Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) έχουν συνήθως την ικανότητα να αποφύγει τη χημειοθεραπεία και μπορεί να είναι η κύρια πηγή των μεταστάσεων. Οι ΚΕΠ για καρκινώματος ανθρώπινου παγκρεατικού πόρου (PDAC) έχουν ταυτοποιηθεί, αλλά ούτε το μεταστατικό δυναμικό ούτε η χημειοαντίσταση αυτών των κυττάρων έχουν αξιολογηθεί επαρκώς. Έχουμε αντιμετωπιστούν αυτά τα ζητήματα από την εξέταση πλευρά πληθυσμού (SP) κύτταρα που απομονώνονται από το Panc-1 και BxPC3 γραμμές των ανθρώπινων κυττάρων PDAC, οι oncogenotypes των οποίων διαφέρουν. κύτταρα SP θα μπορούσε να απομονωθεί από μονοστοιβάδες Panc-1, αλλά μόνο από σφαιροειδή BxPC3. Χρησιμοποιώντας ορθοτοπική ξενομοσχεύματα στην σοβαρή ανοσοκαταστολή NSG ποντίκι, βρήκαμε ότι SP κύτταρα που απομονώνονται από δύο κυτταρικές σειρές παρήγαγαν όγκους που ήταν πολύ μεταστατικός, σε αντίθεση με την προηγούμενη εμπειρία με κυτταρικές σειρές PDAC. κύτταρα SP που προέρχονται από δύο κυτταρικές σειρές εξέφρασαν τον μεταφορέα ABCG2, η οποία ήταν αποδεδειγμένα υπεύθυνη για το φαινότυπο SP. κύτταρα SP οδήγησε σε μη-SP κύτταρα (NSP)

in vitro

και

in vivo

, μια μετάβαση που ήταν προφανώς οφείλεται σε μετα-μεταφραστική αναστολή του μεταφορέα ABCG2. Είκοσι-δύο άλλες γραμμές κυττάρων PDAC εξέφρασε επίσης ABCG2. Η ευαισθησία των κυττάρων PDAC SP στην βινκριστίνη βίνκα αλκαλοειδές θα μπορούσε να αυξηθεί σε μεγάλο βαθμό με βεραπαμίλη, ένας γενικός αναστολέας των μεταφορέων. Σε αντίθεση, η βεραπαμίλη δεν είχε καμία επίδραση στην θανάτωση των κυττάρων PDAC με γεμσιταβίνη, η τρέχουσα θεραπευτική πρώτης γραμμής για PDAC. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η απομόνωση των κυττάρων SP μπορεί να είναι ένα βολικό και αποτελεσματικό εργαλείο για τη μελέτη των PDAC ΚΕΠ? ότι τα ΚΕΠ μπορούν να είναι οι κύριοι πρόγονοι της μετάστασης από την ανθρώπινη PDAC? ότι ο μεταφορέας ABCG2 είναι υπεύθυνη για το φαινότυπο SP σε ανθρώπινα κύτταρα PDAC, και μπορεί να είναι μια πανταχού παρούσα πηγή του φαρμάκου αντοχής σε PDAC, αλλά δεν προσδίδουν αντίσταση σε gemcitabine? και ότι η αναστολή της ABCG2 θα μπορούσε να προσφέρει ένα χρήσιμο συμπλήρωμα σε μια θεραπευτική επίθεση στα ΚΕΠ του PDAC

Παράθεση:. Bhagwandin VJ, Επίσκοπος JM, Ράιτ ΕΜΕΙΣ, Shay JW (2016) Το μεταστατικό δυναμικό και χημειοαντίσταση του Ανθρώπου του παγκρέατος καρκινικά βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 11 (2): e0148807. doi: 10.1371 /journal.pone.0148807

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 23 Ιουνίου, 2015? Αποδεκτές: 22 Ιανουαρίου, 2016? Δημοσιεύθηκε: 9 Φεβρουαρίου 2016

Copyright: © 2016 Bhagwandin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Πιο σχετικά δεδομένα είναι μέσα στο χαρτί. δεδομένων των μικροσυστοιχιών χρησιμοποιήθηκαν από τη μελέτη Gysin, των οποίων οι συγγραφείς μπορεί να έρθει σε επαφή με [email protected]

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από: 1. Εθνική Υπηρεσία Αεροναυτικής και Διαστήματος-Εξειδικευμένο Κέντρο Έρευνας: NNJ05HD36G (VJB, wew, ΤΣΕ), και 2. Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, η Ruth L. Kirschstein Εθνικό Βραβείο Έρευνας Υπηρεσία, θεσμικές Εκπαίδευση Grant (Τ32) για το GW Hooper Ίδρυμα Ερευνών: CA09043 (VJB, JMB)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) τάξεις μεταξύ των πιο θανατηφόρος ανθρώπινων κακοηθειών. Παρά την επιθετική χειρουργική επέμβαση και τη χρήση της σύγχρονης εισαγωγική και επικουρική χημειοθεραπεία, η συνολική επιβίωση 5 ετών είναι περίπου 10-26%, ανάλογα με τη σοβαρότητα της διάδοσης (cancer.org και cancer.net). Χημειοθεραπευτικούς παράγοντες όπως η γεμσιταβίνη τη μείωση της πρωτογενούς φορτίο όγκου, αλλά αποτυγχάνουν να εξαλείψουν μεταστατική νόσο του ήπατος, η κύρια αιτία θνησιμότητας στις PDAC. Η υπόθεση καρκίνος βλαστικών κυττάρων υποδηλώνει ότι ένας μικρός πληθυσμός των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν είναι υπεύθυνη για την επίμονη ανάπτυξη ενός όγκου και αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά [1]. Επιπλέον, έχει προταθεί ότι τα ΚΕΠ μπορεί να είναι η άμεση πηγή των μεταστατικών κυττάρων που αντέχουν εγγενώς χημειοθεραπεία [1,2]. Αρκετές ομάδες έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί παγκρέατος ΚΕΠ χρησιμοποιώντας συνδυασμούς δεικτών κυτταρικής επιφάνειας [είτε CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ [3], ή CD133

+ /CXCR4

+ [4]], ή από την SP κλασματοποίησης [5-8]. Το ΚΕΠ που εκφράζουν CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ λαμβάνονται από δείγματα ασθενών ή CD133

