Αφηρημένο

Drug στόχευση είναι ένας ενεργός τομέας των συστημάτων έρευνας και νανο-κλίμακα χορήγησης φαρμάκων κατέχουν τεράστιες δυνατότητες για τη θεραπεία των νεοπλασμάτων. Σε αυτή τη μελέτη, μία νέα κυκλοδεξτρίνη (CD) σύστημα παροχής φαρμάκου με έδρα νανοσωματίδιο έχει συναρμολογηθεί και η οποία χαρακτηρίζεται για τη θεραπεία του φολικού θετικούς υποδοχείς [FR (+)] καρκίνου. Υδατοδιαλυτό φολικό οξύ (FA), συζευγμένης μεταφορείς CD (FACDs) έχουν επιτυχώς συνετέθη και οι δομές τους επιβεβαιώθηκαν με 1D /2D πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), λέιζερ εκρόφησης ιονισμού φασματόμετρο μάζας υποβοηθούμενης από μήτρα χρόνο-πτήσης (MALDI- TOF-MS), υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), μετασχηματισμός Fourier υπέρυθρη φασματοσκοπία (FTIR) και κυκλικού διχρωισμού. Τα σύμπλοκα φαρμάκου από αδαμαντάνιο (ADA) και κυτταροτοξικά δοξορουβικίνη (Dox) με FACD ελήφθησαν εύκολα με καθίζηση μικτό διαλύτη. Το μέσο μέγεθος των FACD-Ada-Dox ήταν 1,5-2,5 nm. Η ένωση υποδοχής επισκεπτών σταθερή

K

a ήταν 1.639 Μ

-1 όπως καθορίζεται από επαγόμενη κυκλικού διχρωισμού και την υδροφιλικότητα των FACDs ήταν πολύ βελτιωμένη σε σύγκριση με το μη τροποποιημένο CD. Κυτταρική πρόσληψη και FR δεσμευτική ανταγωνιστική πειράματα έδειξαν μια αποτελεσματική και κατά προτίμηση στοχευμένη παράδοση Dox σε καρκινικά κύτταρα FR-θετική και παρατεταμένη προφίλ αποδέσμευσης του φαρμάκου θεωρήθηκε

in vitro

. Η παράδοση των Dox σε FR (+) κύτταρα καρκίνου

μέσω

ενδοκυττάρωσης παρατηρήθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία και η πρόσληψη του φαρμάκου των στοχοθετημένων νανοσωματιδίων ήταν 8 φορές μεγαλύτερη από εκείνη των συμπλοκών μη-στοχευμένες φαρμάκου. αποτελέσματα docking μας δείχνουν ότι η FA, FACD και FACD-Ada-Dox θα μπορούσε να δεσμεύσει τα ανθρώπινα σκαντζόχοιρος αλληλεπιδρώντας πρωτεΐνη που περιέχει ένα πεδίο FR. καρδιομυοκύτταρα Mouse καθώς και των ινοβλαστών σε επεξεργασία με FACD-Ada-Dox είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα δραστικών μορφών οξυγόνου, με αυξημένη περιεκτικότητα σε δραστηριότητα γλουταθειόνης και υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, υποδεικνύοντας μία μειωμένη πιθανότητα για Dox επαγόμενη καρδιοτοξικότητα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η στοχευμένη σύμπλοκο φάρμακο έχει υψηλή συσχέτιση φαρμάκου και παρατεταμένης ιδιότητες απελευθέρωσης φαρμάκου με καλή βιοσυμβατότητα και φυσιολογικές σταθερότητα. Το μυθιστόρημα FA-συζευγμένο β-CD σύμπλοκο φαρμάκου βάση θα μπορούσε να είναι πολλά υποσχόμενη ως θεραπεία κατά του όγκου για τον καρκίνο FR (+)

Παράθεση:. Yin JJ, Sharma S, Shumyak SP, Wang ZX, Zhou ZW, Zhang Υ, et al. (2013) Σύνθεση και Βιολογική Αξιολόγηση των νέων φολικό οξύ Υποδοχέων-Στοχευμένες, β-κυκλοδεξτρίνη-Based Drug Συμπλέγματα για την θεραπεία του καρκίνου. PLoS ONE 8 (5): e62289. doi: 10.1371 /journal.pone.0062289

Επιμέλεια: Κατερίνα Cinti, Ινστιτούτο Κλινικής Φυσιολογίας, c /o Toscana Ίδρυμα Επιστημών Ζωής, Ιταλία

Ελήφθη: 6 του Δεκεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 19 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: 2 Μαΐου 2013

