Abstract

Wogonin είναι ένα φυτό monoflavonoid η οποία έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη και /ή να διεγείρει απόπτωση σε διάφορους όγκους. Η παρούσα μελέτη εξέτασε την απόπτωση που επάγει δραστηριότητα και υποκείμενος μηχανισμός δράσης των wogonin σε κύτταρα Α549. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι wogonin ήταν ένας ισχυρός αναστολέας της βιωσιμότητας των κυττάρων Α549. αλλαγές αποπτωτική πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε μετά από έκθεση σε wogonin περιλάμβαναν μείωση ΧΙΑΡ και Mcl-1 έκφραση, αυξημένη διασπάστηκε-PARP έκφρασης και αυξημένη απελευθέρωση του ΟΕΕ και ανάλυση κηλίδας Western cytotchrome Γ έδειξαν ότι η δραστηριότητα της c-Myc /Skp2 και μονοπάτια HDAC1 /HDAC2, οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του όγκου, μειώθηκε. Ποσοτική PCR που αναγνωρίστηκε αυξημένα επίπεδα της c-Myc mRNA και μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης της. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του Fbw7α, ΟδΚ3β και Thr58-Myc, οι οποίες εμπλέκονται σε c-Myc ουβικιτίνη-εξαρτώμενη αποδόμηση, αναλύθηκαν επίσης. Μετά από έκθεση σε wogonin, Fbw7α και έκφραση της ΟδΚ3β μειωμένη και αυξημένη έκφραση Thr58-Myc. Ωστόσο, MG132 δεν ήταν σε θέση να αποτρέψει την υποβάθμιση c-Myc. Τα παρόντα αποτελέσματα προτείνουν ότι wogonin έχει πολλαπλές αντικαρκινικές επιδράσεις που σχετίζονται με την αποδόμηση του c-myc, SKP2, HDAC1 και HDAC2. Η ικανότητά του να επάγει απόπτωση ανεξαρτήτως Fbw7α προτείνει μια πιθανή χρήση στον καρκίνο φαρμακευτικής αντίστασης που σχετίζονται με έλλειψη Fbw7. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να καθοριστεί ποια μονοπάτια σχετίζονται με c-Myc και την αναστροφή Fbw7α και αν φωσφορυλίωσης Thr58 του c-myc εξαρτάται από ΟδΚ3β

Παράθεση:. Chen Xm, Bai Υ, Zhong Yj, Xie XL, Long Hw, Yang Yy, et al. (2013) Wogonin έχει πολλαπλές επιπτώσεις Αντικαρκινικό με τον c-Myc /SKP2 /Fbw7α και HDAC1 /HDAC2 Πορείες και επαγωγή της απόπτωσης σε ανθρώπινο πνεύμονα κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος Α549. PLoS ONE 8 (11): e79201. doi: 10.1371 /journal.pone.0079201

Επιμέλεια: Jian-Xin Gao, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, η Κίνα

Ελήφθη: 23 του Ιαν 2013? Αποδεκτές: 20 Σεπτέμβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 του Νοεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της επαρχίας Guizhou, Κίνα ([2012] 7006 και Νέα Υόρκη [2011] 3072)? Guangzhou Medical College (2012C16)? το Ίδρυμα για Νέους Επιστήμονες της Guangzhou Εκπαιδευτικής Επιτροπής (2012C118). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παρά τον μεγάλο αριθμό των κλινικών δοκιμών που αποσκοπούν στη βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών, ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο που σχετίζονται με τον κόσμο σε άνδρες και γυναίκες. Περίπου το 85% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα κατηγοριοποιούνται ως μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), που συνήθως διαγιγνώσκεται σε προχωρημένα στάδια [1]. αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, το κυρίαρχο ιστολογική υπότυπο του NSCLC, αντιπροσωπεύει το 20 έως 30% των πρωτογενών περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα μεταξύ των ατόμων κάτω των 45 ετών, ανεξάρτητα από το ιστορικό καπνίσματος [2]. Οι περισσότερες περιπτώσεις NSCLC είναι ακατάλληλα για τη χειρουργική επέμβαση και χημειοθεραπεία παραμένει ο ακρογωνιαίος λίθος της θεραπείας για προχωρημένη νόσο.

