Αφηρημένο

Η έκφραση της πρωτεΐνης φωσφατάση 32 (PP32, ANP32A) είναι χαμηλή σε χαμηλής διαφοροποίησης του παγκρέατος καρκίνοι και συνδέεται με τα επίπεδα του HuR (ELAV1), ένα δείκτη για προγνωστική απόκριση γεμσιταβίνη. Σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, η υπερέκφραση του εξωγενούς pp32 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων, την υποστήριξη μακράς αναγνωρισμένο ρόλο του ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο του παγκρέατος. Σε χημειοθεραπευτικό δοκιμασίες ευαισθησίας διαλογής, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν pp32 ήταν επιλεκτικά ανθεκτικός στον ανάλογα νουκλεοσιδίου γεμκιταβίνη και κυταραβίνη (ARA-C), αλλά ευαισθητοποιήθηκαν σε 5-φθοριοουρακίλη? Αντιστρόφως, φίμωση pp32 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα αυξημένη ευαισθησία γεμσιταβίνη. Οι κυτταροπλασματικές επίπεδα pp32 αυξήθηκε μετά τα καρκινικά κύτταρα σε επεξεργασία με ορισμένους στρεσογόνους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των gemcitabine. pp32 υπερέκφραση μείωσε την σύνδεση των HuR με το mRNA που κωδικοποιεί το gemcitabine μεταβολίζουν ένζυμο κινάση δεοξυκυτιδίνης (dCK), προκαλώντας μια σημαντική μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης dCK. Ομοίως, έκτοπη έκφραση pp32 προκάλεσε μείωση HuR πρόσδεση του mRNA που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που προάγουν όγκο (π.χ., VEGF και HuR), ενώ φίμωση pp32 ενισχύεται δραματικά η σύνδεση αυτών των στόχων mRNA. Χαμηλή pp32 πυρηνική έκφραση συσχετίστηκε με υψηλού βαθμού όγκους και η παρουσία της μετάστασης λεμφαδένα, σε σύγκριση με τους όγκους των ασθενών με υψηλή έκφραση της πυρηνικής pp32. Αν και pp32 επίπεδα έκφρασης δεν ενισχύουν την προβλεπτική ικανότητα των κυτταροπλασματικών κατάσταση HuR, τα επίπεδα πυρηνικής pp32 και κυτταροπλασματικά επίπεδα HuR σχετίζεται σημαντικά σε δείγματα ασθενών. Έτσι, η παροχή νέων απόδειξη ότι η λειτουργία καταστολέα όγκου του pp32 μπορεί να αποδοθεί στην ικανότητά του να διασπούν την δέσμευση HuR να στοχεύσει mRNA που κωδικοποιούν πρωτεΐνες κλειδιά για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου

Παράθεση:. Williams TK, Costantino CL , Bildzukewicz NA, Richards NG, Rittenhouse DW, ο Αϊνστάιν L, et al. (2010) pp32 (ANP32A) Έκφραση Αναστέλλει καρκίνο του παγκρέατος ανάπτυξη των κυττάρων και προκαλεί Τζεμσιταμπίνη Αντίσταση διαταράσσοντας HuR δέσμευση σε mRNA. PLoS ONE 5 (11): e15455. doi: 10.1371 /journal.pone.0015455

Επιμέλεια: Janine Santos, Πανεπιστήμιο Ιατρικής και Οδοντιατρικής του Νιου Τζέρσεϊ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26, Ιουλίου, 2010? Αποδεκτές: 26 του Σεπτεμβρίου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 29 Νοέμ του 2010

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της δήλωσης Creative Commons Public Domain που ορίζει ότι, μόλις τοποθετηθεί στο δημόσιο τομέα, το έργο αυτό μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο σκοπό

Χρηματοδότηση:. ΚΑΟ υποστηρίχθηκε από ένα βραβείο Career Development από PanCAN, της αμερικανικής Ένωσης Έρευνας για τον Καρκίνο? κεφαλαίων από την Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία (# IRG-08-060-01), και το Ταμείο για μια θεραπεία, Newtown, PA. MG υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο για τη Γήρανση-εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα, Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα (PDA) είναι μια επιθετική κακοήθεια με κακή πρόγνωση, ακόμη και μετά από χειρουργική εκτομή [1], [2]. Ενώ 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) και γεμσιταβίνη (GEM), με ή χωρίς ακτινοθεραπεία αποτελεί καθιερωμένη θεραπεία στο πλαίσιο της επικουρικής θεραπείας, προσφέρουν μικρή βελτίωση στη μακροπρόθεσμη επιβίωση [3], [4], [5]. Ως εκ τούτου, η καλύτερη κατανόηση των κεκτημένων και

de novo

μηχανισμούς αντίστασης χημειοθεραπευτικών είναι απαραίτητο για εμάς να ενισχύσει τις τρέχουσες στρατηγικές θεραπείας. Αν και πολλά έχουν μάθει για τις μοριακές αλλαγές που εμπλέκονται στη διαδικασία του παγκρέατος ογκογένεσης, υπήρξε μικρή επιτυχία στην κατανόηση του γιατί παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα είναι ανθεκτικά στην χημειοθεραπεία [6], [7].

pp32 ( ANP32A) έχει ένα μοναδικό σχήμα έκφρασης σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους [8], [9], [10], [11]. pp32 λειτουργεί ως ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνη [12], όπως καταδεικνύεται από την ικανότητά της να αναστέλλει

k-ras

μεσολάβηση κακοήθη μετασχηματισμό [13], [14]. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι η έκφραση pp32 συσχετίζεται με την κατάσταση διαφοροποίησης του PDA, με φυσιολογικά επίπεδα έκφρασης ανιχνεύθηκαν σε καλά διαφοροποιημένο όγκους αλλά μείωσε-to-απών επίπεδα έκφρασης σε πτωχά διαφοροποιημένο όγκους [14]. Αυτά τα ευρήματα είναι σημαντικά επειδή ελάχιστα διαφοροποιημένων μορφών PDA είναι και τα δύο κοινά και επιθετικό, αλλά λίγα είναι κατανοητό για τους ειδικούς μοριακά χαρακτηριστικά αυτής της μορφής PDA [15]. Σε προηγούμενη μελέτη, η εισαγωγή pp32 σε μια κακώς διαφοροποιημένο παγκρεατική κυτταρική γραμμή που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την ανάπτυξη ανέστειλαν κυττάρου [14].