Copyright: © 2013 Yin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Δρ JJY υποστηρίζεται από μεταδιδακτορικός υπότροφος από το Κολέγιο της Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα, 12901 Bruce Β Downs Blvd., Τάμπα, Φλόριντα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια κύρια αιτία θανάτου των ανθρώπων σε όλο τον κόσμο, αντιπροσωπεύοντας το 7,6 εκατομμύρια θανάτους (το 13% περίπου του συνόλου των θανάτων) το 2008 [1]. Συνολικά, εκτιμάται ότι περίπου 12,7 εκατομμύρια νέα κρούσματα καρκίνου και 7,6 εκατομμύρια θάνατοι από καρκίνο συνέβη το 2008, με το 56% των νέων περιπτώσεων καρκίνου και το 63% των θανάτων από καρκίνο που συμβαίνουν στις λιγότερο ανεπτυγμένες περιοχές του κόσμου [2]. Οι πιο συχνά διαγιγνώσκονται καρκίνοι του πνεύμονα παγκοσμίως είναι (1,61 εκατ 12,7% του συνόλου), του μαστού (1,38 εκατ 10,9%) και του παχέος εντέρου (1,23 εκατομμύρια, 9,7%). Μυθιστόρημα, ασφαλείς και αποτελεσματικές θεραπείες είναι σαφώς και χρειάζεται επειγόντως να περιορίσει αυτά τα στατιστικά υψηλή θνησιμότητα. Οι τέσσερις κύριες ενότητες της θεραπείας του καρκίνου περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση, ακτινοβολία, χημειοθεραπεία και την ανοσοθεραπεία [3]. Ωστόσο, αυτές οι θεραπείες είναι επιτυχής μόνο όταν ο καρκίνος ανιχνεύεται σε πρώιμο στάδιο, ή περιορίζεται σε ορισμένους τύπους καρκίνου (π.χ., λευχαιμία). Λόγω της αδυναμίας ανίχνευσης καρκίνου σε πρώιμο στάδιο, οι περισσότεροι ασθενείς που υπάρχει στο προχωρημένο στάδιο με εκτεταμένη τοπική διήθηση και μετάσταση. Για προχωρημένους όγκους, και ιδίως εκείνοι οι όγκοι αναπτύσσονται από επιθηλιακών ιστών όπως πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του μαστού, του προστάτη και του παγκρέατος, αυτές οι θεραπείες είναι λιγότερο επιτυχής. Η χημειοθεραπεία αντιπροσωπεύει μία από τις σημαντικότερες μέσα για την θεραπεία του καρκίνου, η οποία αποσκοπεί να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα ή να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό τους, ενώ διατηρώντας τα φυσιολογικά κύτταρα του σώματος [3]. Οι χημειοθεραπευτικοί παράγοντες έχουν γενικά ένα στενό περιθώριο ασφαλείας, και χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό συνήθως δίδεται σε μέγιστη ανεκτή δόση για να επιτευχθεί το μέγιστο θανάτωση των καρκινικών κυττάρων [4]. Αυτοί φονεύουν κύτταρα όγκου με άμεση κυτταροτοξικότητα, ή ενεργοποιώντας ανοσοαπόκριση ξενιστή, αναστέλλοντας τις διαδικασίες πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, και επάγει απόπτωση [5]. Ωστόσο, οι περισσότεροι ασθενείς δεν ανταποκρίνονται σε αυτά τα φάρμακα και συχνά βιώνουν σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες όπως σοβαρή διάρροια και απώλεια των τριχών. Ο πρωταρχικός λόγος για αυτό είναι επειδή το φάρμακο σκοτώνει τα δύο φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα οφείλεται σε χαμηλά επίπεδα επιλεκτικότητας του φαρμάκου και του φαρμάκου εντός κυττάρων όγκου είναι πολύ χαμηλές. Η αντοχή στα φάρμακα και περιοριστικές της δόσης τοξικότητες είναι τα κύρια προβλήματα για την επιτυχία της χημειοθεραπείας του καρκίνου [6]. Κατά την τελευταία δεκαετία, νανο-κλίμακα, στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων έχει προσελκύσει πολύ προσοχή σαν ένα μέσο για τη βελτίωση της θεραπευτική επίδραση των υφιστάμενων χημειοθεραπευτικών παραγόντων περιορίζοντας ταυτόχρονα τις επιπτώσεις τους [7], [8]. Οι πρόσφατες δραματικές εξελίξεις στον τομέα της νανοτεχνολογίας δημιούργησαν μια μυριάδα των αντικαρκινικών νανο-φάρμακα? Ωστόσο, τα περισσότερα σημερινά συστήματα νανο-φαρμάκου υπολείπονται σε ευκολία καθαρισμού, την αναπαραγωγιμότητα και από παρτίδα σε παρτίδα συνοχή [9], [10]. Η προετοιμασία και ο χαρακτηρισμός των σκευασμάτων νανο-φαρμάκων ειδικά για τα υδατικά συγκροτήματα ναρκωτικών παραμένει μια μεγάλη πρόκληση.

Το αντιβιοτικό ανθρακυκλίνης γλυκοζίτη, δοξορουβικίνη (Dox), είναι ένας ισχυρός, ευρέως φάσματος αντικαρκινικός παράγοντας που δρα μέσω παρεμβολής στο DNA και αναστέλλοντας τη σύνθεση του DNA [11]. Dox χρησιμοποιείται συχνά για τη θεραπεία ορισμένων λευχαιμιών και λέμφωμα Hodgkin, καθώς και καρκίνους της ουροδόχου κύστης, του μαστού, του στομάχου, του πνεύμονα, των ωοθηκών, του θυρεοειδούς, και το σάρκωμα των μαλακών μορίων. Σε συνήθεις δόσεις χημειοθεραπευτικών, Dox είναι καρδιοτοξική και μπορεί επίσης να αυξήσει τον κίνδυνο λευχαιμίας ειδικά όταν χορηγείται σε υψηλές δόσεις ή μαζί με ορισμένα άλλα χημειοθεραπευτικούς παράγοντες ή ακτινοθεραπεία [11] – [16].

ο στόχος αυτής της έκθεσης είναι να παρουσιάσει μια μέθοδο για τη σύνθεση ενός νέου και αποτελεσματικού σύμπλοκο φαρμάκου για στοχευμένη παροχή φαρμάκου (Σχήμα 1). Συνδυάζοντας τα μόρια στόχευσης, φορείς φαρμάκων και κυτταροτοξικών παραγόντων σε ένα σύνθετο θα πρέπει να εγγυάται τη σταθερότητα του συζυγούς στην κυκλοφορία και ασφαλίζουν διάσπασης για την απελευθέρωση του φαρμάκου. Η β-CD ήταν διανυσματοποιηθούν με φολικό οξύ (FA) για τη στόχευση υποδοχέων φυλλικού οξέος (FRs) στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων. Dox περιέχουν FR-στόχευση β-CDs συνετέθησαν με μια αντίδραση πολλαπλών σταδίων στην οποία α- και γ-αμιδίου μονομερή καθώς και η δι-CD υποκατεστημένο φορέα FA καθαρίστηκαν και πλήρως χαρακτηρίζονται από ένα πάνελ των φασματικών τεχνικών. Η

in vitro

προφίλ αποδέσμευσης φαρμάκου προσδιορίστηκε με μέτρηση διαπίδυση και φθορισμού, και στοχευμένες σύνδεσης φαρμάκου

in vitro

ποσοτικοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής και συνεστιακή μικροσκοπία. Η κυτταροτοξικότητα των διαφόρων συμπλεγμάτων του φαρμάκου μετρήθηκε και οι βιοδείκτες που σχετίζονται με την απελευθέρωση Dox-καρδιοτοξικότητα από εξετάστηκαν επίσης σε κυτταρικό επίπεδο.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και Αντιδραστήρια

ένυδρο β-κυκλοδεξτρίνη και CERIM (IV) το θειικό τετραένυδρο αγοράστηκαν από την Acros Organics (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ). μολυβδαινικού αμμωνίου (παρα) τετραένυδρο αγοράστηκε από την Alfa Aesar Inc. (Ward Hill, ΜΑ).

