Abstract

ενσωμάτωση HPV DNA στο γονιδίωμα του ξενιστή είναι ένα χαρακτηριστικό αλλά όχι αποκλειστικό στάδιο κατά τη διάρκεια του τραχήλου της μήτρας καρκινογένεση. Είναι ακόμα ένα θέμα συζήτησης αν ιική ενσωμάτωση συμβάλλει στη διαδικασία μετασχηματισμού πέρα ​​εξασφαλίζοντας την συστατική έκφραση των ιικών ογκογονιδίων. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις για μια μη-τυχαία κατανομή των τόπων ολοκλήρωσης και την άμεση συμμετοχή των κυτταρικών γονιδίων σχετίζονται με τον καρκίνο. Στη μελέτη αυτή απευθύνεται αυτό το θέμα με την επέκταση των υφιστάμενων στοιχείων που κατά ένα πρόσθετο 47 HPV16 και HPV18 θετικό καρκίνωμα του τραχήλου. Παρέχουμε ενθαρρυντικά στοιχεία για τα σημεία πρόσβασης που ορίστηκε προηγουμένως ολοκλήρωσης και έχουν αποκαλύψει ένα άλλο σύμπλεγμα των χώρων ολοκλήρωση εντός της κυτταρογενετικής 3q28 μπάντα. Επιπλέον, στην περιοχή αυτών των hotspots πολυάριθμες microRNAs (miRNAs) που βρίσκεται και μπορεί να επηρεάζονται από την ολοκληρωμένη HPV DNA. Με τη συλλογή των δεδομένων μας και δημοσιεύονται εκθέσεις θα μπορούσαν να εντοπιστούν 9 γονίδια τα οποία επλήγησαν από την ολοκλήρωση του HPV, τουλάχιστον δύο φορές σε ανεξάρτητους όγκους. Σε μερικούς όγκους τα ιικά-κυτταρικά μεταγραφές σύντηξης ήταν ακόμη και ταυτόσημες σε σχέση με τον ιικό δότη και κυτταρικές θέσεις δέκτη που χρησιμοποιείται. Ωστόσο, οι ακριβείς θέσεις ενσωμάτωσης είναι πιθανό να διαφέρουν αφού καμία από τις θέσεις ενσωμάτωσης που αναλύθηκαν μέχρι σήμερα έχουν δείξει περισσότερο από μερικές νουκλεοτίδια ομολογίας μεταξύ ιού και ξενιστή αλληλουχίες. Ως εκ τούτου, το DNA ανασυνδυασμού που περιλαμβάνουν μεγάλες εκτάσεις ομολογίας στην περιοχή ολοκλήρωσης μπορεί να αποκλειστεί. Είναι ωστόσο ενδιαφέρον ότι με την ευθυγράμμιση αλληλουχίας αρκετές περιοχές του γονιδιώματος HPV16 βρέθηκαν να έχουν υψηλά ομόλογες εκτάσεις μέχρι 50 νουκλεοτίδια προς τα προαναφερθέντα γονίδια και τα ενεργά σημεία ολοκλήρωσης. Μία κοινή περιοχή από ομολογίες με κυτταρικές αλληλουχίες είναι μεταξύ του ιικού γονιδίου Ε5 και L2 (νουκλεοτίδια θέσεις 4100 να 4 240). Είμαστε εικάζουν ότι αυτή και άλλες περιοχές της ομολογίας που εμπλέκονται στη διαδικασία ολοκλήρωσης. Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι η στοχευμένη διακοπή, ενδεχομένως και των κρίσιμων κυτταρικών γονιδίων, με ολοκλήρωση του HPV παραμένει ένα ζήτημα που πρέπει να επιλυθεί πλήρως

Παράθεση:. Schmitz M, Driesch C, Jansen L, Runnebaum ΙΒ, Dürst Μ (2012) μη τυχαία ενσωμάτωση του HPV γονιδιώματος σε καρκίνο του τραχήλου. PLoS ONE 7 (6): e39632. doi: 10.1371 /journal.pone.0039632

Επιμέλεια: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Ιατρική Σχολή, Χιλή

Ελήφθη: 3 του Απριλίου, 2012? Αποδεκτές: 24 Μαΐου 2012? Δημοσιεύθηκε: 27 του Ιούν 2012

