Αφηρημένο

Ο έλεγχος των ραδιοαντοχή και μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων που επιβιώνουν είναι σημαντική για τη βελτίωση της εξάλειψης του καρκίνου με ακτινοθεραπεία. Το άπω-λιγότερο homeobox2 (

DLX2

) γονίδιο κωδικοποιεί για ένα παράγοντα μεταγραφής ομοιοακολουθίας εμπλέκονται στην μορφογένεση και την απορρύθμιση του βρέθηκε σε ανθρώπινους στερεούς όγκους και αιματολογικές κακοήθειες. Εδώ ερευνήσαμε το ρόλο της DLX2 σε συνδυασμό με ακτινοβολία επαγόμενη επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβασης (ΕΜΤ) και βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με τις ιδιότητες και τη ρύθμιση του από Smad2 /3 σηματοδότηση σε ακτινοβολημένα Α549 και MDA-MB-231 κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου. Σε ακτινοβολημένα Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα, EMT προκλήθηκε όπως αποδεικνύεται από την έκφραση EMT δείκτη, φωσφορυλίωση Smad2 /3, και μεταναστευτικών και επεμβατική ικανότητα. Επίσης, τα ακτινοβολημένα Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα έδειξαν αυξημένη καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) δείκτη. Είναι ενδιαφέρον, DLX2 βρέθηκε να υπερεκφράζεται κατά την ακτινοβολία. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε το ρόλο της DLX2 σε ακτινοβολία που προκαλείται από EMT και ραδιοαντοχή. Η υπερέκφραση του DLX2 μόνος επαγόμενη EMT, τη μετανάστευση και την εισβολή, και έκφρασης δείκτη CSC. Η μειωμένη ικανότητα σχηματισμού αποικιών σε ακτινοβολημένα κύτταρα ήταν εν μέρει αποκατασταθεί από DLX2 υπερέκφραση. Από την άλλη πλευρά, η εξάντληση των DLX2 χρησιμοποιώντας si-RNA κατήργησε που προκαλείται από ακτινοβολία EMT, έκφρασης δείκτη CSC, και φωσφορυλίωση Smad2 /3 σε ακτινοβολημένα Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα. Επίσης, η εξάντληση του DLX2 αύξησε την ευαισθησία ακτινοβολίας σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, knockdown του Smad2 /3, ένα βασικό ενεργοποιητής της οδού TGF-β1, κατήργησε την ακτινοβολία που προκαλείται έκφραση DLX2, υποδεικνύοντας ότι προκαλείται από ακτινοβολία έκφραση DLX2 εξαρτάται Smad2 /3 σηματοδότηση. Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι DLX2 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ραδιοαντοχή, προκαλούμενη από ακτινοβολία ΕΜΤ και έκφρασης δείκτη CSC, και η έκφραση του DLX2 ρυθμίζεται από Smad2 /3 σηματοδότηση σε Α549 και κυτταρικές γραμμές MDA-MB-231.

Παράθεση: Choi YJ, Μπεκ GY, Πάρκο ΥΕ, Jo SK, Jung U (2016) Smad2 /3-ρυθμισμένη έκφραση DLX2 σχετίζεται με προκαλούμενη από ακτινοβολία Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση και ραδιοαντοχή των Α549 και MDA-MB-231 ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές. PLoS ONE 11 (1): e0147343. doi: 10.1371 /journal.pone.0147343

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 8 Απριλίου 2015? Αποδεκτές: 31η Δεκεμβρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 22 Ιανουαρίου 2016

Copyright: © 2016 Choi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:.. το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας (NRF) επιχορήγηση που χρηματοδοτείται από την Κορέα κυβέρνηση (MSIP) (Αρ 2013M2A2A7043663)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η ακτινοθεραπεία είναι μία από τις πιο κοινές θεραπείες για τον καρκίνο, αλλά ένας από τους περιορισμούς του είναι ότι ορισμένα από επιζών του καρκίνου κύτταρα μπορούν να αποκτήσουν ραδιοαντοχή [1] και μεταστατική ικανότητα [2] μετά από αλλεπάλληλες ακτινοθεραπεία. Η παρουσία των επιθηλιακών να μεσεγχυματικών μετάβασης (ΕΜΤ) και καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) έχει ενοχοποιηθεί ως ένα υποθετικό αιτία ραδιοαντοχή όγκου σε ασθενείς [2]. ΚΕΠ αποτελούν ένα ξεχωριστό πληθυσμό κυττάρων όγκου με ιδιότητες αυτο-ανανέωσης και αναγέννησης, και έχουν εντοπιστεί σε διάφορα κακοήθων όγκων του ανθρώπου [3, 4, 5]. ΚΕΠ παρουσιάζουν τυπικά χαρακτηριστικά του ΕΜΤ [6, 7], και EMT πάλι σχετίζεται με ραδιοαντοχή [8, 9]. Για το λόγο αυτό, η έρευνα και η ανάπτυξη των πρόβλεψης βιοδείκτες και στοχευμένη θεραπευτική στρατηγική για CSC και EMT είναι ιδιαίτερα σημαντικές για την αξιολόγηση και τη βελτίωση πρόγνωση ραδιοευαισθησία σε ακτινοθεραπεία [10, 11]. Εκπρόσωπος δείκτες CSC περιλαμβάνουν Oct4, Sox2, γυμνοσάλιαγκας /Σαλιγκάρι [12, 13, 14], και οι πρόσφατες εκθέσεις έχουν εντοπιστεί ιδιαίτερα CD44 ως CSC που σχετίζονται με το δυναμικό βιοδείκτη για ακτινοθεραπεία στον πνεύμονα και του μαστού καρκινικά κύτταρα [15, 16, 17].