σ

-τολουολοσουλφονυλοχλωριδίου,

Ν

,

Ν

‘δικυκλοεξυλ-καρβοδιιμίδιο (DCC), φολικό οξύ (FA),

Ν

υδροξυηλεκτριμίδιο (NHS), υδροχλωρική δοξορουβικίνη, χλωριούχο 1-αδαμαντανοκαρβονυλοχλωριδίου, όξινο ανθρακικό αμμώνιο, αζίδιο νατρίου, τριφαινυλοφωσφίνη, 2 ‘, 7′-διοξική διχλωροφθορεσκεϊνης (DCFH-DA), 5, 5’-διθειοδις (2-νιτροβενζοϊκό οξύ) (DTNB), ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH), υπεροξείδιο του υδρογόνου, υδροξείδιο του καλίου, υδροξείδιο του νατρίου, φωσφορικό οξύ, υδροξείδιο της αμμωνίας, νινυδρίνη, υδροχλωρικό οξύ, ιώδιο, θειικό οξύ, οξικό οξύ, οξείδιο του δευτερίου, χλωροφόρμιο-ά, διμεθυλοσουλφοξείδιο-δ

6, και CM sephadex C

25 ήταν όλα αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich Chemicals Co. (St. Louis, ΜΟ). Η παραφορμαλδεΰδη ελήφθη από EMD Chemicals Inc. (Gibbstown, NJ). Το κιτ δοκιμασίας δικιγχονινικού οξέος (BCA) αγοράστηκε από την Pierce (Rockford, IL). CM-H

2DCFDA αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Το κιτ εκχύλισης Protein Pro-prep (TM) αγοράστηκε από την Intron Βιοτεχνολογία Inc. (Kyungki-Do, Κορέα). Το κιτ δοκιμασίας γλουταθειόνης υπεροξειδάσης (GPx) λήφθηκε από BioVision Inc. (Milpitas, CA). Spectra /Por μεμβράνης διαπίδυσης με αποκοπή μοριακού βάρους 3.000 Da αγοράστηκε από την Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). Όλοι οι διαλύτες για χρωματογραφική απομόνωση ήταν αναλυτικής ποιότητας. ακετόνη, βουτανόλη, ακετονιτρίλιο (ACN), οξικό αιθυλεστέρα (EtOAc), εξάνιο, μεθανόλη, 1-προπανόλη (1-ΡΑ), 2-προπανόλη, διχλωρομεθάνιο (DCM), πυριδίνη, διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF), διμεθυλοσουλφοξείδιο ποιότητας HPLC ( DMSO) και οι πλάκες λεπτής στιβάδας χρωματογραφία (1000 μm και 200 ​​μm) αγοράστηκαν από την Fisher Scientific Co. (Fair Lawn, NJ). Θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό, ορό εμβρύου μόσχου, και το νεογέννητο ορό μόσχου αγοράστηκαν από την Hyclone Laboratories Inc. (Logan, UT). FR και β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). μονοκλωνικό IgG αντίσωμα αντι-κουνελιού HRP ποντικού αγοράστηκε από Prosci Inc. (San Diego, CA). Pierce ECL Western blotting υπόστρωμα αγοράστηκε από Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, ΜΑ).

Cells and Cell Culture

JEG-3 και JAR (αμφότερα προέρχονται από ανθρώπινο πλακούντα χοριοκαρκίνωμα), ΗΤ -29 (ανθρώπινος καρκίνος του παχέος εντέρου), MCF-7 (ανθρώπινου καρκίνου του μαστού), H9c2 (2-1) κύτταρα (καρδιομυοκύτταρα ποντικού) και 3Τ3 (ινοβλάστες ποντικού) κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) . JEG-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM) με 10% ορό νεογνού μόσχου? JAR και MCF-7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 με 10% ορό νεογνού μόσχου? ΗΤ-29 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε McCoy 5Α με 10% ορό νεογνού μόσχου? και 3Τ3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Όλες οι κυτταρικές σειρές επωάστηκαν σε 5% CO

2 και 90-100% σχετική υγρασία στους 37 ° C. Μέσο ανανέωση διεξήχθη 2-3 φορές την εβδομάδα και τα κύτταρα υποκαλλιεργήθηκαν όταν επιτευχθεί 80-90% συρροή. Για την προετοιμασία διαφανειών, 2 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 0,7 εκατοστά Χ 0,7 εκατοστά Nunc διαφάνειες θάλαμο μάρκα από Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και επιστρώθηκαν με μέσο μάρκα Vectashield στερέωσης που περιέχουν 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) αγοράστηκε από Vector Laboratories Inc. (Burlingame, CA).