pp32 έχει δειχθεί ότι είναι ένας σύντροφος συνδέσεως πολλαπλών σημαντικών πρωτεϊνών [14], [16], [17], [18], [19]. Προηγούμενη εργασία έδειξε ότι pp32 εμπλέκεται σε: 1) σταθεροποίηση ορισμένων mRNAs που φέρουν AU-πλούσια στοιχεία (AREs) στις 5 ‘και 3’ αμετάφραστες περιοχές (UTRs) μέσω της αλληλεπίδρασης του pp32 με το RNA-πρωτεΐνης δέσμευσης HuR (ELAVL1) [18]? 2) η τροποποίηση της ακετυλίωσης ιστόνης μέσω του ρόλου της στην αναστολέας της ακετυλο τρανσφεράσης συγκρότημα (ονομάζεται INHAT) [17]? και 3) η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μέσω της αλληλεπίδρασης της με την φωσφορυλιωμένη μορφή του Rb [18], [19], [20], [21].

Πρόσφατα, ανακαλύψαμε επίσης ότι ένας εταίρος δέσμευσης του pp32, HuR [18], [22], είναι κεντρικής σημασίας για την αποτελεσματικότητα GEM κατά παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [23]. Έχουμε αποδείξει ότι HuR μπορεί να συνδεθεί με δεοξυκυτιδίνη κινάση (dCK) mRNA και έτσι ρυθμίζουν την έκφραση της πρωτεΐνης dCK [23]. Η ένωση αυτή ενισχύεται όταν τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα εκτίθενται σε GEM. Μετά την έκθεση GEM, τα επίπεδα dCK αυξάνουν να μεταβολίζει GEM (ένα ανάλογο νουκλεοζίτη) από ένα προφάρμακο σε ενεργούς μεταβολίτες της. Κατά συνέπεια, οι ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με GEM οποίων η εκτομή όγκων εκφράζεται αυξημένα κυτταροπλασματικά επίπεδα HuR είχε & gt? 7-πλάσια αύξηση στην επιβίωση σε σύγκριση με ασθενείς με εκτομή όγκων που εκφράζουν χαμηλά κυτταροπλασματική HuR [23]. Αυτή η προηγούμενη εργασία παρέχει το πλαίσιο για να εξερευνήσετε HuR και των σχετικών πρωτεϊνών (pp32), στο πλαίσιο των χημειοθεραπευτικών αποτελεσματικότητας [24].

Ο ακριβής ρόλος της pp32 ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο και το ρόλο της στην HuR της μετα-μεταγραφικής ρύθμιση των mRNA στόχος είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Προηγουμένως, pp32 συν-ανοσοκαταβυθίζεται με HuR σε μοντέλα καλλιέργειας κυττάρων και δείχθηκε ότι μοτίβων RNA αναγνώριση pp32 ήταν κρίσιμη για την αλληλεπίδραση αυτή [18]. Περαιτέρω, διαφορετικά οι ερευνητές ισχυρίστηκαν ότι pp32 είναι αυστηρά πυρηνικών ή κυτταροπλασματικών. Brennan

et al.

Περιγράφηκε για πρώτη φορά pp32 ως μια πρωτεΐνη που μπορεί λεωφορείο μεταξύ του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος, μαζί με HuR [18]. Με βάση αυτή την εργασία, επιδιώξαμε να διερευνήσει λειτουργικών δεσμών μεταξύ pp32 και HuR σε σχέση με παγκρέατος επιβίωση των καρκινικών κυττάρων (π.χ., καρκινικών κυττάρων ανάπτυξη και την αποτελεσματικότητα GEM).

Μέθοδοι

Ίδρυση ισογονιδιακές pp32 υπερεκφράζουν και κυτταρικές γραμμές ελέγχου

MIAPaCa2 κύτταρα μορφομετατράπηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA). Πλήρους μήκους cDNA pp32 υποκλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pc3.1 Zeo (Invitrogen), το οποίο διαθέτει ένα γονίδιο αντοχής Zeocin ™ για την επιλογή όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], [23].

Για κάθε δείγμα, 5 uL της υπερέκφραση λύμα ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ αντιγόνου Πρότυπο ΟηΟεηε (1 μg /1 uL) τοποθετήθηκαν με 5 μι 2x SDS Δείγμα Buffer (ΟηΟεηε Rockville, Maryland). Η υπερέκφραση του pp32, HuR, ή κενού φορέα είχαν οδηγείται από έναν pCMV6-Entry πλασμίδιο φορέα που προστίθεται ένα C-τερματικό tag Myc /DDK σε κάθε γονίδιο (ΟηΟεηε). Τα δείγματα παρασκευάστηκαν και στη συνέχεια φορτώθηκαν σε ένα 10% NuPage δις-Τρις Gel και διαχωρίζεται στα 200 volts για 60 λεπτά. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PDVF στα 30 volts για 90 λεπτά. Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε για 1 ώρα. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (θυμιδυλικής συνθάσης, dCK, pp32, HuR, και αλφα-τουμπουλίνης? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) όλη τη νύχτα. Οι συγκεντρώσεις για πρωτογενές αντίσωμα ήταν ως ακολούθως: HuR 1:1000, dCK 1:500, TS και άλφα τουμπουλίνης 1:200. Ανιχνεύθηκαν αντισώματα στη συνέχεια πλύθηκαν με διάλυμα TBST και δευτερεύον αντίσωμα εφαρμόστηκε με αντι-ποντικού IgG-HRP αντίσωμα αιγός Santa Cruz σε συγκέντρωση 1:10,000. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν και αναπτύχθηκε με τη χρήση του συστήματος ανίχνευσης Western Immobilon Χημειοφωταυγές HRP Substrate (Millipore, Billerica, ΜΑ).