αποακετυλάσες ιστόνης (HDACs) είναι ένζυμα που απομακρύνουν τα προϊόντα ακετυλίωση των ιστονών. Αυτή η διαδικασία συμπιέζει τη δομή της χρωματίνης και καταστέλλει τη μεταγραφή [3]. HDACs πράξη σε διάφορα nonhistone πρωτεΐνη υποστρώματα τα οποία παίζουν ένα ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, κυτταρική μετανάστευση, τον κυτταρικό θάνατο και την αγγειογένεση [4]. Δεδομένα από προκλινικές μελέτες έχουν αποδείξει ότι φυσικά και συνθετικά αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης έχουν ισχυρή αντικαρκινική δραστικότητα.

HDAC1 και HDAC2 ανήκουν στην Κατηγορία Ι αποακετυλάσης ιστόνης οικογένεια (HDAC). In vivo, τα ένζυμα αυτά σχηματίζουν σύμπλοκα με Sin3, NuRD και [5] Co-ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ. HDAC1 και HDAC2 επίσης δεσμεύονται άμεσα με πρωτεΐνες που δεσμεύονται με DNA όπως ΥΥ1, δεσμευτική πρωτεΐνη Rb-1 και Sp1 [5].

c-Myc είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που είναι υπεύθυνη για τη ρύθμιση μιας σειράς γονιδίων που εμπλέκονται στην κυτταρική πολλαπλασιασμό, την ανάπτυξη, την απόπτωση και διαφοροποίηση [6]. Η απορρύθμιση της έκφρασης του c-Myc παρατηρείται σε περίπου το 70% όλων των ανθρώπινων όγκων [10]. έκφραση c-Myc ρυθμίζεται με γονιδιακή μεταγραφή, και εξαρτάται από τη σταθερότητα του mRNA και μεταμεταφραστική έλεγχο της πρωτεϊνικής σταθερότητας [7] – [9].

Μεταμεταφραστικές ρύθμιση του c-myc μπορεί να διαμεσολαβείται από Skp2 (S- φάση κινάση σχετιζόμενη πρωτεΐνη 2) και Fbw7 (F-box και WD επανάληψης που περιέχει την περιοχή 7) [11]. Skp2 και Fbw7 είναι δύο διαφορετικές υπομονάδες αναγνώριση της ΕΕΤ τύπου Ε3 λιγάση (SCF, Skp1 /Cullin /F-box συμπλέγματα πρωτεϊνών) που αναγνωρίζουν ειδικά υποστρώματα για την υποβάθμιση του πρωτεασώματος. Κανονισμός του c-myc εμπλέκει τη φωσφορυλίωση του c-myc στο Thr58, με αποτέλεσμα Fbw7 μεσολάβηση αποικοδόμηση του πρωτεασώματος. Η κινάση συνθετάσης γλυκογόνου 3β (ΟδΚ3β) είναι η μόνη γνωστή κινάση για να φωσφορυλιώσει c-Myc στο Thr58 [24].

Skp2 είναι ένα υποσχόμενο στόχο για τον περιορισμό του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων και την εξέλιξη του καρκίνου [12], είναι η υπερέκφραση είναι συχνά παρατηρείται στον καρκίνο του ανθρώπου και μπορεί, ως εκ τούτου, δρουν ως ένα ογκογονίδιο. Σε υποστήριξη αυτής της υπόθεσης, Skp2 έχει δειχθεί ότι αναγνωρίζει εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση (Cdk) αναστολείς και πρωτεΐνες καταστολής όγκου όπως ρ27 Kip1 (εξαρτώμενη από κυκλίνη αναστολέα κινάσης 1Β), p57 Kip2 (εξαρτώμενη από κυκλίνη αναστολέα κινάσης 1C), ρ130 ( 130 kDa ρετινοβλάστωμα σχετιζόμενη πρωτεΐνη) και Tob1 (αισθητήριο του erbB-2 1), αλλά όχι το c-Myc [13] – [16]. Skp2 μεσολάβηση σχηματισμό ουβικιτίνης από το c-Myc γίνεται ανεξάρτητα από φωσφορυλίωσης [25].