Western Blot Δοκιμασία

Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο BCA μετά την εκχύλιση πρωτεϊνών από τα κύτταρα. Το επίπεδο έκφρασης του FR στο JAR, ΗΤ-29, κυτταρικές γραμμές 3Τ3 MCF-7 και προσδιορίστηκε με δοκιμασία κηλίδος Western. Εν συντομία, μονοστοιβάδες κυττάρων πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια τα λύματα βρασμένο για 10 λεπτά και ένα κλάσμα χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί το περιεχόμενο πρωτεΐνης με δοκιμασία BCA. Ένα κλάσμα της συνολικής πρωτεΐνης (0,2 mg) αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση 12% νάτριο δωδεκυλ θειικό γέλη πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Μετά ηλεκτροκηλίδωση γελών πάνω διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) φύλλα (Millipore, Bedford, ΜΑ), τα φίλτρα αποκλείστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου με το Tris ρυθμιστικό Tween-20 (TBST) ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (10 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0, 0.1 % Tween 20, και 150 mM NaCl) που περιέχει 10% μη λιπαρό ξηρό γάλα και στη συνέχεια επωάστηκαν σε ρυθμιστικό TBST όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αραίωση 1:200 του FR αντισώματος και 1:10,000 αραίωσης για αντίσωμα β-ακτίνης. Μετά από πλύση με ρυθμιστικό διάλυμα TBST, τα στυπώματα επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με αντι-κουνελιού IgG μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αραιώνεται 1:3,000 σε TBST ρυθμιστικό διάλυμα και στη συνέχεια αποκαλύφθηκε με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL).

Χημική Σύνθεση του φολικού οξύ Receptor-Στοχευμένες, β-κυκλοδεξτρίνη-Based Drug Συγκροτήματα

Για να συνθέσει μονο-6-δεοξυ-6 – (

σ

τολυλοσουλφονυλο) -β-κυκλοδεξτρίνη (Ts-CD), ένα διάλυμα

χλωριούχο ρ-τολουολοσουλφονυλο

(846,3 mg, 4,44 mmol) σε 5 ml ACN προστέθηκαν σε 80 ml υδατικού διαλύματος β-CD (5.0 g, 4.44 mmol) και ΝαΟΗ (434,8 mg, 10,8 mmol) στάγδην σε 15 λεπτά. Μετά από ανάδευση για 4 ώρες στους 0 ° C σε Ν

2 ατμόσφαιρα, το διάλυμα εξουδετερώθηκε με προσθήκη 0,6 ml 2,0 Ν υδατικού υδροχλωρικού οξέος και το προϊόν ανακρυσταλλώθηκε στους 4 ° C όλη τη νύκτα, και στη συνέχεια πλύθηκε με ακετόνη. TS-CD ελήφθη σε απόδοση 84,6% (σχήμα 2 και στα σχήματα S1 & amp? S2).

Η

Mono-6-αζιδο-6-δεοξυ-β-κυκλοδεξτρίνη (N

3 -CD) λήφθηκε από την αντίδραση της Ts-CD και αζίδιο του νατρίου για 5 ώρες στους 80 ° C με απόδοση 91,5%. Mono-6-δεοξυ-6-aminoβ-κυκλοδεξτρίνη (ΝΗ

2-CD): N

3-CD και τριφαινυλ φωσφίνης διαλύθηκαν σε DMF, και προστέθηκε διάλυμα αμμωνίας και το διάλυμα αναδεύτηκε για 3 ημέρες στους 50 ΝΤΟ. Το τελικό διάλυμα ανακρυσταλλώθηκε σε ακετόνη για να δώσει την ένωση NH

2-CD σε 79% απόδοση (Σχήμα 2 και Σχήμα S3), το οποίο καθαρίστηκε με στήλη ανταλλαγής ιόντων με απιονισμένο νερό και 0.1 Μ (ΝΗ

4)

2CO

3.

Ada-COCl διαλύθηκε σε άνυδρη DCM αναμιγνύονται με Et

3Ν, και στη συνέχεια αναδεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 3 ώρες κάτω από Ν

2. υδροχλωρική δοξορουβικίνη προστέθηκε κατόπιν, αναδεύεται όλη τη νύκτα και διαχωρίζεται με παρασκευαστική χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC). Ada-Dox ελήφθη και καθαρίστηκε με στήλη flash με απόδοση 80,5% (Σχήμα 2 και Σχήμα S4).

Ένα μίγμα του φυλλικού οξέος (20 mg, 0.045 mmol), 1.2 ισοδύναμα DCC (11 mg , 0.054 mmol) και 1.2 ισοδύναμα NHS (6 mg, 0.054 mmol) σε άνυδρο DMF (5 ml) αναδεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου υπό μία ατμόσφαιρα αζώτου και σε ένα σκοτεινό για 3 ώρες. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 50 mg NH

2-CD (1 ισοδύναμο) και 0,8 ml πυριδίνης και το μίγμα αναδεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι για 8-40 ώρες. Το μίγμα της αντίδρασης μετά καταβυθίστηκε με 50 ml ακετόνης και ξεπλύθηκε διαδοχικά τρεις φορές με 50 ml ακετονιτριλίου, οξικού αιθυλεστέρα και αιθανόλης για την απομάκρυνση υδρόφοβων πλευρικών προϊόντων. Το προκύπτον κίτρινο ίζημα (48 mg) συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση και διαλύθηκε σε 20 ml απιονισμένο νερό. Ένα διαυγές υδατικό διάλυμα (15 ml) ελήφθη με διήθηση υπό κενό, το οποίο υποβλήθηκε σε διαπίδυση εκτεταμένα έναντι απιονισμένου νερού για μία εβδομάδα, με νερό αιμοκάθαρση ανανεώνεται καθημερινά. Το υδατικό διάλυμα συμπυκνώθηκε σε 5 ml και χρωματογραφήθηκε σε στήλη Sephadex CM C

25 ιονανταλλακτική στήλη flash με απιονισμένο νερό και ακολουθήθηκε από παρασκευαστική λεπτής υγρής χρωματογραφίας που εκλούεται με 1-ΡΑ: ΕtΟΑc: H

2O: NH

3Η

2O (6:1:2.5:1). Τα προϊόντα που περιείχαν τα συζεύγματα φολικού οξέος και ένα άλλο ελαιώδες κίτρινο παραπροϊόν με πολικότητα παρόμοιο με το επιθυμητό προϊόν. Τέλος, τα διαστερεομερή εντελώς καθαρίστηκε με ανακρυστάλλωση σε ακετόνη τρεις φορές, και ξηραίνεται σε κενό φούρνο όλη τη νύχτα. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα τα προϊόντα, μονο-6-δεοξυ-6- (γ- (2