Copyright: © 2012 Schmitz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από κεφάλαια της Deutsche Forschungsgemeinschaft (DR780 /3-1) που χορηγούνται σε CD και MD. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μια επίμονη λοίμωξη με ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων υψηλού κινδύνου (HR-HPV) ειδικότερα HPV16 και 18 αναγνωρίζεται ως το υψηλότερο παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη καρκίνου του τραχήλου [1]. Οι περισσότερες λοιμώξεις HR-HPV είναι είτε λανθάνουσα ή ανεκτική. Λανθάνουσα λοιμώξεις άρρωστος ορίζεται, αλλά υποτίθεται ότι το ιικό γονιδίωμα διατηρείται ως επίσωμα στα βασικά και παραβασικών κύτταρα του επιθηλίου χωρίς επαγωγή προφανές φαινοτυπικές μεταβολές στο κύτταρο-ξενιστή. Η αντιγραφή του ιού σε όρους παραγωγής λοιμογόνου παράγοντα περιορίζεται στα τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα των ενδιάμεσων και επιφανειακή επιθηλιακά στρώματα και τα αποτελέσματα από ένα διακόπτη από μια λανθάνουσα σε μια ανεκτική φάση ή απευθείας από μια οξεία λοίμωξη. Κανονικά HR-HPV λοιμώξεις είναι αυτοπεριοριζόμενη και να επιλύσει μέσα σε μερικούς μήνες. Ωστόσο, σε περίπου 10% των περιπτώσεων, ένα είδος μεταμόρφωσης της HPV λοίμωξης εξελίσσεται. Αυτή η διαδικασία μετασχηματισμού χαρακτηρίζεται από την απορρύθμιση των ιικών ογκογονιδίων Ε6 και Ε7 στην ποδηλασία κύτταρα τα οποία τελικά οδηγεί σε χρωμοσωμική αστάθεια και τη συσσώρευση μεταλλάξεων. Οι υποκείμενοι μηχανισμοί για την απορρύθμιση είναι πολλαπλά. Ενσωμάτωση του γονιδιώματος του HPV είναι ένα χαρακτηριστικό βήμα στην τραχηλική καρκινογένεση και την εμφάνισή του συσχετίζεται με την πρόοδο της προκαρκινικών βλαβών (CIN2 /3) σε διηθητικό καρκίνωμα [2], [3], [4], [5], [6]. Ωστόσο, η ενσωμάτωση δεν είναι υποχρεωτική στη διαδικασία αυτή και δείχθηκε ότι ήταν HPV τύπου εξαρτώμενη. Vinokurova και οι συνεργάτες του παρατήρησαν ότι HPV16, 18 και 45 ήταν σημαντικά πιο συχνά παρούσα σε μία ολοκληρωμένη κατάσταση σε σύγκριση με τους τύπους HPV 31 και 33 [7]. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το υψηλότερο δυναμικό καρκινογένεσης αποδίδεται σε HPV16 και HPV18 [8].

Η απώλεια του γονιδίου ιογενούς Ε2 είναι μια κοινή συνέπεια της ολοκλήρωσης του HPV. Αυτό το γεγονός μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη έκφραση των ογκογονιδίων Ε6 και Ε7, λόγω του γεγονότος ότι Ε2 δεν είναι πλέον σε θέση να καταστέλλει την έκφραση των ιικών ογκογονιδίων

σε trans

[9], [10]. Ωστόσο, να σημειωθεί είναι ότι σε πρόσφατη ανάλυση υλικού βιοψίας κανένας συσχετισμός μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του ιικού ογκογονιδίου μεταγραφές και τη φυσική κατάσταση του ιικού γονιδιώματος βρέθηκε [11]. Δεδομένου ότι οι μεταγραφικά ενεργές θέσεις ιικής ενσωμάτωσης μέχρι στιγμής αναλυθεί σε CIN2 /3 ή του τραχήλου της μήτρας καρκινώματα αντιπροσωπεύουν το τελικό σημείο ενός κλωνικού διαδικασίας επιλογής η πιο ρεαλιστική ερμηνεία των δεδομένων είναι ότι η ενσωμάτωση εξασφαλίζει μια συστατική έκφραση των ιικών ογκογονιδίων σε ένα επίπεδο που απαιτείται για τη διατήρηση η μετασχηματισμένη κατάσταση του κυττάρου. Πιο πρόσφατα αρκετοί ερευνητές έχουν επίσης εστιάζονται στην ολοκλήρωση επιπτώσεις μπορεί να έχει στην γονιδίωμα του ξενιστή. Μια συστηματική ανάλυση της δομής του γονιδιώματος στον τόπο ενσωμάτωσης αποκάλυψε συχνή γονιδιωματικής διαρθρωτικές αλλαγές στις θέσεις εισαγωγής HPV σε καρκίνωμα του τραχήλου [12]. Δύο επιπλέον εκδόσεις παρέχουν στοιχεία για μια πλήρη λειτουργική απώλεια των ογκοκατασταλτικών γονιδίων,

ZBTB7C

και

CASZ1

, αντίστοιχα. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις η έκφραση του γονιδίου εμποδίζεται λόγω παρεμβατικής μεταλλαξογένεσης σε συνδυασμό με την απώλεια της ετεροζυγωτίας [13], [14]. Αν και τέτοια αστερισμοί είναι πιθανό να είναι σπάνια φαινόμενα γίνεται όλο και περισσότερο εμφανές ότι HPV ολοκλήρωση δεν συμβαίνει εντελώς τυχαία. Σε προηγούμενη μελέτη θα μπορούσαμε να δείξουμε ότι η πλειοψηφία των ιικών-κυτταρικών μεταγραφές σύντηξης σε καρκινώματα του τραχήλου συν-μεταγράψει κυτταρικές αλληλουχίες γνωστών ή προβλεπόμενη γονίδια. Πράγματι, 17 από 74 (23%) των θέσεων ενσωμάτωσης βρίσκονταν εντός των ζωνών κυτταρογενετική 4q13.3, 8q24.21, 13q22.1, και 17q21.2, στις συστάδες που κυμαίνονται από 86 να 900 kb. Τα hotspots ένταξη 8q24.21 και 13q22.1 βρίσκονται κοντά σε γειτονικά εύθραυστη sites. Ενδιαφέροντος είναι ότι η ολοκλήρωση εντός του τόπου MYC για 8q24.21 συσχετίζεται ισχυρά με υψηλά επίπεδα

MYC

έκφραση [15], [16], [17] που σημαίνει

cis

ρυθμιστικά αποτελέσματα είναι ασκείται από το γονιδίωμα του ιού.