Παροδική διαμόλυνση φορέα έκφρασης pp32 και siRNA για ποσοτικούς προσδιορισμούς συνδέσεως (RNP-ΙΡ) ριβονουκλεοπρωτεΐνη ανοσοκαθίζησης.

παροδική επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. siRNA knockdown διεξήχθη με τη χρήση ενός pp32 σχεδιασμένο μικρό παρεμβαλλόμενο siRNA (Dharmacon, Thermoscientific) με τη χρήση του Oligofectamine (Invitrogen) όπως περιγράφεται προηγουμένως [9], [23]. Εν συντομία, παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές PL5 και MIAPaCa2 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 60% συρροή και μετεμβολιασθούν εις Oligofectamine και Optimem (Invitrogen) χρησιμοποιώντας pp32 siRNA και μία αλληλουχία σκαρφάλωμα αρνητικό μάρτυρα (Dharmacon). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες για την ανοσοαποτύπωση, αναλύσεις ευαισθησίας και δοκιμασίες RNP-IP.

Απομόνωση RNA και γονιδιωματικής ανίχνευση DNA των πλασμιδίων

Για να επιβεβαιώσετε την υπερέκφραση και τη μείωση του mRNA pp32 στο κελί γραμμές, ημι-ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε. MIAPaCa2 pp32-επιμολυσμένα (Mia.pp32) και κενού φορέα κύτταρα (Mia.EV) θρυψινοποιήθηκαν και συλλέχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25] και παράγεται μας κάνουν ηονο χρησιμοποιώντας την προηγουμένως δημιουργηθεί και αγοράζονται γονική παγκρεατική καρκινική κυτταρική γραμμή (ATCC, Manassas, VA ). Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από κυτταρικές σειρές Mia.pp32 και Mia.EV και το πλασμίδιο ενσωμάτωσης επιβεβαιώθηκε με διεξαγωγή PCR με πρόσθιο εκκινητή ειδικό για την αλληλουχία Τ7 του πλασμιδίου και έναν αντίστροφο εκκινητή ειδικό για pp32: FWD 5′-ΤΑΑΤΑΟΟΑΟΤΟΑΟΤΑΤΑΟΟΟ-3 ‘ , 5’-REV CAGGTTCTCGTTTTCGCTTC-3 ‘.

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης RNA RNeasy (Qiagen) και, στη συνέχεια, υποβάλλεται σε επεξεργασία με Turbo-DNA

δωρεάν download (Ambion, Austin, ΤΧ) προς εξάλειψη ίχνη του gDNA [25].

ριβονουκλεοπρωτεϊνικού ανοσοκατακρήμνιση (RNP-IP) και πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR (qPCR).

τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 65% συρροή και αντιμετωπίζονται ως ενδείκνυται. Ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας είτε αντι-HuR ή αντι-IgG αντισώματα ελέγχου όπως περιγράφηκε προηγουμένως (MBL International, Woburn, ΜΑ) [23], [26]. RT-PCR πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια, μετά μάζα κανονικοποίηση των δειγμάτων RNA, για να δημιουργηθεί cDNA. Οπτική πυκνότητα cDNA μετρήθηκε και RT-ποσοτική PCR (qPCR) εκτελέστηκε σε έναν ΑΒΙ 7500 μέσο? 75 ng του εκμαγείου cDNA χρησιμοποιήθηκε ανά αντίδραση για να προσδιοριστεί η σχετική αφθονία του dCK, VEGF, και HuR mRNAs? δείγματα κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα GAPDH mRNA.

SDS-PAGE /Western Blotting

Mia.pp32 και Mia.EV κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και λύματα ολόκληρων κυττάρων λήφθηκαν χρησιμοποιώντας RIPA ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως. Πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία Bradford (BioRad, Hercules, CA). Οι συγκεντρώσεις του δείγματος εξισώθηκαν χρησιμοποιώντας RIPA. Τα δείγματα αναμίχθηκαν 1:01 με ρυθμιστικό 2Χ Laemmli και διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα 10% Bis-Tris πολυακρυλιμιδικού γέλη σε 1χ MOPS ρυθμιστικό τρέξιμο και οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν και γίνεται αποτύπωμα με αντισώματα υποδεικνύονται όπως περιγράφηκε προηγουμένως ανωτέρω [13].

ανοσοφθορισμού

Mia.pp32 και Mia.EV κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες θαλάμου και αντιμετωπίζεται με τα αναφερόμενα φάρμακα. Μετά την κατεργασία, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS, επωάστηκαν με το ενδεικνυόμενο αντίσωμα και υφίστανται επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ και διαφάνειες θάλαμο τοποθετήθηκαν για ανάλυση με ένα Zeiss LSM-510 Συνεστιακό Laser μικροσκόπιο.

κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα

MIAPaCa2 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 60% συρροή. Έξι ώρες μετά τη θεραπεία με 1 μΜ γεμσιταβίνη (Eli Lilly) ή καμία αγωγή, κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται [23], [26], και η ανάλυση ανοσοστυπώματος εκτελέστηκε [23] χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα που αναγνώρισαν HuR (3A2, 1:1000, Santa Cruz), hnRNP ή pp32 (1:500) [13].

ανάπτυξη δοκιμασία

Χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο επιμόλυνσης που περιγράφονται παραπάνω, τα γονικά κύτταρα MIAPaCa2 επιμολύνονται με ίσες ποσότητες pp32-κωδικοποίησης και κενού φορέα pcDNA σε φιάλες Τ-75. Το μέσο άλλαξε και επιλογής Zeocin ™ πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Στο τέλος της περιόδου των δύο εβδομάδων, το μέσο αναρροφήθηκε και οι φιάλες χρωματίστηκαν με διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους για 20 λεπτά, ακολουθούμενη από ενδελεχή πλύσεις ή κύτταρα μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στην επεξήγηση του σχήματος.