ανεπάρκεια Fbw7 πιστεύεται ότι εμπλέκεται στην αντίσταση στο φάρμακο σε ανθρώπινους καρκίνους [22], [23]. Έχει δειχθεί ότι απενεργοποιούνται με μετάλλαξη, εξάλειψη ή υπερμεθυλίωση προαγωγού στον καρκίνο του μαστού [17], [18], καρκίνος του παχέος εντέρου [19], [20], και λευχαιμία [21]. Fbw7 εκφράζεται ως τρεις διαφορετικές ισομορφές (που χαρακτηρίζονται α, β, και γ) αντίστοιχα που βρίσκονται στην α-πυρήνα, β-κυτόπλασμα, και γ-nucleolus [26], [27]. Δεδομένου ότι δεν υπάρχουν αντισώματα για αυτές τις τρεις ισομορφές χρησιμοποιήσαμε το καλύτερο που περιγράφεται και μεγαλύτερη από τις τρεις ισομορφές Fbw7α, στα πειράματά μας με wogonin.

Wogonin (5, 7-διυδροξυ-8-methoxyflavanon) είναι ένα φυσικό monoflavonoid εξάγεται από

Scutellaria baicalensis

radix [28] που έχει αναγνωριστεί ως υποψήφια αντικαρκινικό φάρμακο με δυνητικά χαμηλή τοξικότητα [29]. Η αντικαρκινική δράση του wogonin έχει αναφερθεί διάφορες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων κύτταρο μυελώματος RPMI 8226 [30], [31] και SMMC-7721 [32], του καρκίνου γλοιώματος κύτταρα [33], ρινοφαρυγγικού κύτταρα καρκινώματος ηπατοκυτταρικού καρκινώματος SK-HEP-1 [ ,,,0],34], τα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού [35], [36] και ανθρώπινου τραχηλικού καρκινώματος HeLa κύτταρα [37]. Η δράση του διαμεσολαβείται από την επαγωγή της απόπτωσης και της διαφοροποίησης των κυττάρων, και ρυθμίζεται από διάφορα γονίδια και πρωτεΐνες [38] – [41]

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τις επιδράσεις της wogonin στη βιωσιμότητα των κυττάρων και την απόπτωση. στο ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Α549 επιθηλιακή κυτταρική γραμμή. Εκτιμήσαμε επίσης τη ρύθμιση και τη λειτουργία του c-myc /Skp2 /Fbw7α και HDAC1 μονοπάτια /HDAC2 εμπλέκονται σε αποπτωτικό αποτέλεσμα.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Wogonin αγοράστηκε από Guangzhou IDC (Κίνα) και MG132 (καρβοβενζοξυ-Leu-Leu-λευκινάλη) ελήφθη από (Beyotime, Κίνα). Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: Fbw7 (CDC4, Η-300) και ρ-ο-Μγο (Thr 58) (Santa Cruz, USA)? c-myc, ΟδΚ3β, ΟΕΕ (απόπτωση που προκαλεί παράγοντας, Proteintech Group, Inc., USA)? HDAC1, HDAC2, Skp2, Survivin, Bcl-2 (λέμφωμα Β-κυττάρου 2), β-ακτίνης (Boster, Κίνα)? Mcl-1 (αλληλουχία λευχαιμία μυελοειδούς κυττάρου 1), ΧΙΑΡ (αναστολέας φυλοσύνδετη πρωτεΐνης απόπτωσης, BIOSs, Κίνα)? Cytochome γ (keygen, Κίνα)? PARP (πολυ ADP-ριβόζη πολυμεράση, Σινο Βιολογικών Inc., Κίνα).

Πολιτισμός τηλέφωνα

Το ανθρώπινο πνευμονικό Α549 αδενοκαρκινώματος κυτταρική γραμμή ελήφθη από την Τράπεζα Κυττάρων του Κέντρου πειράματα σε ζώα, Βόρεια σχολική περιφέρεια, η Sun Yat-Sen University. Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα διατηρήθηκαν στο εργαστήριο μας σε μέσο RPMI 1640 με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Sijiqing, Κίνα) στους 37 ° C και 5% CO

2.