Στη μέθοδο ΕΜΤ των καρκινικών κυττάρων, οι εκφράσεις των επιθηλιακών γονιδίων όπως Ε-καδερίνης και βινκουλίνης αναστέλλεται, ενώ οι εκφράσεις των γονιδίων μεσεγχυματικών όπως Ν-καντερίνης και βιμεντίνης ενισχυθεί [18, 19, 20 ]. Ως αποτέλεσμα της ΕΜΤ, τα κύτταρα αποκτούν μεταστατικές ιδιότητες συμπεριλαμβανομένης της απώλειας αναστολής επαφής, διαταραγμένο έλεγχο της ανάπτυξης και της επιθετικής διεισδυτικότητα [18, 21]. EMT ρυθμίζεται από παράγοντες μεταγραφής συμπεριλαμβανομένων σαλιγκάρι, Twist, και Zeb [7, 22, 23, 24]. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) είναι επίσης σημαντικοί μεσολαβητές EMT, που αποσυντίθενται ECM και επιτρέπουν την μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων σε απομακρυσμένες θέσεις καταλήγοντας σε μετάσταση όγκου [25].

Σε μια κανονική κατάσταση, ΤΟΡ-β δρα ως καταστολέας όγκου αλλά είναι επίσης γνωστό για την ενίσχυση της ΕΜΤ και να υποστηρίξουν αγγειογένεση στο όψιμο στάδιο της ογκογένεσης [26]. Πρόσφατα, αρκετές αναφορές έδειξαν ότι IR προάγει ΕΜΤ μέσω Smad-εξαρτώμενη σηματοδότηση ΤΟΡ-β σε κυτταρικές σειρές καρκίνου [6, 27, 28]. Στην οδό ΤΟΡ-β, ΤΟΡ-β υποδοχείς αναγνωρίζουν συνδετήρες και ενεργοποιούν την φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Smad υποδοχέα που συνδέεται (Smad2 /3), η οποία συνδυάζονται με Smad4. Smad2 /3/4 συγκροτήματα συσσωρεύονται στον πυρήνα και να συμμετέχουν στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων στόχων [29].

σπονδυλωτών άπω-λιγότερο homeobox2 (DLX2) δρα ως παράγοντας μεταγραφής homeo-box και έχει κρίσιμο ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, κρανιοπροσωπικές ανάπτυξη, την ομοιόσταση των ιστών. Σύμφωνα με πρόσφατες αναφορές, η απορρύθμιση της DLX2 βρέθηκε στο ανθρώπινο συμπαγείς όγκους και αιματολογικές κακοήθειες [30, 31, 32], και DLX2 πιθανολογείται ότι εμπλέκεται στην εξέλιξη του όγκου μέσω ρύθμισης των μεταβολικό στρες που προκαλείται από νέκρωση [33]. Επιπλέον, η ίδια DLX2 είναι ένα γονίδιο στόχος του Smad-εξαρτώμενη σηματοδότηση ΤΟΡ-β και δρα ως αρνητικός παράγοντας ανατροφοδότηση του ΤΟΡ-β σηματοδότηση [34]. Οι μελέτες μας έκανε να επικεντρωθεί στο δυναμικό ρόλο της DLX2 στην απόκτηση της CSC και τα χαρακτηριστικά EMT μέσω Smad-εξαρτώμενη σηματοδότησης TGF-β στο IR-θεραπεία καρκινικών κυττάρων.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ερευνήσει το ρόλο του DLX2 σε συνδυασμό με τις ιδιότητες των κυττάρων που μοιάζουν με κοτσάνι και επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβασης (ΕΜΤ) και ρύθμιση του από Smad2 /3 σηματοδότηση σε ακτινοβολημένα Α549 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα και MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου ανθρώπινου μαστού. Αναφέρουμε εδώ ότι IR διήγειρε την έκφραση της DLX2 μέσω της ενεργοποίησης του Smad2 /3, και DLX2 προώθησε τη μετανάστευση και την εισβολή, και ραδιοαντοχή σε Α549 και κυτταρικές γραμμές MDA-MB-231.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα

Αντισώματα έναντι DLX2, Smad2 /3, CD44, β-κατενίνης, Ν-καντερίνης και της Ε-καδερίνης αγοράστηκαν από Thermo Scientific (Rockford, IL, USA). Anti-σαλιγκάρι, αντι-βιμεντίνης και αντι-βινκουλίνης αντισώματα αγοράστηκαν από Cell Signaling Technologies (Danvers, ΜΑ, USA). Ένα αντι-pSmad2 /3 αντίσωμα αγοράσθηκε από Kerafast, Inc. (Boston, ΜΑ, USA). αντίσωμα αντι-β-ακτίνης αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).

πολιτισμό τηλέφωνα και ακτινοβολία

Α549 (ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκίνου κυτταρική γραμμή) και MDA-MB-231 (ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού) αγοράστηκαν από την κορεατική κυτταρική γραμμή Τράπεζα (Σεούλ, Κορέα). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Hyclone, UT, USA), 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Τα κύτταρα αποσπώνται από τον δίσκο καλλιέργειας χρησιμοποιώντας 0,25% θρυψίνη και αραιώθηκαν στα 1,5 × 10

5 κυττάρων /ml. Τα κύτταρα ακτινοβολούνται με

137Cs γ-ακτίνες χρησιμοποιώντας ένα Gammacell 40 exactor (MDS Nordion, Ontario, Canada) στο KAERI και στη συνέχεια εκ νέου τοποθετήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας ή θαλάμους.

