Abstract

Η έκθεση των κυττάρων σε ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) προκαλεί, όχι μόνο, ενεργοποίηση πολλαπλές οδούς σηματοδότησης που παίζουν κρίσιμους ρόλους στον καθορισμό της κυτταρικής τύχης, αλλά επίσης και τις μεταβολές του μοριακών οδών που εμπλέκονται σε κυτταρικό θάνατο ή την επιβίωση . Πρόσφατα, μεθυλίωση του DNA έχει καθιερωθεί ως κρίσιμο επιγενετικών διαδικασία που εμπλέκονται στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε καρκινικά κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η αναστολή της μεθυλίωσης του DNA μπορεί να είναι μια αποτελεσματική στρατηγική θεραπείας του καρκίνου. Επειδή οι μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης από το DNA μεθυλίωση θεωρήθηκαν να επηρεάζουν radioresponsiveness, διερευνήσαμε την επίδραση ενός αναστολέα μεθυλοτρανσφεράσης DNA, 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC), επί ραδιοευαισθησία. Επιπλέον, ερευνήσαμε τις υποκείμενες κυτταρικούς μηχανισμούς του συνδυασμού θεραπειών του ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) και 5-αζα-dC σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. καρκινικές κυτταρικές γραμμές παχέος εντέρου αρχικά εξετάστηκαν για την ευαισθησία ακτινοβολίας IR

in vitro

και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δύο διαφορετικές δόσεις του 5-αζα-DC. Επιβίωση αυτών των κυτταρικών γραμμών μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου) και κλωνογενείς δοκιμασίες. Εξετάστηκαν οι επιδράσεις του 5-αζα-dC μαζί με ακτινοβολία στην κυτταρική ανάπτυξη, τη διανομή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, και γονιδιακή έκφραση απόπτωση. Συνδυασμός θεραπείας ακτινοβόλησης με 5-αζα-άΟ μειώθηκε σημαντικά δραστηριότητα ανάπτυξης σε σύγκριση με τη θεραπεία ακτινοβόλησης μόνο ή με 5-αζα-dC θεραπεία μόνο. Το ποσοστό των κυττάρων HCT116 στην υπο-G1 φάση και αποπτωτικά ποσοστό τους αυξήθηκε όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ακτινοβολία σε συνδυασμό με 5-αζα-dC σύγκριση είτε με θεραπεία μόνο. Οι παρατηρήσεις αυτές υποστηρίζεται σθεναρά από αυξημένη δραστηριότητα κασπάσης, αυξημένη κομήτη ουρές χρησιμοποιώντας κομήτη προσδιορισμούς, και αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης απόπτωσης που σχετίζεται με μόρια (κασπάσης 3/9, διασπασμένη PARP). Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι 5-αζα-dC ενισχυμένη ραδιοευαισθησία σε καρκινικά κύτταρα κόλου, και οι συνδυασμένες επιδράσεις των 5-αζα-dC με ακτινοβολία έδειξε μεγαλύτερη κυτταρικές επιδράσεις από εκείνη της απλής θεραπείας, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο συνδυασμός του 5-αζα-DC και ακτινοβολία έχει τη δυνατότητα να γίνει μια κλινική στρατηγική για την αντιμετώπιση του καρκίνου

Παράθεση:. Kim JG, Bae JH, Kim JA, HEO Κ, Yang Κ, Yi JM (2014) Συνδυασμός Επίδραση των επιγενετικών κανονισμού και Ιονίζουσες Ακτινοβολίες σε κύτταρα του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (8): e105405. doi: 10.1371 /journal.pone.0105405

Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, την Ιαπωνία

Ελήφθη: May 25, 2014? Αποδεκτές: 21 Ιουλίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 19, Αύγ του 2014

Copyright: © 2014 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται από ένα Εθνικό R & amp? Α Προγράμματος (50596-2014) μέσω της DONGNAM Ινστιτούτο Ακτινολογικής & amp? Ιατρικών Επιστημών χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας της Κορέας. Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών (NRF) και το Υπουργείο Επιστημών, των ΤΠΕ και μελλοντικό σχεδιασμό (MSIP), κορεατικής κυβέρνησης, μέσω της Εθνικής Πυρηνικής Τεχνολογίας του πρόγραμμα (2013M2A2A7043665). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Επιγενετική είναι η μελέτη των κληρονομικών αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση ή κυτταρικό φαινότυπο που προκαλούνται από μηχανισμούς εκτός από τις αλλαγές στις υποκείμενες ακολουθίες DNA [1]. Η επιγενετική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης διαμεσολαβείται από μηχανισμούς όπως μεθυλίωσης του DNA, τροποποιήσεις των ιστονών, και τοποθέτηση του νουκλεοσώματος κατά μήκος του DNA. Τυπικά, το DNA υπερμεθυλίωση παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην αδρανοποίηση των γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, την επιδιόρθωση του DNA, την απόπτωση, κυτταρική σηματοδότηση, μεταγραφή, και άλλες κυτταρικές διεργασίες [2].