+ /CXCR4

+ από κυτταρικές σειρές έχει αποδειχθεί ότι είναι εξαιρετικά ογκογόνο σε NOD /SCID ποντικούς [3,4]. Ωστόσο, το μεταστατικό δυναμικό των όγκων που προέρχονται από CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ ΚΕΠ δεν έχει αναφερθεί, και οι όγκοι προκαλούνται με CD133

+ /CXCR4

+ ΚΕΠ ήταν μόνο ασθενώς μεταστατικό [4]. Εναλλακτικά, η διαδικασία της SP κλασματοποίηση έχει χρησιμοποιηθεί για να εμπλουτίσει για παγκρεατική ΚΕΠ, αλλά όγκους που ξεκίνησαν από αυτά τα ΚΕΠ μετάσταση επίσης ανεπαρκώς [5,6]. Έχουμε χρησιμοποιήσει ορθοτοπική ένεση σε σοβαρά ανοσοανεπαρκή ποντίκια για να βελτιωθεί η αξιολόγηση των κυττάρων SP που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές PDAC. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η CSCs περιλαμβάνονται στα κλάσματα PDAC SP μπορεί να είναι οι πρόγονοι της μετάστασης, και αποδεικνύουν ότι η ABCG2 μεταφορέας είναι μια ευρέως διαδεδομένη, αν όχι πανταχού πηγή πιθανής αντίστασης φαρμάκου σε PDAC, αλλά δεν είναι υπεύθυνη για την ανθεκτικότητα στην πρώτη γραμμή θεραπευτική γεμσιταβίνη. κύτταρα SP που προέρχονται από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές PDAC προσφέρουν ένα βολικό μέσο με το οποίο να διερευνήσει τους μηχανισμούς της ογκογένεσης, μετάσταση και η αντίσταση των ναρκωτικών.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα Γραμμές

παγκρέατος κυτταρικές γραμμές καρκίνου ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA) και αναπτύχθηκαν σε DMEM για κύτταρα Panc-1, ή RPMI για κύτταρα BxPC3 συμπληρωμένο με 10% FBS. Η κυτταρική γραμμή BxPC3 επίσης καλλιεργείται ως σφαιροειδή, χρησιμοποιώντας μη επικαλυμμένη βακτηριολογικά τρυβλία Petri (μη TC) και DMEM ελεύθερο ορού συμπληρωμένο με Β27 (Invitrogen), ένα ιδιόκτητο αντιδραστήριο που είναι γνωστό ότι προάγει την ανάπτυξη του CD133

+ /CXCR4

+ ΚΕΠ [9]. Το φλοιού των επινεφριδίων κυτταρική γραμμή καρκινώματος H295 αναπτύχθηκε σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με ινσουλίνη, τρανσφερίνη και σελήνιο (ITS), και 10% FBS.

In Vitro

Φαρμακολογίας

Για τη δόση μελέτες απόκρισης με γεμσιταβίνη, 1500 SP κύτταρα από Panc-1 ή 10.000 SP κύτταρα από BxPC3 απλώθηκαν σε δίσκους 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία 24 ώρες αργότερα με διπλάσιες σειριακές αραιώσεις γεμσιταβίνης με ή χωρίς 20μΜ βεραπαμίλης. Για τις μελέτες βινκριστίνη, Panc-1, κύτταρα BxPC3, ή H295 SP απλώθηκαν σε πιάτα 96 φρεατίων. Κάθε κυτταρική γραμμή υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δύο φορές διαδοχικές αραιώσεις βινκριστίνης με ή χωρίς 50μΜ βεραπαμίλης. Μετά από μία εβδομάδα, τα κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Σε κάθε πείραμα, τα κύτταρα BxPC3 αναπτύχθηκαν όπως σφαιροειδή επί μη TC πιάτα 96 φρεατίων σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό συμπληρωμένο με Β27.

ΜΤΤ Δοκιμασία

Η δοκιμασία ΜΤΤ χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η βαθμός χημειοαντίσταση στα κύτταρα SP και NSP. Το μέσο από κύτταρα επεξεργασμένα φάρμακο αντικαταστάθηκε με 100 μΐ υπόστρωμα ΜΤΤ (5 μg /ml) αραιώνονται σε μέσο προσδιορισμού (φαινόλη ελεύθερο DMEM, 25mM HEPES, 1 mM Na-πυροσταφυλικό) και τοποθετήθηκαν σε ένα επωαστήρα καλλιέργειας ιστού επί 4 ώρες. Το υπόστρωμα αντικαταστάθηκε με 100 μΐ διαλύματος διαλυτοποίησης (10% Triton Χ-100, 0,1 Ν HCl, 80% ισοπροπανόλη) και ήπια ανακινήθηκε για 5 λεπτά. Οι πλάκες αναγιγνώσκονται σε μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας Tecan2 σε ένα μήκος κύματος ανίχνευσης 570nm, και αναφορά των 690nm.

Ανοσοβαφή ABC μεταφορέων

Panc-1, BxPC3 ή H295 κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 0,1% PFA για 10 λεπτά και κατέστησαν διαπερατά με 0,3% σαπωνίνη σε ρυθμιστικό FACS. Και οι δύο τύποι κυττάρων βάφτηκαν με BXP-53 (ABCG2, Santa Cruz) ή G-1 (/MDR-1, Santa Cruz ABCB1) αντίσωμα αραιωμένο 1: 100 σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS για 30 λεπτά επί πάγου, πλύθηκαν δύο φορές με PBS, χρωματίστηκαν με FITC 1: 1000 σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS για 30 λεπτά επί πάγου, πλύθηκαν με PBS, και αναλύθηκαν σε FACSaria. Ανοσοϊστοχημεία: τομές 5 μΜ κόπηκαν από παραφίνη παραφίνη ιστούς των πρωτοπαθών όγκων, αποπαραφινοποιήθηκαν με ξυλόλια, ενυδατωμένο μέσω βαθμονομημένων αλκοολών προς PBS. Τα τμήματα υποβλήθηκαν σε επαγόμενη θερμότητα ανάκτηση επιτόπου, και η υπολειμματική δράση υπεροξειδάσης αποσβέστηκε με PBS /3% μείγμα υπεροξειδίου του υδρογόνου. Η χρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Vectastain ABC kit elite κουνελιού IgG (Cat # PK-6101, Vectorlabs) με ABCG2 πρωτογενές αντίσωμα. 1: 100 όλη την νύκτα αραίωσης (cat # GTX100436, Genetex) και με αιματοξυλίνη του Meyer