Κατασκευή του φορέα DLX2 υπερέκφραση και διαμόλυνση

Ένα ένθετο ανθρώπινου DLX2 ενισχύθηκε από pCMV-sports6 /DLX2 (Κορέα Human Gene Bank, Σεούλ, Κορέα) με PCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές:

EcoRI

(προς τα εμπρός): 5 «-CGGAATTC ATGACTGGAGTCTTTGAC-3» και

Xho

I (πίσω): 5′-CTCTGAGT TTAGAAAATCGTCCCCG-3 ‘. ένθετα DLX2 κλωνοποιήθηκε στον φορέα pcDNA3-myc η οποία επιτρέπει την έκφραση του c-myc-tagged πρωτεΐνης σε κύτταρα θηλαστικών. pcDNA3-myc /DLX2 ή pcDNA3-myc στη συνέχεια παραδίδεται σε κύτταρα (4 μg /2,5 × 10

5 κύτταρα) χρησιμοποιώντας HilyMax (Dojindo Molecular Technologies, Rockville, ML, USA) αντιδραστήριο διαμόλυνσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από επώαση για 24 ώρες, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν και ακτινοβολούνται.

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) διαμόλυνση

Ο DLX2 si-RNAs στόχευση και Smad2 /3 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, CA, USA). Για την επιμόλυνση, τα κύτταρα επιστρώθηκαν και αναπτύχθηκαν σε 70-90% συρροή. Στόχου si-RNA ή αρνητικό έλεγχο si-Ct στη συνέχεια παραδίδονται σε κύτταρα (si-DLX2: 50 μΜ /2.5 × 10

5 κύτταρα? Si-Smad2 /3: 100 μΜ /2.5 × 10

5 κύτταρα) χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης HilyMax σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από επώαση για 24 ώρες, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν και ακτινοβολούνται.

εκχύλιση RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Μετά από 24 ώρες ακτινοβόλησης, ολικά εκχυλίσματα RNA (1 × 10

6 κύτταρα ) απομονώθηκαν από το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Ambion, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε για τη σύνθεση cDNA με τη χρήση TOPscript RT DryMIX περιέχει ανάστροφης μεταγραφάσης, ρυθμιστικό RT, μείγμα dNTP, ολίγο dT (Enzynomics, Σεούλ, Κορέα). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε με ένα StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems, CA, USA) με SYBR Green αντιδραστήριο (Enzynomics, Σεούλ, Κορέα). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) και οι αλληλουχίες παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Ο συνολικός όγκος της αντίδρασης του μείγματος PCR ήταν 20 μΙ και η αντίδραση συνθήκες ήταν 15 λεπτά από την αρχική μετουσίωση στους 95 ° C και 40 κύκλους 10 sec στους 95 ° C, 15 sec στους 60 ° C και 20 sec στους 72 ° C. Η συγκριτική C

t μέθοδος χρησιμοποιήθηκε και το επίπεδο έκφρασης σε σχέση mRNA υπολογίστηκε με βάση την κανονικοποίηση σε β-ακτίνη. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα.

Η

Κλωνογόνος

δοκιμασία

Πωλείται κύτταρα εξετέθησαν σε διάφορες δόσεις ακτινοβολίας και επωάστηκαν για 7 ημέρες (Α549) και 10 ημέρες (MDA-ΜΒ -231) στους 37 ° C. Το μέσο του συνόλου των καλλιεργειών ανανεώθηκε κάθε 3 ημέρες. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με 60% μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες. Αποικίες που περιέχουν 50 κύτταρα ή περισσότερο μετρήθηκαν ως κλωνογόνων κυττάρων. Οι αναφερθείσες τιμές κλάσματος επιβίωσης είναι ο μέσος όρος έξι αντιγράφων από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Για να μετρηθεί η μετανάστευση τους, τα ακτινοβολημένα Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα σπάρθηκαν σε μία transwell (Corning Incorporated, ΝΥ, USA) σε πυκνότητα 2,5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε 200 μΙ μέσου χωρίς ορό και επωάστηκαν για 7 ώρες (Α549) ή 3 ώρες (MDA-MB-231) στους 37 ΝΤΟ. Μετά την επώαση, το μέσο απομακρύνθηκε. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν μέσω επώασης με 100% μεθανόλη και χρωματίσθηκαν με 0,5% κρυσταλλικό ιώδες επί 15 λεπτά. Η μεμβράνη κόπηκε μακριά από κάθε θάλαμο και μετανάστευσαν κύτταρα στην κάτω επιφάνεια του φίλτρου μετρήθηκαν ανά φίλτρο σε τυχαία μικροσκοπική κατατεθεί σε μεγέθυνση 200 φορές (Leica, Heidelberg, Germany). Οι αναφερόμενες τιμές είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Κυττάρων εισβολή δοκιμασία