εκτροπές σε μεθυλίωσης του DNA παρατηρούνται συχνά σε πολλούς διαφορετικούς τύπους καρκίνου [3], [4]. Ειδικότερα, αποσιώπηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων ή άλλων γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο από ανώμαλη υπερμεθυλίωση του DNA σε προαγωγού ή ρυθμιστικές περιοχές συμβάλλει στην ογκογένεση [5], [6]. Σε αντίθεση με γενετικές αλλοιώσεις, επιγενετικές εκδηλώσεις, συμπεριλαμβανομένης της μεθυλίωσης του DNA, είναι αναστρέψιμη, καθιστώντας επιγενετική ρύθμιση εξαιρετικά ενδιαφέρουσα από την άποψη της ανάπτυξης νέων προσεγγίσεων στη θεραπεία. DNA υπερμεθυλίωση μπορεί να αντιστραφεί με παράγοντες DNA-απομεθυλίωση. Επιπλέον, DNA μεθυλοτρανσφεράση (DNMT) αναστολείς μπορεί να αποκαταστήσει την έκφραση γονιδίων σιγήσει μεθυλίωσης DNA. Τα τελευταία χρόνια, ο αναστολέας DNMT, 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC), έχει αποδειχθεί ότι έχει αντικαρκινικές δραστηριότητες σε ασθενείς με λευχαιμία, μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο, καθώς και αρκετές στερεούς όγκους [7], [8] . Αν και ένα μόνο επιγενετικές θεραπεία δεν έδειξε σημαντικές αντιδράσεις έναντι των περισσότερων στερεών όγκων [9], προκλινικές μελέτες υποδεικνύουν ότι ένας συνδυασμός των επιγενετικών τροποποιητές, όπως αναστολείς DNMT ή αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης, μπορεί να είναι αποτελεσματική. Επιπλέον, ο συνδυασμός αυτών των επιγενετικών τροποποιητές με συνηθισμένα χημειοθεραπευτικά μπορούν επίσης να είναι αποτελεσματικές. Ως εκ τούτου, αυτοί οι τύποι συνδυαστικών θεραπειών εξετάζονται σε κλινικές δοκιμές [10], [11]. Ωστόσο, λίγες εκθέσεις έχουν ερευνήσει ραδιοευαισθησία που συνδέονται με την έκθεση σε 5-αζα-άΟ [12] – [15]. Πρόσφατα, υπήρξε αυξανόμενο ενδιαφέρον για τις στρατηγικές που χρησιμοποιούν ουσίες που ρυθμίζουν την κυτταρική ραδιοευαισθησία να αυξήσει ακτινοευαισθησία όγκου. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε το θεραπευτικό δυναμικό του συνδυασμού 5-αζα-DC με ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) για την αύξηση της ακτινοευαισθησία στα κύτταρα ορθοκολικού καρκινώματος και να εξετάσει τις κυτταρικούς μηχανισμούς που διέπουν αυτά τα αποτελέσματα.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια και 5-αζα-dC θεραπεία

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ορθοκολικού καρκινώματος: HCT116, SW480, Colo320, και RKO, τα οποία ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA), καθώς και μια διπλή-knockout κύτταρα (ϋΚΟ) για το DNA μεθυλοτρανσφεράση-1 και DNA μεθυλοτρανσφεράση-3b σε HCT116 κυτταρική γραμμή [16], το οποίο διατηρεί & lt? 5% μεθυλίωσης γονιδιωματικού DNA, καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C με 20 % O

2 και 5% CO

2. Τα HCT116, ϋΚΟ, και τα κύτταρα SW480 διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α (WelGENE, Daegu, Κορέα). Colo320 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI (WelGENE). RKO κύτταρα διατηρήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle Medium (ϋΜΕΜ) (WelGENE) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, UT, USA) και 1% αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό (Gibco, Grand Island, ΝΥ, USA). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-dC (0,5 ή 1 μΜ? Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA). Μία φορά την ημέρα για 3 ημέρες (Σχήμα S1)

Ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) έκθεση

Cells επεξεργάστηκε με 5-αζα-άΟ για 3 ημέρες ή μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου εκτέθηκαν σε ακτίνες γάμμα από πηγή

137Cs-ray (Eckert & amp? Ziegler, Βερολίνο, Γερμανία) σε μία δόση ποσοστό 2,6 Gy /min. Μετά την ακτινοβόληση σε δόσεις των 2, 5, και 10 Gy, τα κύτταρα επωάστηκαν για 3 ημέρες στους 37 ° C, 20% O

2, και 5% CO

2.

κλωνογονική δοκιμασία

HCT116, τα κύτταρα SW480, RKO, Colo320, και ϋΚΟ σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (5000 κύτταρα /φρεάτιο) και επεξεργάστηκε με 5-αζα-άΟ και IR. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 2 εβδομάδες. Το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο κάθε 2 ημέρες. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν με 1.25% κρυσταλλικό ιώδες, πλύθηκαν εκτεταμένα για να απομακρυνθεί η περίσσεια του χρώματος, και απεικονίζονται χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή MultiXpress C9250ND (SAMSUMG, Σεούλ, Κορέα). Αποικίες με & gt? 50 κύτταρα /αποικία μετρήθηκαν με τη χρήση του Image-Pro Plus 7.0 λογισμικό (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA)

δοκιμασίες

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η βιωσιμότητα των κυττάρων

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων. προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) 3-. Τα κύτταρα (2 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επωάστηκαν στους 37 ° C. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), και 5 mg /mL ΜΤΤ σε PBS προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για 4 ώρες. Μετά την απομάκρυνση του διαλύματος ΜΤΤ, ένα διάλυμα διαλυτοποίησης (διμεθυλοσουλφοξείδιο /αιθανόλη, 1:01) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι φορμαζάνης. Η απορρόφηση στα 570 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών Paradigm (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). HCT116 κύτταρα κατεργασμένα με 5-αζα-dC ή /και ακτινοβολία σπάρθηκαν σε μια συγκέντρωση 5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά από 24, 48, 72 και 96 h, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, αραιώθηκαν με ένα μπλε διάλυμα εργασίας Τρυπάνης, και μετρήθηκαν για να δημιουργήσει μια καμπύλη ανάπτυξης.