Methylthiazolyldiphenyl-τετραζόλιο βρωμίδιο ( ΜΤΤ) Cell Vaibility Δοκιμασία

κύτταρα συλλέγονται με τρυψίνη σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 ανά φρεάτιο. Μετά από ολονύκτια επώαση, το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις wogonin. Μετά από έκθεση σε wogonin για 24, 48 ή 72 ώρες τα κύτταρα επωάστηκαν με ΜΤΤ στους 37 ° C για επιπλέον 4 ώρες. Αυτό επέτρεψε μιτοχονδριακή αφυδρογονάση για τη μετατροπή ΜΤΤ σε αδιάλυτα κρύσταλλοι φορμαζάνης. Το μέσο καλλιέργειας στη συνέχεια απορρίφθηκε, και 100 μι διμεθυλσουλφοξειδίου (DMSO) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι φορμαζάνης. Η απορρόφηση της διαλυτοποιημένης φορμαζάνης μετρήθηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας EL340 (Bio-Tek. Instruments, Winooske, VT).

πυρηνική χρώση

Α549 κύτταρα χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη) κιτ χρώσης (keygen, Κίνα). Μετά από έκθεση σε διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις της wogonin για 48 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν με ένα διάλυμα DAPI εργασίας (1-2 μg /mL) για 15 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με μεθανόλη και ρυθμιστικό διάλυμα Α (60% γλυκερόλη σε 10 mM φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS, ρΗ 7.6)) προστέθηκε στο αιώρημα. κύτταρα Α549 παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Eclipse Ti Nikon μικροσκόπιο (Nikon, Ιαπωνία).

μιτοχονδριακή μεμβράνη Πιθανές

Το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (Δψπι) των κυττάρων Α549 μετρήθηκε usimg φθορισμού, λιπόφιλη, κατιονικές ανιχνευτή, JC-1 (Beyotime, Κίνα), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, κύτταρα που εκτέθηκαν σε wogonin επωάστηκαν με 1Χ διάλυμα χρώσης JC-1 για 20 λεπτά στους 37 ° C. Αυτά στη συνέχεια ξεπλένονται δύο φορές με JC-1 ρυθμιστικό χρώσης και οι εικόνες ελήφθησαν με ένα μικροσκόπιο Nikon Eclipse Ti (Nikon, Ιαπωνία).

Προσδιορισμός απόπτωσης

Τα κύτταρα σημάνθηκαν με ΡΙΤΟ-επισημασμένο αννεξίνης V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Annexin V-FITC (keygen Biotech, Κίνα), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, μετά από 48 ώρες έκθεση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις wogonin, τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό σύνδεσης 1Χ. Κλάσματα των 10

5 κύτταρα αναμίχθηκαν με 5 μΐ αννεξίνης V-FITC και 5 μί ΡΙ για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Φθορισμού (530 nm) ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής (FACS Aria, BD Biosciences, USA) μέσα σε 1 ώρα.

Real-time PCR ανάλυση

Ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green δημοσιογράφος. Α549 κύτταρα εκτεθειμένα σε wogonin πλύθηκαν με PBS και το συνολικό RNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας RNAiso Plus (TAKARA, Ιαπωνία). Το προκύπτον RNA πρώτα μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας ένα κιτ PrimeScript® RT Master Mix (TAKARA, Ιαπωνία). Gene-ειδικών εκκινητών συνδυάστηκαν με SYBR® πρόμιγμα Εχ Taq ™ (TAKARA, Japan) και ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα PCR πραγματικού χρόνου μηχανή ΑΒΙ 7500 (Applied Biosystems, USA). Όλες οι αντιδράσεις qPCR πραγματοποιήθηκαν ανεξάρτητα σε πέντε δείγματα. Η έκφραση σχετική mRNA υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την 2

-ΔΔCt μέθοδο. Οι αλληλουχίες εκκινητή που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

Ανάλυση Western Blot

κύτταρα πλένονται με PBS υποβάλλονται σε λύση με RIPA (50 mM Tris (ρΗ 7,4), 150 mM NaCl, 1 % ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS, ορθοβαναδικό νάτριο, φθοριούχο νάτριο, EDTA και leupeptin, (Beyotime, Κίνα) συμπληρωμένο με αναστολέα πρωτεάσης PMSF (Beyotime, Κίνα). Κυτταροπλασματικά πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας μια πρωτεΐνη Πυρηνική και την κυτταροπλασματική Extraction Kit (keygen Biotech, Κίνα).

