραστηριότητα των υποκινητών LTBP4L ή LTBP4S. Η έκφραση των παραγόντων μεταγραφής επιβεβαιώθηκε με SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση (Υποστηρικτικά Πληροφορίες S1).

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, παρατηρήσαμε ότι GATA1 ελαφρώς αυξημένη δραστικότητα προαγωγού LTBP4L, αλλά δεν μετέβαλε δραστηριότητα υποκινητή LTBP4S ( Σχήμα 6Α).

ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με pGL4.10-LTBP4L ή pGL4.10-LTBP4S και

Renilla

λουσιφεράσης φορέα έκφρασης για ομαλοποίηση. Τα κύτταρα επίσης συν-επιμολύνθηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις του Α) ένας φορέας έκφρασης GATA1, Β) ένα φορέα έκφρασης SP1, γ) ένα φορέα έκφρασης Smad3 ή Δ) ένας φορέας έκφρασης E2F4. Μετά από 24 ώρες τα κύτταρα λύθηκαν και προσδιορίστηκε λουσιφεράσης δραστηριότητες. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές και υπολογίστηκε η μέση τιμή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ± τυπική απόκλιση.

Η

Παρατηρήσαμε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αύξηση είτε της δραστηριότητας υποκινητή LTBP4L ή LTBP4S από το SP1 και Smad3, αλλά η αύξηση δραστηριότητα υποκινητή LTBP4S ήταν πολύ πιο σημαντικό από ό, τι η δραστηριότητα υποκινητή LTBP4L αυξάνεται (Σχήμα 6Β και το Σχήμα 6C). δραστηριότητα υποκινητή LTBP4L δεν αλλοιώνεται από E2F4, αλλά E2F4 αυξήθηκε ελαφρώς δραστηριότητα υποκινητή LTBP4S (Σχήμα 6D).

Για να διερευνήσουν μια πιθανή λειτουργία ενισχυτή της GATA1, SP1, Smad3 και E2F4, προσδιορίσαμε επίσης τη δραστηριότητα της LTBP4L και υποκινητές LTBP4S συνδεδεμένη με έναν ελάσσονα προαγωγέα.

δεν υπήρξαν εμφανείς αλλαγές με GATA1, SP1, Smad3 (τα δεδομένα δεν φαίνονται) ή E2F4 (Σχήμα 7) σχετικά με τη δραστηριότητα υποκινητή LTBP4L και GATA1, SP1 ή Smad3 σε LTBP4S υποκινητή δραστηριότητα, όταν προαγωγοί LTBP4 συνδέθηκαν με έναν ελάχιστο προαγωγέα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, E2F4 οδήγησε σε μια 14-πλάσια αύξηση της δραστικότητας υποκινητή LTBP4S, όταν συνδέεται με ένα ελάχιστο προαγωγό (Σχήμα 7).

ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με pGL4.23-LTBP4L ή pGL4.23-LTBP4S και ένα

Renilla

λουσιφεράσης φορέα έκφρασης για την εξομάλυνση. Τα κύτταρα επίσης συν-επιμολύνθηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις ενός φορέα έκφρασης E2F4. Μετά από 24 ώρες τα κύτταρα λύθηκαν και προσδιορίστηκε λουσιφεράσης δραστηριότητες. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές και υπολογίστηκε η μέση τιμή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ± τυπική απόκλιση.

Η

Συζήτηση

Η εξωκυττάρια πρωτεΐνη μήτρα αδρανούς ΤΟΡ-β δεσμευτική πρωτεΐνη 4 (LTBP4) ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ανθρώπινα και ποντικού πορογενές καρκίνωμα

in situ

, επεμβατική μαστικά καρκινώματα [17], [24], καθώς και σε κυνικός μαστικά καρκινώματα [25], υποδηλώνοντας μια πιθανή φυλογενετική συντηρημένη ρύθμιση της έκφρασης LTBP4. Στην ηλικία των 6-8 μηνών Ltbp4S knockout ποντίκια αναπτύσσουν παχέος αδενοκαρκινώματα [26]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η απουσία του LTBP4 μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη των επιθηλιακών νεοπλασιών.

Τώρα βρήκαμε ότι LTBP4 ρυθμίζεται μειωτικά σε διάφορα ανθρώπινα αδενοκαρκινώματα του γαστρεντερικού σωλήνα, καθώς επίσης και σε νεοπλασίες και preneoplasias του οισοφάγου .

Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν μοριακοί βιοδείκτες για διάγνωση ή για τη διαστρωμάτωση και την αξιολόγηση του καρκίνου του οισοφάγου κινδύνου που χρησιμοποιούνται στην κλινική πράξη [27]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν LTBP4 ως πιθανό υποψήφιο γονίδιο για ένα πάνελ βιοδείκτη για νεοπλασίες και ειδικά preneoplasias του οισοφάγου ιστού.

LTBP4 δεν είναι το μόνο LTBP η οποία σχετίζεται με το σχηματισμό των διαφόρων τύπων καρκίνου [13], [14 ], [15], [16], [18], [28]. Σε νεοπλάσματα του ήπατος, των ωοθηκών και νευροενδοκρινών όγκων του πεπτικού συστήματος έκφρασης LTBP1 μειώνεται [14], [16], [18]. Ltbp3 ρυθμίζεται μειωτικά σε ογκο-ειδικών πληθυσμών Τ κυττάρων ενεργοποιημένων ποντικού σε σύγκριση με παρθένα κύτταρα Τ [28]. Σε ρινοφαρυγγικά καρκινώματα και έκφραση ESCC LTBP2 μειώνεται και επανέκφραση του LTBP2 σε καρκινικά κύτταρα ESCC καταστέλλει νεοπλασματική ικανότητα

in vitro

και

in vivo

[13], [15]. Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν παρόμοια επίδραση για LTBP4

in vitro

. Re-έκφραση της LTBP4 σε κύτταρα EAC και ESCC μειώνει την ικανότητα κυτταρικής μετανάστευσης, ενώ η βιωσιμότητα των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παραμένουν αμετάβλητα. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι LTBP4 παίζει ένα συγκεκριμένο ρόλο στην προώθηση της ΑΗΚ και ESCC κινητικότητα των κυττάρων. Ωστόσο, για να ανακαλύψετε τις υποκείμενες μοριακών μηχανισμών που οδηγούν σε μειωμένη κινητικότητα των κυττάρων απαιτούνται περαιτέρω έρευνες.

Μια καλά μελετημένη μεταγραφικό ρυθμιστικό μηχανισμό, που συχνά μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια του κακοήθους μετασχηματισμού, είναι η μεθυλίωση των CpG νησίδων σε υποστηρικτές [29 ]. Προηγουμένως, δείχθηκε ότι η μεθυλίωση προαγωγού είναι υπεύθυνη για τη μειωμένη έκφραση του LTBP2 σε ρινοφαρυγγικού καρκινώματος και ESCC [13], [15]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η θεραπεία απομεθυλίωση οδηγεί σε προς τα πάνω ρύθμιση LTBP4 στις γραμμές της ΑΗΚ και ESCC κυττάρων και υψηλότερη έκφραση LTBP4 μειώνει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. θεραπεία απομεθυλίωση αποκαθιστά έκφραση LTBP2 σε κυτταρικές σειρές ESCC και υψηλή έκφραση LTBP2 συσχετίζεται με καλύτερη επιβίωση των ασθενών ESCC [13]. Έτσι, επιγενετική θεραπεία του καρκίνου του οισοφάγου με παράγοντες υπομεθυλίωσης θα μπορούσε να είναι μια νέα θεραπευτική προσέγγιση, δεδομένου ότι επιγενετικές θεραπείες με azacitidine αποδείξει πρώτα ελπιδοφόρα αποτελέσματα σε ασθενείς με μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα, τη βελτίωση της ποιότητας ζωής τους και την επιβίωση [30]. Φυσικά, αυτή η νέα πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση του καρκίνου του οισοφάγου χρειάζεται περαιτέρω έρευνες.

LTBP4L και LTBP4S προβλέπεται να να μεταγραφεί από τον έλεγχο δύο ανεξάρτητων υποκινητών [12]. Λεπτομερείς αναλύσεις των προτύπων μεθυλίωσης των δύο υποκινητών σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από την ΑΗΚ και ESCC αποκαλύπτουν υψηλά μεθυλιωμένη υποθετικές θέσεις πρόσδεσης για διαφορετικούς παράγοντες μεταγραφής, όπως GATA1, Smad3, E2F4 και SP1.