Η ικανότητα των ακτινοβολημένων Α549 και MDA ΜΒ-231 κύτταρα-να περάσει μέσα από τα φίλτρα Matrigel επικαλυμμένα μετρήθηκε σε Boyden δοκιμασία εισβολής θάλαμο. Matrigel εφαρμόστηκε στην κορυφή ένα πολυκαρβονικό φίλτρο (μέγεθος πόρων, 8 μm). προσδιορισμοί κυττάρων εισβολής διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας matrigel κιτ δοκιμασίας εισβολή (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν στον άνω θάλαμο σε πυκνότητα 2.5-5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε 500 μΙ μέσου χωρίς ορό και επωάστηκαν για 48 ώρες (Α549), 24 ώρες (MDA-MB-231 ) στους 37 ° C. Κύτταρα που εισέβαλαν την κατώτερη επιφάνεια της κάθε μεμβράνης σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη και χρωματίσθηκαν με 0,5% κρυσταλλικό ιώδες επί 15 λεπτά. Η μεμβράνη κόπηκε μακριά από κάθε θάλαμο και εισέβαλαν κύτταρα στην κάτω επιφάνεια του φίλτρου μετρήθηκαν ανά φίλτρο σε τυχαία μικροσκοπική υποβάλλεται σε 100-πλάσια μεγέθυνση (Leica, Heidelberg, Germany). Οι αναφερόμενες τιμές είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Western ανάλυση κηλίδος

Μετά από 24 ώρες ακτινοβόληση, η συνολική κυτταρολύματα (2 × 10

6 κύτταρα) παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας RIPA ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) που περιέχει 10 mM phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF), 10 mM φθοριούχο νάτριο (NaF), 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο (Na

3νο

4) και ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης πλήρης (Sigma- Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) και η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), με αλβουμίνη βόειου ορού ως πρότυπο. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Amersham Hybond, Freiburg, Γερμανία). Η μεμβράνη στη συνέχεια πλύθηκε με αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (10 mM Tris και 150 mM NaCl) που περιέχει 0.1% Tween 20 (TBST) και αποκλείστηκαν με TBST που περιείχε 5% άπαχο ξηρό γάλα σε σκόνη. Η μεμβράνη επωάστηκε όλη την νύκτα με πρωτογενές αντίσωμα και το στύπωμα εκτέθηκε σε ραφανιδική δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση και εμφανίσθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια ανίχνευσης στύπωσης ECL Western (Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, USA).

ανοσοφθορισμού (IF) χρώση

Για να αναλυθεί η ενδοκυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών F-ακτίνη και δείκτη, Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα ήταν σπόρων σε Lab-Tek slide θάλαμο γυάλινο πλακίδιο 8 φρεατίων (Nunc, ΝΥ, USA) και επιμόλυνση με si -Ct ή si-DLX2 για 24 ώρες και στη συνέχεια επώαση επί 24 ώρες μετά IR. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% φορμαλδεΰδη βάφτηκαν με επώαση με πρωτογενές αντίσωμα (αντι-Ν-cadherin /βιμεντίνης /Ε-καδερίνης /βινκουλίνης αντίσωμα κουνελιού πολυκλωνικό, αραιωμένο 1: 100) για μία νύχτα σε 4 ° C. Αυτά στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με PBS, επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού, και κατεργάζεται με 546-συζευγμένο αντίσωμα Alexa αντι-κουνελιού (Molecular Probes, CA, USA) για 3 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, η ενδοκυτταρική F-ακτίνης χρώση χρησιμοποιώντας Alexa-φαλλοειδίνη-488 (αραίωση 1: 300, Molecular Probes, CA, USA) για 1 ώρα. Ο πυρήνας του κυττάρου βάφτηκε με TO-PRO-3 (Molecular Probes, Eugene, USA). Βαμμένα κύτταρα τοποθετούνται και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο σάρωσης ομοεστιακό λέιζερ (Leica, Heidelberg, Germany).

Προσδιορισμός του ΤΟΡ-β1 σε υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας

Α549 και MDA-MB-231 (5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο κύτταρα) εκτέθηκαν σε 8 Gy IR στα, 4Gy και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Το επίπεδο της πρωτεΐνης ΤΟΡ-β1 σε υπερκείμενα καλλιέργειας μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ΤΟΡ-β1 κιτ ELISA (BD Biosciences, San Diego, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Οι ΤΟΡ-β1 επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν από τρία διαφορετικά πειράματα και εκφράζονται ως pg /ml.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές. Στατιστικά σημαντικές διαφορές ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student. Στατιστική πιθανότητα Ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± S.E.M. των τριών πειραμάτων, το καθένα εκτελούνται εις τριπλούν.

Αποτελέσματα

ιοντίζουσα ακτινοβολία προκαλεί EMT και αυξάνει CD44 και DLX2 έκφραση

Αναλύσαμε πρώτα την ευαισθησία ακτινοβολίας καρκινώματος πνεύμονα ανθρώπινου Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα αδενοκαρκινώματος στήθους με κλωνογόνο προσδιορισμό. Σε αυτή τη δοκιμασία, η επιβίωση των κυττάρων με δοσοεξαρτώμενο τρόπο μειώθηκε κατά IR (0, 2, 4, 6, 8 Gy) σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, αλλά MDA-MB-231 κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα σε IR από κύτταρα Α549 (Εικόνα 1Α). Οι μορφολογικές μεταβολές των κυττάρων μετά από έκθεση σε IR ελέγχθηκαν σε κύτταρα Α549 ακτινοβολείται σε 8 Gy και MDA-MB-231 κύτταρα σε 4Gy. Το ακτινοβολημένο Α549 και MDA-MB-231cells έδειξε ατρακτοειδής και επιμήκη μορφολογίες, τα οποία είναι τυπικά του ΕΜΤ μορφολογικών φαινοτύπων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 1Β).