Side πληθυσμός δοκιμασία

προσδιορισμοί SP εκτελέστηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [7,10]. Εν συντομία, 1 χ 10

6 κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 (ΗΟΕ) σε τελική συγκέντρωση ml και βεραπαμίλη έλεγχοι /5μg προ-επεξεργασία με 100 μΜ του verapamil για 10 λεπτά. Όλα τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 ° C βαθμούς για 60 λεπτά με διαλείπουσα ανάμιξη κάθε 15 λεπτά. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε PBS με 3% BSA, 0,01% ϋΝάσης Ι, και 1 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου και διηθείται μέσα από ένα σουρωτήρι κύτταρο 40μΜ. Τα σφαιροειδή BxPC3 διαχωρίστηκαν με κανονική θρυψινοποίηση πριν από τη χρώση ΗΟΕ. δοκιμασία ανοσο-αναστολής: πριν από τη χρώση ΗΟΕ, Panc-1, BxPC3 και H295 κύτταρα προ-επεξεργασία με 5μg είτε ABCG2 αντίσωμα, 5D3 (R &? συστήματα D, cat # MAB995) ή MDR1 αντίσωμα, MRK-16 (Kamiya Biomedical , cat # MC-017).

ορθοτοπική ξενομοσχεύματος

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας στο Επιτροπής των ζώων Χρήση του Σαν Φρανσίσκο (αριθμός πρωτοκόλλου: AN090185-01). Για ορθοτοπική ξενομοσχεύματα, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με κεταμίνη και ξυλαζίνη. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν με ένεση με κεταμίνη και ξυλαζίνη, ακολουθούμενη από αφαίμαξη. Οι NOD-SCID /IL-2 γάμμα (NSG) ποντίκια αγοράστηκαν από τα εργαστήρια Jackson για όλα τα

in vivo

διαδικασίες. Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση ενός κοκτέιλ που περιείχε 50 μΙ, 25 mg /ml κεταμίνη, 2,5 mg /ml ξυλαζίνης, και 0,5 mg /ml ακεπρομαζίνης. Μετά από ποντίκια αναισθητοποιούνται την περιοχή της τομής αποστειρώνεται με betadine και να καθαρίζονται με ένα βαμβάκι εμποτισμένο με οινόπνευμα. Μια μικρή τομή έγινε κάτω από το πλευρικό περιθώριο και το πάγκρεας εξετέθη χρησιμοποιώντας λαβίδες χωρίς να καταστραφεί ή αποσύνδεση του οργάνου και τοποθετείται επί του εξωτερικού της κοιλιάς. Το πάγκρεας πραγματοποιήθηκε με ήπια έλξη και ένα εναιώρημα κυττάρων σε 50 μΐ matrigel εγχύθηκε στην ουραία κάτω από την κάψουλα του παγκρέατος. Ενα αποστειρωμένο μάκτρο από βαμβάκι-tip εφαρμόστηκε στην θέση της ένεσης για 5 δευτερόλεπτα για να επιτραπεί η παγκρεατική κάψουλα την επανασφράγιση. Η εγχέεται πάγκρεας ακολούθως επέστρεψε στην περιτοναϊκή κοιλότητα μέσω της αρχικής τομής. Η θέση της τομής ράβεται και αγωγή με τοπική αντιβιοτική κρέμα. Τέλος, το ζώο τοποθετήθηκε σε ένα θερμό κλουβί και ένεση με μετεγχειρητική αναλγητικά όπως είναι απαραίτητο.

λουσιφεράσης σήμανση των κυττάρων PDAC και

In vivo

βιοφωταύγεια Imaging

Μια τεσσάρων πλασμίδιο σύστημα διαμόλυνσης χρησιμοποιήθηκε για να κάνει φακοϊό. Πλασμίδια που λαμβάνονται από την Geron Corp. κωδικοποιεί tet-rev, gag-pol, VSV-G, και pMND-Luc επιμολύνθηκαν σε κυτταρική σειρά ΗΕΚ293 χρησιμοποιώντας Fugene 6 ακόλουθες συστάσεις πωλητή επιμόλυνση. Τα κύτταρα ανακτήθηκαν μετά από 24 ώρες και ιικά υπερκείμενα συλλέχθηκαν κάθε 12 ώρες για το σύνολο των 72 ώρες. Τα υπερκείμενα διηθήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο 0.45 και αναμιγνύεται DEAD-δεξτράνης στα 4 μg /ml και προστέθηκαν σε Panc-1 ή BxPC3 κύτταρα για μεταγωγή. Μετά από 72 ώρες διαδοχικής λοιμώξεων, τα κύτταρα ανακτήθηκαν σε κανονικό μέσο καλλιέργειας επί τρεις ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια χωρίζονται σε αναλογία 1:10 και τοποθετήθηκαν υπό επιλογή G418 σε 1 mg /ml για 10 ημέρες. Ζωντανά κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν με τη χρήση του συστήματος ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως λουσιφεράσης της Promega για 30 λεπτά σε πάγο και στη συνέχεια μετρήθηκε σε ένα φωτόμετρο.

In vivo

απεικόνιση βιοφωταύγεια διεξήχθη σε μία συσκευή απεικόνισης Xenogen χρησιμοποιώντας συνθήκες που περιγράφονται προηγουμένως [11].

