Αφηρημένο

Sagopilone, μια βελτιστοποιημένη πλήρως συνθετικό εποθιλόνης, είναι μια ένωση σταθεροποίησης των μικροσωληνίσκων που έχει δείξει υψηλό

in vitro

και

in vivo

δράση ενάντια σε ένα ευρύ φάσμα μοντέλων ανθρώπινων όγκων. Αναλύσαμε το διαφορικό μηχανισμό δράσης του sagopilone σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα σειρές κυττάρων

in vitro

. Sagopilone ανέστειλε πολλαπλασιασμό των μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα γραμμές σε χαμηλότερη συγκέντρωση nanomolar. Η θεραπεία με sagopilone προκάλεσε ισχυρές διαταραχές της κυτταρικής οργάνωσης του κυτταροσκελετού. Παρατηρήθηκαν δύο φαινοτύπους εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση. Στο 2,5 nM sagopilone ή 4 nM πακλιταξέλη μια ανευπλοειδικών φαινότυπο προκύψει λαμβάνοντας υπόψη ότι μια μιτωτική φαινότυπο σύλληψη προκλήθηκε από 40 nm sagopilone ή πακλιταξέλη. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία με 2.5 ηΜ του sagopilone αποτελεσματικά ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά – σε σύγκριση με υψηλές συγκεντρώσεις (40 ηΜ) – μόνο οριακά επαγόμενη απόπτωση. Η θεραπεία με υψηλή έναντι χαμηλή συγκέντρωση sagopilone ή paclitaxel ρυθμίζει μια μη-επικαλυπτόμενα σύνολο γονιδίων, που δείχνει ότι οι δύο φαινότυποι διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους. Γονίδια που εμπλέκονται στην G2 /M φάση μετάβασης και το σημείο ελέγχου συναρμολόγηση ατράκτου, όπως κυκλίνης Β1 και BUBR1 ήταν απορυθμίζεται με κατεργασία με 40 nm sagopilone. Απροσδόκητα, επίσης γονίδια που εμπλέκονται στην αντιμετώπιση βλαβών του DNA ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω από την εν λόγω θεραπεία. Αντίθετα, η θεραπεία των Α549 κυττάρων με χαμηλή συγκέντρωση sagopilone αποκάλυψε μια ρύθμιση προς τα πάνω της άμεσης μεταγραφικής γονιδίων στόχων του ΤΡ53, όπως CDKN1A, MDM2, GADD45A, FAS. Knockdown του ΤΡ53, που ανέστειλε τη μεταγραφική επαγωγή των γονιδίων στόχων ΤΡ53, οδήγησε σε σημαντική αύξηση της επαγωγής απόπτωσης σε κύτταρα Α549 όταν έλαβαν θεραπεία με χαμηλή συγκέντρωση sagopilone. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενεργοποίηση των ΤΡ53 και κατάντη επενεργητές του όπως CDKN1A με χαμηλές συγκεντρώσεις sagopilone είναι υπεύθυνη για τη σχετική αντίσταση απόπτωση των κυττάρων Α549 και μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα μηχανισμό αντοχής σε sagopilone

Παράθεση:. Winsel S, Sommer Α, Eschenbrenner J, K Mittelstaedt, Klar U, Hammer S, et al. (2011) Μοριακή Τρόπος δράσης και ο ρόλος του TP53 στην ευαισθησία στην Μυθιστόρημα εποθιλόνη Sagopilone (ΖΚ-ΕΡΟ) στο Α549 μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 6 (4): e19273. doi: 10.1371 /journal.pone.0019273

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Αυγ του 2010? Αποδεκτές: 31 Μάρτη, 2011? Δημοσιεύθηκε: 29 Απριλίου 2011

Copyright: © 2011 Winsel et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο χρηματοδοτήθηκε από την Bayer Healthcare (www.bayerhealthcare.com). Οι χρηματοδότες είχαν ένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση, και την προετοιμασία του χειρογράφου. Όλοι οι συγγραφείς είναι υπάλληλοι ή πρώην υπάλληλοι της Bayer Healthcare. Τη χορήγηση στήριξης αναλυτικά: Σ Winsel, J. Eschenbrenner, Κ Mittelstaedt παραληφθέντα εμπορική ερευνητικές επιχορηγήσεις από την Bayer Healthcare? Α Sommer, U. Klar, S. Hammer, J. Hoffmann είναι νυν ή πρώην employes της Bayer Healthcare και κρατήστε τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας στην Bayer Healthcare καθώς και μετοχές της Bayer