(Α) Πωλείται-κύτταρα (1 χ 10

5cells /ml) εκτέθηκαν σε διάφορες δόσεις ακτινοβολίας και επωάστηκαν για 7 ημέρες (Α549) και 10 ημέρες (MDA-MB-231) στους 37 ° C. Αποικίες που περιέχουν 50 κύτταρα ή περισσότερο μετρήθηκαν ως κλωνογόνων κυττάρων. Το κλάσμα επιβίωσης υπολογίστηκε διαιρώντας την αποδοτικότητα επιμετάλλωση του επεξεργασμένου δείγματος με την αποτελεσματικότητα επιμετάλλωση του ελέγχου. Επιμετάλλωση αποτελεσματικότητα υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό αποικιών με τον αριθμό των κυττάρων απλώνονται. Οι αναφερόμενες τιμές είναι ο μέσος όρος έξι αντιγράφων από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Β) IR προκαλεί μορφολογική μεταβολή στα Α549 και MDA-MB-231 κυττάρων μετά από 24 ώρες έκθεσης (A549-8Gy, MDA-MB-231-4Gy). Η μεγέθυνση της εικόνας είναι × 100. Ct, τον έλεγχο των κυττάρων? IR, ακτινοβολημένα κύτταρα.

Η

επόμενο διερευνηθεί η δόση-και το χρόνο που εξαρτάται από τις αλλαγές των CSC- και EMT που σχετίζονται με την έκφραση δείκτη. Σε συνέπεια με τις προηγούμενες μελέτες, IR αύξησε την έκφραση του παράγοντα σηματοδότησης ΤΟΡ-β pSmad2 /3, ένας δείκτης CSC (CD44), EMT θετικών σηματοδοτών (Ν-καδερίνης, βιμεντίνη), και παράγοντες μεταγραφής που ρυθμίζουν EMT (σαλιγκάρι, β-κατενίνης ), και μείωσε την έκφραση του ΕΜΤ αρνητικών σηματοδοτών (Ε-καδερίνης, βινκουλίνης) εξαρτώμενο επί IR δόση ή χρόνο σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Α και 2Β). Είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση του DLX2 αυξήθηκε επίσης με IR σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Πειράματα δόσης-απόκρισης αποκάλυψαν ότι επαγωγή DLX2 παρατηρήθηκε σε 8 Gy σε Α549 και στο 4Gy ή υψηλότερη σε MDA-MB-231 (Σχήμα 2Α και S1 σχήμα), και τα πειράματα χρονικής πορείας έδειξε ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης DLX2 είχαν αυξηθεί δραματικά στις 24 ώρες μετά ακτινοβολία στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Β και S2 Εικ). Επίσης, IR ενεργοποιείται προς τα άνω ρύθμιση των επιπέδων mRNA του βλαστική ικανότητα σημειωτές (Oct4, SOX2, LIF), παράγοντες μεταγραφής (Twist, σαλιγκάρι), και δείκτες μετάσταση (ΜΜΡ2, ΜΜΡ7) σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές στις 24 ώρες μετά την ακτινοβολία με μία μόνο δόση των 8 Gy για κύτταρα Α549 ή 4Gy για MDA-MB-231 κύτταρα (Σχ 2C και 2D).

(Α) Α549 και MDA-ΜΒ-231 κύτταρα εκτέθηκαν σε IR στα 0-8Gy και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western με τα επισημασμένα αντισώματα. Δύο ανεξάρτητα πειράματα ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα. (Β) Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα συλλέχθηκαν επί 0/3/6/24 ώρες μετά 8 Gy (Α549) ή 4Gy (MDA-MB-231). Τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western με τα επισημασμένα αντισώματα. Δύο ανεξάρτητα πειράματα ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα. (Γ), (Δ) Α549 και MDA-ΜΒ-231 κύτταρα εκτέθηκαν σε IR σε 8 Gy (Α549) ή 4Gy (MDA-MB-231) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Ακολούθως, τα κύτταρα απομονώθηκαν με ΤπζοΙ και υποβάλλεται σε ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου με τα επισημασμένα εκκινητές. Όλα τα αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα (*** Ρ & lt? 0.001, ** Ρ & lt? 0,01, * Ρ & lt? 0,05 έναντι Ct). Ct, τον έλεγχο των κυττάρων? IR, ακτινοβολημένα κύτταρα.

Η

Η υπερέκφραση του DLX2 ενισχύει EMT και ραδιοαντοχή

Για να εξεταστεί αν DLX2 μπορούν να ρυθμίζουν προς τα πάνω αντίσταση ακτινοβολίας και μεταστατικό δυναμικό, Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με pcDNA3-myc φορέα που εκφράζει DLX2 ή pcDNA3-myc φορέα ελέγχου, και εξετάσαμε την έκφραση του CSC και δεικτών ΕΜΤ με ανάλυση κηλίδος Western. Η υπερέκφραση του DLX2 αύξησε την έκφραση ενός δείκτη CSC (CD44) και EMT θετικών σηματοδοτών (Ν-καδερίνης, βιμεντίνη) και μείωσε την έκφραση του ΕΜΤ αρνητικών σηματοδοτών (Ε-καδερίνης, βινκουλίνης) σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Η ακτινοβόληση προκάλεσε παρόμοιες αλλαγές αυτών των δεικτών ως DLX2 υπερέκφραση. Ωστόσο, φωσφορυλίωση Smad2 /3 ήταν ελαφρά μειωμένη (Α549) ή δεν έχει αλλάξει (MDA-MB-231) με υπερεκφράζεται DLX2 αλλά αυξήθηκε κατά την ακτινοβόληση και στις δύο κυτταρικές σειρές. Η υπερέκφραση του DLX2 αυξημένη έκφραση του σαλιγκαριού σε Α549 αλλά όχι σε MDA-MB-231 κύτταρα. Η έκφραση της β-κατενίνης δεν αλλοιώνεται από DLX2 υπερέκφραση στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Α).