το φαινόμενο της μη τυχαία ενσωμάτωση του HPV DNA είναι ενδιαφέρουσα και μπορεί να μην είναι απλώς ένα ζήτημα της χρωματίνης προσβασιμότητας σε μεταγραφικά ενεργές περιοχές ή εύθραυστα περιοχές που είναι επιρρεπείς σε διπλή διάσπαση της έλικας [18 ], [19], [20]. Για μια καλύτερη κατανόηση του ρόλου και των μηχανισμών της ενσωμάτωσης του ιού στην αυχενική καρκινογένεση, είναι απαραίτητο να συγκεντρωθούν περισσότερα στοιχεία για συγκριτικούς σκοπούς. Ως εκ τούτου, έχουμε αναλύσει τις ιογενείς-κυτταρική μεταγραφές συγχώνευση των 34 HPV16 θετικά και 13 HPV18 θετική του τραχήλου της μήτρας καρκινώματα. Με βάση αυτά τα νέα στοιχεία τα ορίστηκε προηγουμένως hotspots για ένταξη αυτή μπορεί να επιβεβαιωθεί και να επεκταθεί επάνω. Υπάρχει επίσης αυξανόμενες ενδείξεις ότι πολλές γονίδια επηρεάζονται περισσότερο από μία φορά από την ένταξη.

Αποτελέσματα

Σε 47 από 87 HPV16 ή HPV18 θετικούς όγκους που αναλύθηκαν ιογενή-κυτταρικό μεταγραφές σύντηξη θα μπορούσε να ενισχυθεί. μεταγραφήματα σύντηξης ανιχνεύθηκαν συχνότερα σε HPV18 θετικό όγκους (72%) από ό, τι σε HPV16 θετικό όγκους (49%). Τα υπόλοιπα όγκοι περιείχαν είτε μόνο επισωματική ιικών γονιδιωμάτων ή ολοκληρωμένου HPV DNA το οποίο είναι μεταγραφικώς σιωπηλό. Οι κυτταρικές αλληλουχίες των μεταγραφών συγχωνεύσεως χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας το εργαλείο του ανθρώπου megaBlast NCBI. Για τον προσδιορισμό των εκφρασμένων ετικετών αλληλουχίας και η προβλεπόμενη γονιδίων όλες τις πρόσθετες κυτταρικές αλληλουχίες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων Blat UCSC.

Χρωμοσωμικό εκχώρηση των μεταγραφών συγχωνεύσεως

Στο σύνολο, 23 μεταγραφές σύντηξης περιείχε αλληλουχίες γνωστών γονιδίων και 23 περιείχε αλληλουχίες των προβλεπόμενων γονιδίων και ESTs. Σε μία περίπτωση, η κυτταρική σειρά δεν ταιριάζει με κανένα καταχωρήσεις στη βάση δεδομένων. Τα ιικά κυτταρικά μεταγραφές σύντηξη θα μπορούσε να ανατεθεί σε όλων των χρωμοσωμάτων, εκτός από το χρωμόσωμα 11, 14, 16, 18 και 20 και συνοψίζονται στον πίνακα 1. Σε προηγούμενη μελέτη είχαμε ήδη περιγραφεί ότι ορισμένες περιοχές που πλήττονται πιο συχνά από ό, τι άλλα ολοκλήρωση τμήματα του γονιδιώματος [21]. Για τρεις από αυτές τις hotspots έχουμε βρει τώρα πρόσθετες εκδηλώσεις ολοκλήρωσης: Οι περιοχές 8q24.21 και 13q22.1 επλήγησαν δύο φορές και περιοχή 4q13.3 επηρεάστηκε φορά. Επιπλέον, τρεις μεταγραφές σύντηξης χαρτογραφήθηκαν σε μία περιοχή 600 kb στο χρωμοσωμικό κυτταρογενετικής 3q28 μπάντα και επομένως αντιπροσωπεύουν ένα νέο hotspot για την ολοκλήρωση του HPV. Σχήμα 1 περιλαμβάνει τα δεδομένα από Kraus και οι συνάδελφοί του και απεικονίζει τα πέντε hotspots, το μέγεθός τους και τη γειτνίαση με σχετική εύθραυστη χώρους και miRNAs.

Απεικονίζονται θέσεις ενσωμάτωσης που βρίσκονται εντός των ζωνών κυτταρογενετική 3q28 (Α), 4q13.3 (Β), 8q24.21 (C), 13q22.1 (D) και 17q21.2 (Ε). Φως μπλε βέλη: τα γονίδια που επηρεάζονται από την ολοκλήρωση του HPV? κόκκινα βέλη: HPV μεταγραφές σύντηξης που περιγράφονται σε αυτή την εργασία? γκρι βέλη: μεταγραφές HPV σύντηξης που περιγράφεται από Kraus et al. 2008? πράσινα βέλη: εύθραυστη θέση? σκούρο μπλε βέλη: microRNAs

Η

Σύνδεσης με Εύθραυστο τοποθεσίες και miRNAs

Από την loci 47 ολοκλήρωσης προσδιορίζεται, 10 (21%) εμφανίστηκαν εντός ενός κοινού εύθραυστη θέση (CFS. ) και 6 (13%) σε σπάνιες εύθραυστες θέσεις. Επιπλέον, σε 15 (32%) περιπτώσεις, οι θέσεις ενσωμάτωσης είχαν συνοδευτικά εύθραυστη τοποθεσίες σε απόσταση 200 kb έως 5 Mb. Ένα άλλο 16 θέσεις ενσωμάτωσης δεν συσχετίστηκαν με εύθραυστες περιοχές. Επιπλέον, 32 θέσεις ενσωμάτωσης βρίσκονται σε απόσταση 3 Mb να miRNAs (πίνακας 1).