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει το πολιτική και περιοδικού έχουν τις ακόλουθες συγκρούσεις: Η εταιρεία είχε έναν ρόλο σε αυτή τη μελέτη στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση και την προετοιμασία του χειρογράφου. Όλοι οι συγγραφείς είναι υπάλληλοι ή πρώην υπάλληλοι της Bayer Healthcare. Τη χορήγηση στήριξης αναλυτικά: Σ Winsel, J. Eschenbrenner, Κ Mittelstaedt παραληφθέντα εμπορική ερευνητικές επιχορηγήσεις από την Bayer Healthcare? Α Sommer, U. Klar, S. Hammer, J. Hoffmann είναι νυν ή πρώην employes της Bayer Healthcare και κρατήστε τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας στην Bayer Healthcare καθώς και μετοχές της Bayer. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, όπως είναι συχνά μόνο διαγιγνώσκονται σε προχωρημένα στάδια και εμφανίζει ένα υψηλό βαθμό αντίστασης προς τις χημειοθεραπευτικές αγωγές που χρησιμοποιήθηκαν. [1] – [5]. Sagopilone (SAG) είναι ένα πλήρως συνθετικό εποθιλόνης, επί του παρόντος σε κλινική ανάπτυξη, που βελτιστοποιήθηκε για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί συχνά σχετίζεται με ταξάνες, συμβατικούς παράγοντες σύνδεσης τουμπουλίνης (TBAs) όπως για παράδειγμα MDR μεσολάβηση ανθεκτικά μηχανισμούς [6]. SAG έχει επιδείξει υψηλή

in vitro

και

in vivo

δραστηριότητα σε μια σειρά από μοντέλα όγκων σε σύγκριση με πακλιταξέλη (PAC) και άλλα συνήθως χρησιμοποιούμενα χημειοθεραπευτικά μέσα [6]. Με ισχυρή αντικαρκινική δραστικότητα έχουν παρατηρηθεί σε NSCLC (μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα) κυτταρικές σειρές

in vitro

και πρωτογενών ανθρώπινων μοντέλων NSCLC ποντικού ξενομοσχεύματος, SAG μπορεί να παρέχει μία δυνητική νέα ευκαιρία για τη θεραπεία NSCLC [7].

Αρκετές μελέτες περιγράφουν προγνωστική δείκτες απόκρισης για κυτταρικές γραμμές NSCLC, ως έκφραση της ομάδας επισκευή εκτομή εγκάρσιας συμπληρώσεως 1 (ERCC1) γονίδιο για ενώσεις λευκοχρύσου [8] ή του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) κατάστασης μεταλλάξεων για τις τυροσίνης κινάσης αναστολείς EGFR (gefitinib και erlotinib) [9]? [10]. Όσον αφορά την αντοχή σε TBAs, εκθέσεις σε κυτταρικές σειρές που επιλέγονται για την αντοχή PAC μέσω μακροχρόνιας καλλιέργειας με την παρουσία του φαρμάκου έδειξαν αυξημένα επίπεδα TUBB3 (beta III τουμπουλίνης) πρωτεϊνική έκφραση [11]. Σε αντίθεση, ανθεκτικό ομόλογό τους patupilone (εποθιλόνη Β), επωάστηκαν με τον ίδιο τρόπο, έδειξαν χαμηλή έκφραση της πρωτεΐνης TUBB3 [11]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι TUBB3 συνεισφέρει στην κυτταρική αντίσταση προς PAC αλλά όχι με την εποθιλόνη. Κατά συνέπεια υπάρχει ανάγκη για άλλους δείκτες που μπορούν να προβλέψουν απόκριση SAG.

Μεταλλάξεις σε γονίδια καταστολής όγκων, η οποία παίζει κεντρικό ρόλο στην κυτταρική απόκριση σε βλάβη του DNA, τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, και την απόπτωση [12] , βρέθηκαν στο περίπου 50% όλων των περιπτώσεων NSCLC [13]. Ωστόσο, ο ρόλος των TP53 σε απάντηση ΤΒΑ όπως PAC έχει αμφισβητηθεί: Μερικές ομάδες ανέφεραν καμία συσχέτιση μεταξύ TP53 κατάστασης μεταλλάξεων και την ευαισθησία στην PAC [14]? [15], ενώ άλλοι παρατήρησε ότι η έλλειψη δραστηριότητας ΤΡ53 οδήγησε σε αυξημένη χημειοευαισθησία προς PAC [16]? [17]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η κατάσταση μεταλλάξεων ΤΡ53 και μεταβάλλεται δραστηριότητα TP53 θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ευαισθησία των κυττάρων στην SAG. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, έχουμε αναλύσει την επίδραση της ΤΡ53 στην ικανότητα της SAG να επάγει απόπτωση σε ένα μοντέλο NSCLC

in vitro

.