Αποτελέσματα

Ο φαινότυπος SP σε μονοστοιβάδες και καλλιέργειες σφαιροειδή ανθρώπινων κυτταρικών PDAC γραμμές

Είμαστε σε σύγκριση πρώτα το περιεχόμενο SP των δύο ανθρώπινων κυτταρικών σειρών PDAC, οι oncogenotypes των οποίων διαφέρουν: κύτταρα Panc-1, το οποίο περιέχει ένα ογκογόνο

KRAS

μετάλλαξη και η απώλεια της λειτουργίας

TP53

μετάλλαξη (και τα δύο από τα οποία είναι κοινά σε PDAC)? και τα κύτταρα BxPC3, τα οποία περιέχουν μια μετάλλαξη απώλειας λειτουργίας στο

Smad4

και

CDKN2A

γονίδια (δύο από τα οποία είναι σχετικά σπάνια σε PDAC) [12]. Το κλάσμα SP προσδιορίστηκε με ανίχνευση του αποκλεισμού της χρωστικής δέσμευσης DNA Hoechst 33342 (ΗΟΕ) από κύτταρα, μία ένδειξη της δραστηριότητας μεταφορέα [4,10]. Η πύλη για την SP προσδιορίστηκε με βεραπαμίλη αναστολή, σε γενικές γραμμές ενεργό ανταγωνιστή μεταφορέα. Ένα κλάσμα SP 10% ανιχνεύθηκε σε κύτταρα Panc-1 (Σχ 1Α), αλλά σε αντίθεση με μια προηγούμενη αναφορά [5], ένα κλάσμα SP δεν μπορούσε να ανιχνευθεί σε κύτταρα BxPC3 πολλαπλασιάζονται σε συμβατικό μέσο ως 2D μονοστιβάδες (Σχήμα 1Α). Το κλάσμα SP προηγουμένως αναφερθεί σε κύτταρα BxPC3 δεν δοκιμάστηκε σε μία βιολογική ανίχνευση και ως εκ τούτου μπορεί να είναι ένα ζήτημα του κυτταρομετρίας ροής τύπου όργανο, ρυθμίσεις του οργάνου ή τη μέθοδο χρώσης. Σε μια προσπάθεια να αποκαλύψει ΚΕΠ στην κυτταρική σειρά BxPC3, μη κλασματοποιημένα κύτταρα αναπτύχθηκαν ως σφαιροειδή υπό συνθήκες που αποσκοπούν στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Αυτό παρήγαγε ένα κλάσμα SP 5% στις καλλιέργειες των BxPC3 σφαιροειδή (σχήμα 1Β). Σε αντίθεση, τα κύτταρα Panc-1 απέτυχε να ευδοκιμούν όταν καλλιεργείται υπό τις συνθήκες που χρησιμοποιούνται με BxPC3 και δεν μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την SP κλασμάτωση. Η ικανότητα των σφαιροειδών για να αποκαλύψει τον φαινότυπο SP σε BxPC3 είναι συνεπής με προηγούμενες αναφορές ότι τα ΚΕΠ εμπλουτισμένα σε σφαιροειδή [13-15]. Είναι αξιοσημείωτο ότι οι δύο PDAC κυτταρικές σειρές έχουν σαφώς διαφορετικές oncogenotypes, η οποία μπορεί να ευθύνεται για τις διαφορές στην περιεκτικότητα SP τους και την απόκριση στο εξειδικευμένο μέσο.

(Α) Panc-1 και BxPC3 κύτταρα βάφτηκαν με Hoechst 33342 χρωστική (5 μg /ml) και αναλύθηκαν με ένα κυτταρόμετρο FACSaria ροής, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Η πύλη για τα κύτταρα SP προσδιορίστηκε με κατεργασία με βεραπαμίλη (100 μΜ). Το κλάσμα των κυττάρων στην πύλη SP δίδεται σε κάθε πάνελ. Προφίλ των κυττάρων Panc-1, άνω σειρά? και τα κύτταρα BxPC3, κάτω σειρά? ελέγχου βεραπαμίλη (VP), δεξιά πάνελ. (Β) Επάνω σειρά: κύτταρα BxPC3 αναπτύχθηκαν είτε σε πρότυπο μέσο σε τρυβλία ιστοκαλλιέργειας (TC), σε ϋΜΕΜ άνευ ορού με Β27 (SFDB) σχετικά με πιάτα TC, ή ως σφαιροειδή σε SFDB επί μη επικαλυμμένων βακτηριολογικών (μη TC) Petri πιάτα. Κάτω σειρά:. Ποσοτικοποίηση της SP με FACS ταξινόμησης για κάθε κατάσταση πολιτισμό, τον έλεγχο βεραπαμίλη (VP), ακροδεξιά πίνακα

Η

Όγκων έναρξη δυναμικό των SP και κυττάρων NSP

Με βάση μας ερμηνεία των δημοσιευμένων στοιχείων [3,5,6,8], ΚΕΠ εμπλουτίζεται με επιλογή για δείκτες κυτταρικής επιφάνειας είναι ουσιαστικά περισσότερο αποτελεσματική από SP CSCs σε δοκιμασίες ογκογένεση. Σε μια προσπάθεια να βελτιωθεί η επίδοση του SP ΚΕΠ σε δοκιμασίες για ογκογένεση, χρησιμοποιήσαμε ορθοτοπικό ένεση στο πάγκρεας ποντικών NSG, του οποίου η σοβαρή ανοσοανεπάρκεια καθιστά εξαιρετικά ευαίσθητο σε ογκογένεση με ξενομοσχεύματα [16]. Εμείς ορθοτοπικώς ένεση 500, 5000 ή 50000 της SP ή κυττάρων NSP κλασματώθηκαν από λουσιφεράσης-tagged μονοστιβάδες Panc-1 ή σφαιροειδή BxPC3. Η λουσιφεράση χρησιμοποιήθηκε για τη λήψη εικόνων από ενεμένους ποντικούς. Βρήκαμε ότι 500 SP κύτταρα ήταν αρκετή για να παραχθεί όγκους εντός δύο εβδομάδων σε ολόκληρη την ομάδα των πέντε ποντικών, ενώ 500 κύτταρα NSP έκαναν σε ένα μόνο ποντίκι έξω από πέντε (Σχήμα 2Α και 2Β). Με τρεις μήνες, ωστόσο, όλα τα ζώα είχαν αναπτύξει όγκους του παγκρέατος (βλέπε παρακάτω, Σχήμα 3Α). Τα αποτελέσματα αυτά είναι μια αποφάσισε βελτίωση μετά από προηγούμενη εμπειρία με κύτταρα SP, στην οποία απαιτείται ένα ελάχιστο 10.000 κύτταρα να ξεκινήσει ογκογένεση που ήταν ανιχνεύσιμη μέσα σε 4-5 εβδομάδες [5,6]. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι το πρωτόκολλο μας έχει βελτιώσει την αποδοτικότητα της ογκογένεσης με ΚΕΠ που περιέχονται στο κλάσμα SP από κυτταρικές γραμμές PDAC.