S

) -2 – [(4 – {[(2-αμινο-4-hydroxypteridin-6-υλ) μεθυλ ] αμινο} φαινυλ) φορμαμιδο] πεντανοδιοϊκού οξέος) -β-κυκλοδεξτρίνη (γ-FACD) 11,6 mg (Σχήματα S5 & amp? S5) με απόδοση 41,6% (σκούρα κίτρινη σκόνη), μονο-6-δεοξυ-6- (α- ( 2

S

) -2 – [(4 – {[(2-αμινο-4-hydroxypteridin-6-υλ) μεθυλ] αμινο} φαινυλ) φορμαμιδο] πεντανοδιοϊκού οξέος) -β-κυκλοδεξτρίνης (α-FACD ) 3,2 mg (Σχήματα S7 & amp? S8) με απόδοση 11,4% (ελαφρά κίτρινη σκόνη), καθώς και των ποσοτήτων ίχνος δι-μονο-6-δεοξυ-6 – ((2

S

) -2- [(4 – {[(2-αμινο-4-hydroxypteridin-6-υλ) μεθυλ] αμινο} φαινυλ) φορμαμιδο] πεντανοδιοϊκού οξέος) -β-κυκλοδεξτρίνη (FA-δι-CD) 3,4 mg (Σχήμα S9) σε 7,1% απόδοση (Σχήμα 2).

Ο σχηματισμός των συμπλοκών εγκλεισμού επισκέπτη-ξενιστή μεταξύ Ada-Dox και κυκλοδεξτρίνες φολικό οξύ συζευγμένο παρασκευάστηκε με συν-καταβύθιση και η μέθοδος ξήρανσης με 1:01 στοιχειομετρία. FACDs (1 eq) διαλύθηκαν σε νερό, και το διάλυμα DMSO του Ada-Dox (1 eq) προστέθηκε στο διάλυμα κυκλοδεξτρίνης και στη συνέχεια αναδεύθηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C που ακολουθείται από μερική εξάτμιση. Το ίζημα συλλέχθηκε με διήθηση.

Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR) και Matrix-Assisted Laser εκρόφησης ιονισμού Time-of-Flight Φασματόμετρο Μάζας (MALDI-TOF-MS)

Υψηλής ανάλυσης

φάσματα 1Η NMR καταγράφηκαν σε ένα ψηφιακό NMR Spectrospin Bruker Avance 600 MHz και 800 MHz (Bruker BioSpin Co., The Woodlands, Τέξας). Η κινητική απελευθέρωση των φαρμάκων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Perkin-Elmer Lambda 2 υν /VIS φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης. εικόνες μικροσκοπία φθορισμού ελήφθησαν με το σύστημα Applied Precision DeltaVision (Issaquah, WA) εξοπλισμένη με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο της Olympus ΙΧ 70 (Tokyo, Japan). Ο σταθμός εργασίας εικόνα περιλαμβάνει λογισμικό SoftWoRx για την ψηφιακή απόκτηση εικόνας, αποσυνέλιξης, και οπτικά κοπής.

Τα φάσματα μάζης ελήφθησαν με ένα φασματόμετρο Bruker Daltronics Autoflex MALDI-TOF (Bruker Daltonics Inc., Billerica, ΜΑ), με α-κυανο -4-υδροξυκινναμωμικού οξέως (CHCA) ως μήτρα (10,0 mg /ml, από Thermo Scientific Pierce). Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με το πρόγραμμα mMass.

υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC)

αναλύσεις HPLC διεξήχθησαν σε ένα Agilent 1260 σύστημα Infinity HPLC (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, Καλιφόρνια ) που περιλαμβάνονται δυαδική αντλίες G1312C παροχής διαλύτη, ένα απαεριωτής G1379B, ένα G1329B αυτόματο δειγματολήπτη, μια φωτογραφία-ανιχνευτή συστοιχίας διόδων G4212B, έναν ανιχνευτή G1321B φθορισμού, και το λογισμικό του λειτουργικού Chemstation (Rev. Β 04. 03). Η HPLC ήταν εφοδιασμένο με έναν Agilent Eclipse Plus C

18 στήλη με μέγεθος σωματιδίων 3,5 μm και μέγεθος των 100 mm × 4,6 mm, το οποίο είχε τοποθετηθεί σε ένα φούρνο στήλης (G1316A) υπό μία σταθερή θερμοκρασία στους 25 ° C . Η κινητή φάση αποτελείται από ακετονιτρίλιο και νερό (Gradient). Ο ρυθμός ροής της στήλης ρυθμίστηκε σε 1.0 ml /min, ενώ η πίεση HPLC ελέγχθηκε μεταξύ 260-290 bars.

Ο /εξατμιστικό ανιχνευτή σκέδασης φωτός HPLC-UV (ELSD) και το HPLC-DAD /διαχωρισμού φθορισμού συνθήκες είχαν ως εξής: μέσο έκλουσης Α, νερό? υγρό εκλούσεως Β, ακετονιτρίλιο? κλίση, 0-6 min (10-15% Β), 6-50 λεπτά (15-40% Β), 50-60 λεπτά (40-80% Β), και στη συνέχεια εξισορροπήθηκε με 10% Β για 8 λεπτά σε ένα ροής 1.0 ml /min. ELSD ορίστηκε σε θερμοκρασία αισθητήρα 70 ° C, ένα κέρδος 7 και το άζωτο αέριο νεφελοποιητή ρυθμίζεται σε 2,5 bar.