Ένα εξαιρετικά μεθυλιωμένα υποθετική θέση δέσμευσης για GATA1 προσδιορίζεται στην περιοχή προαγωγού LTBP4L. Οι δυνητικές θέσεις σύνδεσης για GATA1 βρίσκονται επίσης στην αναρροϊκή περιοχή του LTBP1S [31], υποδηλώνοντας μια πιθανή ρύθμιση των διαφόρων ισομορφών LTBP με GATA1. Ωστόσο, μας

in vitro μελέτες

δραστηριότητα μεταγραφικού παράγοντα δείχνουν μόνο μια μικρή επίδραση επαγωγής για GATA1 στην έκφραση LTBP4L και καμία επίδραση στην έκφραση LTBP4S.

Η περιοχή του υποκινητή LTBP4S περιέχει εξαιρετικά μετουσιωμένο υποθετικές θέσεις πρόσδεσης για ο παράγοντες μεταγραφής SP1 και E2F4 και επιπλέον ένα υποθετική θέση δέσμευσης για Smad3 εντοπίζεται 13 νουκλεοτίδια ανοδικά από τα υψηλά μεθυλιωμένων δινουκλεοτιδίων CpG. παράγοντες μεταγραφής SP1 είναι σημαντικοί ρυθμιστές των διαφόρων πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας [32] και θέσεις πρόσδεσης Smad3 είναι αναγκαία για την επαγωγή της δραστηριότητας του ανθρώπου LTBP3 υποκινητή από τον TGF-β1 [33].

in vitro μελέτες

δραστικότητα του παράγοντα μεταγραφής μας δείχνουν ότι το SP1 και Smad3 παρά ρυθμίζουν LTBP4S από LTBP4L. Επιπλέον, E2F4 δείχνει το πιο σημαντικό αποτέλεσμα για τη ρύθμιση των LTBP4S, αλλά E2F4 ενεργεί μόνο ως ένας ισχυρός ρυθμιστής της έκφρασης LTBP4S σε συνδυασμό με ένα κουτί ΤΑΤΑ ως ρυθμιστικό στοιχείο. Για τις γνώσεις μας, τα αποτελέσματα αυτά είναι τα πρώτα για να αποκαλύψει μια σύνδεση μεταξύ LTBPs και του παράγοντα μεταγραφής E2F4. Προηγούμενες μελέτες εντοπιστεί ένα σημαντικό ρόλο για E2F4 στη ρύθμιση της διαφοροποίησης και της ανάπτυξης των διαφόρων κυττάρων, όπως τα λιποκύτταρα [34], τα ερυθροκύτταρα [35], [36] και του θόλου οστεοβλαστών προγονικών κυττάρων [37]. Ανεπάρκεια της E2f4 σε ποντικούς οδηγεί σε μεταγεννητική θάνατος οφείλεται σε διαταραχή της ανάπτυξης του επιθηλίου των αεραγωγών [38]. Είναι ενδιαφέρον, οι άνθρωποι με μεταλλάξεις στο LTBP4 δείχνουν μια παρόμοια, ελαφρώς ηπιότερο φαινότυπο του πνεύμονα, πεθαίνουν νωρίς στη ζωή οφείλεται σε διαταραχή της πνευμονικής ανάπτυξης και να εμφανίσει κρανιοπροσωπικές ανωμαλίες, συμπεριλαμβανομένων microretrognathia, επίπεδη μεσαίο τμήμα του προσώπου, υποχωρώντας μέτωπο και ευρεία fontanelles [39]. Ltbp4S knockout ποντίκια αναπτύσσουν επίσης μια πνευμονική φαινότυπο με μειωμένη πνευμονική ανάπτυξη, αλλά όχι προφανείς κρανιοπροσωπικές ανωμαλίες [26], [40]. Αυτά τα αποτελέσματα είναι ενθαρρυντικά δείκτες για μια ρυθμιστική επίδραση του E2F4 στην έκφραση LTBP4S, σε σχέση με την πνευμονική ανάπτυξη. Αυτή η ενδιαφέρουσα νέα πτυχή χρειάζεται περαιτέρω έρευνες.

Θα δείξουμε τώρα ότι LTBP4 ρυθμίζεται προς τα κάτω στην ΑΗΚ και ESCC μέσω μεθυλίωσης υποκινητή, που δείχνουν LTBP4 ως πιθανό προγνωστικό βιοδείκτη που μπορούν να εμπλουτίσουν θεραπευτικές επιλογές. Επιπλέον, έχουμε εντοπίσει το μεταγραφικό παράγοντα E2F4 ως νέα ισχυρή ρυθμιστική αρχή για την έκφραση LTBP4S.