SP και NSP κύτταρα ελήφθησαν με κλασμάτωση χρησιμοποιώντας τις πύλες φαίνεται στην Εικόνα 1. Ο όγκος δυναμικό για την κίνηση των SP και NSP δοκιμάστηκε με ορθοτοπικά έγχυση 500, 5000, ή 50.000 κύτταρα λουσιφεράσης-επισημασμένα κύτταρα από κάθε πληθυσμό, χρησιμοποιώντας ομάδες από πέντε ποντίκια NSG για κάθε δόση των κυττάρων. Μετά από δύο εβδομάδες, η σχετική ποσότητα του όγκου του όγκου ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο

in vivo

βιοφωταύγεια απεικόνισης. (Α) Panc-1 μονοστιβάδα κυττάρων (Β) BxPC3 σφαιροειδή κύτταρα. (Γ) Ιστόγραμμα της εμφάνισης του όγκου για κάθε ομάδα των πέντε NSG ποντίκια, Φοιτητών

t

test =

P

& lt?. 0.002

Η

SP και NSP κύτταρα απομονωθεί από Panc-1 μονοστιβάδες και σφαιροειδή BxPC3, τότε ορθοτοπικώς ένεση ως κλάσματα των 500 κυττάρων σε ομάδες των τριών NSG ποντίκια. Τα ζώα διατηρήθηκαν για τρεις μήνες και κατόπιν εξετάστηκαν για πρωτογενείς και μεταστατικούς όγκους. (Α) Σύγκριση των πρωτογενών όγκων και μεταστάσεων που προκύπτουν από SP, δεξιά στήλη και τα κύτταρα NSP, αριστερή στήλη απομονώθηκε από Panc-1 μονοστιβάδες και μεταστάσεις που απομονώνονται από BxPC3 σφαιροειδή. Η επάνω σειρά απεικονίζει πρωτογενείς όγκους και η δεύτερη σειρά απεικονίζει μεταστάσεις και για τις δύο κυτταρικές σειρές. (Β) Κύτταρα όγκου που απομονώνονται από πρωτογενείς και μεταστατικούς όγκους και αναλύθηκαν για περιεκτικότητα SP. Πρωτογενούς όγκου, κορυφαία πάνελ? μεταστατικό χώρο, κάτω πάνελ. κλάσματα (C-D) SP και NSP απομονώθηκαν από Panc-1 και BxPC3 κυττάρων και απλώνονται πίσω στον πολιτισμό, χρησιμοποιώντας τυποποιημένο μέσο για τα κύτταρα από Panc-1 σε κανονικό πιάτα καλλιέργειας ιστού και σφαιροειδές μέσο για τα κύτταρα BxPC3 για πιάτα μη-TC. Μετά από μία εβδομάδα χωρίς πέρασμα, κάθε επιστρώθηκαν κλάσμα αναλύθηκε με FACS. Το ποσοστό των κυττάρων στην πύλη SP δίδεται σε κάθε πάνελ.

Η

μεταστατικό δυναμικό των SP ΚΕΠ

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι τα ΚΕΠ μπορεί να είναι η πηγή της μεταστατικής νόσου [17,18 ]. Ωστόσο, προηγούμενες προσπάθειες απέτυχαν να αποκτήσουν έντονη μετάσταση με ΚΕΠ εμπλουτίζεται από τη χρήση είτε δεικτών κυτταρικής επιφάνειας ή SP κλασμάτωση. Αυτό ήταν αλήθεια των κυττάρων που εκπροσωπούν είτε PDAC ή άλλες μορφές κακοήθειας [3,4,19-24]. Σε μια προσπάθεια να αυξήσει τη μετάσταση από όγκους που σχηματίζονται από κύτταρα SP, χρησιμοποιήσαμε πάλι ορθοτοπική ένεση σε ποντικούς NSG. Απομονώσαμε κλάσματα SP και NSP από Panc-1 κύτταρα μονοστιβάδας και κυττάρων σφαιροειδές BxPC3, στη συνέχεια με ένεση 500 αυτών των κυττάρων εντός του παγκρέατα τριών NSG ποντικών σε κάθε ομάδα. Κατά τρεις μήνες, τόσο SP και κυττάρων NSP από κάθε κυτταρική γραμμή παρήγαγε πρωτογενείς όγκους των περίπου 1 cm σε μέγεθος (Σχήμα 3Α). Επιπλέον, υπήρχε σοβαρή μεταστατική ηπατική νόσο στα ποντίκια που ενέθηκαν με κύτταρα SP, ουσιαστικά effacing το φυσιολογικό ηπατικό παρέγχυμα (Σχήμα 3Α, δεξιά πάνελ). Τα ζώα που είχαν λάβει κύτταρα NSP περιείχε επίσης ηπατικές μεταστάσεις, αλλά οι μεταστάσεις ήταν τόσο λίγοι σε αριθμό και σημαντικά μικρότερη (Σχήμα 3Α, αριστερό πάνελ). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι οι όγκοι που παράγονται με κύτταρα SP προέρχονται είτε από μονοστιβάδες ή σφαιροειδή είναι επιθετικά μεταστατικά.

Δημοτικό όγκους που ξεκίνησαν με κύτταρα SP είτε από Panc-1 ή BxPC3 περιείχε ένα κλάσμα SP περίπου το ίδιο μέγεθος με αυτό που βρέθηκε στο οι κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, το μέγεθος του κλάσματος SP ήταν ακόμα χαμηλότερο στις μεταστάσεις (Εικόνα 3Β), σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [8,25]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα ΚΕΠ ή άλλα συστατικά του πληθυσμού κλάσμα SP γεννήσει πολυάριθμα κύτταρα NSP κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης και της μετάστασης. Περαιτέρω στοιχεία ενός τέτοιου γεγονότος παρατηρήθηκε όταν SP και NSP κύτταρα κλασματοποιήθηκαν από Panc-1 μονοστιβάδες και σφαιροειδή BxPC3, και στη συνέχεια καλλιεργούνται

in vitro

χωρίς πέρασμα. Μετά από μία εβδομάδα, με μόνο 2,5 διπλασιασμούς, μια μεγάλη πλειοψηφία των καλλιεργημένων SP κύτταρα και από τις δύο γραμμές τώρα κλασματοποιήθηκαν ως κύτταρα NSP (Σχήμα 3C και 3D), να προσπαθεί έτσι να αναπαράγουν τα γεγονότα που συνέβησαν