μετασχηματισμού Fourier φασματοσκοπία υπερύθρου (FTIR)

Το όργανο που χρησιμοποιείται για την FTIR ανάλυση ήταν 1,725 ​​σειρά φασματόμετρο FTIR Perkin-Elmer (Perkin-Elmer Co., Norwalk, CT) εξοπλισμένο με ένα ανιχνευτή θειικό δευτεριωμένου τριγλυκίνη θερμοκρασία δωματίου και ελέγχεται από ένα Perkin-Elmer 7300 PC. Το λογισμικό που χρησιμοποιείται για τη συλλογή των δεδομένων FTIR ήταν το Spectrum έκδοση 5.3.1.

Εγκύκλιος Διχρωισμού Ανάλυση

Εγκύκλιος φάσματα διχρωϊσμού καταγράφηκαν στους 25 ° C σε ένα μοντέλο Αβίβ 215 κυκλικού φασματόμετρο διχρωϊσμού (Αβίβ Biomedicals Inc., Lakewood, NJ) χρησιμοποιώντας ένα 0,1 cm κύτταρο για τρεις σαρώσεις με εύρος ζώνης 0,1 nm. Η συγκέντρωση των φαρμάκων ήταν 50 μΜ σε DMF εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Η υβριδική συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας multi-mode Synergy Η4 αγοράστηκε από BioTek Instruments Inc. (Winooski, VT).

Ηλεκτρονική Μικροσκοπία (ΤΕΜ) και Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης (AFM)

Η μορφολογία και μέγεθος των supramolecules FACD-Ada-Dox αξιολογήθηκαν με μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίου (ΤΕΜ) και μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM). Ένα υδατικό διάλυμα FACD-Ada-Dox ήταν κυλούσε απευθείας πάνω σε πλέγμα χαλκού 300 mesh και ξηραίνεται σε κλίβανο κενού στους 35 ° C για 4 ώρες, στη συνέχεια εικόνες παρατηρήθηκαν με ΤΕΜ (JEM 100CX? JEOL Ltd, Tokyo, Japan) με μια τάση επιτάχυνσης 160 kV. Για εικόνες AFM, το δείγμα διαλύθηκε σε διπλά απιονισμένο νερό (1.0 mg /ml), ένα κλάσμα του διαλύματος (5.0 μΐ) κηλιδώθηκε επί ενός πρόσφατα διασπάστηκε επιφάνεια μίκας και θερμαίνεται στους 37 ° C για 3 ώρες. Απεικόνιση διεξήχθη σε Πολύτροπη Νθηοδοορθ AFM σε λειτουργία υποκλοπή, χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο υγρού, J σαρωτή και 200 ​​μm πρόβολοι με 1 nm Si

3Ν

4 συμβουλές.

3- (4, 5- διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) Δοκιμασία

JAR, ΗΤ-29 και 3Τ3 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 96-φρεατίων και διατηρήθηκαν όλη τη νύχτα σε μέσο ϋΜΕΜ. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με Dox, Ada-Dox, FACD-Ada-Dox, ή NFACD-Ada-Dox σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C. Η απορρόφηση μετρήθηκε μετά την προσθήκη ΜΤΤ. ΜΤΤ μειώνεται κατά μιτοχονδριακών δεϋδρογενασών σε ζωντανά κύτταρα σε ένα μπλε-mageta χρωματισμένο ίζημα φορμαζάνης. Η απορρόφηση της διαλυμένης φορμαζάνης στην περιοχή του ορατού συσχετίζεται με τον αριθμό των ανέπαφων δραστικών κυττάρων. Η κυτταροτοξικότητα εκτιμήθηκε με αναφορά στο IC

50 τιμή που ορίστηκε ως η συγκέντρωση που απαιτείται για μείωση κατά 50% της επιβίωσης με βάση τις καμπύλες επιβίωσης. IC

50 τιμές υπολογίστηκαν από καμπύλες δόσης-απόκρισης (π.χ., κλάσμα κυτταρικής επιβίωσης

vs

. Συγκέντρωση φαρμάκου) που ελήφθη στο πολυ-αναπαραχθούν πειράματα.

Drug Release Assay

Ο

in vitro

προφίλ απελευθέρωσης και κινητική της στόχευσης φαρμάκου FACD-Ada-Dox και προφάρμακο Ada-Dox προσδιορίστηκαν με μία μέθοδο αιμοκάθαρσης. Εν συντομία, 3 ml υδατικού φάρμακο προστέθηκε σε 1 ml PBS (ρΗ 7,4, 0,01 Μ). Το μίγμα αιωρήθηκε σε σάκο διάλυσης (αποκοπή μοριακού βάρους: 3.000 Dal) και υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι 10 ml PBS που περιέχει 50% ορό εμβρύου βοός (FBS) στους 37 ° C με ήπια ανακίνηση για τρεις ημέρες. Ένα κλάσμα 20 μΐ του δείγματος αποσύρθηκε από το μέσο επώασης σε καθορισμένους χρονικά σημεία και αποθηκεύονται κατεψυγμένα για ανάλυση. Η κυκλοφόρησε Ada-Dox ποσοτικά με αναγνώστη μικροπλάκας σε λ

Ex

= 490 nm και λ

Em

= 600 nm. Μια καμπύλη βαθμονόμησης παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις του ελεύθερου Ada-Dox.

Κυτταρομετρίας Ροής

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε σε ένα FACS (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) με μέτρηση 10000 γεγονότα. Για την αξιολόγηση της απόπτωσης των κυττάρων σε επεξεργασία με διάφορα φάρμακα σε ισοδύναμες συγκεντρώσεις, Dox, Ada-Dox, FACD-Ada-Dox και NFACD-Ada-Dox σε μια τελική συγκέντρωση των 5.0 μΜ προσετέθησαν στα έτοιμα φαγητά Petri 35 mm που περιείχε 2 × 10

5 ΗΤ-29, MCF-7, ή κύτταρα JAR σε μέσο 3.0 ml καλλιέργειας. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 2 ώρες για να επιτρέψει την πρόσληψη των φαρμάκων. Πριν από την ανάλυση, τα κύτταρα πλύθηκαν προσεκτικά με PBS τρεις φορές, σε επεξεργασία με θρυψίνη και επαναιωρήθηκαν στο μέσο μετά την επώαση. Τα συλλεχθέντα κύτταρα επανα-διασπείρονται σε 500 μΙ φρέσκου PBS και χρωματίστηκαν με 20 μΙ ϋΑΡΙ σε 1,0 μΜ για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Ο φθορισμός των Dox σχετίζονται μόριο μετρήθηκε με λ

EX

στα 490 nm και λ

EM

στα 600 nm. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα επωάζονται μόνο με DMEM (που περιείχε 10% FBS, συμπληρωμένου με 1% πενικιλίνη) χρησιμοποιήθηκαν ως οι έλεγχοι.