Ο προσδιορισμός των biomakers διαστρωμάτωση ή τα ναρκωτικά ή τα ναρκωτικά στόχο δείκτες-σχετικών απάντηση θα μπορούσε να βελτιώσει σημαντικά την έκβαση της θεραπείας και θα οδηγήσει σε μια στροφή προς πιο προσαρμοσμένες θεραπείες ενάντια σε συγκεκριμένους τύπους της νόσου [18]. Η βέλτιστη θεραπεία για ασθενείς που πάσχουν από NSCLC θα βασίζονται όλο και περισσότερο στην ανάλυση βιοδείκτη για τον προσδιορισμό του πληθυσμού των ασθενών που θα ωφεληθούν περισσότερο από ένα ορισμένο μονο- ή θεραπεία συνδυασμού. Παρ ‘όλα αυτά, η αναγνώριση και η επικύρωση των βιοδεικτών παραμένει σημαντική πρόκληση [19] και, συνεπώς, είναι σημαντικό να συνοδεύει την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παραγόντων για ασθενείς με ΜΜΚΠ με την έρευνα για τη διαστρωμάτωση των ασθενών και την αναγνώριση και την επικύρωση της κλινικής βιοδεικτών που προβλέπουν την απόκριση. Ως μέρος αυτής της διαδικασίας, είναι ζωτικής σημασίας να κατανοήσουμε πώς η δραστηριότητα των πολλά υποσχόμενων νέων παραγόντων επηρεάζεται από αλλαγές σε βασικές κυτταρικές οδούς, και το αντίστροφο.

Ο στόχος της μεταφραστικής του προγράμματός μας ήταν να εξετάσει τη δραστηριότητα των SAG

in vitro

σε ένα πάνελ των κυτταρικών σειρών NSCLC, να αναλύσει περαιτέρω το μηχανισμό δράσης του και να το συγκρίνουμε με τα αποτελέσματα της PAC και για τη διερεύνηση πιθανών μηχανισμών αντοχής, καθώς και προγνωστικοί παράγοντες ανταπόκρισης βασίζεται σε προφίλ γονιδιακής έκφρασης.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα κύτταρα και οι ενώσεις

Ανθρώπινο κυτταρικές σειρές καρκινώματος του πνεύμονα (Α549, ΝΟΙ-H1437, NCI-H23, ΝΟΙ-Η522, ΝΟΙ-Η226, NCI- Η460) λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που συνιστά. SAG συντέθηκε στην Bayer Healthcare Εργαστήρια μέσω της συνολικής συνθέσεις. PAC αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (Μόναχο, Γερμανία). Ο αναστολέας ZVAD.fmk παν-κασπάσης αγοράστηκε από την Bachem, (Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Όλα τα μέσα και τα συμπληρώματα για την καλλιέργεια κυττάρων αγοράστηκαν από Biochrom AG (Βερολίνο, Γερμανία). Αποθεματικά διαλύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Για την επιλογή των σταθερώς μετασχηματισμένων γραμμών κυττάρων Υγρομυκίνη αγοράστηκε από την Roche (Mannheim, Germany).

πολλαπλασιασμός καρκινικών κυττάρων δοκιμασία

Η επίδραση της SAG ή PAC επί του πολλαπλασιασμού του καρκίνου του πνεύμονα εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρου που βασίζεται στη χρώση των κυττάρων με κρυσταλλικό ιώδες, όπως περιγράφεται προηγουμένως [20]. Οι τιμές IC50 υπολογίστηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα χρησιμοποιώντας το λογισμικό Sigmaplot (SPSS, Friedrichsdorf, Γερμανία).

In vitro

ανάλυση των επιπτώσεων στο κυτταροσκελετό, του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης

κύτταρα Α549 επωάστηκαν με όχημα (αιθανόλη 0,1%), 2,5 ηΜ ή 40 ηΜ SAG για 20 ώρες, σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με ένα αντι-α-τουμπουλίνης μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (1:1000) (Sigma-Aldrich ), αντι-ποντικού IgG δευτερεύον αντίσωμα Alexa Fluor® 488-συνδεδεμένο κατσίκα (1:250) (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA) και DRAQ5 (Biostatus, Leicestershire, UK), σύμφωνα με τυποποιημένα πρωτόκολλα. Σταθερή και χρωματισμένα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss LSM 510 META μικροσκόπιο (Carl Zeiss AG, Jena, Germany) εξοπλισμένο με 63x /1.4 (DIC πετρελαίου) στόχος του σχεδίου-Apochromat®. λογισμικό Zeiss LSM (έκδοση 3.0 SP3) χρησιμοποιήθηκε για συνεστιακή απεικόνιση.

ενεργοποιημένων με φθορισμό διαλογέα κυττάρου (FACS) διεξήχθη για να προσδιοριστεί κατανομή κύκλου κυττάρου του SAG- ή PAC-επεξεργασμένα κύτταρα. Τα κύτταρα επωάστηκαν με SAG στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ή όχημα για 18 ώρες, στερεώθηκαν με 70% αιθανόλη, και χρωματίστηκαν με 50 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (Sigma-Aldrich). Cellular περιεχόμενο DNA προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το BD FACSCalibur ™ (Becton, Dickinson and Company, San Jose, CA, USA) και τα δεδομένα αναλύθηκαν με το λογισμικό CellQuest ™ (Becton, Dickinson and Company). Για να διερευνηθεί απόπτωσης με FACS, τα κύτταρα Α549 επωάστηκαν συνεχώς για 72 ώρες με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις SAG ή του οχήματος, σε επεξεργασία με θρυψίνη και χρωματίστηκαν με DiOC

6 (3), (3,3′-dihexyloxacarbocyanine ιωδιούχο) (Invitrogen Inc.) και PI όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21].