in vivo

κατά τη διάρκεια της διάρκεια της ογκογένεσης. Σε αντίθεση, τα καλλιεργημένα κύτταρα NSP και από τις δύο γραμμές που περιέχονται μικρών ποσοτήτων κυττάρων SP (Σχ 3C και 3D). Αυτό το εύρημα θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει είτε ένα μόλυνση ίχνος του κλάσματος NSP ή χαμηλό επίπεδο μετατροπής των κυττάρων NSP στο φαινότυπο SP. Όποια και αν είναι η πηγή τους, η παρουσία των κυττάρων SP στο κλάσμα NSP αντιπροσωπεύει μια πιθανή εξήγηση για τον όγκο που ξεκίνησε από το κλάσμα NSP στο σχήμα 2Α, η φαινόμενη ικανότητα των κυττάρων NSP να παράγουν όγκους σε ένα καθυστερημένο τρόπο (Σχήμα 3Α), καθώς και τις μεταστάσεις ότι συνέβη σε ποντίκια που έλαβαν κύτταρα NSP (Σχήμα 3Α).

ABCG2 είναι υπεύθυνη για το φαινότυπο SP σε κυτταρικές σειρές PDAC

Η κασέτα σύνδεσης ΑΤΡ (ABC) οι μεταφορείς είναι μια σημαντική πηγή των ναρκωτικών αντίσταση σε ανθρώπινους όγκους [26,27]. Δύο από αυτούς τους μεταφορείς, ABCG2 /BCRP και ABCB1 /MDR-1, αναφέρεται ότι είναι οι κύριες πηγές του φαινοτύπου SP σε κυτταρικές σειρές όγκων του ανθρώπου [19,20]. Έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι PDAC κύτταρα εκφράζουν ABCG2, αλλά όχι MDR-1 [5,6,28,29]. Ωστόσο, η δραστηριότητα ABCG2 εξαρτάται από την έκφραση στην κυτταρική επιφάνεια, η οποία ρυθμίζεται από μετα-μεταφραστική τροποποίηση και διαμερισματοποίηση [30]. Ως εκ τούτου, χρωματίστηκαν για τους δύο μεταφορείς επί της επιφανείας του Panc-1 και BxPC3 κύτταρα. Ως μάρτυρας, χρησιμοποιήσαμε H295 κύτταρα, κύτταρα του φλοιού των επινεφριδίων καρκινώματος που εκφράζουν MDR-1 [31,32]. Βρήκαμε ότι Panc-1 και τα κύτταρα BxPC3 εκφράζεται μόνο ABCG2 στην επιφάνειά τους, ενώ H295 κύτταρα εξέφρασαν μόνο MDR-1 (Σχ 4Α). Τα δεδομένα ΡΑΟδ δείχνουν ότι το σύνολο του πληθυσμού των Panc-1 και BxPC3 κύτταρα εξέφρασαν ABCG2 (Σχήμα 4Α), και πήραμε παρόμοια αποτελέσματα με τη χρήση ανοσοϊστοχημείας για να εξετάσει πρωτογενείς όγκους που παράγεται από SP και τα κύτταρα NSP, και τέσσερα δείγματα ασθενή άνθρωπο PDAC (Εικόνα 4Β και 4C).

(Α) χρώση κυτταρικής επιφάνειας των ABCG2 (5D3 αντίσωμα) και ABCB1 /MDR-1 (MRK-16 αντισώματος) σε κύτταρα Panc-1 μονοστρωματική, BxPC3 κύτταρα σφαιροειδές και τα κύτταρα H295. (Β) χρώση ανοσοϊστοχημεία της ABCG2 για SP και NSP παράγονται πρωτογενείς όγκους (θετική DAB λεκέ, καφέ). (Γ) Η ανοσοϊστοχημεία χρώση ABCG2 για την πρωτοβάθμια PDAC όγκους από τέσσερις ασθενείς (θετική DAB λεκέ, καφέ).

Η

Η πανταχού παρουσία των ABCG2 στους κυτταρικούς πληθυσμούς έθεσε το ανορθόδοξη πιθανότητα ότι ο μεταφορέας δεν ήταν υπεύθυνος για την ο φαινότυπος SP. Για να δοκιμαστεί αυτή η πιθανότητα, εμείς κατεργασμένα κύτταρα με αντισώματα αποκλεισμού για ABCG2 [33] και MDR-1 [34] πριν από την εκτέλεση της κλασματοποίησης SP. Η αναστολή της ABCG2 μείωσε το κλάσμα SP του Panc-1 κύτταρα και σφαιροειδή BxPC3 στο 1,04% (9,5 φορές μείωση) και 0,01% (400 φορές μείωση), αντίστοιχα (Σχήμα 5). Σε αντίθεση, η αναστολή της MDR-1 δεν είχε καμία επίδραση επί του περιεχομένου SP των δύο PDAC κυτταρικές σειρές, αλλά μείωσε το κλάσμα SP στον H295 κύτταρα με περισσότερο από εννέα φορές (Σχήμα 5). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι ο μεταφορέας ABCG2 είναι υπεύθυνη για το φαινότυπο SP σε Panc-1 και BxPC3 κύτταρα. Έτσι, παρά την πανταχού παρουσία του μεταφορέα στους κυτταρικούς πληθυσμούς, πρέπει να είναι ενεργός μόνο στο περιορισμένο μέρος των κυττάρων αυτού του είδους ως SP. Έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι η δραστηριότητα του ABCG2 υπόκειται σε μετα-μεταφραστική ελέγχου από Akt [30], η οποία θα μπορούσε να εξηγήσει την ύπαρξη των κυττάρων NSP.