Drug Ευαισθησία Δοκιμασίες

δοκιμασίες ευαισθησίας διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας PicoGreen ™ (Invitrogen), μία φθορίζουσα χρωστική η οποία συνδέεται επιλεκτικά δίκλωνο DNA. Η ένταση του σήματος φθορισμού συσχετίζεται με τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων. Εν συντομία, τα κύτταρα 2000 καλλιεργήθηκαν ανά φρεάτιο μίας πλάκας 96 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία 24 ώρες αργότερα [23]. Οι χημειοθεραπευτικοί παράγοντες αγοράστηκαν από τη Sigma, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

δοκιμασίες πρόσδεσης RNA

Για ριβονουκλεοπρωτεΐνης ανοσοκαταβύθιση (RNP-ΙΡ) ανάλυση, τα κύτταρα MIAPaCa2 απλώθηκαν σε μια συρροή 65%, υποβλήθηκε σε επεξεργασία 24 ώρες αργότερα με 1 μΜ γεμσιταβίνη για 3 ώρες και IP πραγματοποιείται με τη χρήση είτε αντι-HuR ή IgG αντισώματα ελέγχου όπως περιγράφεται [23], [26]. Μετά την απομόνωση του RNA, τα επίπεδα mRNA dCK μετρήθηκαν με ανάλυση PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές TCTCTGAATGGCAAGCTCAA και CTATGCAGGAGCCAGCTTTC [23].

Ανοσοϊστοχημεία και τα δείγματα ασθενούς

φορμαλίνη σταθερό, μπλοκ εγκλεισμένο σε παραφίνη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται [ ,,,0],23] χρησιμοποιώντας ανάκτηση αντιγόνου θερμότητα και αβιδίνη-βιοτίνη συγκρότημα ανίχνευσης. Ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε στις 37 εκτομή δείγματα PDA από τα αρχεία παθολογία Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον μετά Διοικητικού Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον Institutional Review (IRB). Εμείς τηρούνται σε όλα τα ηθικά ζητήματα εδώ. Όλα τα δείγματα ασθενών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν κάτω από το Πανεπιστήμιο Διοικητικού κριτική Thomas Jefferson Θεσμική (IRB) ενέκρινε το πρωτόκολλο. Έτσι αυτή η μελέτη διεξήχθη με τη συγκατάθεση του ασθενούς 100%. Δεν υπάρχουν νέες κυτταρικές σειρές που παράγονται απευθείας από ανθρώπινο ιστό χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη. Συγκατάθεση γράφτηκε. IRB τίτλο έγκριση είναι «Συλλογή, Banking, και αξιολόγηση των ιστών, του αίματος, του παγκρέατος χυμός και της χολής από ασθενείς με παγκρεατική και σχετίζονται με τα καρκινώματα που υποβάλλονται σε χειρουργική εκτομή.» Σύμφωνα με το Υπουργείο Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών των ΗΠΑ (IRB εγκριθεί). Η πλειοψηφία των ασθενών έλαβαν GEM μόνο, ή σε συνδυασμό με Xeloda ή ακτινοθεραπεία. Τα αντισώματα που αναγνωρίζουν pp32 [14] ή HuR [23] χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως [23]. Κυτταρικού εντοπισμού (πυρηνική έναντι κυτταροπλασματική) και ένταση χρώσης (ισχυρή έναντι ασθενής) βαθμολογήθηκαν. Με βάση το ποσοστό των χρωματισμένων κυττάρων (& gt? 50% έναντι 5-50%) η έκφραση βαθμολογήθηκε ως διάχυτη ή εστιακή, αντίστοιχα. Οι καμπύλες επιβίωσης παρήχθησαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (έκδοση 4.0) και σ τιμές που υπολογίζονται χρησιμοποιώντας ένα log-rank (Mantel-Cox) τεστ.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός της pp32 κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν

ενσωμάτωση πλασμιδίου σε κύτταρα MIAPaCa2 επιβεβαιώθηκε με PCR ενίσχυση του γενωμικού DNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το Σχήμα 1 απεικονίζει την επιβεβαίωση της πρωτεΐνης pp32 υπερέκφραση στον Mia.pp32 κυτταρική γραμμή σε σχέση με Mia.EV. Ίση φόρτωση πρωτείνης επιβεβαιώθηκε με χρώση της μεμβράνης χρησιμοποιώντας Fast Green (Σχήμα 1Α). Η ισχυρή πυρηνική παρουσία pp32 σε κύτταρα Mia.pp32 ανιχνεύθηκε με ανοσοφθορισμό (Σχήμα 1Β). Περιοδική ανάλυση ανοσοκηλίδος διεξήχθη για να επικυρώσει τη συνεχή υπερέκφραση της πρωτεΐνης pp32 στα κύτταρα Mia.pp32 (Σχήμα 1).

(Α) ανάλυση ανοσοκηλίδος των προϊόντων λύσεως πρωτεΐνης από κύτταρα Mia.pp32 και τους ελέγχους. Mia.pp32 κύτταρα εκφράζουν αυξημένα επίπεδα pp32 από τα κύτταρα Mia.EV. (Β) ανοσοφθορισμού με κύτταρα Mia.pp32 και Mia.EV (

πάνω

). Ανοσοφθορισμός πραγματοποιήθηκε επίσης με την επισήμανση του Ωρ, pp32 και DAPI υπό μεγαλύτερη μεγέθυνση (

κάτω

). Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία laser. κύτταρα (C) Mia.pp32 μείωσαν σημαντικά δυναμικό ανάπτυξης σε σχέση με κύτταρα Mia.EV. (

Αριστερά

) κύτταρα εξίσου επιχρυσωμένο και συλλέγονται τις ημέρες 3 και 5 και μετρήθηκαν. Πέντε φορές λιγότερα κύτταρα Mia.pp32 μετρήθηκαν σε 5 ημέρες σε σύγκριση με τα κύτταρα Mia.EV. (

Δικαίωμα

) κύτταρα MIAPaCa2 επιμολύνονται με ίσες ποσότητες pp32 και κενού φορέα pcDNA 3.1 (Zeo). Οι φιάλες επεξεργάστηκε όμοια σε διάστημα δύο εβδομάδων και ακολούθως βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες για να ποσοτικοποιηθεί ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων (βλέπε μεθόδους). Κάθε φιάλη είναι αντιπροσωπευτική 3 φιάλες.