Προσανατολισμός της ΑΠΑ κατά Fusion Tanscripts

Είκοσι τρία από τα 47 μεταγραφές σύντηξης περιείχε αλληλουχίες γνωστών γονιδίων . Σε 12 περιπτώσεις το γονίδιο υποδοχής ήταν προσανατολισμένη προς την κατεύθυνση του ιικού προαγωγού δηλαδή και οι δύο ιικές και ανθρώπινες αλληλουχίες ήταν σε προσανατολισμό με νόημα. Σε σχεδόν όλες αυτές τις όγκων, η ιική αλληλουχία ήταν συγκολλημένα σε ένα κυτταρικό αλληλουχία εξονίου (11 από 12 γεγονότα). 23 μεταγραφές σύντηξης περιείχαν προβλεπόμενες αλληλουχίες γονιδίων και 8 εντάχθηκαν σε προσανατολισμό με νόημα. Σε 3 περιπτώσεις ο προσανατολισμός δεν μπορεί να προσδιοριστεί λόγω της ασυνέπειας μεταξύ των βάσεων δεδομένων που χρησιμοποιούνται (πίνακας 1).

Τα Ίδια γονίδια που επηρεάζουν την ενσωμάτωση σε διαφορετικά όγκοι

Με τη συλλογή των δεδομένων της μελέτης αυτής και δημοσιευμένα στοιχεία θα μπορούσαν να προσδιοριστούν πέντε γονίδια και τέσσερα προβλεπόμενη γονίδια που επηρεάστηκαν τουλάχιστον δύο φορές σε ανεξάρτητες όγκους (Πίνακας 2). Τέσσερα από αυτά τα γονίδια βρίσκονται στα hotspots 3q28 (

LEPREL1

και

TP63

), 8q24.1 (

LOC727677

) και 13q22.1 (

BG182794

). Τα άλλα γονίδια που βρίσκονται αλλού στο γονιδίωμα. Εκτιμώντας τα γονίδια

Chr2.3.305.a

,

LEPREL1

,

NT_008046.7

, και

LIPC

επλήγησαν δύο φορές από την ένταξη,

TP63

επηρεάστηκε τρεις φορές,

LRP1B

,

LOC727677

και

BG182794

τέσσερις φορές και

TMEM49

ακόμα και έξι φορές.

Επιπλέον, τα γονίδια

NT_008046.7

,

LOC727677

,

BG182794

και

TMEM49

έχουν ιδιαίτερη σημασία, διότι τουλάχιστον δύο όγκοι φιλοξενούν πανομοιότυπα ιικών μεταγραφημάτων κυτταρική σύντηξη σε σχέση με τις ιικές θέσεις δότη και δέκτη ματίσματος που χρησιμοποιούνται.

Συζήτηση

ενσωμάτωση HPV μέσα στο γονιδίωμα του ξενιστή είναι πιθανό να είναι ένα πολύ συχνό γεγονός, αλλά δεν μπορεί να είναι άμεσα ανιχνεύεται εάν ενσωμάτωση λαμβάνει χώρα σε ένα μόνο κύτταρο χωρίς μετέπειτα κλωνική πίεση επιλογής. Στις περισσότερες καρκίνων του τραχήλου υπάρχει μόνο μία μεταγραφικά ενεργή θέση HPV ολοκλήρωσης. Υπάρχουν ενδείξεις ότι αυτές οι περιοχές ολοκλήρωσης αντιπροσωπεύουν νωρίς κλωνική γεγονότα που έχουν παράσχει ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα για την επέκταση του νεοπλάσματος. Λόγω της συμβολής τους στην καρκινογόνο διαλεύκανση διαδικασία αυτών των συγκεκριμένων εκδηλώσεων ολοκλήρωσης είναι συναφείς για την κατανόηση του HPV που προκαλείται από την καρκινογένεση.

Viral-κυτταρικό μεταγραφές σύντηξης είναι μοριακών δεικτών για τις περιοχές μεταγραφικά ενεργό ένταξη και μπορεί να ανιχνευθεί από ένα 3` πρωτόκολλο RACE (η δοκιμασία APOT) το οποίο επιτρέπει την ενίσχυση PCR για επακόλουθη ανάλυση αλληλουχίας. Σε αυτή τη μελέτη έχουμε εντοπίσει ιούς κυτταρική μεταγραφές σύντηξης σε 47 καρκινώματα του τραχήλου. Με μία εξαίρεση οι μεταγραφές σύντηξης περιλαμβάνουν κυτταρικές αλληλουχίες του είτε γνωστές ή προβλεπόμενη γονίδια. Αυτό είναι σύμφωνα με τα αποτελέσματα της προηγούμενης ανάλυσής μας και δείχνει ότι η ένταξη εμφανίζεται κυρίως σε μεταγραφικά ενεργές περιοχές [21]. Επιπλέον, σε συμφωνία με τη βιβλιογραφία το 66% των εκδηλώσεων ολοκλήρωσης ήταν είτε εντός (34%) ή δίπλα σε μια εύθραυστη θέση (32%) [18], [19], [20], [21]. Επίσης ολοκλήρωσης του HPV DNA κοντά miRNAs είναι προφανής. Τα miRNAs σχετίζονται με τη ρύθμιση των σημαντικών διεργασιών όπως η ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση [22] και συχνά απορυθμισμένη σε καρκινικά κύτταρα [22], [23]. Από τις 75 miRNAs στη γειτονιά των τόπων ενσωμάτωσης 19 έχουν ήδη συσχετιστεί με τον καρκίνο (σχήμα 1). Από αυτά τα miR-34a, miR-191, miR-28, miR-944, miR-31, miR-7-2, miR-9-3, miR-497, miR-195, miR-301a, miR-21, miR-181γ, miR-27a, miR-99a και miR-let7c εκφράζονται σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα [24], [25], [26], [27], [28], [29]? λαμβάνοντας υπόψη ότι η miR-34a, miR-21, miR-191, miR-9-3, miR-181δ, miR-23a, miR-24-2, miR-99a και miR-125b2 αναφέρονται να εμπλέκονται και σε άλλες οντότητες του όγκου [ ,,,0],28], [30], [31], [32].