Αναστολή του φαινοτύπου SP. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντισώματα αποκλεισμού για ABCG2 (5D3) και MDR-1 (MRK-16), και στη συνέχεια κλασματώθηκαν με FACS, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. H295, πάνω σειρά? Panc-1 μονοστρωματική, μεσαία γραμμή? και BxPC3 σφαιροειδή, κάτω σειρά. Στήλες 1-4 είναι όπως επισημαίνονται στην εικόνα:. Χωρίς θεραπεία, βεραπαμίλη (VP), 5D3 αντίσωμα και MRK-16 αντισώματος

Η

Για να προσδιοριστεί πόσο διαδεδομένη έκφραση ABCG2 μπορεί να είναι σε PDAC, έχουμε λάβει προηγουμένως δημοσιευθέντα δεδομένα μικροσυστοιχιών από 22 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [35] και συνέκριναν την έκφραση του ABCG2 με εκείνη του MDR-1. Τρεις κανονική παγκρεατική επιθηλιακών κυτταρικών σειρών αναλύθηκαν επίσης στη μελέτη συστοιχία και χρησιμοποιήθηκαν εδώ για την κανονικοποίηση των δεδομένων καρκινικής κυτταρικής γραμμής. Εντυπωσιακά, κάθε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρική γραμμή που εκφράζεται ABCG2 από 2-5 φορές πάνω από το φυσιολογικό παγκρεατικό επιθηλιακών κυτταρικών γραμμών, ενώ κανένα από τα κύτταρα εξέφρασαν MDR-1 (Σχήμα 6). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η έκφραση του ABCG2 μπορεί να είναι μια πανταχού παρούσα ιδιότητα των κυττάρων PDAC, ίσως αντιπροσωπεύει μια αταβισμός από ένα κανονικό στέλεχος που μοιάζει με κύτταρο που δημιουργεί ΚΕΠ, και ως εκ τούτου, σε όγκους.

ανάλυση Microarray του ABCG2 και MDR -1 σε 22 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [36].

2 στοιχεία έκφρασης Το αρχείο καταγραφής για ABCG2 και MDR-1 από τρεις μη-κακοήθη ανθρώπινα παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κυτταρικές γραμμές (hPDEC? # 904, # 916, # 515) έχουν κατά μέσο όρο και αφαιρείται από το αρχείο καταγραφής

2 από κάθε παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική γραμμή και αναπαρίσταται ως οικόπεδο Καταρράκτης και το Μανχάταν,

t

test =

P

& lt Φοιτητών?. 0.001

Η

Ο μεταφορέας ABCG2 δεν προσδίδουν ανθεκτικότητα με γεμσιταβίνη

γεμσιταβίνη είναι γενικά η θεραπεία πρώτης γραμμής για ασθενείς με PDAC, αλλά η μελαγχολική ποσοστό επιβίωσης για την ασθένεια αντικατοπτρίζει μια σχετικά περιορισμένη ανταπόκριση στο φάρμακο. Η αντίσταση των κυττάρων PDAC SP σε γεμσιταβίνη έχει αποδοθεί στην εκροή από ABCG2 [5]. Αν αυτό ήταν σωστό, τότε η αναστολή του μεταφορέα από την ευρέως ενεργό βεραπαμίλη ανταγωνιστής θα πρέπει να αυξήσει την ευαισθησία των κυττάρων PDAC να γεμσιταβίνης [27]. Επιβεβαιώσαμε πρώτα την παρουσία του μεταφορέα μεσολάβηση αντίσταση στις κυτταρικές γραμμές PDAC με κατεργασία κυττάρων SP από Panc-1, BxPC3 και H295 είτε με βινκριστίνη ή ένα συνδυασμό βινκριστίνη και βεραπαμίλη (Σχήμα 7Α, 7C και 7Ε και Πίνακας 1). Βεραπαμίλη ενισχύεται σε μεγάλο βαθμό τη δολοφονία από βινκριστίνη κυττάρων SP από τις τρεις γραμμές. Σε αντίθεση, η βεραπαμίλη δεν είχε καμία επίδραση στην θανάτωση των Panc-1 και BxPC3 SP κύτταρα με γεμκιταβίνη (Σχήμα 7Β, 7D και 7Ε και Πίνακας 1), υποδεικνύοντας ότι η παρουσία του ABCG2 ή MDR-1 δεν είχε ανατεθεί αντίσταση σε γεμσιταβίνης στη είτε κυτταρική σειρά. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι ο μεταφορέας τη συνήθη διαμονή του στην PDAC κύτταρα δεν συμβάλλει στους περιορισμούς της γεμσιταβίνης ως θεραπευτικό για την ασθένεια.

Η απόκριση της δόσης των κυττάρων SP από (Α) H295, (C) Panc-1 μονοστρωματική κύτταρα και κύτταρα σφαιροειδή (Ε) BxPC3 να βινκριστίνη (VCR) και ο συνδυασμός της βινκριστίνης με βεραπαμίλη (VCR-VP) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Ομοίως, η απόκριση στη δόση των κυττάρων SP από το (Β) H295, (D) Panc-1 κύτταρα μονοστιβάδας και σφαιροειδές κύτταρα (Ε) BxPC3 να γεμσιταβίνη (Gem) και το συνδυασμό γεμκιταβίνης με βεραπαμίλη (Gem-VP) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το ΜΤΤ δοκιμασία. Όλα τα σημεία δεδομένων παρήχθησαν από ένα μόνο πείραμα και αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή έξι φρεάτια ανά συγκέντρωση θεραπεία, κανονικοποιημένη προς το μέσο όρο έξι φρεάτια ελέγχου εσωτερικής χωρίς θεραπεία, στη συνέχεια μετασχηματίζονται από φυσικά log και εμφανίζεται ως τεσσάρων παραμέτρων μεταβλητή πλοκή ως συνάρτηση του log ( φάρμακο) έναντι απόκριση. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) από έξι κοιλότητες σε ένα μόνο πείραμα, όλα τα διαγράμματα δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας Prism λογισμικό στατιστικής ανάλυσης, του Student

t

test =

P

& lt? 0.0002 .