Η

Ο καρκίνος του παγκρέατος κύτταρα έχουν μειωθεί σημαντικά περιθώρια ανάπτυξης σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου.

πολυάριθμες προσπάθειες για να δημιουργήσει κύτταρα Hs766T και PL5 υπερεκφράζουν pp32 ήταν ανεπιτυχείς, ενώ ο κενός φορέας πλασμίδιο που δημιουργήθηκε αποικίες ρουτίνας (αδημοσίευτα στοιχεία, βλέπε Μέθοδοι) [14]. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν περιγραφεί σε προηγούμενες μελέτες [8], [14].

κύτταρα Mia.pp32 απαιτείται συνήθως λιγότερο συχνή πέρασμα από τα κύτταρα Mia.EV. δοκιμασίες ανάπτυξης (Σχήμα 1 C,

αριστερά

) εκτελέστηκε όπως περιγράφεται (βλέπε μεθόδους) αποκάλυψε ότι κατά την ημέρα 5, υπήρχαν 5 φορές λιγότερα Mia.pp32 κύτταρα από τα κύτταρα Mia.EV. Σημειώστε το τυπικό logartihmic ανάπτυξη του Mia.EV σε σύγκριση με την αμβλεία, γραμμικό ρυθμό ανάπτυξης του Mia.pp32. Δεν παρατηρούμε σημαντικές κυτταρικό θάνατο σε κάθε κυτταρική σειρά στην υπο-συρροή κατάσταση, υποστηρίζοντας το συμπέρασμα ότι η μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης, παρά την απόπτωση, αντιπροσώπευαν τη δραματική διαφορά στον αριθμό των κυττάρων, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14].

επιμολυσμένα τα pp32 και τα κενά πλασμίδια φορέα σε ίσες ποσότητες των γονικών κυττάρων MIAPaCa2. Μια δραματική μείωση της ανάπτυξης στα κύτταρα επιμολυσμένα με MIAPaCa2 pp32 ανιχνεύθηκε σε σύγκριση με τα κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα. Σημειώσαμε εμφανώς μειωμένη χρώση στη φιάλη pp32-επιμολυσμένα (Σχήμα 1 C,

δεξιά

), καταδεικνύοντας τη μειωμένη δυνητική ανάπτυξη αυτών των κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο. Μαζί, αυτά τα πειράματα απέκλεισε την πιθανότητα ότι pp32 μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων λόγω της «ποικιλοποίησης θέση-αποτελέσματος» που προκύπτουν από την τυχαία ενσωμάτωση ενός γονιδίου σε μία ανεπιθύμητη περιοχή στο γονιδίωμα.

δοκιμασίες ευαισθησίας Drug αποκάλυψε Mia.pp32 κύτταρα να είναι ανθεκτικά σε νουκλεοσιδικά ανάλογα

Μόλις καθιερώθηκαν σταθερά επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές Mia.pp32 και Mia.EV, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες από διαφορετικές κατηγορίες φαρμάκων (Πίνακας 1). Για τα περισσότερα φάρμακα, όπως ετοποσίδη, σισπλατίνη, οξαλιπλατίνη (Σχήμα 2Α), κυκλοφωσφαμίδη και πακλιταξέλη (Σχήμα 2Β, βλέπε Πίνακα 1 για τις περιγραφές κατηγορία φαρμάκων) μόνο αμελητέες μεταβολές στην χημειοευαισθησία παρατηρήθηκαν μεταξύ Mia.pp32 και Mia.EV κύτταρα (Πίνακας 1 και Σχήμα 2Α και Β). Ένα επιπλέον υπο-γραμμή pp32 επιμολυσμένα κύτταρα (Mia.pp32-2) συμπεριλήφθηκε ως πειραματικό έλεγχο και βρέθηκαν διαφορές μεταξύ όλων pp32 υπερεκφράζουν κυτταρικές σειρές και τα κενά κελιά έλεγχο των φορέων, αποκλείοντας έτσι ένα τεχνούργημα της κλωνοποίησης (Σχήμα 2 ). Αμφότερες οι γραμμές Mia.pp32 και Mia.EV πολλαπλασιάστηκαν με τον ίδιο ρυθμό, όπως υποδεικνύεται από αμελητέες διαφορές παρατηρήθηκαν σε surivival ποσοστά κύτταρο μεταξύ των κυτταρικών σειρών σε ακραίες χαμηλές δόσεις και συγκέντρωση κάθε δοκιμάστηκε (Εικόνες 2A-C) φάρμακο.

η επιβίωση των Mia.pp32 και Mia.EV γραμμές μετρήθηκε με την δοκιμασία PicoGreen μετά από 5-7 ημέρες επώασης με τις υποδεικνυόμενες δόσεις φαρμάκου. (Α) Φάρμακα που προκαλούν κανένα pp32 που εξαρτώνται από την ευαισθησία? (Β), τα φάρμακα που δείχνει μέτρια διαφορές στην ευαισθησία? (Γ) φάρμακα για τα οποία pp32 παρέχει αυξημένη αντοχή. Γραφήματα αντιπροσωπεύουν μόνο πειράματα (S.E.M.)? κάθε πείραμα είναι αντιπροσωπευτικό & gt? τρία ξεχωριστά πειράματα. Οι Mia.pp32 γραμμές αναφέρονται ως ▴▪ και τα κενά κελιά φορέα ελέγχου που αναφέρεται ως ♦.

