Αφηρημένο

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι η πιο συχνή κακοήθης νόσος ουρολογικές στην Κίνα. Υδροξυκαμπτοθεσίνη (HCPT) είναι ένας αναστολέας DNA τοποϊσομεράσης Ι, η οποία έχει χρησιμοποιηθεί σε χημειοθεραπεία για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης για σχεδόν 40 χρόνια. Προηγούμενη έρευνα έχει αποδείξει ότι η ισοφλαβόνη, genistein, μπορεί να ευαισθητοποιήσει πολλαπλές κυτταρικές γραμμές καρκίνου σε θεραπεία HCPT, όπως του προστάτη και του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε κατά πόσον η genistein μπόρεσε να ευαισθητοποιήσει κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως και επιθηλιακά κύτταρα ουροδόχου κύστης BDEC στη θεραπεία HCPT, και διερευνήθηκαν οι πιθανές υποκείμενων μοριακών μηχανισμών. Η γενιστεΐνη μπορεί να σημαντικά και με δοσοεξαρτώμενο ευαισθητοποιούν πολλαπλές κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης και κυττάρων BDEC να HCPT απόπτωση τόσο in vitro όσο και in vivo. Η γενιστεΐνη και HCPT συνεργικά ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων της ουροδόχου κύστης και του πολλαπλασιασμού, και επάγεται G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης φάση σε TCCSup καρκίνο της ουροδόχου κύστης και κυττάρων BDEC κύτταρο. Προθεραπεία με genistein ευαισθητοποιημένα BDEC και κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως να HCPT προκαλούμενη βλάβη του DNA από τη συνεργιστική ενεργοποίηση του αταξία τελαγγειεκτασία μεταλλαγμένου (ΑΤΜ) κινάσης. Η γενιστεΐνη εξασθενημένο σημαντικά την ικανότητα του να επάγει HCPT ενεργοποίηση του αντι-αποπτωτική NF-κΒ μονοπάτι τόσο in vitro όσο και in vivo σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου της ουροδόχου κύστης, και έτσι παρεμπόδισαν την αντι-αποπτωτική δράση του μονοπατιού ΝΡ-κΒ. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι η genistein θα μπορούσε να λειτουργήσει ως μια πολλά υποσχόμενη μη-τοξικό παράγοντα για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας των HCPT χημειοθεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Wang Υ, Wang Η, Zhang W, Shao C, Xu P, Shi CH, et al. (2013) Η γενιστεΐνη ευαισθητοποιεί ουροδόχου κύστης καρκινικά κύτταρα να HCPT Θεραπεία Ιη Vitro και Ιη Vivo μέσω ATM /ΝΡ-κΒ /ΙΚΚ Pathway απόπτωση. PLoS ONE 8 (1): e50175. doi: 10.1371 /journal.pone.0050175

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Ιουν, 2012? Αποδεκτές: 22η Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 24η του Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30901498, Αρ 30100185, Αρ 81250036, Αρ 30973000, Αρ 30872583, Αρ 81072116) και το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Shaan’xi, Κίνα ( 2009JQ4003). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος της ουροδόχου κύστης είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες που επηρεάζουν το ουροποιητικό σύστημα. Συνολικά 44.690 άνδρες (29,8 ανά 100.000) και 16.730 γυναίκες (11,2 ανά 100.000) διαγνώστηκαν το 2006, κατάταξη καρκίνου της ουροδόχου κύστης ως το τέταρτο αρσενικό συχνότερη και η ένατη πιο συνηθισμένη γυναικεία κακοήθης νόσος στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Σε αντίθεση, η συχνότητα εμφάνισης καρκίνου της ουροδόχου κύστης στην Ασία είναι πολύ χαμηλότερο. Το 2009, Zhang et al. ανέφερε ότι παρόλο που οι τιμές αυξήθηκαν μεταξύ 1988 και 2002 (8,22 ανά 100.000 το 1988-1992, 9,45 ανά 100.000 το 1993 – 1997 και 9,68 ανά 100.000 το 1998-2002), η συχνότητα εμφάνισης καρκίνου της ουροδόχου κύστης στην Κίνα παραμένει χαμηλότερη από ό, τι στις Ηνωμένες Πολιτείες [ ,,,0],2]. Ομοίως, στην Ανατολική Ασία, η χαμηλή συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης έχουν αναφερθεί στην Κορέα (14,39 ανά 100.000), η Ιαπωνία και η Ινδία (περίπου 14 ανά 100.000) [3] – [5]. Επιπλέον, οι συγκεκριμένες ασθένειες ποσοστά επιβίωσης 5-χρόνια των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης στην Ασία είναι υψηλότερες από εκείνες στις δυτικές χώρες [6].