Η διαλυτή συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με κιτ δοκιμασίας πρωτείνης BCA (Beyotime, Κίνα). Τα κυτταρολύματα βράστηκαν για 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης και διαχωρίστηκαν σε μια SDS- PAGE γέλη. Μετά από ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη PVDF (Millipore, USA). οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με άπαχο γάλα, ανιχνεύθηκαν με διάφορα πρωτογενή αντισώματα και συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα, και οπτικοποιούνται με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια αντιδραστήρια ανίχνευσης (ECL) (Beyotime, Κίνα).

Στατιστική Ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκε με τη χρήση SPSS έκδοση 17.0 του λογισμικού. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι όροι και τυπικά σφάλματα (Μέση τιμή ± SEM) από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ των ομάδων. Οι τιμές των P & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Wogonin αναστέλλει τον κυτταρικό Βιωσιμότητα και επάγει την απόπτωση των κυττάρων

Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ σε συνδυασμό με χρώση DAPI. και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής μετά από έκθεση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις wogonin. ανάλυση ΜΤΤ έδειξε ότι wogonin ανέστειλε την κυτταρική βιωσιμότητα σε μια δοσο-εξαρτώμενη και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1Β). (Εικ. 1Γ). Αυτό επιβεβαιώθηκε από τα αποτελέσματα της ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιώντας Αηηβχίην-PI

(Α) Χημική δομή της wogonin (C

16H

12O

5, MW: 284.27 ). βιωσιμότητας (Β) Cell αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα κύτταρα επωάστηκαν με wogonin για 24 ώρες, 48 ώρες ή 72 ώρες. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τις μέσες τιμές ± SEM (n = 3). (Γ) Η απόπτωση αξιολογήθηκε με αννεξίνη V /χρώση ΡΙ σε κύτταρα Α549. Τα κύτταρα επωάστηκαν με wogonin σε συγκεντρώσεις των 0, 15, 25, 35 μg /mL, για 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες. (D) Πυρήνες χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ και παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού. Τα αποπτωτικά κύτταρα υποδεικνύονται με βέλη. *

P

& lt? 0,05 έναντι ομάδας ελέγχου, **

P

& lt? 0,01 έναντι ομάδας ελέγχου

Η

Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, το ποσοστό και των δύο. πρώιμη και την όψιμη φάση της απόπτωσης αυξήθηκε μετά από την έκθεση σε όλες τις συγκεντρώσεις του wogonin. Το συνολικό ποσοστό απόπτωσης υπερέβη το 50% στο 35 μg ομάδα /mL.

χρώση DAPI (Εικ. 1D) προσδιορίζονται συμπυκνώνονται και διασπώνται πυρήνες στα κύτταρα που εκτίθενται σε 35 μg /mL wogonin, ενώ μόνο σαφές πυρήνες με ανοιχτό μπλε χρώση παρατηρήθηκε στην ομάδα ελέγχου.

Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, Wogonin συσχετίστηκε με δοσοεξαρτώμενη μείωση στα μιτοχόνδρια δυναμικό (Δψπι), η οποία οδήγησε σε μειωμένη ερυθρό φθορισμό (JC-1 πολυμερούς) και αυξημένη πράσινου φθορισμού (JC-1 μονομερούς). Αυτό μπορεί να σχετίζεται με προς τα κάτω ρύθμιση των Mcl-1 καθώς δεν υπήρχε εμφανής μείωση στα επίπεδα Bcl-2. Wogonin προώθησε επίσης την απελευθέρωση του ΟΕΕ και του κυτοχρώματος C στο κυτταρόπλασμα παρέχοντας περαιτέρω ενδείξεις μιτοχονδριακές βλάβες (Εικ. 2C). Κάτω ρύθμιση των ΧΙΑΡ, survivin, και των διασπασμένων θραυσμάτων από PARP αναφέρει ότι η διαδικασία της απόπτωσης συνεχίστηκε μετά από βλάβη μιτοχόνδρια (Σχ. 2Β).