(Α) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με 4 μg ροϋΝΑ-myc /DLX2 ή ροϋΝΑ-myc και επωάζονται στους 37 ° C για 24 ώρες. Μετά κύτταρο αποκόλληση, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε IR σε 8 Gy (Α549) ή 4Gy (MDA-MB-231) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Ακολούθως, τα κύτταρα λύθηκαν και τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Δύο ανεξάρτητα πειράματα ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα. (Β) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με 4 μg ροϋΝΑ-myc /DLX2 ή ροϋΝΑ-myc και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Μετά κύτταρο αποκόλληση, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε IR σε 8 Gy (Α549) ή 4Gy (MDA-MB-231) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 6 ώρες (Α549), 3 h (MDA-MB-231), σε transwell ( δοκιμασία μετανάστευσης). Οι φωτογραφίες είναι αντιπροσωπευτικά πεδία μετανάστευσαν κυττάρων επί της μεμβράνης. Το γράφημα δείχνει μέσο όρο μετανάστευσαν αριθμός κυττάρων από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± SE (*** P & lt? 0.001 έναντι των κυττάρων ελέγχου φορέα). (C) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με 4 μg ροϋΝΑ-myc /DLX2 ή ροϋΝΑ-myc και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Μετά κύτταρο αποκόλληση, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε IR σε 8 Gy (Α549) ή 4Gy (MDA-MB-231) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 48 ώρες (Α549), 24 ώρες (MDA-MB-231), σε matrigel ( δοκιμασία εισβολής). Οι φωτογραφίες είναι αντιπροσωπευτικά πεδία εισέβαλαν κυττάρων επί της μεμβράνης. Το γράφημα δείχνει μέσο όρο εισέβαλαν αριθμός κυττάρων από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± SE (*** P & lt? 0.001 έναντι των κυττάρων ελέγχου φορέα)

Η

Για να διερευνηθεί η επίδραση της μεταστατικής DLX2 και IR σε Α549. και MDA-MB-231 κυττάρων, η μετανάστευση και δοκιμασίες εισβολή διεξήχθησαν. DLX2-υπερεκφράζεται Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα παρουσίασαν αυξημένη ικανότητα μετανάστευσης κατά 3 και 4 πτυχώσεις, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα (Σχήμα 3Β). Επίσης, η έκθεση σε IR (8 Gy για Α549, 4Gy για MDA-MB-231) αυξήθηκε μεταναστεύουν αριθμούς κυττάρων με 3,2 πτυχώσεις στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι DLX2 υπερέκφραση και IR ενίσχυσε σημαντικά την κυτταρική κινητικότητα των Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα. Για να εξεταστεί εάν η ικανότητα των κυττάρων εισβολή παρομοίως ενισχύεται με IR ή DLX2 υπερέκφραση, Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα εφαρμόζονται σε θαλάμους και τους αριθμούς των κυττάρων κόλλας εισβολή μετρήθηκαν. DLX2-υπερεκφράζεται Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα παρουσίασαν αυξημένη διεισδυτική ικανότητα κατά 3 και 5.3 πτυχώσεις, αντίστοιχα (Σχήμα 3C). Επιπλέον, η έκθεση σε IR αύξησε τους αριθμούς εισβολή των κυττάρων του Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα με 2.5 και 3.6 πτυχώσεις, αντίστοιχα (Σχήμα 3C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η υπερέκφραση της DLX2 ή IR ενισχυθεί σημαντικά το μεταναστευτικό και επεμβατική ικανότητα, καθώς και τις αλλαγές έκφρασης του CSC και EMT που σχετίζονται με τα γονίδια στο Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα.

Εμείς καθορίζεται επόμενο αν DLX2 θα παρέχει αυξημένη επιβίωση των καρκινικών κυττάρων μετά την ακτινοβόληση. DLX2 υπερεκφράζουν Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα ακτινοβολήθηκαν σε 8 Gy και 4Gy, αντίστοιχα, και στη συνέχεια κλωνογονική δοκιμασία εκτελέστηκε. Το κλάσμα επιβίωσης των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με φορέα μάρτυρα μειώθηκε μετά την ακτινοβόληση σε σύγκριση με μη-ακτινοβολημένα κύτταρα. Ωστόσο, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν DLX2-έδειξαν σημαντικά υψηλότερο ποσοστό επιβίωσης σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα μετά την ακτινοβολία (Σχήμα 4Α και 4Β). Σε μη-ακτινοβολημένα κύτταρα, ο σχηματισμός αποικίας δεν επηρεάστηκε από DLX2-υπερέκφραση (Σχήμα 4Α και 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση DLX2-συνεισφέρει τουλάχιστον μερικώς να ραδιοαντοχή σε Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα.

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 4 μg ροϋΝΑ-myc /DLX2 ή ροϋΝΑ-myc και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Μετά κύτταρο αποκόλληση, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε IR σε 8 Gy (Α549) ή 4Gy (MDA-MB-231) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 7 ημέρες (Α549), 10 ημέρες (MDA-MB-231) και κυτταρικές κλωνογονικότητας μετράται με κλωνογόνο δοκιμασία σε Α549 (Α) και MDA-MB-231 (Β). Οι φωτογραφίες είναι αντιπροσωπευτικές πλάκα των κυττάρων επιβίωσης. Η γραφική παράσταση αντιπροσωπεύει το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SE (*** Ρ & lt? 0.001 έναντι των IR εκτεθειμένα κύτταρα).