Η

Υπήρξε μια μέτρια αύξηση στην ευαισθησία των γραμμών Mia.pp32 με τον αναστολέα της πρωτεϊνικής κινάσης C σταυροσπορίνη (STS) σε σύγκριση με Mia.EV (Σχήμα 2Β,

δεξιά

). Mia.pp32 κύτταρα ήταν δύο φορές πιο ευαίσθητα σε 5-FU σε σύγκριση με κύτταρα Mia.EV (Σχήμα 2C,

αριστερά

). Ωστόσο, η πιο δραματική αλλαγή σημειώθηκε με τα φάρμακα από την ίδια τάξη που χρησιμοποιούν dCK για τον κυτταρικό μεταβολισμό: GEM και κυταραβίνη (ARA-C) (Πίνακας 1 και Σχήμα 2C,

κέντρο και δεξιά

). Mia.pp32 κύτταρα που εμφανίζεται δέκα φορές αντοχή σε GEM σε σύγκριση με Mia.EV, και ένα 2-φορές αντοχή στην Ara-C (Πίνακας 1 και αντιπροσωπευτικά στοιχεία, το σχήμα 2C,

κέντρο

).

siRNA νοκ ντάουν της ενδογενούς έκφρασης pp32 ευαισθητοποιεί τα κύτταρα να γεμσιταβίνης

Το παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική σειρά PL5, με άφθονη έκφραση pp32, ήταν παροδικά επιμολυσμένα χρησιμοποιώντας είτε pp32 siRNA ή ένα στοιχείο ελέγχου κωδικοποιημένο ακολουθία. Knockdown έκφρασης pp32 (Σχήμα 3Α), κατέστησε τα κύτταρα κατά προσέγγιση 3 φορές πιο ευαίσθητο σε GEM σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3Β). pp32 knockdown δεν επηρέασε την κυτταρική βιωσιμότητα εξής etoposide (αρνητικός έλεγχος) θεραπεία (Σχήμα 3C). Δεν παρατηρήσαμε καμία αλλαγή σε παραμέτρους της κυτταρικής ανάπτυξης ή κυτταρικού φαινοτύπου στα κύτταρα pp32 siRNA.

(Α) ανάλυση ανοσοκηλίδος των pp32 αφθονία σε προϊόντα λύσης από κύτταρα PL5 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Σε κύτταρα επιμολυσμένα όπως εξηγείται στην (Α), η ευαισθησία σε GEM (Β) ή ετοποσίδη (C) ελέγχθηκε με δοκιμασία κυτταρικής επιβίωσης PicoGreen.

Η

Η υπερέκφραση και μείωση του pp32 διαταράσσει VEGF, HuR, και dCK mRNA μεταγραφήματος σύνδεση προς HuR και μειώνει την έκφραση της πρωτεΐνης dCK

Προηγουμένως αποδείξαμε ότι dCK mRNA συνδέεται με HuR και έτσι ενισχύει dCK πρωτεΐνη μετάφραση [23]. Εμείς χειραγωγείται επίπεδα έκφρασης pp32 (Σχήμα 4Α) σε ισογονικών καρκινικά κύτταρα και στη συνέχεια ποσοτικά αξιολόγησε την ένωση των γνωστών HuR mRNA στοχεύει dCK [23], του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) [27], και HuR [28] mRNAs με HuR με ριβονουκλεοπρωτεΐνης ανοσοκαταβύθιση (RNP-ΙΡ) δοκιμασία όπως περιγράφεται προηγουμένως [23]. Μετά από μια σύντομη θεραπεία GEM, η συσχέτιση μεταξύ HuR και dCK mRNA ανιχνεύθηκε σε κύτταρα MIAPaCa2 (Σχήμα 4Β). Ωστόσο, μια σημαντική μείωση της dCK, VEGF, και HuR mRNAs ανιχνεύθηκε σε HuR αντίσωμα-ανοσοκαταβυθίστηκε-RNA από κύτταρα που υπερεκφράζουν pp32 (Σχήμα S1 και Σχήμα 4Α και Β)? ενώ στα κύτταρα siRNA επιμολυσμένα pp32 μια σημαντική, συνεπής ενίσχυση (& gt? 4 φορές) σε dCK, VEGF, και HuR mRNAs συνδεδεμένο με HuR (Σχήμα 4Α και Β). Fold αλλαγές προσδιορίστηκαν με σύγκριση HuR αντίσωμα-ανοσοκαταβυθίστηκε-RNAs από επιμολυσμένα κύτταρα να αδειάσει-φορέα επιμολυσμένα κύτταρα, με την κανονική, ενδογενή επίπεδα έκφρασης pp32. Για ειδικότητα, αξιολογήσαμε και δεν βρήκε καμία σύνδεση της GAPDH και pp32 mRNAs (Σχήμα 4Β και δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εικόνα S1 δείχνει το δραματικό αποτέλεσμα της σταθερής υπερέκφραση pp32 (κύτταρα Mia.pp32) έχουν στο δεσμευτικό dCK mRNA σε HuR.

(Α) pp32 επίπεδα mRNA ομαλοποιηθούν τα επίπεδα του GAPDH mRNA σε κενό-φορέα επιμολυσμένα κύτταρα, pp32 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα, και το πλασμίδιο pp32 επιμολυσμένων κυττάρων. Αριθμός δηλώνει φορές αλλαγή της έκφρασης mRNA pp32 επισημασμένου δημιουργούνται κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με το άδειο κύτταρα ελέγχου φορέα. (Β) δέσμευση σε VEGF και dCK mRNAs HuR ανιχνεύθηκε με ανάλυση RNP-IP σε κύτταρα επιμολυσμένα με MIAPaCa2 pp32 siRNA, πλασμίδιο pp32, ή κενό φορέα ελέγχου (Α). τα επίπεδα mRNA σε HuR και τα δείγματα IgG ΠΕ πρώτη ομαλοποιηθούν τα επίπεδα του GAPDH mRNA στα ίδια αντιδράσεις IP, και στη συνέχεια να παρίσταται ως σχετική εμπλουτισμός φορές σε VEGF, dCK, και HuR mRNAs σε HuR IP vs IgG IP. Τα δεδομένα δείχνουν τον μέσο όρο από 3 ανεξάρτητα σημεία δεδομένων. Δύο ανεξάρτητα πειράματα με σκοπό να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα. Οι αριθμοί δείχνουν φορές αλλαγές σε σχέση με IgG ελέγχου. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των pp32 και dCK επίπεδα έκφρασης σε προϊόντα λύσης πρωτεΐνης από τα κύτταρα Mia.pp32 και Mia.EV. (Δ) Τρεις λωρίδες αντιπροσωπεύουν λύματα από τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ δημιουργείται ότι είτε αριστερά προς τα δεξιά: υπερεκφράζουν HuR, κενό φορέα, ή pp32 με ετικέτα myc /DCK. Η ανάλυση στυπώματος Western περιλαμβάνονται αντισώματα που αναγνωρίζουν pp32, HuR, dCK, αλφα-τουμπουλίνης, και θυμιδυλική συνθάση (TS) πρωτεΐνες.