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR και Western Blot

RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία), cDNA δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας SuperScript First Strand Σύνθεση System (Invitrogen Inc.). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με δοκιμασίες έκφρασης γονιδίου από την Applied Biosystems: p21 (# Hs00355782_m1), ΤΡ53 (# Hs00153340_m1), κυκλίνη Β1 (# Hs00259126_m1), BUBR1 (Hs00176169_m1), FAS (Hs00163653_m1), GADD45A (Hs00169255_m1), MDM2 ( Hs00242813_m1), και HPRT (# 4326321E) ως ενδογενή έλεγχο. Αντιδράσεις στήθηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας το TaqMan FAST Οικουμενική PCR βασικού μείγματος και καταγράφονται σε 7500 Fast Real-Time PCR-System (Applied Biosystems). Η σχετική έκφραση του κάθε γονιδίου προσδιορίστηκε ποσοτικά σύμφωνα με τη μέθοδο συγκριτικής κύκλος κατωφλίου (ΔΔ

Ct μέθοδος) με αποτελεσματικότητα ίση ενίσχυση του στόχου και του ενδογενούς μάρτυρα.

Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας Μ-PER θηλαστικών Protein Αντιδραστήριο εκχύλισης (Pierce, Perbio Science, Βόννη, Γερμανία). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των προϊόντων λύσης προσδιορίστηκε με την BCA Protein Assay Kit (Pierce) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν σε 4-12% Bis-Tris γέλης (Invitrogen) σε ένα θάλαμο ηλεκτροφόρησης XCell SureLock (Invitrogen) που γεμίζουν με MOPS SDS ρυθμιστικό τρέξιμο και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά το μπλοκάρισμα της μη ειδικής θέσεων δέσμευσης, η μεμβράνη ανιχνεύτηκε με αντισώματα ειδικά για CDKN1A (Abcam, # 16767), ΤΡ53 (BD ​​Pharmingen, # 15801A), BUB1B (BD Transduction Laboratories, # 612502), κυκλίνη Β1 (BD Pharmingen, # 554176 ), γH2AX (Upstate, # 05-636), PARP (BD Pharmingen, # 551024), φωσφο-Ser /Thr-MPM-2 (Upstate # 05-368), και GAPDH (Advanced αντιγονοχημικές # RGM2 /κλώνος 6C5) ως έλεγχος φόρτωσης.

εκχύλιση RNA για ανάλυση γονιδιακής έκφρασης

Α549 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 10 cm και αφέθηκαν να προσκολληθούν για μία νύχτα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με μέσο που περιέχει είτε 2,5 ηΜ SAG, 40 ηΜ SAG, 4 ηΜ PAC ή 40 ηΜ PAC, αντίστοιχα, του οχήματος (αιθανόλη 0,1%), ή αφέθηκαν χωρίς θεραπεία για 18 ώρες. Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) που περιλαμβάνει ένα I (Qiagen) βήμα για την εξάλειψη των γενωμικού DNA DNase. Ολικό RNA ελέγχθηκε για ακεραιότητα χρησιμοποιώντας τα RNA LabChips στην Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA, USA) και η συγκέντρωση προσδιορίστηκε σε ένα φασματοφωτόμετρο Nanodrop (Peqlab, Erlangen, Germany). Όλα τα δείγματα RNA είχε αριθμοί υψηλή ακεραιότητα του RNA [22] μεγαλύτερο από 9.5.

Affymetrix GeneChip® ανάλυση

Το One-Κύκλος ευκαρυωτικά στόχος Labeling Kit (Affymetrix Inc., Santa Clara, Καλιφόρνια, ΗΠΑ ) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 2 μα υψηλής ποιότητας ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας Τ7 ετικέτα ολιγο-άΤ εκκινητή για την αντίδραση σύνθεση cDNA πρώτου κλώνου. Μετά από ΚΝάση Η σύνθεση δεύτερου κλώνου cDNA, το δίκλωνο cDNA καθαρίστηκε και χρησίμευσε ως μήτρα για την επακόλουθη

vitro αντίδραση μεταγραφής

σε η οποία παράγει βιοτίνη σημασμένο συμπληρωματικό RNA (cRNA). Το βιοτινυλιωμένο cRNA στη συνέχεια καθαρίζονται, κατακερματισμένη και υβριδοποιήθηκε σε συστοιχίες έκφραση GeneChip HGU133Plus2.0 (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA.), Που περιέχουν 54.675 σύνολα ανιχνευτή. Τα GeneChips πλύθηκαν και χρωματίστηκαν με στρεπταβιδίνη-φυκοερυθρίνη σε ρευστών Station GeneChip 450 (Affymetrix). Μετά το πλύσιμο, οι συστοιχίες σαρώθηκαν σε μια Affymetrix GeneChip 3000 σαρωτή με μηχανισμό αυτόματης φόρτωσης. Συνολικά 30 συστοιχίες HGU133Plus2.0 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με η = 5 βιολογική επαναλήψεων για όλες τις ομάδες θεραπείας.