Η

Η σίγαση του DLX2 αναστέλλει IR επαγόμενη EMT και ραδιοαντοχή

Στη συνέχεια, θα εξεταστεί κατά πόσον DLX2 αποσιώπηση θα καταστείλει μεταστατικό δυναμικό και ραδιοαντοχή ανατίθενται με IR. Α549 και MDA-MB-231cells επιμολύνθηκαν παροδικά με 50 μΜ siRNA της DLX2 (si-DLX2) ή τον έλεγχο si-RNA (SI-CT) για 24 ώρες πριν από την ακτινοβολία (8 Gy για Α549, 4Gy για MDA-MB-231) . Στη συνέχεια, αναλύσαμε την έκφραση της CSC και EMT σχετικά γονίδια, μεταναστεύουν και εισβάλλουν ικανότητες, και την ικανότητα σχηματισμού αποικίας. Αποσιώπηση του DLX2 με siRNA εμπόδισε EMT όπως αποδεικνύεται από τα μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης του ΕΜΤ θετικών σηματοδοτών (Ν-καδερίνης, βιμεντίνη) (Σχήμα 5Α, S3 Σχ και S4 σχήμα) και αυξημένο επίπεδο αρνητικών σηματοδοτών EMT (Ε-καδερίνης, βινκουλίνης) σε ακτινοβολημένα Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα (Σχήμα 5Α, S5 Σχ και S6 Εικ). Αναστολή της DLX2 εμπόδισε επίσης την επαγωγή των παραγόντων μεταγραφής κρίσιμη για ΕΜΤ (σαλιγκάρι και β-κατενίνης) και ένα δείκτη CSC (CD44) σε ακτινοβολημένα Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ενεργοποίηση του παράγοντα σηματοδότησης ΤΟΡ-β, Smad2 /3, δεν επηρεάστηκε από SI-DLX2 σε ακτινοβολημένα κύτταρα (Σχήμα 5Α).

(Α) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με 50 μΜ si-DLX2 ή Si- Ct και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε IR σε 8 Gy (Α549) ή 4Gy (MDA-MB-231) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Ακολούθως, τα κύτταρα λύθηκαν και τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Δύο ανεξάρτητα πειράματα ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα. (Β) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με 50 μΜ si-DLX2 ή SI-Ct και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Μετά κύτταρο αποκόλληση, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε IR σε 8 Gy (Α549) ή 4Gy (MDA-MB-231) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 6 ώρες (Α549), 3 h (MDA-MB-231), σε transwell ( δοκιμασία μετανάστευσης). Οι φωτογραφίες είναι αντιπροσωπευτικά πεδία μετανάστευσαν κυττάρων επί της μεμβράνης. Το γράφημα δείχνει μέσο όρο μετανάστευσαν αριθμός κυττάρων από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± SE (*** P & lt? 0.001). (C) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με 50 μΜ si-DLX2 ή SI-Ct και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Μετά κύτταρο αποκόλληση, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε IR σε 8 Gy (Α549) ή 4Gy (MDA-MB-231) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 48 ώρες (Α549), 24 ώρες (MDA-MB-231), σε matrigel ( δοκιμασία εισβολής). Οι φωτογραφίες είναι αντιπροσωπευτικά πεδία εισέβαλαν κυττάρων επί της μεμβράνης. Το γράφημα δείχνει μέσο όρο εισέβαλαν αριθμός κυττάρων από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± SE (*** P & lt? 0.001).

Η

Για να διερευνηθεί η αντι-μεταστατική επίδραση του si-DLX2 σε ακτινοβολημένα κύτταρα, τη μετανάστευση και την δοκιμασίες εισβολής διεξήχθησαν. DLX2-σίγηση σε MDA-MB-231 κύτταρα ελαφρώς μειωμένη ικανότητα μετανάστευσης σε σύγκριση με τα κύτταρα SI-Ct. Επίσης, σε ακτινοβολημένα Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα, επιμόλυνση του si-DLX2 μείωσε τις μεταναστεύουν αριθμούς κυττάρων με 1,7 αναδιπλώσεις σε σύγκριση με SI-Ct διαμόλυνση (Σχήμα 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αποσιώπηση του DLX2 με siRNA αναστέλλει σημαντικά την κυτταρική κινητικότητα του Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα. Για να εξεταστεί εάν η ικανότητα των κυττάρων εισβολή παρομοίως μειώθηκε κατά DLX2 σίγηση, ακτινοβολημένα κύτταρα εφαρμόσθηκαν σε θαλάμους εισβολή και μετρήθηκαν οι αριθμοί κόλλας κυττάρων. Σε μη-ακτινοβολημένα κύτταρα, DLX2-σίγηση ανέστειλε επεμβατική ικανότητα των κυττάρων Α549 με 1,4 πτυχώσεις, αλλά καμία σημαντική αλλαγή δεν παρατηρήθηκε σε MDA-MB-231 κύτταρα. Σε ακτινοβολημένα Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα, επιμόλυνση του si-DLX2 μειώθηκε εισβάλλουν αριθμούς κυττάρων Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα με 2.3 και 2.2 πτυχώσεις, αντίστοιχα (Σχήμα 5C). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι αποσιώπηση του DLX2 σε ακτινοβολημένα Α549 και MDA-MB-231 ανέστειλε σημαντικά την έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με CSC και EMT, και μεταναστευτικών και επεμβατική ικανότητα που επάγεται από IR.