Η

Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης μειώθηκαν dCK σε κύτταρα σε σύγκριση με Mia.pp32 κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 4C). Τέλος, θα χρησιμοποιηθεί ένα διαφορετικό μοντέλο καλλιέργειας κυττάρων για την επικύρωση αυτών των ευρημάτων. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης από ανθρώπινα κύτταρα ΗΕΚ293Τ (βλέπε μεθόδους) που υπερεκφράζεται HuR, pp32 και ένα φορέα ελέγχου. Επικύρωση HuR και pp32 υπερέκφραση επιβεβαιώθηκε με ανοσοαποτύπωση (Σχήμα 4D). Όπως ήταν αναμενόμενο, ανιχνεύσαμε ενισχυμένη έκφραση πρωτεΐνης dCK στα προϊόντα λύσης υπερέκφραση HuR [23] σε σύγκριση με τον έλεγχο και μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης dCK στα προϊόντα λύσης υπερέκφραση pp32 σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικόνα 4D). Αλφα-τουμπουλίνης και θυμιδυλική συνθάση χρησιμοποιήθηκαν για να δείξουν ισότιμη πρωτεΐνη φόρτωσης. Τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώνουν ότι dCK απορυθμίζεται σε μια ρύθμιση, όταν HuR υπερεκφράζεται και προς τα κάτω σε μια ρύθμιση, όταν pp32 υπερεκφράζεται. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι pp32 μπορεί να επηρεάσει τόσο την dCK mRNA σύνδεση με HuR και dCK έκφραση της πρωτεΐνης (Σχήμα 4).

STS και GEM αυξημένη αφθονία κυτταροπλασματική pp32

Εμείς επιβεβαίωσε προηγούμενες εκθέσεις [29 ] ότι STS μπορεί να αυξήσει τα κυτταροπλασματικά επίπεδα τόσο HuR και pp32 σε καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 5Α). Ομοίως, η θεραπεία GEM αυξημένη pp32 κυτταροπλασματική αφθονία, αλλά σε μικρότερο βαθμό από ό, τι HuR (Σχήμα 5Α). Η αύξηση των pp32 και HuR κυτταροπλασματικά επίπεδα μετά τη θεραπεία GEM εκτιμήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western (Σχήμα 5Β). Καμία αλλαγή στην pp32 και HuR έκφραση ανιχνεύθηκε σε ολόκληρο κυτταρολύματα από GEM-επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 5Β), σε συμφωνία με προηγούμενα αποτελέσματα μας [23]. Η παρακολούθηση των επιπέδων της hnRNP (C1 /C2) επιβεβαίωσε την καθαρότητα των Κυτταροπλασματικά προϊόντα λύσης (Σχήμα 5Β).

(Α) ανοσοφθορισμού που δείχνουν αυξημένη HuR και pp32 κυτταροπλασματική έκφραση σε κύτταρα κατεργασμένα με STS (1 μΜ για 3 ώρες ) και GEM (1 μΜ για 3 ώρες), όπως υποδεικνύεται από τα λευκά βέλη. (Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των επιπέδων HuR και pp32 στην κυτταροπλασματική και ολικού κυττάρου προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν από κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία, όπως εξηγείται στο (Σχήμα 5).

Η

Πυρηνική ένταση pp32 είναι ένας βιοδείκτης για φτωχή πρόγνωση σε PDA, αλλά δεν ενισχύει την προγνωστική αξία της HuR για τη θεραπεία GEM

Είμαστε ξεχωριστά ανιχνεύεται τόσο ισχυρή και ασθενή πυρηνική και κυτταροπλασματική έκφραση τόσο HuR και pp32 σε δείγματα PDA [14], [23] (Πίνακας 2 και Εικόνα 6Α, HuR,

αριστερά

πάνελ και pp32,

δεξί πάνελ

). Για όλους τους ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με GEM (n = 31) [23], pp32 πυρηνική ένταση δεν συσχετίζονται σημαντικά με ανταπόκριση GEM σε σχέση με τη συνολική επιβίωση (Εικόνα 6Β). pp32 επίπεδα πυρηνική έκφραση σε συνδυασμό με HuR κυτταροπλασματική κατάσταση (Σχήματα 6C και D) δεν ενίσχυσε την προγνωστική αξία της HuR μόνη ως δείκτης για την ανταπόκριση GEM (p = 0,0009, τα δεδομένα φαίνεται τώρα [23]). Βρήκαμε μια μέτρια συσχέτιση μεταξύ pp32 και τα επίπεδα έκφρασης υποκυτταρική εντόπιση HuR (Πίνακας 3). Ο Πίνακας 2 περιγράφει τη συσχέτιση μεταξύ χαμηλών επιπέδων πυρηνικής pp32 και πιο επιθετικούς όγκους (υψηλότερης βαθμίδας, ρ = 0,0002, και θετικά για λεμφαδένα μετάσταση, p = 0,0069, βλέπε Πίνακα 2). Τα στοιχεία αυτά τα προηγούμενα ευρήματά μας, σε ένα ξεχωριστό σύνολο κλινικά δεδομένα, που δείχνουν ότι η χαμηλή έκφραση pp32 συσχετίζεται με ελάχιστα διαφοροποιημένο PDAs [14], [15].