Έκφραση αναλύσεις διεξήχθησαν με το Pro 4.0 λογισμικό Expressionist (Genedata AG, Βασιλεία, Ελβετία). Η ποιότητα των αρχείων δεδομένων (format CEL) που περιέχει δεδομένα έκφρασης επίπεδο ανιχνευτή ελέγχθηκε και εξευγενισμένα χρησιμοποιώντας το λογισμικό εξπρεσιονιστικές διύλισης (Genedata AG). Η διαδικασία ραφιναρίσματος πραγματοποιήθηκε με την ομαδοποίηση των δειγμάτων σε επίπεδο έντασης χαρακτηριστικό. Αυτό επιτρέπει τον εντοπισμό των πιθανών ακραίων τιμών σε επίπεδο έντασης χαρακτηριστικό. Στη συνέχεια, εκλεπτυσμένη αρχεία CEL συμπυκνώνονται με αλγόριθμο MAS5.0 (Affymetrix) και Lowess ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας όλα τα πειράματα ως αναφορά. Οι κανονικοποιημένες σύνολα δεδομένων έκφρασης φορτώθηκαν στη βάση δεδομένων Κόμπι (Genedata) και αναλύονται με το λογισμικό Genedata εξπρεσιονιστικές. Ανάλυση αρχή συνιστωσών (PCA) και η ιεραρχική ομαδοποίηση έγινε με το Pro 4.0 λογισμικό εξπρεσιονιστικές Analyst (Genedata). Μια έγκυρη ανάλυση αναλογία αξία πραγματοποιήθηκε για κάθε ομάδα (4 από 5 σετ ανιχνευτή έπρεπε να δείξει ένα σήμα) και το προκύπτον ομάδες ανιχνευτών ενώθηκαν. Αυτά τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε μια σειρά από ζεύγη συγκρίσεις χρησιμοποιώντας το Pro 4.0 λογισμικό εξπρεσιονιστικές Analyst (Genedata). Οι στατιστικές αναλύσεις που περιλαμβάνονται κατά ζεύγη συγκρίσεις μεταξύ SAG- ή PAC επεξεργασμένα δείγματα και τα δείγματα υπό αγωγή με όχημα. σετ καθετήρα θεωρήθηκαν να ρυθμιστεί αν ήταν έξω από το ελλειψοειδές περιοχής στο οικόπεδο Ηφαίστειο εφαρμογή τα ακόλουθα κατώτατα όρια: οικόπεδο Ηφαίστειο: & gt? 5x φορές αλλαγή και P-value & lt? 1 × 10-5 από την T-test για 40 nM SAG και PAC? για 2,5 nM SAG και 4 nM PAC & gt? 3-φορές αλλαγή και P-value & lt? 5 × 10-3. Βεν διασταύρωση αναλύσεις σημαντικά ρυθμιζόμενων γονιδίων έγιναν για τον εντοπισμό γονιδίων που ρυθμίζονται συνήθως από διαφορετικές θεραπείες με τη χρήση του Pro 4.0 λογισμικό εξπρεσιονιστικές Analyst. αναλύσεις μονοπάτι πραγματοποιήθηκαν με την GeneGo Metacore (Αγίου Ιωσήφ, MI, USA) λογισμικού βάσεων δεδομένων και εργαλείων. Όλα τα δεδομένα Affymetrix cel-αρχείο είναι διαθέσιμο μέσω του αριθμού ένταξη ArrayExpress E-mtab-377.

Κλωνοποίηση shRNA κατασκευάζει

Το μπλοκ-iT RNAi αλγόριθμο Designer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση ΤΡ53 mRNA (GenBank αριθμός πρόσβασης, NM_000546.4) και για τον εντοπισμό των τριών αλληλουχιών στόχου για shRNA, δηλαδή shTP53_1 (με νόημα) 5′-GCATCTTATCCGAGTGGAAGG-3 ‘και 5′-CCTTCCACTCGGATAAGATGC-3′? shTP53_2 (με νόημα) 5’-GACTCCAGTGGTAATCTAC-3 ‘και 5′-GTAGATTACCACTGGAGTC-3′? shTP53_3 (με νόημα) 5’-GCGCACAGAGGAAGAGAATCT-3 ‘και 5′-AGATTCTCTTCCTCTGTGCGC-3’. Οι αλληλουχίες στόχοι για έναν μη ειδικό έλεγχο shRNA (μη στόχευση shRNA) ήσαν shCtrl1 (με νόημα) 5′-TAAGGCTATGAAGAGATAC-3 ‘και 5′-GTATCTCTTCATAGCCTTA-3′ και shCtrl2 (με νόημα) 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘και 5 «-ACGTGACACGTTCGGAGAA-3 ‘.