η

Συζήτηση

Τα SP Πυρήνων της PDAC

Ιδρύθηκε γραμμές ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων έχουν χρησιμοποιηθεί από καιρό ως πειραματικό υποκατάστατα για τα δείγματα που λαμβάνονται απευθείας από όγκους , τόσο για τη μελέτη της ογκογένεσης και διαλογή για νέα θεραπευτικά μέσα. Η χρησιμότητα κυτταρικών σειρών που προέρχονται από ανθρώπινο PDAC, ωστόσο, έχει παραβιαστεί από την αποτυχία των όγκων που παράγονται με τέτοια κύτταρα για να εμφανιστεί η ισχυρή μετάσταση που είναι τόσο χαρακτηριστική της κλινικής νόσου. Εδώ δείχνουμε μια λύση σε αυτό το πρόβλημα. Όταν ορθοτοπικώς ένεση σε σοβαρά ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς NSG, τα κύτταρα SP από κυτταρικές σειρές PDAC προκάλεσε όγκους που ήταν επιθετικά μεταστατικά. Σε αντίθεση, τα κύτταρα NSP ήταν λιγότερο ογκογόνα, και τα προκύπτοντα όγκοι ήταν ανεπαρκώς μεταστατικό. Από το κλάσμα SP είναι εμπλουτισμένο για ΚΕΠ, τα ευρήματα αυτά συμφωνούν με την άποψη ότι τα ΚΕΠ μπορούν να είναι οι κύριοι πρόγονοι για μετάσταση [2,17,18]. Νεοπλασματικών organoids που προέρχονται τόσο από ποντικού και ανθρώπου PDAC οδηγούν επίσης σε μεταστατική νόσο όταν εμβολιάζονται ορθοτοπικώς σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια [16]. Μένει να δούμε αν οι μεταστάσεις σε αυτό το σύστημα προέρχονται από ένα διακριτικό υποσύνολο των κυττάρων σε όγκους, και αν ναι, αν είναι τα ΚΕΠ του όγκου.

Μια πρόσφατη έκθεση περιγράφεται ο διαχωρισμός των ΚΕΠ από το SP κλάσμα διάφορους τύπους όγκων με τη χρήση του αυτοφθορισμού [15]. Αντιθέτως, το κλάσμα SP που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές PDAC εμφανίζεται ένα εμπλουτισμένο ικανότητα να παράγουν υψηλά μεταστατικών όγκων, ιδιότητες σύμφωνες με την παρουσία του ΚΕΠ. Σημειώνουμε ότι υπήρχε σημαντική διαφορά στο πώς οι δύο μελέτες που εκπονήθηκαν κύτταρα για διαλογή FACS. Διαφορετικά, δεν μπορούμε να εξηγήσει τη διαφορά μεταξύ των δύο συνόλων αποτελεσμάτων.

Για να αποκτήσετε ένα κλάσμα SP από την κυτταρική σειρά BxPC3, είχαμε να διαδώσει τα κύτταρα κάτω από συνθήκες που ενθάρρυνε την ανάπτυξη ως σφαιροειδή. Μπορούμε να σκεφτούμε δύο πιθανές εξηγήσεις για αυτή την παρατήρηση. Πρώτον, τα κύτταρα SP μπορεί να υπάρχει στη γραμμή, αλλά σε αριθμούς πολύ χαμηλά για ανίχνευση με SP κλασμάτωση. Δεδομένου ότι οι συνθήκες ανάπτυξης σχεδιάστηκαν να ευνοούν βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν, θα μπορούσαν να παρέχουν ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SP, συμπεριλαμβανομένου του υποσυνόλου αυτών των κυττάρων που συμπεριφέρονται ως ΚΕΠ σε δοκιμασίες ογκογένεση. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα σφαιροειδή φημισμένα για να εμπλουτιστεί εγγενώς για ΚΕΠ [9,13,14]. Εναλλακτικά, το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας θα μπορούσε να προωθήσει τη μετατροπή του NSP στην SP κύτταρα, παρόμοια με την μετατροπή από μη ΚΕΠ για CSC περιγράφηκε προηγουμένως για ανθρώπινο μελάνωμα και τον καρκίνο του μαστού [37,38]. Έχουμε αποκτήσει μια υπόδειξη της εν λόγω μετατροπής από την παρουσία των κυττάρων SP σε καλλιέργειες κυττάρων NSP, αν και τα κύτταρα SP ενδέχεται να προκύψει, αντί από ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα που παρέχονται σε μολυσματικές κύτταρα SP με πολλαπλασιασμό

in vitro

. Όποια και αν είναι η εξήγηση για τη συμπεριφορά των κυττάρων BxPC3, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η καλλιέργεια των κυττάρων ως σφαιροειδή μπορεί να είναι ένα γενικό μέσο για να αποκαλύψει ένα φαινότυπο SP σε κυτταρικές σειρές όγκων που διαφορετικά δεν εμφανίζουν αυτό το φαινότυπο.

Οι προηγούμενες εκθέσεις έχουν περιέγραψε την ικανότητα των κυττάρων SP με στόχο την αναπαραγωγή των κυττάρων NSP [21-25,39-41], όσο ΚΕΠ χρησιμεύσει ως πηγή για τα πιο ώριμα κύτταρα που συνθέτουν το μεγαλύτερο μέρος των όγκων. Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, υπήρχε αφθονία των κυττάρων NSP στους όγκους PDAC ξεκίνησε από κύτταρα SP στα πειράματά μας, και την καλλιέργεια κυττάρων SP

in vitro

οδήγησε σε κύτταρα NSP να γίνει γρήγορα η μεγάλη πλειοψηφία του πληθυσμού. Από το σύνολο του πληθυσμού των κυττάρων περιέχει ABCG2, μια πιθανή εξήγηση για τη μετάβαση στο φαινότυπο NSP είναι το περιγράφηκε προηγουμένως μετα-μεταφραστική αναστολή της δραστηριότητας μεταφορέα από Akt [30].

Η ABCG2 μεταφορέα ως μεσολαβητής της SP φαινότυπο και χημειοαντίσταση

Έχουμε εντοπίσει το μεταφορέα ABCG2 ως μεσολαβητής του φαινοτύπου SP στο Panc-1 και BxPC3 κύτταρα, και βρήκαν την έκφραση του εν λόγω μεταφορέα σε είκοσι δύο άλλες κυτταρικές σειρές PDAC. Η φαινομενική πανταχού παρουσία του ABCG2 σε PDAC κυττάρων προτείνει ότι η έκφραση του μεταφορέα μπορεί να είναι ένα επαναφορά σε μια εξελικτική προγονικό είδος παρόμοιο με ένα κανονικό βλαστικών ή προγονικών κυττάρων που οδηγούν στο βλαστοκυττάρων για PDAC. Παραμένει ασαφές σε ποιο βαθμό ABCG2 είναι υπεύθυνη για την πυρίμαχη φύση της PDAC. Από τη μία πλευρά, παρατηρήσαμε ότι ABCG2 δεν εκρέει γεμσιταβίνη, προβάδισμα φάρμακο για τη θεραπεία της PDAC.