Το χημειοθεραπευτικό παράγοντα, υδροξυκαμπτοθεσίνης (HCPT), χρησιμοποιείται κυρίως για τη θεραπεία της καρκίνο της ουροδόχου κύστης. HCPT διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα κύστης σχηματίζοντας ένα τριμερές σύμπλοκο με το DNA και το ένζυμο DNA τοποϊσομεράση Ι μέσω δεσμών υδρογόνου, σταθεροποιώντας έτσι το συγκρότημα. Το σταθερό σύμπλοκο DNA αποτρέπει την εκ νέου απολίνωση και οδηγεί στην μετατροπή του μονής αλυσίδας DNA σε δίκλωνα σπασίματα κατά τη διάρκεια της S-φάσης. Σε αυτό το σημείο, η διχάλα αντιγραφής συγκρούεται με συμπλέγματα σχάσης DNA, η οποία επάγει την απόπτωση και κυτταρικό κύκλο σύλληψης [7].

genistein, ένα γνωστό ισοφλαβόνη και φυσικών βοτανικών οιστρογόνο, έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, επιβίωση, τη μετάσταση και την αγγειογένεση μέσω της αύξησης αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο μέσω της επαγωγής των διαφόρων ερεθισμάτων προκαλούν βλάβη στο DNA [8] – [10]. Η γενιστεΐνη έχει αποδειχθεί ότι έχει ένα ανασταλτικό αποτέλεσμα επί της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη [11], τον καρκίνο του τραχήλου [12], του καρκίνου του μαστού [13], καρκίνος του παχέος εντέρου [14] και του καρκινώματος νεφρικών κυττάρων [15] κύτταρα. Η genistein μπορεί επίσης chemosensitize πολλές κακοήθεις όγκους στις επιδράσεις της DNA τοξικά φάρμακα. Προηγούμενες αναφορές έχουν υποδείξει ότι προθεραπεία με 10-30 μmol /l γενιστεΐνη μπορεί chemosensitize του τραχήλου της μήτρας, των ωοθηκών και τα φυσιολογικά κύτταρα ινοβλαστών σε θεραπεία με HCPT επάγοντας ένα μεγαλύτερο βαθμό αναστολής της ανάπτυξης και της κυτταρικής απόπτωσης [16]. Ωστόσο, αν η genistein μπορεί να ενισχύσει την χημειοθεραπευτική επίδραση του HCPT στα κύτταρα της ουροδόχου κύστης, και το μοριακό μηχανισμό δράσης της σε αυτόν τον τύπο ιστού, παραμένουν ασαφείς. Ως εκ τούτου, εμείς διερευνηθεί κατά πόσον η genistein μπορούσε chemosensitize καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα να HCPT, και να διερευνηθούν τα πιθανά υποκείμενων μηχανισμών αυτού του αποτελέσματος.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Οι κυτταρικές σειρές