Η ανάπτυξη του όγκου ανάλυση

Για

in vivo

αξιολόγηση της ανάπτυξης του όγκου, χρησιμοποιήσαμε μια υποδόρια SCID μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού που φέρουν όγκο που δημιουργείται από μόλυνση κυττάρων. Θηλυκό C.B-17 SCID ποντίκια αγοράστηκαν από την Κεντρική Lab. Ζώα (Σεούλ, Κορέα). Έξι εβδομάδες ηλικίας θηλυκά ποντίκια χωρίστηκαν σε πειραματικές ομάδες (η = 3 σε κάθε ομάδα). Ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως στα δεξιά πλευρά του την περιοχή της ράχης με 5 × 10

6 κύτταρα αραιώνονται σε 100 μL PBS. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν μία φορά την εβδομάδα. όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: (μικρός άξονας)

2 × (μακρύ άξονα) × 0,5

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη με τη χρήση ιωδιούχου προπιδίου (PI. ). Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 75% αιθανόλη στους 4 ° C για 1 ώρα. Πριν από την ανάλυση, τα κύτταρα πλένονται και πάλι με PBS, αιωρήθηκαν σε ένα κρύο διάλυμα ΡΙ με 1 mg /mL RNase, και επωάζονται στο σκοτάδι για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Κυτταρομετρίας ροής ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας FACScan όργανο (BD FACSAria? BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Η απόπτωση των επεξεργασμένων κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αννεξίνης V /FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences). Εν συντομία, όλα τα κύτταρα σπάρθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία σε δίσκους 100-mm. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS. Τα κύτταρα βάφτηκαν με φυκοερυθρίνη (ΡΕ) αννεξίνη V και 7-αμινο-ακτινομυκίνη και επωάστηκαν για 15 λεπτά στο σκοτάδι. Μετά τη χρώση, ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης προστέθηκε στα κύτταρα, τα οποία αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το όργανο FACScan. λογισμικού FACSDiva (BD Biosciences) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων.

κασπάσης 3/7 δραστηριότητα δοκιμασία

Για την δοκιμασία δραστικότητας της κασπάσης 3/7, τα κύτταρα (5 × 10

3 κύτταρα ) σπάρθηκαν με 100 μL μέσου McCoy 5Α σε μια πλάκα 96 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες επώασης, 100 μL από το 3/7 κιτ προσδιορισμού Caspase-Glu (Promega, Madison, WI, USA) μίγμα υποστρώματος και ρυθμιστικού προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα και τα διαλύματα αναμίχθηκαν απαλά για 30 λεπτά και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα στο σκοτάδι. δραστικότητα φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο (ΑΤΤΟ, Tokyo, Japan). Όλες οι δοκιμασίες επαναλήφθηκαν τρεις φορές και περιείχε αρνητικούς μάρτυρες.

βλάβη του DNA δοκιμασία

βλάβης του DNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το OxiSelect Comet Assay Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA). 5-αζα-DC- ή /και IR-κατεργασμένα κύτταρα HCT116 (1 × 10

5) αναμίχθηκαν με χαμηλού σημείου τήξεως αγαρόζη (1:10 αναλογία), και στη συνέχεια ο κομήτης slide γέμισε με 75 μι το μίγμα. Τα πλακίδια επωάστηκαν στους 4 ° C για 30 λεπτά και στη συνέχεια βυθίζεται σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης στους 4 ° C στο σκοτάδι για 1 ώρα. Το ρυθμιστικό λύσης στη συνέχεια αναρροφάται από διαφάνειες, και πλάκες εμβαπτίζονται σε αλκαλικό διάλυμα στους 4 ° C στο σκοτάδι για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, για να εξαλειφθεί η αλκαλικό διάλυμα, τα πλακίδια αποθηκεύονται σε τρις-οξικό-ΕϋΤΑ (ΤΑΕ) ρυθμιστικό για 5 λεπτά. Οι πλάκες τοποθετήθηκαν σε έναν οριζόντιο θάλαμο ηλεκτροφόρησης και υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση με ρυθμιστικό ΤΑΕ στα 25 V για 20 λεπτά. Τα πλακίδια ξηραίνονται και χρωματίστηκαν με χρωστική DNA (CELL Biolabs). Comet ουρές ανιχνεύθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon, Tokyo, Japan).

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, και η συνολική κυτταρολύματα που περιέχει ίσες ποσότητες πρωτεϊνών φορτώθηκαν σε 4-12% πηκτώματα για ηλεκτροφόρηση πήγματος πολυακρυλαμιδίου-δωδεκυλοθειικού νατρίου και στη συνέχεια μεταφέρονται σε μεμβράνες πολυβινυλιδένο διφθοριούχο (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ USA). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% γάλα διαλυμένο σε PBS που περιέχει 0.02% Tween-20 και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με ειδικά πρωτογενή αντισώματα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με ειδικές ραφανιδική υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα. Οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας ένα σύστημα FX5 Fusion (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Germany). Τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-διασπασμένη κασπάση 3 (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA), αντι-διασπασμένη κασπάση 9 (Cell Signaling Technology), αντι-διασπάται PARP1 (Cell Signaling Technology), αντι-survivin (Abcam , Cambridge, ΜΑ, USA), αντι-ρ53 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), και αντι-α-ακτίνης (Sigma-Aldrich).

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα ήταν παρουσιάζονται ως μέσο ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Student

t-test

. Ένα

P

-τιμή μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Ηθική Δήλωση

Όλα τα πρωτόκολλα των ζώων που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από την φροντίδα των ζώων θεσμικές και Χρησιμοποιήστε Επιτροπή σε DONGNAM Ινστιτούτο Ακτινολογικής & amp? Ιατρικών Επιστημών (DIRAMS-IACUC-11-005).