(Α) Η αφθονία και η υποκυτταρική εντόπιση του HuR (

αριστερά

) και χαμηλή για να απουσιάσει έκφραση πυρηνικών pp32 (

δεξιά

) σε δείγματα από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος αξιολογήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία? μεγέθυνσης, 200x. Δείγματα είναι αντιπροσωπευτικά της κλάσης αναλύονται στο Β-Δ. (Β) Συσχέτιση μεταξύ pp32 πυρηνική έκφραση και την ανταπόκριση στη θεραπεία GEM (p = 0,3, συνδεθείτε τεστ rank). (Γ) τη σχέση μεταξύ των δειγμάτων όγκου υψηλής πυρηνική pp32 εκφράζουν στρωματοποιημένη σε υψηλή ή χαμηλή κατάσταση HuR σε σχέση με την ανταπόκριση του GEM (p = 0.88, συνδεθείτε τεστ rank). (Δ) Η συσχέτιση μεταξύ των υψηλών κυτταροπλασματικά δείγματα HuR εκφράζουν όγκου στρωματοποιημένη σε υψηλές και χαμηλές pp32 πυρηνική έκφραση συσχετίζεται με ανταπόκριση GEM (p = 0.25, συνδεθείτε τεστ rank).

Η

Η

Συζήτηση

Πολυάριθμες ερευνητές έχουν ανεξάρτητα χαρακτηριζόμενη pp32 ως καταστολέας πρωτεΐνη όγκου σε μια ποικιλία από πειραματικά μοντέλα [8], [9], [12], [13], [30], [31]. Οι πρώτες μελέτες έδειξαν ότι pp32, μέσω μιας συγκεκριμένης περιοχής αποτελείται από περίπου 25 αμινοξέα, ενήργησε ως καταστολέας των όγκων αναστέλλοντας K-ras, ένα μεταλλαγμένο p53, c-jun, Ε1Α, Ε6 και Ε7 [12], [13]. Βρήκαμε μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ των δύο υψηλής ποιότητας όγκους και μετάσταση λεμφαδένα με ασθενές pp32 πυρηνική έκφραση (Πίνακας 2), υποστηρίζοντας τα προηγούμενα ευρήματα μας ότι pp32 λειτουργεί ως μία πρωτεΐνη καταστολέας όγκων σε PDA [14]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης pp32 διακόψει άμεσα ή διευκολύνουν την ικανότητα HuR να υποστηρίξει βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό με την διατάραξη της σταθεροποίησης των μεταγραφών mRNA που κωδικοποιούν πρωτεΐνες απαραίτητες για την επιβίωση των κυττάρων του όγκου, όπως dCK, VEGF, ή HuR (Σχήμα 7). Εμείς υποθέσουμε ότι η παρουσία του μπορεί να διαταράξει pp32 ρόλο HuR στη στήριξη ογκογένεση και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, ενώ η απουσία pp32 διευκολύνει ογκογένεσης. υποστηρίζει το έργο μας και επεκτείνεται πάνω από μια δεκαετία της έρευνας που έχει αποδείξει ότι pp32 λειτουργεί σαν ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε πολλαπλά μοντέλα και συστήματα όγκου [8], [9], [11], [12], [13], [30] [31], [32] (Εικόνα 7).

στην αριστερή πλευρά δείχνει ένα σενάριο όπου pp32 μειώνεται ή απουσιάζει (ογκογένεσης) και HuR είναι διαθέσιμη για να συνδέσει και να σταθεροποιήσει mRNAs που υποστηρίζουν την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και βιωσιμότητα. Στη δεξιά πλευρά είναι ένα σενάριο στο οποίο pp32 είναι παρούσα (καταστολή όγκου) και HuR δεν μπορεί να συνδεθεί με mRNAs σημαντική για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Σημείωση: GEM είναι πιο πιθανό να μεταβολιστούν από τη μορφή προφαρμάκου της για δραστικούς μεταβολίτες της κατά dCK στο σενάριο στο αριστερό

Η

Ρύθμιση της έκφρασης pp32 μέσω υπερέκφρασης ή σίγασης που μεταβάλλεται την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων να. οι ανάλογα νουκλεοσιδίου GEM και ARA-C (Σχήματα 2C και 3). Περαιτέρω, ενισχυμένη ή μειωμένη επίπεδα έκφρασης pp32 μεταβάλλεται άμεσα την αλληλεπίδραση του HuR με dCK mRNA (Σχήματα 4) και μείωσε σημαντικά την έκφραση dCK πρωτεΐνη (Σχήματα 4C και D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι pp32 παίζει ένα ρόλο στην μετα-μεταγραφική ρύθμιση HuR της dCK. Επαληθεύσαμε νωρίτερα αναφέρει ότι κυτταροπλασματική pp32 επίπεδα μπορεί να αυξηθεί με την παρουσία του ειδικού στρες [22], [33]. Ίσως διαφορετικές στρεσογόνους παράγοντες μεταφέρει διάφορα μέλη της οικογένειας γονιδίων pp32 σε συνδυασμό με HuR. Για παράδειγμα, Fries Β

et al.

Έδειξε ότι

Απρίλιος

και όχι pp32 δρα ως σύνδεσμος και μπορεί να βοηθήσει HuR στη ρύθμιση της μεταγραφής του CD83 [33]. Μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών pp32 (π.χ., ΑΠΡΙΛΙΟΥ pp32r1, pp32) ενδέχεται να παρέχει πρόσθετες ρυθμιστικούς μηχανισμούς για HuR και mRNAs στόχο της [31].

Αν και τα στοιχεία μας παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι pp32 ρυθμίζει τη λειτουργία HuR, η κλινική μας δεδομένα δείχνουν ότι, πριν από την αγωγή, η ενδογενής έκφραση pp32 και υποκυτταρικού εντοπισμού δεν μεταβάλλει προγνωστική αξία HuR της απόκρισης GEM (Σχήμα 6). Επιπλέον, ενώ η συσχέτιση μεταξύ pp32 και HuR υποκυτταρικού εντοπισμού σε δείγματα όγκων (πίνακας 3), φαίνεται ότι κάθε πρωτεΐνη δεν ρυθμίζει πλήρως το υποκυτταρικό εντοπισμό του άλλου

in vivo

.