Υλικά και Μέθοδοι

μικροσυστοιχίες ιστών, ανοσοϊστοχημική χρώση και σκοράροντας

Ιστός μικροσυστοιχίες (TMAs) για οισοφάγου εξέλιξης του καρκίνου, πολλαπλές καρκίνο του στομάχου, καρκίνο του παγκρέατος, καρκίνου του λεπτού εντέρου και καρκινώματος του κόλου που το καθένα περιλαμβάνει επιπλέον δείγματα ιστού του φυσιολογικού πλακώδους επιθηλίου και υποβλεννογόνο του esopagus, η κανονική γαστρικό καρδιακή, η κανονική πάγκρεας, η κανονική λεπτό έντερο επιθηλιακά κύτταρα και βλεννογόνου και φυσιολογικό κόλον ήταν αγοράστηκε από την US Biomax (USA). Τα τμήματα TMA βάφτηκαν με ένα πρωτεύον αντίσωμα που εγείρεται έναντι ενός Ν-τερματικού θραύσματος του LTBP4 (Υποστηρικτικά Πληροφορίες S1). Το αντιγόνο ανάκτηση έγινε με μικροκύματα σε κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0) για 10 λεπτά. Πρωτογενής αντίσωμα αραιώθηκε σε 1:100 και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Το αντίσωμα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας την επίβλεψη RED 2 σετ AP-πολυμερές σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (DCS Καινοτόμες Diagnostik-Systeme, Γερμανία). Τα τμήματα TMA Ακολούθησε χρώση χρησιμοποιώντας αιματοξυλίνη, αφυδατωμένα, και καλύφθηκαν. Για θετική ανοσοδραστικότητα, διαβάθμιση έγινε ημιποσοτικά σε κλίμακα πέντε βαθμίδων, όπου 0 = λιγότερο από 10%, 1 = 10-25%, 2 = 25-50%, 3 = 50-75%, 4 = πάνω από 75% θετική για χρώση LTBP4. Δεν έγινε προσπάθεια να τα αποτελέσματα βασίζονται σε βαθμό χρώσης ένταση του χρώματος, λόγω της εγγενούς υποκειμενικότητας μιας τέτοιας μέτρησης, και την ευαισθησία του στις διακυμάνσεις μεταξύ ερευνητές. Η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε ανεξάρτητα από δύο έμπειρους ερευνητές οι οποίοι δεν γνώριζαν την σχετική κλινικές πληροφορίες και τα αντικρουόμενα αποτελέσματα επιλύθηκαν σε ένα μικροσκόπιο συζήτηση.

Οι κυτταρικές σειρές

OE33, μια κυτταρική γραμμή που προέρχεται από αδενοκαρκίνωμα του οισοφάγου, αγοράστηκε από την Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών κυττάρων (ECACC, UK). KYSE180, μια κυτταρική σειρά που προέρχεται από οισοφαγικό καρκίνωμα πλακώδους κυττάρου, αγοράστηκε από την Γερμανική Συλλογή Μικροοργανισμών και Καλλιεργειών Κυττάρων (DSMZ, Germany). Όλες οι κυτταρικές σειρές οισοφαγικού καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου και 1% 10.0000 U /ml πενικιλλίνη /10,000 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C και 5% CO

2.

Επιμόλυνση και δοκιμασία μετανάστευσης

Ανθρώπινο cDNA της LTBP4L (NM_001042544) και LTBP4S (NM_001042545) αγοράστηκαν από ΟηΟεηε (ΗΠΑ) και κλωνοποιήθηκε (εναύσματα για τη Στήριξη Πληροφορίες S1) σε ένα pcDNA6 /

myc-

του διάνυσμα (Life Technologies, Germany). OE33 και KYSE180 κύτταρα σπάρθηκαν σε 1,5 × 10

4 /πηγάδι και 2 × 10

4 /καλά, αντίστοιχα, σε Πολιτισμός-Ένθετα για τις δοκιμασίες μετανάστευσης (ibidi, Γερμανία) και παροδικά επιμολυσμένα με 1: 1 μείγμα /

myc-His

φορείς έκφρασης pcDNA6 για LTBP4L και LTBP4S 24 ώρες αργότερα. Ο Πολιτισμός-Εισάγει αφαιρέθηκαν 18 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η μετανάστευσαν απόσταση των κυττάρων μετρήθηκε σε 0 h, 3 h, 6 h, 12 h και 24 h μετά την απομάκρυνση της καλλιέργειας-Εισάγει. Η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης προσδιορίστηκε με ανοσοφθορισμό και της πρωτεΐνης έκφρασης με SDS-PAGE και ανοσοαποτύπωση.