Αναλύσαμε επόμενο αν DLX2-φίμωση επηρεάζει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων μετά την ακτινοβόληση. Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα επιμολυσμένα με SI-DLX2 ή SI-Ct ακτινοβολήθηκαν σε 4Gy και 2Gy, αντίστοιχα, και στη συνέχεια εξετάστηκε ο σχηματισμός αποικίας. Σε μη-ακτινοβολημένα κύτταρα, DLX2 σίγηση οδήγησε σε ελαφρά μείωση του κλάσματος επιβίωσης στις δύο κυτταρικές σειρές. Σε ακτινοβολημένα κύτταρα, DLX2 σίγασης που οδήγησαν σε μια πρόσθετη μείωση της κυτταρικής επιβίωσης σε σημαντικό βαθμό (1,5-φορές μείωση για Α549 και 1,6-φορές μείωση για MDA-MB-231) (Σχήμα 6Α και 6Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σίγηση του DLX2 κατέστειλε IR επαγόμενη EMT δυναμικού και βελτιωμένη ευαισθησία ακτινοβολίας.

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 μΜ si-DLX2 ή SI-Ct και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Μετά κύτταρο αποκόλληση, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε IR στα 4Gy (Α549) ή 2Gy (MDA-MB-231) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 7 ημέρες (Α549), 10 ημέρες (MDA-MB-231) και κυτταρικές κλωνογονικότητας μετράται με κλωνογόνο δοκιμασία σε Α549 (Α) και MDA-MB-231 (Β). Οι φωτογραφίες είναι αντιπροσωπευτικές πλάκα των κυττάρων επιβίωσης. Το γράφημα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SE (*** P & lt? 0.001).

Η

IR-επαγόμενη έκφραση DLX2 ρυθμίζεται από Smad2 /3

IR προωθεί EMT μέσω Smad-εξαρτώμενη σηματοδότηση ΤΟΡ-β σε κυτταρικές σειρές καρκίνου [6, 27, 28], και DLX2 είναι ένα γονίδιο στόχος του Smad-εξαρτώμενη ΤΟΡ-β σηματοδότηση και αρνητικός παράγοντας ανάδραση [34]. Επομένως, εξετάσαμε τη σύνδεση των ΤΟΡ-β σηματοδότηση με έκφραση DLX2 IR-επαγόμενη. Η ακτινοβόληση των κυττάρων Α549 (8 Gy) και MDA-MB-231cells (4Gy) αύξησε την ποσότητα του ΤΟΡ-β1 που εκκρίνεται εντός του μέσου καλλιέργειας (Σχήμα 7Α). Επίσης, IR προωθείται φωσφορυλίωση του ΤΟΡ-β παράγοντας σηματοδότησης Smad2 /3 (Σχήματα 2Α, 2Β, 3Α, 5Α και 7C, S1 και S2 Σχ Εικ). Ωστόσο, η υπερέκφραση του DLX2 μειώθηκε μάλλον ελαφρώς φωσφορυλίωση Smad2 /3 (Εικόνα 3Α). Η φωσφορυλίωση του Smad2 /3 δεν επηρεάστηκε ούτε από SI-DLX2 σε ακτινοβολημένα Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα (Σχήμα 5Α). Ως εκ τούτου, το επόμενο εξετάστηκε αν η επαγωγή της DLX2 με IR ρυθμίζεται από Smad2 /3 σηματοδότηση. Smad2 /3 σίγηση με siRNA κατήργησε την έκφραση που προκαλείται από IR mRNA DLX2 (Σχήμα 7Β) και η έκφραση πρωτεΐνης DLX2 (Σχ 7C και 7D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο IR-επαγόμενη έκφραση DLX2 εξαρτάται Smad2 /3 σηματοδότηση.

(Α) Τα επίπεδα του ανοσοαντιδραστικού ΤΟΡ-β1 προσδιορίστηκαν ποσοτικά από το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας με ELISA, όπως περιγράφεται στα Υλικά και μέθοδοι (*** P & lt? 0.001, ** P & lt? 0,01, έναντι Ct). Ct, τον έλεγχο των κυττάρων? IR, ακτινοβολημένα κύτταρα. (Β) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με 100 μΜ si-Smad2 /3 ή Si-Ct, επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε IR σε 8 Gy (Α549) ή 4Gy (MDA-MB-231) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Ολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα και υποβλήθηκαν σε ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου. Η γραφική παράσταση αντιπροσωπεύει το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SE (*** Ρ & lt? 0.001). (C) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με 100 μΜ si-Smad2 /3 ή Si-Ct και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε IR σε 8 Gy (Α549) ή 4Gy (MDA-MB-231) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Τρία ανεξάρτητα πειράματα ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα. (D) Τα επίπεδα πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως σχετικές τιμές με εκείνες των si-Ct μετά από κανονικοποίηση με β-ακτίνη (*** P & lt? 0.001, ** P & lt? 0,01, * P & lt? 0,05 έναντι si-CT)

Συζήτηση

η θεραπεία ακτινοβολίας είναι ένα κρίσιμο συστατικό της διαχείρισης του καρκίνου, αλλά μερικά από επιβιώνουν τα καρκινικά κύτταρα να αποκτήσουν ραδιοαντοχή [1] και μεταστατική ικανότητα [2] σχετικά με την επαναλαμβανόμενη ακτινοθεραπεία.