Αποτελέσματα

Εφέ 5-αζα-DC στο ραδιοευαισθησία των κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου

Για να προσδιορίσετε αν 5 -αζα-dC ενισχύει την κυτταρική ευαισθησία στο IR, το καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές HCT116, SW480, RKO, Colo320, και ϋΚΟ εκτέθηκαν σε 5-αζα-dC σε δύο διαφορετικές δόσεις (0,5 μΜ και 1 μΜ) για 72 ώρες πριν να εκτέθηκαν σε τρεις διαφορετικές δόσεις ΙΚ (2 Gy, 5 Gy και 10 Gy) (Σχήμα S1). Στη συνέχεια, ένα κλωνογόνο δοκιμασία διεξήχθη δείχνουν ότι η 5-αζα-dC μπορούσε ραδιοευαισθητοποιεί όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου που εξετάστηκαν, και ο συνδυασμός του 5-αζα-DC και IR ήταν ανώτερη θεραπεία από μόνη της 5-αζα-DC. κύτταρα ϋΚΟ, γενετικά αναστέλλουν DNMT1 και 3b, έδειξε επίσης ανάπτυξη καταστολή με IR με τρόπο που εξαρτάται από τη δόση (Σχήμα 1Α).

(Α) κλωνογονική δοκιμασία του HCT116, τα κύτταρα SW480, Colo320, και RKO επεξεργάστηκε με 5-αζα -dC (0.5 και 1 μΜ) και /ή IR (2 Gy, 5 Gy και 10 Gy). Κλωνογονική δοκιμασία ακτινοβολημένων (2 Gy, 5 Gy και 10 Gy) κύτταρα DKO. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (5000 κύτταρα /φρεάτιο) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5-αζα-DC /IR. Μετά από 2 εβδομάδες, οι καλλιέργειες σταθεροποιήθηκαν με αιθανόλη και βάφτηκαν με 1.25% κρυσταλλικό ιώδες. Φωτογραφίες από μεμονωμένες αποικίες φαίνονται επίσης. (Β-Ε) κλάσμα επιβίωσης (SF) του HCT116 /ϋΚΟ (Β), SW480 (C), Colo320 (D) και RKO κύτταρα (Ε) επεξεργάστηκε με 5-αζα-dC (0.5 και 1 μΜ) ή /και ιοντίζουσα ακτινοβολία (IR? 2 Gy, 5 Gy και 10 Gy). Το SF υπολογίστηκε ως μέση αποικίες /σπαρμένων κυττάρων. Η αναλογία ενίσχυσης δόση υπολογίστηκε ως ο λόγος της καμπύλης SF που λαμβάνεται με κατεργασία με έναν συνδυασμό 5-αζα-DC και IR με εκείνη που λαμβάνεται με κατεργασία με IR μόνο. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

P

-τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση του Student

t-test

. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt?. 0.001

Η

Οι καμπύλες επιβίωσης ακτινοβολίας παρήχθησαν για κάθε κυτταρική σειρά που έλαβαν θεραπεία με 5-αζα-DC και IR για να καταλάβουμε αν η ακτινοβολία μπορεί να ευαισθητοποιούνται από 5 -αζα-dC σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου κόλον (Σχήμα 1Β-Ε). Χρησιμοποιώντας την δόση που απαιτείται για να δημιουργηθεί ένα κλάσμα επιβίωσης (SF) του 0,5 ως σημείο αναφοράς, εκτιμήθηκαν οι ρυθμοί ενίσχυση της δόσεως (DERS). Κύτταρα κατεργασμένα με 5-Αζα-DC για 72 ώρες πριν από την ακτινοβόληση παρουσίασαν αύξηση σε ακτινοευαισθησία, με DER από: 1,19 (0,5 μΜ 5-αζα-dC) και 1.41 (1 μΜ 5-αζα-dC) σε κύτταρα HCT116, 1,23 (0,5 μΜ 5-αζα-dC) και 1.42 (1 μΜ 5-αζα-dC) σε κύτταρα SW480, 1,23 (0,5 μΜ 5-αζα-dC) και 1.28 (1 μΜ 5-αζα-dC) σε κύτταρα Colo320, και 1,14 (0,5 μΜ 5-αζα-dC) και 1,31 (1 μΜ 5-αζα-dC) σε κύτταρα RKO (Εικόνα 1Β-Ε). Τα δεδομένα μας πρότειναν ότι μια χαμηλότερη δόση της 5-αζα-dC μπορούσε ραδιοευαισθητοποιεί ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. Επειδή 1 μΜ 5-αζα-dC ή 10 Gy από IR είναι κυτταροτοξικά, σχετικά χαμηλές δόσεις 5-αζα-dC (0,5 μΜ) και IR (2 Gy και 5 Gy) επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτες για να εξετασθούν τα αποτελέσματα του συνδυασμού α αναστολέα DNMT, 5-αζα-dC και IR.

Ο συνδυασμός της 5-αζα-dC και IR επαγόμενη καταστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου

Αναλύσαμε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με 5 -αζα-dC ή IR μόνο του ή με το συνδυασμό 5-αζα-άΟ και IR. Οι καμπύλες ανάπτυξης έδειξαν ότι η θεραπεία με συνδυασμό 5-αζα-DC και IR (2 Gy και 5 Gy) οδήγησε σε στατιστικά σημαντική αναστολή ανάπτυξης σε HCT116 και SW480 κύτταρα σε κάθε χρονικό σημείο που εξετάστηκαν (24, 48, 72, και 96 h ) σε σύγκριση με εκείνη στα κύτταρα ελέγχου, σε κύτταρα κατεργασμένα μόνο με 5-αζα-dC, ή σε κύτταρα επεξεργασμένα μόνο με IR (2 Gy και 5 Gy) (Σχήμα 2Α?