Αξιοσημείωτο είναι ότι για ένα σημαντικό αριθμό μεταγράφων σύντηξης (11/47) οι ιικές αλληλουχίες ματιστεί σε προσανατολισμό με νόημα σε κυτταρικά εξώνια του γνωστού γονίδια. Η διακοπή ενός γονιδίου από την ολοκλήρωση του HPV, ακόμα και αν αυτό συμβεί εντός των αλληλουχιών ιντρονίου, είναι πιθανό να έχει επιπτώσεις στην έκφραση γονιδίων και σε σπάνιες περιπτώσεις έχει αποδειχθεί ότι συνέβαλε στην πλήρη απώλεια της λειτουργίας των γονιδίων [13], [14].

ένα σημαντικό εύρημα αυτής της μελέτης είναι ότι παρέχει περαιτέρω στήριξη για την ομαδοποίηση των περιοχών ολοκλήρωσης του HPV σε περιοχές χρωμοσωμικές hotspot. Από τους 121 όγκους που αναλύθηκαν (συμπεριλαμβανομένων των δεδομένων από τον Kraus et al., 2008) το 22% των μεταγραφών συγχωνεύσεως ιό κυτταρικά αποδόθηκαν σε μία από τις πέντε hotspots (σχήμα 1). Τα hotspots κυμαίνονται σε μέγεθος από 150 kb έως 995 kb και περιέχει έως και 8 θέσεις ενσωμάτωσης. Επιπλέον, περιλαμβάνοντας περαιτέρω δημοσιευμένα στοιχεία βρέθηκαν 9 γονίδια να επηρεάζονται τουλάχιστον δύο φορές με ολοκλήρωση HPV, τέσσερα από αυτά τα γονίδια βρίσκονται εντός των hotspots των κυτταρογενετική μπάντες 3q28, 8q24.21 και 13q22.1 (πίνακας 2). Αυτή η παρατήρηση έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, διότι δείχνει ότι η ένταξη δεν είναι μόνο συνδέεται με μεταγραφικά ενεργές περιοχές και τα κοντινά εύθραυστη sites. Ειδικά δεδομένου ότι σε ορισμένες όγκοι βρέθηκαν ακόμη και ταυτόσημες ιό κυτταρική σύντηξη μεταγραφές σε σχέση με ιούς κυτταρική μάτισμα (πίνακας 2). Ωστόσο, αλληλουχίας των θέσεων ενσωμάτωσης σε περίπτωση

TMEM49

είχαν δείξει ότι τα σημεία διακοπής των δύο αντίστοιχων όγκοι είναι περίπου 17 kb χώρια. Επιπλέον, και οι δύο θέσεις ενσωμάτωσης δεν έδειξε ομολογία μεταξύ των ιικών και κυτταρικών αλληλουχιών [14]. ανασυνδυασμού του DNA που αφορούν μεγάλα τμήματα της ομολογίας στην περιοχή ολοκλήρωσης μπορεί τουλάχιστον να αποκλειστούν για το

TMEM49

. Περιέργως ευθυγράμμιση αλληλουχίας των γονιδίων που απαριθμούνται στον Πίνακα 2 αποκάλυψε διάφορες περιοχές με μεγάλη ομολογία με το γονιδίωμα HPV16. Η πιο κοινή περιοχή υψηλής ομολογίας μεταξύ του ιικού γονιδίου Ε5 και L2 (νουκλεοτίδια θέσεις 4100 να 4,240). Έξι από τα 9 γονίδια επηρεάζονται τουλάχιστον δύο φορές από την ολοκλήρωση του HPV δείξει τουλάχιστον 80% ομολογία σε εκτάσεις μέχρι 34 νουκλεοτίδια (Ακολουθίες S1). Επιπλέον, κάθε ένα από τα 9 γονίδια δείχνουν περαιτέρω ομολογίες με άλλες περιοχές του γονιδιώματος του ιού. Υποδειγματικά οι θέσεις των ομόλογων περιοχών των γειτονικών γονιδίων