(Α) Ανάλυση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (ΔΨm) χρησιμοποιώντας JC -1 χρώση μετά από έκθεση σε wogonin για 48 ώρες. Ένα μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει τα αποτελέσματα. Μιτοχονδριακή αποπόλωση υποδείχθηκε από την αύξηση στο πράσινο φθορισμό και μια μείωση στην ένταση φθορισμού κόκκινο. (Β) Τα επίπεδα πρωτεΐνης Bcl-2, Mcl-1, ΧΙΑΡ, survivin και PARP αναλύθηκε με κηλίδα western. (C) Κυτταροπλασματικά πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν για ανάλυση κηλίδος western των απελευθερωμένων Κυτοχρώματος c και ΟΕΕ. Σε αυτά τα πειράματα, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε wogonin 0, 15, 25, 35 μg /mL για 48 ώρες. *

P

& lt? 0,05 έναντι ομάδας ελέγχου, **

P

& lt?. 0.01 vs ομάδα ελέγχου

Η

Wogonin Down-ρυθμίζει HDAC1 και HDAC2 σε δύο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης

επίπεδα πρωτεΐνης του HDAC1 και HDAC2 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από έκθεση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις wogonin για 48 ώρες (Εικ. 3Β). Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με την προς τα κάτω ρύθμιση του mRNA ανιχνεύεται με qPCR δείχνοντας ότι HDAC1 μειώθηκε με 0,69 φορές και HDAC2 από 0,73 φορές, (αβεβαιότητες που σχετίζονται με πολλαπλές μεταβολές ήταν & lt? 2) (Εικ. 3Α). Αυτές οι αλλαγές μπορεί να οδηγήσει σε ανάλογη αύξηση ακετυλίωση των ιστονών και να προωθήσει την έκφραση των πρωτεϊνών καταστολής όγκου.

(Α) Σχετικά επίπεδα mRNA του HDAC1 και HDAC2 ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου με GAPDH ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM των πέντε ανεξάρτητα πειράματα.

#

P

& lt? 0,01 έναντι ομάδας ελέγχου. (Β) Τα επίπεδα πρωτεΐνης του HDAC1 και HDAC2 αναλύθηκαν με western blot. Σε αυτά τα πειράματα, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε wogonin 0, 15, 25 και 35 μg /mL για 48 ώρες. *

P

& lt? 0,05 έναντι ομάδας ελέγχου, **

P

& lt?. 0.01 vs ομάδα ελέγχου

Η

Wogonin ρυθμίζει προς τα κάτω c-Myc και Skp2 σε επίπεδο πρωτεΐνης, και αυξάνει το επίπεδο mRNA του c-myc

Τόσο c-Myc και Skp2 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε πρωτεϊνικό επίπεδο μετά από έκθεση σε wogonin (0, 15, 25, 35 μg /mL) για 48 ώρες, (Σχ. 4Β). Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, το επίπεδο του mRNA της Skp2 μειώθηκε 0,81 φορές, ενώ το επίπεδο του mRNA του c-myc αυξήθηκε περίπου 1,6 φορές (αβεβαιότητες που σχετίζονται με πάσο-αλλαγές τόσο & lt? 2). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ένας πρωτεασώματος οδός αποδόμησης μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση της c-Myc και Skp2. Ωστόσο, όπως wogonin οδήγησε σε μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης σε Skp2, περαιτέρω πειράματα επικεντρώθηκαν στην υπομονάδα αναγνώριση πρωτεασώματος, Fbw7α, το οποίο στοχεύει ο-Μγο.

(Α) Σχετικά επίπεδα mRNA του c-myc και Skp2 ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου με GAPDH ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM των πέντε ανεξάρτητα πειράματα.

#

P

& lt? 0,01 έναντι ομάδας ελέγχου. επίπεδα (Β) Protein του c-myc και Skp2 αναλύθηκε με κηλίδα western. Σε αυτά τα πειράματα, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε wogonin 0, 15, 25 και 35 μg /mL για 48 ώρες. *

P

& lt? 0,05 έναντι ομάδας ελέγχου, **

P

& lt?. 0.01 vs ομάδα ελέγχου

Η

Wogonin Μειώθηκε Fbw7α και ΟδΚ3β και αυξημένη Thr58- myc στο πρωτεϊνικό επίπεδο

επίπεδα πρωτεΐνης του Fbw7α μειώθηκε μετά από έκθεση σε wogonin, (Εικ. 5Β), αλλά δεν υπήρξε καμία αντίστοιχη μείωση στην έκφραση του mRNA (εικ. 5Α). Thr58 φωσφορυλίωση του c-myc αυξημένη (Σχ. 5Β). Thr58 φωσφορυλίωση του c-myc είναι ένα απαιτούμενο στοιχείο της αποδόμησής της και διαμεσολαβείται από ΟδΚ3β. Ωστόσο, η έκφραση της ΟδΚ3β μειώθηκε τόσο στο mRNA (0,78-φορές σε 35 μg /mL) (Σχ. 5Α) και στο επίπεδο πρωτεΐνης (Εικ. 5Β). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι φωσφορυλίωση του c-myc σε Thr58 μπορεί να συμβεί ανεξάρτητα από ΟδΚ3β. Ωστόσο, αυτό απαιτεί περαιτέρω μελέτη.