P

& lt? 0,05). Επιπλέον, θα πραγματοποιηθεί η δοκιμασία ΜΤΤ στα δύο HCT116 και SW480 κύτταρα που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με ή χωρίς 5-αζα-dC (0,5 μΜ) και στη συνέχεια να τους ακτινοβολείται με 2, 5, και 10 Gy, αντίστοιχα. Η απορρόφηση από τη δοκιμασία πραγματοποιείται σε κύτταρα που κατεργάζονται με ένα συνδυασμό από 5-αζα-DC και IR ήταν σημαντικά χαμηλότερη (

P

& lt? 0,05) από ότι από κύτταρα κατεργασμένα με 5-αζα-dC ή IR μόνο ( Σχήμα 2Β). Πραγματοποιήσαμε επίσης ανάλυση καμπύλης ανάπτυξης και τη δοκιμασία ΜΤΤ σε κύτταρα ϋΚΟ, η οποία έδειξε επίσης μια μείωση της καταστολής ανάπτυξης καθώς και τον πολλαπλασιασμό, ανάλογα με τη δόση της ακτινοβολίας (Σχήμα 2Α και Β). Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι επιδράσεις των 5-αζα-DC και IR στην αναστολή της ανάπτυξης είναι αθροιστικές. Βασισμένο σε μας

in vitro

δεδομένων σημαντική αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με το συνδυασμό 5-αζα-DC και IR, μας ενδιαφέρει να προσδιοριστεί αν θα μπορούσαν να παρατηρηθούν αυτά τα αποτελέσματα

in vivo

. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα HCT116 εκτέθηκαν σε 5-αζα-dC (0,5 μΜ) για 72 ώρες πριν από την έκθεση σε IR (2 Gy και 5 Gy), και στη συνέχεια εγχύθηκαν υποδορίως σε ποντικούς SCID. Εικόνα 2C έδειξαν καθυστερήσει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου με τη συνδυασμένη θεραπεία 5-αζα-DC και IR (2 Gy και 5 Gy) σε σύγκριση με μόνο θεραπεία είτε με 5-αζα-dC ή IR. Επιπλέον, ο όγκος των ξενομοσχευμάτων από κύτταρα επεξεργασμένα με αμφότερους τους 5-αζα-DC και IR μειώθηκαν σε σύγκριση με εκείνα από κύτταρα κατεργασμένα με είτε 5-αζα-dC ή IR μόνο. ​​

(Α) Η ανάπτυξη των κυττάρων Οι καμπύλες που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας 0,5 μΜ 5-αζα-dC και δύο διαφορετικές δόσεις ακτινοβολίας (2 Gy και 5 Gy) σε καρκινικά κύτταρα κόλου (HCT116, ϋΚΟ και SW480) και (Β) δοκιμασίες ΜΤΤ σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου που έλαβαν θεραπεία με 5-αζα-dC (0.5 μΜ) και /ή ακτινοβολία (2 Gy και 5 Gy). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση των τριπλών πειραμάτων. (Γ) Η ανάπτυξη του όγκου ακόλουθες 5-αζα-dC (0,5 μΜ) θεραπεία ή /και ακτινοβολία (2 Gy και 5 Gy) σε SCID ποντίκια. κύτταρα HCT116 (5 × 10

6 κύτταρα) που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με 5-αζα-dC (0,5 μΜ) και ακτινοβολημένα (2 Gy και 5 Gy) εγχύθηκαν υποδορίως σε ποντικούς SCID (n = 4), και η μέση το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε μία φορά την εβδομάδα για 7 εβδομάδες.

P

-τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση του Student

t-test

. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

Για την διαλεύκανση των μηχανισμών της αναστολής της ανάπτυξης με 5-αζα-dC, IR, και τη θεραπεία συνδυασμού, χρησιμοποιήσαμε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για τον προσδιορισμό αν η αναστολή της ανάπτυξης συσχετίστηκε με τις αλλαγές του κυτταρικού κύκλου. ανάλυση κυττάρων διανομή κύκλου έδειξε ότι η αναλογία των κατεργασμένων κυττάρων στο G1, S, και τις φάσεις G2-M δεν ήταν διαφορετικό από τα κύτταρα ελέγχου, εκτός του ότι υπήρξε αύξηση στην αναλογία των κυττάρων στη φάση υπο-G1, προτείνοντας μια αύξηση στην απόπτωση (Σχήμα 3). Η αναλογία των κυττάρων HCT116 επεξεργάστηκε με 5-αζα-dC ή IR (2 Gy) μόνο στην υπο-G1 φάση των κυττάρων ήταν οκτώ φορές (5-αζα-dC), δύο φορές (IR, 2 Gy), και τέσσερις φορές (5 Gy) μεγαλύτερη από εκείνη των κυττάρων ελέγχου και πάνω από οκτώ φορές μεγαλύτερη σε κύτταρα κατεργασμένα με 5-αζα-dC και IR σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αντίθεση με τα κύτταρα HCT116, SW480 κύτταρα έδειξαν G2 /M σύλληψης μετά IR μόνο (2 Gy και 5 Gy) σε σύγκριση με ελέγχους [2-Gy G2 /M κλάσμα: 46,77% (έναντι 28,03% σε κύτταρα ελέγχου)? 5 Gy G2 /M κλάσμα: 58,88% (έναντι 22,03% σε κύτταρα ελέγχου)]. Ωστόσο, η υπο-G1 φάση των κυττάρων επεξεργάστηκε με 5-αζα-dC ή IR (2 Gy) μόνη της ήταν έξι φορές (5-αζα-dC), δύο φορές (2 Gy), και επτά φορές (5 Gy) μεγαλύτερο από κύτταρα ελέγχου και ένα πάνω από 19-πλάσια αύξηση σε κύτταρα κατεργασμένα με 5-αζα-dC και IR σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι η υπο-G1 φάση των κυττάρων ακτινοβολείται με 2 Gy ή 5 Gy σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου αυξήθηκε στα κύτταρα DKO. Συνεπώς, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι τα ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης του 5-αζα-dC ή IR οφείλονται σε αύξηση της απόπτωσης.