LEPREL1

και

TP63

με το γονιδίωμα HPV16 απεικονίζονται στο σχήμα 2. Θεωρούμε ότι αυτές οι περιοχές μπορούν να συμμετέχουν στη διαδικασία ολοκλήρωσης. Προβλέπεται ότι το ιικό γονιδίωμα δεμένοι με χρωματίνη από Brd4 που παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην χρωμοσωμική λειτουργικά γεγονότα όπως μεταγραφή, αντιγραφή του DNA, την επισκευή και ανασυνδυασμό [33], [34]. Τα ομόλογα τμήματα του DNA μπορεί στη συνέχεια να επιτρέψει ανασύνδεση των μερικώς διαχωρισμένων νημάτων και με τον τρόπο αυτό να συμβάλει στην εκδήλωση ανασυνδυασμού. ομολογία αλληλουχίας στη θέση ολοκλήρωσης από μόνη της δεν χρειάζεται να είναι ένα προαπαιτούμενο. Πέρα από αυτό το άκρως κερδοσκοπικές σενάριο είναι επίσης ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι όλα τα γονίδια που εμπλέκονται είναι ο καρκίνος που σχετίζεται γονίδια σε διάφορους βαθμούς. Αν λειτουργικά μειωμένη, μπορεί να έχουν παίξει κάποιο ρόλο στη διαδικασία κλωνική επιλογή. Για τις προβλεπόμενες γονίδια

chr2.3.305.a

(Ν-SCAN),

NT_008046.7

,

LOC727677

(ψευδώνυμο sweeker) και

BG182794

καμία λειτουργική υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα. Ωστόσο,

LRP1B

ανήκει στην οικογένεια γονίδιο υποδοχέα λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας και παίζει ένα ρόλο στη διαδικασία της προκαλούμενης από υποδοχέα ενδοκυττάρωσης. Ένα ομόζυγο απώλεια

LRP1B

σε αρκετές τραχήλου όγκους βρέθηκε χρησιμοποιώντας σειρά που βασίζεται σε συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση υβριδισμού [35]. Επίσης, σε άλλες οντότητες όγκων, όπως ο καρκίνος του θυρεοειδούς [36], γαστρικό καρκίνο [37], ο καρκίνος του πνεύμονα [38], [39], [40], [41] και μορφές καρκίνου του στόματος [42], [43] φίμωση ή απώλεια

παρατηρήθηκε LRP1B

. Από λειτουργική άποψη

LRP1B

είναι σε θέση να αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων [44] και η απώλεια του μπορεί έτσι να είναι σχετικές για την εισβολή και τη μετάσταση. Το δεύτερο γονίδιο,

LEPREL1

, κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που εμπλέκεται στη βιοσύνθεση του κολλαγόνου, δίπλωση, τη συναρμολόγηση. Μέχρι στιγμής αυτό το γονίδιο δεν σχετίζονται με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, αλλά παρατηρήθηκε να σιγήσει κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού και στο 26% των καρκίνων του μαστού αναλύθηκαν [45]. Δύο επιπλέον γονίδια είναι

TP63

και

LIPC

.

TP63

, ένα μέλος της οικογένειας των πρωτεϊνών p53, είναι ένα άλλο γονίδιο που πλήττονται από την ένταξη. Δρα ως πρωτεΐνη καταστολέας όγκου και παρεκκλίνουσα έκφραση σημειώθηκε για αρκετές οντότητες καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του τραχήλου [46], [47].

LIPC

είναι μία κυτταροπλασματική πρωτεΐνη που εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ. Είναι εμπλέκεται στο μεταβολισμό lipidprotein και καταλύει την υδρόλυση των φωσφολιπιδίων, μονο-, δι- και τριγλυκερίδια και ακυλο-CoA θειοεστέρες [48]. Μια άμεση σύνδεση με καρκινογένεση δεν είναι εύκολα εμφανές, αλλά σε μια πρόσφατη μελέτη παρατηρήθηκε πλήρης έλλειψη έκφρασης σε 18% των τραχηλικών καρκινωμάτων. Αντίθετα όλες τις κανονικές του τραχήλου της μήτρας επιθήλια, μεταπλασία και CIN που εξετάστηκαν εκφράζονται LIPC [14]. Η πιο συχνά ενοχλήσεις γονίδιο, που διαταράσσεται 6 φορές, είναι

TMEM49

(διαμεμβρανική πρωτεΐνη 49), επίσης γνωστή ως

VMP1

(πρωτεΐνη χυμοτόπια μεμβράνη 1) που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 17q23.1. Είναι κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη της μεμβράνης του πλάσματος, που αποτελεί βασική συνιστώσα της αρχικής επαφές κυττάρου-κυττάρου και σφιχτό σχηματισμούς κόμβο [49]. Μειωμένη έκφραση του

TMEM49

βρέθηκε για επεμβατική κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού και στην μετάσταση καρκίνου του νεφρού [49].

TMEM49

επίσης φαίνεται να είναι ιδιαίτερα εμφανές στην άποψη της απορρύθμισης των γύρω miRNAs. miR21 βρίσκεται μόλις 676 bp καθοδικά αυτού του γονιδίου και μπορεί ως συνέπεια της ολοκλήρωσης του HPV είναι είτε προς τα πάνω ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται. Σύνδεσμος αυτής miRNA έχει αναφερθεί για καταρράκτη κασπάσης [50] και μπορεί να στοχεύσει BTG2, ένα γονίδιο με αντιπολλαπλασιαστικές ιδιότητες [51]. Μέχρι στιγμής miR21 δείχθηκε να ρυθμίζεται αυξητικά σε πολλαπλούς καρκίνους όπως του μαστού, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του παγκρέατος, του προστάτη, του στομάχου, των ωοθηκών και της μήτρας [28], [31], [32].

Τρεις ομόλογες εκτάσεις οι έως 50 νουκλεοτίδια που φαίνεται. Ο αριθμός των ακριβείς αντιστοιχίες νουκλεοτιδίων δίδεται σε παρένθεση (βλέπε επίσης αλληλουχίες S1). Ο βρόχος του DNA μεταξύ των δύο ομολογίες που βρίσκεται στο

LEPREL1

περιλαμβάνει 102.689 νουκλεοτίδια? το δεύτερο loop 269.968 νουκλεοτίδια. Γκρι κουκίδες αφορούν την κατά προσέγγιση θέση των αντίστοιχων ιογενή-κυτταρικό μεταγραφές σύντηξης ανιχνεύθηκε σε όγκους D3829, T2107 και T4335 (από αριστερά προς τα δεξιά).