Συμπληρωματικά συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια DNA υβριδοποιήθηκαν και εισάγεται εντός pENTR /φορέα U6 (Invitrogen). κασέτες shRNA ανασυνδυάστηκαν με πύλη κλωνοποίηση σε ένα τροποποιημένο Plenti-6 φορέα προορισμού (pGT3, Invitrogen) για να δημιουργήσει λεντοϊού έκφραση shRNA κατασκευάζει shCtrl1, shCtrl2, shTP53_1, shTP53_2 και shTP53_3. Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση DNA στις υπηρεσίες στη Μοριακή Βιολογία (SMB), Βερολίνο, Γερμανία.

Παραγωγή φακοϊό και μεταγωγή των κυττάρων Α549

293FT κύτταρα επιμολύνθηκαν με διαφορετικούς φορείς έκφρασης pGT3 που περιέχουν ΤΡ53 Τα siRNAs ή μη στοχευόμενων έλεγχο shRNA. Lentivirus παραγωγή πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το BLOCK-iT U6 RNAi Έναρξη Vector Εγχειρίδιο Kit χρήστη (Invitrogen). Τα κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με φακοϊούς ανασυνδυασμένη για shTP53_1, shTP53_2, shTP53_3, ή τον έλεγχο των μη στοχευόμενων Τα siRNAs shCtrl1 και shCtrl2, αντίστοιχα, και επιλεγμένα με υγρομυκίνη (100 μg /ml). Μεμονωμένα κλώνοι επεκτάθηκαν και ελέγχθηκαν για TP53- knockdown απόδοσης κατά qRT-PCR (δεδομένα που δεν φαίνονται) και ανοσοκηλίδωση.

Αποτελέσματα

Sagopilone αναστέλλει efficaciously πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών NSCLC στην περιοχή nanomolar

Η αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα των SAG και PAC εξετάστηκε σε 6 μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές σειρές διαφόρων υποτύπων (αδενοκαρκίνωμα: Α549, ΝΟΙ-H1437, ΝΟΙ-Η23, ΝΟΙ-Η522? καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων: NCI -H226? μεγάλο καρκίνωμα του πνεύμονα: NCI-H460) χρησιμοποιώντας ένα

in vitro

δοκιμασία πολλαπλασιασμού (Σχήμα 1Α).. SAG ανέστειλε πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα σε όλες τις κυτταρικές σειρές, με τιμές IC50 κυμαίνονταν από 0,2 έως 3,3 ηΜ και ήταν αποτελεσματική σε συγκεντρώσεις υπο-νανογραμμομοριακή (≤1 ηΜ) σε πέντε από τις έξι κυτταρικές γραμμές. Επιπλέον, SAG ήταν σταθερά περισσότερο αποτελεσματική από PAC.

1Α, SAG και PAC αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα. Έξι διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με SAG ή PAC για 72 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός μετρήθηκε με προσδιορισμό κρυσταλλικό ιώδες. Οι μέσες τιμές IC50 ως μέτρο της ημι-μέγιστη αναστολή της ανάπτυξης και οι τυπικές αποκλίσεις δείχνονται. 1Β, ανοσοφθορισμού χρώση των α-τουμπουλίνης (πράσινο) και DNA (κόκκινο) σε Α549 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα μετά από επώαση είτε με έκδοχο (0,1% αιθανόλη), 2,5 ηΜ, ή 40 ηΜ SAG. μπαρ κλίμακας = 20 μm. Αντιπροσωπευτικά φωτογραφίες της ενδιάμεσης και μιτωτικά κύτταρα εμφανίζονται. 1C, ανάλυση FACS των κυττάρων Α549 σε επεξεργασία με όχημα, 2.5 και 40 ηΜ SAG ή 4 ηΜ και 40 ηΜ PAC επί 18 ώρες αποκάλυψε G2 /M σύλληψης στους 40 ηΜ SAG ή PAC και αυξημένους αριθμούς κυττάρων με & lt? 2Ν και & gt? 2Ν περιεκτικότητα σε DNA και εμπλουτισμού G