καρκινικά κύτταρα κόλου (HCT116, ϋΚΟ και SW480) επεξεργάστηκε με 5-αζα-dC (0,5 μΜ) ή /και ακτινοβολία (2 Gy και 5 Gy) βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ροής FACS κυτταρόμετρο. Στήλες δείχνουν το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου. Μαύρη στήλη, φάση υπο-G1? φωτεινό γκρι στήλη, G1 φάση? σκούρο γκρι στήλη, φάση S? λευκό στήλη, φάση G2-M.

Η

Ο συνδυασμός της 5-αζα-DC και IR συμβάλλει στην επαγωγή της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

Για να διευκρινιστεί η επαγωγή απόπτωσης από 5-αζα-dC σε συνδυασμό με IR σε HCT116 και SW480 κύτταρα, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με διπλό ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη-σημασμένο αννεξίνη V και ΡΙ. Το επίπεδο της απόπτωσης που επάγεται από την 5-αζα-dC σε συνδυασμό με IR ήταν μεγαλύτερη από ότι με IR (1,7 φορές για 2 Gy ή 1,8 φορές για 5 Gy) ή 5-αζα-dC μόνο (& gt? 2,4 φορές) σε HCT116 κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε παρόμοια αποτελέσματα αυξημένα επίπεδα απόπτωσης που επάγεται από τη θεραπεία συνδυασμού με 5-αζα-DC και IR σε σύγκριση με IR (3,4-φορές για 2 Gy ή 2,4-φορές για 5 Gy) ή 5-αζα-dC (& gt? 1.5-φορές) μόνο σε κύτταρα SW480 (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, διερευνήθηκαν οι κυτταρικοί μηχανισμοί που διέπουν τα αποπτωτικά αποτελέσματα του συνδυασμού 5-αζα-άΟ και IR. Μία από τις πιο κοινές καταρρακτών σηματοδότησης που εμπλέκονται στην απόπτωση είναι η ενεργοποίηση του άκρως απόπτωσης συγκεκριμένη οικογένεια των κασπασών, οι οποίες, όταν ενεργοποιηθεί, θα κινήσει τον κυτταρικό θάνατο με διάσπαση και ενεργοποίηση των κασπασών τελεστών απόπτωση [17] οδήγησης. Για να καθοριστεί εάν κασπάσες μεσολάβηση τις επιδράσεις της 5-αζα-DC και IR, μετρήσαμε τις δραστηριότητες των κασπασών 3 και 7, τα οποία είναι βασικοί τελεστές για απόπτωση σε κύτταρα θηλαστικών [18]. Σε αμφότερες τις κυτταρικές εκχυλίσματα επεξεργάστηκε με 5-αζα-DC και IR, είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό, οι δραστηριότητες των κασπασών 3 και 7 πολύ αυξημένη σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 5-αζα-DC και IR (2 Gy και 5 Gy) σε σύγκριση με εκείνοι σε κύτταρα κατεργασμένα με IR ή 5-αζα-dC μόνο του (Σχήμα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα αντιστοιχούν με αυξημένη στην απόπτωση που προκαλείται από την θεραπεία συνδυασμού 5-αζα-DC και IR και φαίνεται στο Σχήμα 4Α. Και στις δύο αναλύσεις, τα κύτταρα ϋΚΟ ήταν επίσης δείξει αυξάνοντας το επίπεδο της απόπτωσης από IR. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζονται ισχυρά από πλέον κομήτη ουρές που παρατηρήθηκε στην κομήτη δοκιμασία, υποδεικνύοντας μεγαλύτερη ποσότητα βλάβη του κυτταρικού DNA σε κύτταρα κατεργασμένα με συνδυασμό 5-αζα-DC και IR σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου ή κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 5-αζα-dC ή IR μόνο του (Σχήμα 4C και D).

(α) Τα επίπεδα απόπτωσης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αννεξίνη V και 7-αμινο-ακτινομυκίνη και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα FACS κυτταρομετρητή ροής. Τα επίπεδα απόπτωσης σε HCT116, ϋΚΟ και SW480 κυττάρων επεξεργάστηκε με 5-αζα-dC (0,5 μΜ) και /ή ακτινοβολία (2 Gy και 5 Gy) εκφράστηκαν ως ποσοστά του συνολικού κυτταρικού πληθυσμού τόσο σε πρώιμα και όψιμα στάδια της απόπτωση. (Β) Οι δραστηριότητες των κασπασών 3 και 7 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία κασπάση-Glo και αντιπροσωπεύθηκαν ως ποσοστά του HCT116, ϋΚΟ και τα κύτταρα SW480 επεξεργάστηκε με 5-αζα-dC (0,5 μΜ) και /ή ακτινοβολία (2 Gy και 5 Gy) σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Η γραφική παράσταση αντιπροσωπεύει τα δεδομένα (μέση τιμή ± τυπική απόκλιση) από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (C) Εκπρόσωπος μικρογραφίες των φθορίζουσα χρωστική DNA χρησιμοποιώντας τον κομήτη δοκιμασία. DNA κατακερματισμού από τον κομήτη δοκιμασία σε HCT116, SW480 και ϋΚΟ κύτταρα κατεργάζονται με 0.5 μΜ 5-αζα-dC ή /και ακτινοβολία (2 Gy και 5 Gy). (Δ) Ποσοτικοποίηση των κυττάρων DNA υποστεί βλάβη αντιπροσωπεύει το μέσο όρο τριών τυχαίων μικροσκοπικά πεδία ανά δείγμα, και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± τυπικές αποκλίσεις. NS δεν δείχνει σημαντική.