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν 24 ώρες μετά την απομάκρυνση του Πολιτισμού-Εισάγει για 15 λεπτά σε 4% παραφορμαλδεΰδη και αποκλείστηκαν για 60 λεπτά σε 5% αλβουμίνη βόειου ορού /0.3% Triton Χ-100 σε PBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (Υποστηρικτικά Πληροφορίες S1) για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα προς Alexa Fluor 488 ή Cy3 (Life Technologies, Germany). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (Life Technologies, Germany).

Έκφραση RNA Ανάλυση

Συρρέουσες καλλιέργειες του οισοφαγικού κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση του RNA με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (PEQLAB Biotechnologie, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις RNA και καθαρότητες προσδιορίσθηκαν φασματοφωτομετρικά. Αντίστροφη μεταγραφή εκτελέστηκε με ολίγο dT πριμοδότες και SuperScript III της αντίστροφης μεταγραφάσης (Life Technologies, Germany) χρησιμοποιώντας 1 μα ολικού RNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα ληφθέντα δείγματα cDNA χρησιμοποιήθηκαν για ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου ανάλυση (qPCR). qPCR έγινε χρησιμοποιώντας την Platinum® Ποσοτική PCR SuperMix UDG-w /ROX (Life Technologies, Germany). Εις τριπλούν αντιδράσεις στήθηκαν και τα προϊόντα qPCR επαληθεύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. LTBP4 και ΤΟΡ-β1 ποσοτικοποίηση των επιπέδων mRNA υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την πρότυπη μέθοδο καμπύλη. Πρότυπες καμπύλες δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας δεκαπλάσιες αραιώσεις ενός εξωτερικού ελέγχου. Τα χρησιμοποιημένα εκκινητών και ανιχνευτών (Eurofins MWG Operon, Γερμανία) που αναφέρονται στο Υποστήριξη Πληροφορίες S1.

SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση

Συρρέουσες καλλιέργειες των οισοφάγου κύτταρα συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris -ΗΟΙ, ρΗ 7.5? 150 mM NaCl? 1% ΝΡ-40? 0,5% Na-δεοξυχολικό? 0,1% SDS), συμπληρωμένο με αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Roche, Ελβετία). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρωματομετρικά με δοκιμασία Bradford χρησιμοποιώντας το Protein Assay Kit (Biorad, USA). 100 μα συνολικών πρωτεϊνών των κυττάρων διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 7,5%) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Macherey-Nagel, Γερμανία). Μετά από αποκλεισμό με 5% σκόνη γάλακτος ή 5% BSA σε TBST, πρωτογενή αντισώματα (Υποστηρικτικά Πληροφορίες S1) χρησιμοποιήθηκαν για την ολονύκτια επώαση των μεμβρανών νιτροκυτταρίνης. Αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αντιγόνα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας συζευγμένο με υπεροξειδάση αντι-rabbit- ή αντι-ποντικού-αντισώματος (Jackson ImmunoResearch, USA). σήμα χημικής φωταύγειας μετρήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού μέτρησης ImageLab (Biorad, USA).

Η μεθυλίωση ανάλυση

Γονιδιωματικό DNA από καρκίνο του οισοφάγου κυτταρικές γραμμές εκχυλίστηκαν με τυποποιημένες διαδικασίες και να τροποποιηθούν χρησιμοποιώντας την EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Δύο περιοχές υποκινητή της LTBP4 ταυτοποιήθηκαν προηγουμένως [12]. Χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα περιήγησης UCSC γονιδίωμα [41] οκτώ νησιά CpG (περιεκτικότητα σε CG & gt? 50%) εντοπίστηκαν εντός των περιοχών υποκινητή. Ειδικούς μεθυλίωσης εναρκτήρες σχεδιάστηκαν με MethPrimer [42]. Τα χρησιμοποιημένα εναύσματα που απαριθμούνται στο Στήριξη Πληροφορίες S1. Τα ενισχυμένα κατεργασμένου με όξινο θειώδες CpG νησίδων στη συνέχεια υποκλωνοποιήθηκε εντός του PGM-Τ Easy (Promega, USA).