0 /G

1 φάση του κυτταρικού κύκλου σε 2,5 nM SAG ή 4 nM PAC. 1D, επαγωγή απόπτωσης με αυξανόμενες συγκεντρώσεις SAG σε κύτταρα Α549. Α549 κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες με όχημα, ή 2,5 ηΜ, 5 ηΜ, 10 ηΜ, 40 ηΜ, ή 100 ηΜ SAG. Περαιτέρω, τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο 3,3′-dihexyloxacarbocyanine (DiOC6) (3) και ιωδιούχο προπίδιο για FACS μέτρηση. Λευκό μπάρες δείχνουν την μέση εκατοστιαία αναλογία των κυττάρων που χαρακτηρίζεται από μείωση του ΔΨm (ΔΨm χαμηλή) και μαύρες μπάρες δεικνύουν κυττάρων με σήμα ΔΨm χαμηλή και υψηλή ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ + και ΔΨm χαμηλή) λόγω ρήξης της μεμβράνης του πλάσματος. Η μέση τιμή τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και τυπική απόκλιση δίνεται.

Η

Sagopilone παρεμβαίνει με τις λειτουργίες του κυτταροσκελετού και επάγει την απόπτωση σε κύτταρα Α549

Περαιτέρω πειράματα σχετικά με τη γενική τρόπο δράσης των SAG διεξήχθησαν με την Α549 ως μοντέλο κυτταρικής γραμμής. Όχημα-επεξεργασμένα κύτταρα Α549 έδειξε μία κανονική διασπορά μικροσωληνίσκων σε μεσόφαση κύτταρα και τυπικά διπολική ατράκτους με congressed χρωμοσώματα στην πλάκα μετάφασης σε μιτωτικά κύτταρα (Εικ. 1Β). Αντίθετα, όταν τα κύτταρα Α549 επωάστηκαν με 40 nm SAG σημειώνονται Δέσιμο μικροσωληνίσκων σε κύτταρα μεσόφαση ήταν ορατή η οποία οδήγησε σε μια ανώμαλη οργάνωσης της ατράκτου σε κύτταρα μετάφαση, με πολλαπλές πόλους της ατράκτου, αρκετές πλάκες congressed χρωμοσωμάτων, και ένα ακανόνιστο χρωμοσωμικές ευθυγράμμιση. Αυτές οι κυτταρικές επιδράσεις ήταν δοσοεξαρτώμενη και παρατηρείται επίσης μετά από επώαση με 2,5 ηΜ SAG, αλλά σε μικρότερο βαθμό.

Επιδράσεις της SAG και PAC στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μετρήθηκαν σε κύτταρα Α549

in vitro

με ανάλυση FACS (Εικ. 1Γ και συμπληρωματική Εικόνα. S1). Παρατηρήθηκαν δύο διαφορετικούς φαινοτύπους: Χαμηλές συγκεντρώσεις SAG ή PAC (0.5-5 ηΜ και 2-7 ηΜ, αντίστοιχα) προκάλεσε αποκλίνον κυτταρική διαίρεση με αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός αυξημένου ποσοστού ανευπλοειδικών κυττάρων με ένα περιεχόμενο DNA & lt? 2Ν ή & gt? 2Ν, αλλά μόνο μια μικρή αύξηση του ποσοστού των κυττάρων σε G2 /M φάση. Ένα διαφορετικό φαινότυπο παρατηρήθηκε σε υψηλότερες συγκεντρώσεις SAG και PAC (& gt? 10 ηΜ): Εδώ, μια δραματική αύξηση του ποσοστού των κυττάρων στο G2 /παρατηρήθηκε φάση Μ (Σχ 1C και συμπληρωματική Εικόνα S1..). Για όλες τις περαιτέρω αναλύσεις των δύο διαφορετικών φαινοτύπων, δύο συγκεντρώσεις απασχολούνταν που επάγουν είτε το ανευπλοειδικών φαινότυπο, δηλαδή 2,5 nM SAG ή 4 nM PAC ή η μιτωτική φαινότυπο σύλληψη, δηλαδή 40 nm SAG ή PAC.

Μια συγκέντρωση εξαρτώμενη επαγωγή απόπτωσης με SAG παρατηρήθηκε σε ανάλυση FACS μετά από 72 ώρες επώασης. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία με χαμηλές συγκεντρώσεις SAG (2,5, 5, και 10 ηΜ) πολλαπλασιασμός ανέστειλαν αποτελεσματικά κυττάρων αλλά προκάλεσε μόνο μικρή απόπτωση, ενώ οι θεραπείες SAG υψηλή συγκέντρωση (40 ηΜ και 100 ηΜ) οδήγησε σε έντονη επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα Α549 ( Σχ. 1D).