(Α) Σχετικά επίπεδα mRNA της Fbw7α και ΟδΚ3β ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου με GAPDH ως εσωτερικός έλεγχος. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM των πέντε ανεξάρτητα πειράματα.

#

P

& lt? 0,01 έναντι ομάδας ελέγχου. επίπεδα (Β) Η πρωτεΐνη της Fbw7α, Thr58-Myc και ΟδΚ3β αναλύθηκαν με western blot. επίπεδα (Γ) Πρωτεΐνη c-Myc δοκιμασία με κηλίδα western. Σε αυτά τα πειράματα, 1 μΜ MG132 προστέθηκε επωάστηκαν με ή χωρίς 25 μg /mL wogonin για 48 ώρες. *

P

& lt? 0,05 έναντι ομάδας ελέγχου, **

P

& lt?. 0.01 vs ομάδα ελέγχου

Η

Τα πειράματα διεξήχθησαν με το MG132 αναστολέα πρωτεασώματος για την περαιτέρω κατανοήσουν το μονοπάτι αποδόμησης του πρωτεασώματος εμπλέκονται στη ρύθμιση της c-Myc. Τα αποτελέσματα στο Σχ. 5C δείχνουν ότι MG132 δεν ήταν σε θέση να αντιστρέψει την υποβάθμιση c-Myc που επάγεται από 25 μg /mL wogonin. Απαιτείται λοιπόν περαιτέρω έρευνα απαιτείται για να καθορίσει το ακριβές μονοπάτι που εμπλέκονται στην αποδόμηση c-Myc.

Συζήτηση

Wogonin είναι ένα φυσικό monoflavonoid εξάγεται από

Scutellaria baicalensis

radix [28] . Έχει αναφερθεί ότι έχουν αντινεοπλασματική δράση σε διάφορους τύπους καρκίνου με την επαγωγή της απόπτωσης και της διαφοροποίησης των κυττάρων [30] – [37], και να ρυθμίζεται από διάφορες γονίδια και πρωτεΐνες [38] – [41]. Είναι γνωστό ότι το C-Myc /Skp2 /Fbw7α και μονοπάτια HDAC1 /HDAC2, συνδέονται με την εξέλιξη του όγκου. Εδώ ερευνούμε το ρόλο τους στις αντικαρκινικές δράσεις της wogonin στα κύτταρα Α549 NSCLC.

Είμαστε αξιολόγησε για πρώτη φορά το αντι-βιωσιμότητα και αποπτωτικά αποτελέσματα της wogonin χρησιμοποιώντας ΜΤΤ και αναλύσεις διπλή χρώση αννεξίνης V-PI. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι wogonin προκάλεσε δοσο-εξαρτώμενη και χρονο-εξαρτώμενη αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων (IC

50 & lt? 35 μg /mL σε 48 ώρες). Η πρώιμη αύξηση του ρυθμού της απόπτωσης σε απόκριση προς wogonin πραγματοποιήθηκε παράλληλα με Annexin V κύτταρα θετικά σταδιακά Annexin-V αρνητική.

Στο IC

50 κύτταρα (35 μg /mL) έδειξε απόδειξη αξιοσημείωτη απόπτωση, σύμφωνα με τις αλλαγές πυρηνική μορφολογία παρατηρήθηκε με χρώση ϋΑΡΙ.

Η έκφραση που σχετίζονται με την απόπτωση πρωτεϊνών, όπως Bcl-2, Mcl-1, PARP, ΧΙΑΡ, Survivin, κυτόχρωμα c και AIF αξιολογήθηκε σε προσδιορίσουν περαιτέρω τα αποπτωτικά αποτελέσματα του wogonin στο πρωτεϊνικό επίπεδο. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι wogonin είναι σε θέση να επηρεάσει τη σταθερότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης και να μειωθεί το δυναμικό της μεμβράνης των μιτοχονδρίων (Δψπι). Αυτό αποδείχθηκε με χρώση JC-1, μειωμένη mcl-1 έκφραση και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος C και ΟΕΕ στο κυτταρόπλασμα. Διασπασμένη PARP και μειωμένη ΧΙΑΡ και έκφραση survivin μπορεί να συνέβαλαν στην εξέλιξη της απόπτωσης.