P

-τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση του Student

t-test

. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

Οι κασπάσες 3 και 9 είναι επίσης γνωστό ότι εμπλέκεται στην ακτινοβολία απόπτωση [19]. Έτσι, χρησιμοποιήθηκε κηλίδωση Western για την επιβεβαίωση των επιπέδων ενεργοποίηση κασπασών 3 και 9 σε κύτταρα κατεργασμένα με 5-αζα-dC ή /και IR. Το Σχήμα 5 δείχνει τα υψηλότερα επίπεδα των ενεργοποιημένων κασπασών 3 και 9 σε HCT116, ϋΚΟ, και τα κύτταρα SW480 επεξεργάστηκε με 5-αζα-dC ή IR μόνος σε σύγκριση με εκείνα σε κύτταρα ελέγχου. Είναι ενδιαφέρον, κηλίδωση Western, στις τρεις, δοκιμάστηκε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, αποκάλυψε ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης των κασπασών 3 και 9 αυξήθηκαν επίσης σε κύτταρα που κατεργάζονται με ένα συνδυασμό από 5-αζα-DC και IR σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με τον κάθε παράγοντα ξεχωριστά ή σε ελέγχους κύτταρα. Το επίπεδο της διασπασμένης PARP1, η οποία είναι ένα άλλο βασικό τελεστής της επαγωγής απόπτωσης [20], [21], ήταν επίσης αυξημένη σε κύτταρα κατεργασμένα με 5-αζα-dC ή IR μόνος σύγκριση με κύτταρα ελέγχου, και ακόμη περισσότερο αυξημένο κατά κύτταρα κατεργασμένα με ένας συνδυασμός 5-αζα-άΟ και IR. Αντίθετα, τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης survivin μειώθηκαν σε κύτταρα κατεργασμένα με 5-αζα-DC και IR μόνο και σε συνδυασμό σε σύγκριση με εκείνα στα κύτταρα ελέγχου. Επιπλέον, εξετάσαμε το επίπεδο της ρ53, καθώς και. Είναι ενδιαφέρον ότι, το επίπεδο έκφρασης της ρ53 αυξάνεται σε κύτταρα που κατεργάζονται με ένα συνδυασμό από 5-αζα-DC και IR ό, τι σε κύτταρα επεξεργασμένα μόνο με 5-αζα-DC. Αυτά τα δεδομένα είναι συμφωνία με προηγούμενη έκθεση η οποία είναι κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53 είναι καλύτερα ευαίσθητα IR από μεταλλαγμένο τύπο ρ53 [14]. Αυτά τα πρότυπα έκφρασης πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκαν σε ακτινοβολημένα κύτταρα ϋΚΟ. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι ο συνδυασμός του 5-αζα-DC και IR επάγει συνεργικά ένα υψηλότερο επίπεδο απόπτωσης σε σύγκριση με μόνο θεραπεία, χρησιμοποιώντας 5-αζα-dC ή IR σε διάφορες καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα.

Western blot ανάλυση για την έκφραση της απόπτωσης που σχετίζεται με πρωτεΐνες (διασπασμένη κασπάση 3, διασπασμένη κασπάση 9, διασπασμένη PARP1, survivin, και ρ53) σε HCT116 και SW480 κυττάρων επεξεργάστηκε με 5-αζα-dC (0,5 μΜ) και /ή ακτινοβολία (2 Gy και 5 Gy), καθώς επίσης και σε ακτινοβολημένα κύτταρα ϋΚΟ, χρησιμοποιώντας διασπασμένη κασπάση 3, διασπασμένη κασπάση 9, διασπασμένη PARP1, survivin, και αντισώματα ρ53.

η

Συζήτηση

αποτελέσματα έκθεση σε IR η ταυτόχρονη ενεργοποίηση ή προς τα κάτω ρύθμιση πολλαπλές οδούς σηματοδότησης που παίζουν κρίσιμους ρόλους στην κυτταρικό τύπο έλεγχο της επιβίωσης ή θανάτου. IR είναι ένας πολύ γνωστός γονιδιοτοξικός παράγοντας και καρκινογόνο για τον άνθρωπο που προκαλεί κυτταρική βλάβη μέσω άμεσων και έμμεσων μηχανισμών [22]. Πρόσφατα, πολλές μελέτες έχουν επικεντρωθεί επί των μορίων και των διαδικασιών που επηρεάζουν την απόκριση των κυττάρων σε IR. Πολλοί διαφορετικοί τύποι μορίων είναι γνωστό ότι αυξάνουν ραδιοευαισθησία επηρεάζοντας σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, την επιδιόρθωση του DNA, τη μεταγραφή γονιδίων, και την απόπτωση. Οι πιο πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι επιγενετικές μηχανισμών, όπως τροποποίηση ιστόνης και μεθυλίωσης του DNA που σχετίζονται με γονιδιακή σίγηση και μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση ακτινοευαισθησία σε καρκινικά κύτταρα. Μια σειρά από προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι πολλές ιστόνης αναστολείς δεακετυλάσης είναι κυτταροτοξικά και μπορεί να ευαισθητοποιήσει τα κύτταρα των όγκων στην ακτινοθεραπεία. Ωστόσο, ελάχιστα διαθέσιμα στοιχεία σχετικά με τις επιδράσεις των αναστολέων DNMT για ραδιοευαισθητοποίηση [13], [23]. Επιπλέον, 5-αζα-άΟ έχει αποδειχθεί ότι έχει μικρή δραστικότητα σε συμπαγείς όγκους ως μονοθεραπεία [24], [25], και λίγα είναι γνωστά σχετικά με τους μοριακούς ή κυτταρικών μηχανισμών που διέπουν τη ραδιοευαισθησία επάγεται από επιγενετικές αναστολέων. Συνδυάζοντας επιγενετικές ναρκωτικά με ακτινοθεραπεία είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον, στο πλαίσιο αυτό, και έχει αποδείξει τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας και