ισχυρές επιδράσεις της υψηλής συγκέντρωσης, αλλά όχι από χαμηλή συγκέντρωση sagopilone-θεραπεία σχετικά με τις αλλαγές στην έκφραση γονιδίων γονιδιώματος σε επίπεδο σε κύτταρα Α549

RNA απομονώθηκε από κύτταρα Α549, μη επεξεργασμένα , όχημα μάρτυρα, καθώς και σε επεξεργασία με δύο συγκεντρώσεις κάθε μία από SAG (2,5 ηΜ και 40 ηΜ) και PAC (4 ηΜ και 40 ηΜ) για 18 ώρες, και υβριδίστηκαν με συστοιχίες Affymetrix HGU133Plus2.0. Ελήφθησαν δεδομένα γονιδιακής έκφρασης υψηλής ποιότητας. Μια ανάλυση των κύριων συστατικών (PCA) με βάση την έκφραση όλων των γονιδίων που παρουσίασε δύο κύριες ομάδες: Μία συστάδα περιείχε το μη επεξεργασμένο, υπό αγωγή με όχημα και χαμηλή συγκέντρωση SAG (2,5 ηΜ) – ή PAC-αγωγή (4 ηΜ) δείγματα, ενώ δείγματα που κατεργάζονται με υψηλές συγκεντρώσεις (40 ηΜ) SAG ή PAC σχηματίζεται ένα ξεχωριστό σύμπλεγμα (Σχ. 2Α, 2Β) υποδεικνύοντας ότι η θεραπεία με χαμηλή συγκέντρωση φαρμάκου SAG ή PAC επάγεται μόνο σχετικά μικρές αλλαγές έκφρασης γονιδίου σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα δείγματα, ενώ ένα υψηλή συγκέντρωση φαρμάκου SAG ή PAC επαγόμενη ισχυρότερη αλλαγές γονιδιακής έκφρασης.

2Α και 2Β. Ανάλυση Στοιχείο Αρχή (PCA) των μικροσυστοιχιών δεδομένων των κυττάρων Α549 χωρίς θεραπεία (γκρι), αγωγή με όχημα (σκούρο γκρι), ή κατεργασμένα με 2,5 nM (μπλε) ή 40 nm SAG (σκούρο μπλε) και 4 nM (πράσινο) ή 40 nm PAC (σκούρο πράσινο) για 18 ώρες. Κάθε απεικονίζονται σφαίρα αντιπροσωπεύει το προφίλ έκφρασης ενός ατόμου δείγματος με n = 5 ανεξάρτητες βιολογικές επαναλήψεις για την προβολή των δεδομένων σχετικά με τα πρώτα τρία κύρια συστατικά, που αντιπροσωπεύουν το μεγαλύτερο μέρος της μεταβλητότητας των δεδομένων (με την ένδειξη αξόνων). Οι απόψεις από δύο διαφορετικές οπτικές γωνίες (Εικ. 2Α, 2Β) φαίνεται να απεικονίσει την ομαδοποίηση.

Η

Paired t-τεστ συγκρίνοντας κάθε ομάδα θεραπείας με τις ομάδες υπό αγωγή με όχημα πραγματοποιήθηκαν και τα αποτελέσματα εμφανίζονται ως Ηφαίστειο plot (Συμπληρωματική εικ. S2) που απεικονίζει τη σημασία ως συνάρτηση της πτυχής αλλαγής. Τέσσερις λίστες γονίδιο δημιουργήθηκαν με τις παραμέτρους κατωφλίου για Ρ-τιμή και διπλώστε αλλαγή των υψηλών και χαμηλών θεραπείες συγκέντρωση των δύο ενώσεων όπως περιγράφεται στον Πίνακα 1, μαζί με τον συνολικό αριθμό και τον αριθμό των πάνω και κάτω ρυθμιζόμενα γονίδια. Οι κατάλογοι γονίδιο λαμβάνονται από τις στατιστικές δοκιμασίες συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας διαγράμματα Venn. Από το σύνολο των 503 γονιδίων που ρυθμίζονται από 40 nm PAC και 593 κατά 40 ηΜ SAG, 391 γονίδια τόσο ρυθμίζονται από τις δύο θεραπείες, υποδεικνύοντας ένα παρόμοιο σύνολο των γονιδίων που επηρεάζονται από υψηλή συγκέντρωση και των δύο TBAs. Μια ανάλυση Gene Ontology (GO) των 391 γονιδίων που ρυθμίζονται με το λογισμικό GeneGo Metacore αποκάλυψε μια παρόμοια εμφάνιση και την κατάταξη τάξη των βιολογικών διεργασιών (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα) υποδεικνύοντας ένα πολύ παρόμοιο μηχανισμό δράσης και για τις δύο TBAs σε υψηλή συγκέντρωση. Αντίθετα, κατά τη σύγκριση των 593 γονιδίων που ρυθμίζονται από 40 ηΜ SAG με τα 221 γονίδια που επηρεάζονται από τη θεραπεία με 2.5 ηΜ του ίδιου φαρμάκου, μόνο 41 γονίδια συνήθως ρυθμίζονται από τις δύο συγκεντρώσεις του φαρμάκου και μια πενιχρή εννέα γονίδια συνήθως ρυθμίζονται από 40 nm ( [32]. [35]. [37]. [15]. [45].