υποδοχέα φολικού-Δοκιμασία Σύνδεσης Ανταγωνισμού

Στην ανταγωνιστική ανίχνευση πρόσληψη φαρμάκου , κύτταρα JAR (FR θετικό) σπάρθηκαν σε δίσκους Petri 35 mm που περιέχει 5 × 10

5 κύτταρα και επωάζονται στους 37 ° C με FACD-Ada-DOX στα 2 μΜ για 5 ώρες με την παρουσία FA στα 5, 10 ή 50 μΜ. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS τρεις φορές, σε επεξεργασία με θρυψίνη και επαναιωρήθηκαν στο PBS. Τα συλλεχθέντα κύτταρα επανα-διασπείρονται και οι εντάσεις φθορισμού προσδιορίστηκαν με κυτταρόμετρο ροής.

Ομοεστιακή Laser Scanning Microscopy

Ομοεστιακή εικόνες καταγράφηκαν με PerkinElmer Ultraview ERS γυρίζοντας δίσκο ομοεστιακό μικροσκόπιο (PerkinElmer Inc. , Waltham, ΜΑ). JAR ή JEG-3 κύτταρα σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες σε πλάκες δυο φρεατίων και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ή χωρίς 5,0 μΜ φάρμακα για 2 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS τρεις φορές για να απομακρυνθεί το μη δεσμευμένο ναρκωτικά και σταθεροποιήθηκαν σε 2 ml 4% paraformade σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές και στη συνέχεια τοποθετείται με μέσο που περιέχει DAPI (1,5 μg /ml). Τα πλακίδια ωρίμασαν επί μία νύκτα στο σκοτάδι. Για να μελετηθεί η πρόσληψη φαρμάκων επί 2 ώρες σε κύτταρα κατεργασμένα με διαφορετικά σύμπλοκα φαρμάκου, τα κύτταρα εξετέθησαν σε φάρμακα με διαφορετικούς χρόνους επώασης (15 λεπτά αύξηση). Οι εικόνες συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν.

Μοριακή σύνδεσης της βιβλιοδεσίας της FA και των συζυγών της στα ανθρώπινα Hedgehog πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης (HHIP)

Δυστυχώς, οι κρυσταλλικές δομές των ανθρώπων και των ζώων RCF /SLC19A1, FR /FRα /FLOR1, FRβ /FLOR2, FRγ /FLOR3, FRδ /FLOR4 και PCFT /SLC46A1 δεν έχουν επιλυθεί μέχρι σήμερα. Δεν δομές των βακτηρίων και ζυμομυκήτων ομόλογα έχουν αναφερθεί και ως εκ τούτου είναι απίθανο να δημιουργήσει ένα μοντέλο ομολογίας. Διενεργήσαμε προκαταρκτική μελέτη σύνδεσης του FA και συζυγών της να HIPP που περιέχει ένα πεδίο FRα εξετάστηκε χρησιμοποιώντας το Discovery Studio 3.1 (Accelrys Software Inc., San Diego, CA) όπως περιγράφεται από εμάς προηγουμένως [17], [18]. εφαρμόστηκαν διάφορες λειτουργικές μονάδες στο Discovery Studio 2.1, περιλαμβανομένων διαφόρων Διάπλαση Γενιάς, Υπολογίστε Molecular Properties, Δημιουργία Πολλαπλό Γραμμικό Μοντέλο Παλινδρόμησης και CDOCKER. Το πρόγραμμα εκτελείται με τη χρήση ενός διακομιστή optiplex755 Dell και Chemoffice2002 (CambridgeSoft, Cambridge, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε για την ένωση των διαρθρωτικών φινέτσα. Η κρυσταλλική δομή του HHIP επιλέχθηκε από την Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/pdb/) με το προσχέδιο προϋπολογισμού ID της 2WFT [19] που βρέθηκε να περιέχει έναν τομέα FRα όταν ψάξαμε τη βάση δεδομένων PCAM 26,0 (https://pfam.sanger.ac.uk/). Η βάση δεδομένων Pfam είναι μια μεγάλη συλλογή των οικογενειών πρωτεϊνών, κάθε εκπροσωπείται από πολλαπλές στοιχίσεις και κρυμμένα μοντέλα Markov. Οι μοριακή δυναμική (MD) προσομοιωμένης ανόπτησης διαδικασία διεξήχθη χρησιμοποιώντας μια άκαμπτη πρωτεΐνη και ευέλικτο συνδετήρα. Οι αλληλεπιδράσεις συνδέτη-FRα υπολογίστηκαν είτε από GRID Ι, GRID ΙΙ, ή το πλήρες δυναμικό πεδίο. Ένα τελικό στάδιο ελαχιστοποίησης εφαρμόστηκε σε κάθε ένα από πόζες σύνδεσης του υποκαταστάτη. Κατά τη διάρκεια του συνδέτη προετοιμασία, το αντίγραφο δομή διαγράφηκε. Οι επιλογές για την αλλαγή ιονισμού, ταυτομερούς ή ισομερές γενιάς, φίλτρο Lipinski και 3D γεννήτρια ήταν όλα έτοιμα αλήθεια [20]. Μετά από εξευγενισμένα με CHARMM, οι ενώσεις αγκυροβολημένο στην πιθανή θέση πρόσδεσης της πρωτεΐνης. Η βάση σύνδεσης διεξήχθη με εξέταση της ηλεκτροστατικής ενέργειας και van der Waals (VDW) δύναμη, τα οποία μαλάκωσε σε διάφορα επίπεδα κατά τη διάρκεια της διαδικασίας σύνδεσης, αλλά αυτό το μαλάκωμα έχει αφαιρεθεί για την τελική ελαχιστοποίηση [21] .Για κάθε καθορισμένο VDW ή ηλεκτροστατικών ανιχνευτή , οι αλληλεπιδράσεις με όλα τα άτομα πρωτεΐνη φυλάχθηκαν σε αυτά τα σημεία πλέγματος. Για άτομα συνδέτης βρίσκεται μεταξύ των σημείων πλέγματος, μία τρι-γραμμική παρεμβολή χρησιμοποιήθηκε για την προσέγγιση των πηγών ενέργειας. Ένα αρμονικό δυναμικό με τη σταθερή δύναμη 300 kcal /mol εφαρμόστηκε έξω από τα όρια του δικτύου.