HDAC1 και HDAC2 είναι HDACs της κατηγορίας Ι που deacetylate ιστόνης και μη-ιστόνης πρωτεΐνες [5]. Καταστέλλουν γονιδιακή έκφραση, και την τροποποίηση συγκεκριμένων πρωτεϊνών όγκων που εμπλέκονται στην εξέλιξη [4]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης του HDAC1 και HDAC2 ήταν τόσο μειώνεται με την παρουσία του wogonin, υποδεικνύοντας ότι ακετυλιωμένη πρωτεΐνη ιστόνης μπορεί να προωθήσει την έκφραση των πρωτεϊνών καταστολής όγκων και ως εκ τούτου αναστέλλει την εξέλιξη του όγκου.

Ένα ενδο-σχέση υπάρχει μεταξύ c-Myc και Skp2 τέτοια ώστε c-Myc προάγει έκφραση Skp2, και Skp2 στόχων c-Myc για ουβικιτίνη εξαρτώμενη αποδόμηση [11], [12], [24], [25]. Στα πειράματά μας, wogonin κάτω ρυθμισμένα c-Myc και Skp2 στο επίπεδο πρωτεΐνης, αλλά η έκφραση του mRNA του c-myc αυξήθηκε 1,6 φορές. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η οδός αποδόμησης του πρωτεασώματος μπορεί να σχετίζεται με την αντιστροφή του c-myc. Ωστόσο, δεδομένου ότι μειωμένη έκφραση Skp2, εστιάσαμε περαιτέρω πειράματα μας σε Fbw7α, μια άλλη υπομονάδα αναγνώριση πρωτεασώματος που στοχεύει ο-Μγο.

Thr58 φωσφορυλίωση του c-myc απαιτείται για Fbw7α μεσολάβηση αποικοδόμηση c-Myc [24]. Όπως Thr58, φωσφορυλιώνεται από ΟδΚ3β, αξιολογήσαμε τα επίπεδα έκφρασης του Fbw7α, Thr58 c-Myc και ΟδΚ3β. Σε αυτά τα πειράματα έκφρασης Fbw7α μειώθηκε στο πρωτεϊνικό επίπεδο, αλλά όχι στο επίπεδο του mRNA. Thr58 φωσφορυλίωση του c-myc αυξήθηκε σε κάποιο βαθμό και η έκφραση της ΟδΚ3β τόσο στο mRNA και επίπεδο πρωτεΐνης μειώθηκε. Αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν την έλλειψη συμμόρφωσης μεταξύ Fbw7α mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης, η μειωμένη έκφραση της ΟδΚ3β, και η αυξημένη φωσφορυλίωση του c-myc σε Thr58.

Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η φωσφορυλίωση της Thr58 σε κύτταρα Α549 συμβεί ανεξάρτητα από ΟδΚ3β [42]. Ωστόσο, ΟδΚ3β είναι η μόνη γνωστή κινάση που φωσφορυλιώνει c-Myc στο Thr58. Στις μελέτες μας η πρωτεασώματος αναστολέας MG132 δεν ήταν σε θέση να αποτρέψει την υποβάθμιση του c-myc που υποδηλώνει ότι μειώθηκε Fbw7α και Skp2 μπορεί να εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός που εμπλέκεται απαιτεί περαιτέρω έρευνα.

Όλα μαζί τα ευρήματά μας προτείνουν ότι η ικανότητα του wogonin να επηρεάζει διαφορετικά βιοχημικά μονοπάτια μπορεί να εξηγήσει τη δραστηριότητά της ενάντια σε μια ποικιλία διαφορετικών καρκίνων. Τα δεδομένα μας μπορεί επίσης εν μέρει να εξηγήσει γιατί μερικοί ανεπαρκή κύτταρα γονίδιο (π.χ. άτομα με ανεπάρκεια Fbw7α) είναι ανθεκτικά σε wogonin.