in vitro

και

in vivo

σε πολλές συμπαγείς όγκους [13] – [15], [26 ]. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τις κυτταρικές επιδράσεις του αναστολέα DNMT, 5-αζα-dC, και IR, και μεμονωμένα και σε συνδυασμό, επί καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Βρήκαμε ότι η 5-αζα-dC αποδεικνύεται πρόσθετα αποτελέσματα στην αναστολή της ανάπτυξης σε συνδυασμό με IR, γεγονός που υποδηλώνει ότι η 5-αζα-dC θα μπορούσε να είναι ένα χρήσιμο ευαισθητοποιητή ακτινοβολίας στη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ένα πράγμα που πρέπει να εξετάσουμε περαιτέρω με βάση τα αποτελέσματά μας, τα κύτταρα DKO, σύστημα γενετικό μοντέλο για την αναστολή της DNA μεθυλοτρανσφεράση, δεν φαίνεται να έχουν πιο ισχυρή κατασταλτική δράση ανάπτυξη με IR από τη χρήση φαρμακολογικών σύστημα μοντέλο που αντιμετωπίζονται 5-αζα-dC με IR.

από τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αυτό το αποτέλεσμα προκαλείται από την επαγωγή της απόπτωσης, η απόπτωση έχει προηγουμένως θεωρηθεί ως πιθανός μηχανισμός για ραδιοευαισθητοποίηση. Αρκετές διαφορετικές αποτελέσματα έχουν αναφερθεί σχετικά με τις επιδράσεις της ραδιοευαισθητοποίησης αναστολέων DNMT. Λατρεύουν et al. έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι ο συνδυασμός IR και Zebularine δεν αύξησε σημαντικά την απόπτωση [13]. Αντίθετα, Qiu et al. κατέδειξε ότι η 5-αζα-επαγόμενο από DC ραδιοευαισθητοποίηση σε ορισμένες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και προκάλεσε αύξηση στην απόπτωση, που συνοδεύτηκε από αυξημένη έκφραση του

p53

,

RASSF1

, και

DAPK

γονίδιο οικογένειες [14]. Στη μελέτη μας, 5-αζα-dC αύξησε το επίπεδο απόπτωσης σε HCT116 και SW480 κύτταρα, ένα εύρημα που ήταν σύμφωνη με τα αποτελέσματα από Qiu et al. Πολύ ενδιαφέροντα, Qiu et al. Προτείνεται επίσης ότι γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53 είναι πιο ευαίσθητα σε θεραπεία συνδυασμού με IR και 5-αζα-dC σε σύγκριση με εκείνους που εκφράζουν μεταλλαγμένο ρ53. Η HCT116 κυτταρική γραμμή που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη εκφράζει άγριου τύπου ρ53, και παρατηρήσαμε ότι το επίπεδο ρ53 αυξήθηκε σε απόκριση σε 5-αζα-dC θεραπεία με και χωρίς IR. Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης της ρ53 αυξάνεται σε κύτταρα που κατεργάζονται με ένα συνδυασμό από 5-αζα-DC και IR ό, τι σε κύτταρα επεξεργασμένα μόνο με 5-αζα-DC. Ωστόσο, σε αντίθεση με τα κύτταρα HCT116, καμία επίδραση δείχθηκε στο επίπεδο ρ53 στα κύτταρα SW480, η οποία εκφράζει μεταλλαγμένο ρ53 τύπου (Εικόνα 5). p53 έχει κλασικά περιγράφεται ως ένας μεσολαβητής IR κυτταροτοξικότητα και δρα με την προώθηση είτε διακοπή του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση [27], [28]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η 5-αζα-dC επάγει έκφραση p53, η οποία συνδέεται με την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε κύτταρα άγριου τύπου ρ53, αλλά όχι σε μεταλλαγμένα κύτταρα p53 στον καρκίνο του προστάτη [29], [30]. Ωστόσο, επειδή μόνο μερικές κυτταρικές σειρές και p53-μόρια που συνδέονται εξετάστηκαν σε αυτές τις μελέτες, η περαιτέρω έρευνα για την πιθανή συσχέτιση της 5-αζα-DC με p53 είναι απαραίτητη. Περαιτέρω έρευνα απαιτείται επίσης να εντοπίσουν πρόσθετες επιγενετικές αλλοιώσεις που σχετίζονται με ακτινοευαισθησία. Υπάρχουν περιορισμένες μελέτες σχετικά με το ρόλο της μεθυλίωσης του DNA σε αντίσταση σε IR. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η θεραπεία με 5-αζα-άΟ προκαλεί την παγκόσμια υπομεθυλίωση, το οποίο έχει μια επίδραση ραδιοευαισθητοποίησης [23]. Ως εκ τούτου, η οριστική μελέτες θα πρέπει να διεξαχθεί για να καθοριστεί εάν IR έχει επίδραση της επιτόπου ή ειδική γονιδιακή μεθυλίωσης του DNA στον καρκίνο (χειρόγραφο υπό προετοιμασία).

Σε αυτή τη μελέτη, η ανάλυση κυτταρικού κύκλου δεν μεταβάλλονται σημαντικά με ενιαία