Προσδιορισμός της Κυτταρικής δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) Επίπεδα

Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS σε H9c2 το ποντίκι (2 -1) κύτταρα ποσοτικά χρησιμοποιώντας CM-H

2DCFDA ως ανιχνευτής για παραγωγή ROS [22]. CM-H

2DCFDA είναι ένα παράγωγο χλωρομεθυλο του H

2DCFDA, χρήσιμος ως δείκτης για ROS στα κύτταρα. H9c2 (2-1) κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα πιάτο με πυκνότητα 3 × 10

6 κύτταρα ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Dox, Ada-Dox, FACD-Ada-Dox, ή NFACD-Ada-Dox, και στη συνέχεια ξεπλένεται με PBS. Στη συνέχεια, η ένταση του φθορισμού μετρήθηκε. Η συγκέντρωση του φαρμάκου ήταν 2,0 μΜ σε H9c2 (2-1) κύτταρα. Τα κύτταρα μάρτυρες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το όχημα DMSO σε τελική συγκέντρωση 0,05% (ν /ν).

ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS σε κύτταρα 3Τ3 ποντικού ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία διχλωροφθορεσκεϊνης [23]. 3Τ3 σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα σε μια πυκνότητα των 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Dox, Ada-Dox, ή FACD-Ada-Dox σε 5,0 μΜ, τότε τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με PBS, εν συνεχεία 75 μΙ PBS, και 25 μΐ διάλυμα 2 ‘, 7’-dichlorfluorescein-διοξική (DFCH-DA) σε τελική συγκέντρωση 62,5 μΜ σε ρυθμιστικό PBS προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Ο φθορισμός από κάθε φρεάτιο μετρήθηκε στους 35 ° C αμέσως μετά την ενσωμάτωση του αντιδραστηρίου και κάθε 5 λεπτά για 1 ώρα με χρόνο ολοκλήρωσης 1 δευτερόλεπτο, με τη χρήση 485 και 535 nm όπως διέγερσης και εκπομπής μήκη κύματος. Καταγραφή της έντασης φθορισμού με το χρόνο χρησιμοποιείται ως δείκτης των επιμέρους ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS στα κύτταρα 3Τ3. Η απάντηση της μεθόδου ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ένα

2O

2 καμπύλη H. Πέντε ανεξάρτητα πειράματα ανά αγωγή.

Μέτρηση υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GPx) Δραστηριότητα και GSH Περιεχόμενο

Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο BCA μετά την εκχύλιση πρωτεϊνών από τα κύτταρα. Οι δραστηριότητες των GPx και το περιεχόμενο των GSH κλιμακώθηκαν την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη για τη διόρθωση για τις διαφορές στο βιομάζα των διαφόρων προϊόντων ομογενοποίησης. Τα επίπεδα GSH στα κύτταρα προσδιορίστηκαν σύμφωνα με την μέθοδο του Beutler

κ.ά.

. [24] βασίζεται στο σχηματισμό του 2-νιτρο-5-tiobenzoic οξέος από DTNB παρουσία GSH. Εν συντομία, 25 μΐ τριχλωροξικού οξέος (15%) προστέθηκε σε 50 μλ του ομογενοποιήματος, που ακολουθείται από φυγοκέντρηση στα 13, 000

g

για 5 λεπτά στους 4 ° C. Ένα κλάσμα υπερκειμένου (50 μλ) αναμίχθηκε με 50 μΙ 3,4 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA) διαλυμένο σε PBS, 1 ml PBS, και 250 μΐ DTNB σε PBS (20 mg /ml). Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 412 nm μετά από 15 λεπτά και σε σύγκριση με μία πρότυπη καμπύλη της GSH (0,01-0,5 mM). Η δραστικότητα GPx μετρήθηκε με βάση την οξείδωση της GSH με GPx συζευγμένο με την εξαφάνιση του μειωμένης φωσφορικό νικοτιναμιδο-αδενινο δινουκλεοτιδίου (NADPH) από γλουταθειόνη αναγωγάσης.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως ο μέσος ± τυπική απόκλιση (SD). Η σύγκριση των τιμών για πολλαπλές ομάδες αγωγής διεξήχθη με το ένα ή αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από Bonferroni πολλαπλής σύγκρισης τεστ σε

P

& lt? 0.05. Οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας unpaired Student του

t-test

. Ένα

P

αξία των & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Σύνθεση FACDs και FACD-Ada-Dox και των διαρθρωτικών αποφασιστικότητά τους από φασματικές τεχνικές

.

Η συνθετική διαδικασία για FR στόχευση β-CD με βάση αδαμαντάνιο-Dox supramolecule απεικονίζεται στην Εικόνα 2. για την κατασκευή του supremolecule, οι στόχευσης φορείς φαρμάκων παρασκευάστηκαν πρώτον. Mono-6-αμινο-6-δεοξυ-CD (ΝΗ

2-CD) συντέθηκε ως το αρχικό υλικό σύμφωνα με τη μέθοδο του Petter

κ.ά.

. [25] με κάποιες τροποποιήσεις. σι.