Η

Με το που χαρακτηρίζουν έναν αυξανόμενο αριθμό των μεταγραφικά ενεργές θέσεις ολοκλήρωσης του HPV έχει καταστεί προφανές ότι η ένταξη δεν είναι ένα εντελώς τυχαίο γεγονός, αλλά περιλαμβάνει επίσης την προτιμώμενη χρωμοσωμικές περιοχές. Σε μεμονωμένες περιπτώσεις, αυτό μπορεί να επηρεάσει τη λειτουργία των γονιδίων και την προώθηση κακοήθη εξέλιξη. Προς το παρόν μπορούμε να σκεφτούμε μόνο για τους μηχανισμούς που συμβάλλουν στο φαινόμενο αυτό.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

Σε αυτή τη μελέτη, 69 HPV16 και HPV18 18 θετικές βιοψίες από καρκίνο του τραχήλου ασθενείς με καρκίνωμα σαρώθηκαν για ολοκλήρωση HPV με τη δοκιμασία APOT. Για HPV προσδιορισμό του γονότυπου ενός multiplex πραγματικό χρόνο Taqman βάση χρησιμοποιήθηκε PCR δοκιμασία [52]. Όλες οι βιοψίες ελήφθησαν από ασθενείς που έλαβαν θεραπεία στο Τμήμα Γυναικολογίας του Friedrich-Schiller-Universität, Ιένα, Γερμανία μεταξύ 1995 και 2008. Όλες οι όγκοι ιστοπαθολογικά ταξινομηθεί ως ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα.

νουκλεϊκών οξέων Απομόνωση

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο για την απομόνωση RNA από ιστούς. Τα δείγματα ομογενοποιήθηκαν με τη χρήση βελονών ένεσης με διάμετρο 0,55 mm. DNA απομακρύνθηκε σε όλα τα δείγματα με επεξεργασία DNase για 15 λεπτά (RT). DNase ήταν που παρέχεται με το κιτ NucleoSpin RNA II. Ολικό RNA εκλούστηκε σε 60 μΙ RNase-free νερό και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C για περαιτέρω ανάλυση.

Αντίστροφη Μεταγραφή

Ολικό RNA (300-500 ng) μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας 200 μονάδες Superscript II αντίστροφη μεταγραφάση (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) και ένα ολίγο (dT) εκκινητή συνδέεται με μία συνδετική αλληλουχία (5′-AAG CAG TGG ΤΑΤ CAA CGC AGA GTA CT

(30) VN-3 ‘ ), που αναφέρεται ως CDS-Primer (Clontech, Heidelberg, Germany). Η αντίδραση επωάστηκε για 70 λεπτά στους 42 ° C σε τελικό όγκο 20 μΐ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κιτ Superscript II. Προστέθηκαν 40 μονάδες RNaseOUT (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) για την αναστολή της δραστικότητας ριβονουκλεάσης.

Ενίσχυση Papillomavirus Oncogene Transcript (APOT) Δοκιμασία

μεταγραφές σύντηξης HPV-προερχόμενα ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας το APOT δοκιμασία [6]. Βασίζεται σε ένα 3′-ταχείας ενίσχυσης των άκρων cDNA (RACE) πραγματοποιείται σε μια ένθετη μορφή PCR. Οι HPV Ε7 εκκινητές που χρησιμοποιούνται ως εναύσματα (HPV16: πρώτα αστάρι: CGG ACA GAG CCC ΑΤΤ ACA AT, δεύτερο εκκινητή: ΚΔ ΤΤΤ GTT GCA AGT ΟΤΟ ACT CTA CG? HPV18: πρώτα αστάρι: TAG ΑΑΑ GCT CAG CAG ACG ACC, δεύτερο εκκινητή :. ACG ACC TTC GAG CAT TCC AGC AG) και ένα εκκινητή προσαρμογέα συμπληρωματική προς την αλληλουχία συνδέτη στον εκκινητή CDS ως πρώτος αντίστροφος εκκινητής και το Primer CDS ως δεύτερος φωλιασμένο διεγερτή

Η δοκιμασία APOT έγινε όπως περιγράφεται προηγουμένως [6] με ελαφρές τροποποιήσεις σε σχέση με τον εκκινητή που χρησιμοποιήθηκε. Ο αντίστροφος εκκινητής για την πρώτη PCR περιλαμβάνει την αλληλουχία 5′-AAG CAG TGG ΤΑΑ CAA CGC A-3 », η ένθετη PCR εκκινητή την αλληλουχία 5′-AAG CAG TGG ΤΑΑ CAA CGC AGA GTA CT-3 ‘. Το μίγμα της αντίδρασης, που περιέχει 20 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl

2, 200 μΜ dNTPs, 250 ηΜ εκκινητή το καθένα και 0,75 μονάδες ανασυνδυασμένης Taq πολυμεράσης (Invitrogen, Carlsbad, California, USA), υποβλήθηκε σε ένα αρχικό στάδιο μετουσίωσης για 5 λεπτά στους 94 ° C, ακολουθούμενη από 30 κύκλους μετουσίωσης στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, συγκόλληση του αρχικού τεμαχίου για 30 δευτερόλεπτα και επιμήκυνση στους 72 ° C για 2 λεπτά. Για HPV16, οι θερμοκρασίες ανόπτησης των 61 ° C και 66 ° C για την πρώτη και δεύτερη PCR, αντίστοιχα, χρησιμοποιήθηκαν? για HPV18, 61 ° C και 68 ° C. Η αντίδραση τερματίστηκε με ένα τελικό στάδιο επιμήκυνσης στους 72 ° C για 6 λεπτά. Δύο μικρολίτρα του πρώτου PCR χρησιμοποιήθηκαν ως μήτρα για την ένθετη στάδιο της PCR. Αμφότερες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σε όγκο 25 μικρολίτρων. Τα προϊόντα ενίσχυσης κατέστησαν ορατά με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 1%. Προϊόντα τα οποία διαφέρουν ως προς το μέγεθος τους από την μείζονα ιική μεταγραφή (Ε6 * 1-Ε7-E1

VE4-E5) είναι ενδεικτικές για ιογενή-κυτταρικών μεταγραφές σύντηξης. Η δοκιμασία APOT έχει αρκετούς περιορισμούς. Ένας όγκος στον οποίο η ολοκληρωμένη HPV γονιδίωμα είναι μεταγραφικώς σιωπηλό δεν θα αποκαλύψει το χαρακτηριστικό ιό κυτταρική σύντηξη μεταγραφής και ως εκ τούτου θα σημειωθούν ως αρνητικό για ολοκλήρωση. Επιπλέον, η δοκιμασία μπορεί να μην ανιχνεύσει ιική-κυτταρικών μεταγραφές σύντηξη με την παρουσία μιας περίσσειας του μετεγγραφής που προέρχονται από επισωματική HPV γονιδιωμάτων. Τέλος, ένας όγκος στον οποίο η ολοκληρωμένη HPV γονιδίωμα παραμένει σε μορφή αλυσιδωτής σύνδεσης τα ιικά μεταγραφήματα μπορεί να μην περιλαμβάνουν κυτταρικές αλληλουχίες και επομένως δεν μπορεί να διαφοροποιηθεί από μεταγραφές επίσωμα προέλευσης. Συνολικά, η δοκιμασία υποεκτιμά τον αριθμό των όγκων με ενσωματωμένο HPV DNA.

Αναλύσεις Αλληλουχίας

Viral-κυτταρικά μεταγραφές σύντηξης αποκόπηκαν από την πηκτή και εκχυλίστηκαν με το Zymoclean Gel DNA Ανάκτηση Kit (AnalytikJena, Jena , Γερμανία). Τα απομονωμένα προϊόντα αλληλουχία (Seqlab, Göttingen, Γερμανία) και ο τόπος ολοκλήρωσης προσδιορίζεται με ευθυγραμμίσεις βάση δεδομένων χρησιμοποιώντας Εθνικό Κέντρο Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας (NCBI) ανθρώπινο εργαλείο megaBlast και το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας στη Σάντα Κρουζ (USCS) του προγράμματος περιήγησης γονιδιώματος.

PCR

Για επιλεγμένα δείγματα (n = 13), η ύπαρξη των ιικών-κυτταρικών μεταγραφημάτων σύντηξης πιστοποιήθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ιικές και κυτταρικές ολοκλήρωση ειδικών εκκινητών. PCR ενίσχυση πραγματοποιήθηκε σε έναν τελικό όγκο 25 μικρολίτρων που περιείχε 20 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl

2, 50 mM ΚΟΙ, 200 μΜ dNTPs, 400 ηΜ εκκινητή το καθένα και 1.5U Platinum Taq DNA πολυμεράσης (Invitrogen, Carlsbad, California, USA). Οι αντιδράσεις PCR εκτελέστηκαν με αρχική βαθμίδα μετουσίωσης στους 94 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 45 κύκλους μετουσίωσης στους 94 ° C για 15 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 58-60 ° C (ανάλογα με το ζεύγος εκκινητών που χρησιμοποιείται) για 20 sec και επιμήκυνση στους 72 ° C για 30 sec.

σε αναλύσεις Silico

για χρωμοσωμική χαρτογράφηση των ιικών-κυτταρικό μεταγραφές σύντηξης και να αφορούν την ολοκλήρωση του HPV σε εύθραυστα χώρους και miRNAs, το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, χρησιμοποιήθηκαν Σάντα Κρουζ (UCSC) του προγράμματος περιήγησης γονιδιώματος (hg19) και ο Χάρτης Viewer (Build 37,3) του Εθνικού Κέντρου πληροφοριών Βιοτεχνολογίας (NCBI). Όλες οι γνωστές αλληλουχίες miRNA που περιλαμβάνονται στο μητρώο miRNA «miRBase» (https://www.mirbase.org/) με 1527 αρχεία (απελευθέρωση 18) για τον homo sapiens.

Διερεύνηση Ενσωμάτωσης Loci Συχνότητα

Για να προσδιοριστεί η συχνότητα της ολοκλήρωσης του HPV σε συγκεκριμένα γονίδια και hotspots, στοιχεία που δημοσίευσε η Dall 2008, Ferber 2003, Kraus 2008, Matovina 2009, ο Peter 2006, Thorland 2003, Wentzensen 2002 και 2004 και Ziegert 2003 [3], [15 ], [17], [19], [20], [21], [53], [54], [55] συμπεριλήφθηκαν.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Ακολουθίες S1.

ευθυγραμμίσεις Ακολουθία των ομόλογων περιοχών.

doi: 10.1371 /journal.pone.0039632.s001

(DOC)