J82, scaber, και TCCSup κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), BFTC905, HT1197, Τ24, TSGH-8301 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές ήταν από την Κίνα Κέντρο Type Culture Collection (CCTCC). Η κύρια κυτταρική σειρά επιθηλιακών κύστη, BDEC, ήταν από την BioWhittaker (San Diego, CA, USA) και διατηρήθηκαν ως εκθετικά αναπτυσσόμενες καλλιέργειες σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Genistein (Sigma, Σαγκάη, Κίνα) και HCPT (ευγενώς από την Sanofi, Σαγκάη, Κίνα) διαλύθηκαν σε DMSO για την προετοιμασία 10 mM διαλύματα παρακαταθήκης. Για τα πειράματα, τα κύτταρα επωάστηκαν για 3 ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς 10 μΜ γενιστεΐνης και 1 μΜ HCPT για 24 ώρες.

2. αναστολή της ανάπτυξης κυττάρου με genistein και HCPT

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο και αφέθηκαν να προσκολληθούν για μία νύχτα. Το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει genistein σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 24 ώρες, και τα κύτταρα στη συνέχεια εκτίθενται σε HCPT για επιπλέον 72 ώρες. Για κάθε θεραπεία απλού παράγοντα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με genistein για 96 ώρες και HCPT για 72 ώρες. Η ανάπτυξη των κυττάρων εξετάστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ.

3. Η κυτταρομετρία ροής για την απόπτωση

προσκολλημένα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν, επαναιωρήθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μπλε φως αργού σε λέιζερ (μήκος κύματος διέγερσης, 488 nm? Ισχύς λέιζερ, 200 mW) και ερυθρού φθορισμού από το ΠΙ που χαρακτηρίζει DNA καταγράφηκε. Όλες οι δοκιμασίες για απόπτωση διεξήχθησαν εις διπλούν και τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών πειραμάτων.

4. χρώση ανοσοφθορισμού για γ-Η2ΑΧ και ATM

Για τη χρώση γ-Η2ΑΧ, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις HCPT και genistein, το μέσο απομακρύνθηκε σε διάφορα χρονικά σημεία και τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 1% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά που ακολουθείται από 70% αιθανόλη για 10 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε 0.1% Triton Χ σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) για 10 λεπτά, διαπερατά σε 0.5% Triton σε PBS για 10 λεπτά, πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS και αποκλείστηκαν με 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) σε PBS για 60 λεπτά. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-γ-Η2ΑΧ (1:2,000? Cell Signaling, Σαγκάη, Κίνα) ή αντι-ATM (1:300, Cell Signaling, Σαγκάη, Κίνα) σε 5% BSA σε PBS στους 4 ° C όλη τη νύκτα, πλύθηκαν τέσσερις φορές σε PBS, επωάστηκαν στο σκοτάδι με ένα FITC-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα (1:2,000 για αντι-γ-Η2ΑΧ και 1:300 για αντι-ATM) σε 5% BSA για 1 ώρα, πλύθηκαν 4 φορές σε PBS, επωάζονται στο σκοτάδι με 1 μg /ml 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης (DAPI? Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σε PBS για 5 λεπτά, και τοποθετείται και καλυπτρίδα σε Fluoromount G (Southern Biotech, Birmingham, AL , ΗΠΑ). Οι διαφάνειες εξετάστηκαν σε μια Leica μικροσκόπιο φθορισμού (Wetzlar, Γερμανία), οι εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού Nikon (Nikon Eclipse E800) και εισάγονται στην Nikon ACT-1 (Έκδοση 1.12) του λογισμικού. Εικόνες συνδυάστηκαν σε μορφή εκδόσεων χρησιμοποιώντας το λογισμικό Adobe Photoshop CS2. Για κάθε κατάσταση θεραπείας, ο αριθμός των γ-Η2ΑΧ ή ΑΤΜ εστίες προσδιορίστηκε σε τουλάχιστον 50 κύτταρα. Όλες οι παρατηρήσεις επικυρωθεί από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

5. Western blotting

ουροδόχου κύστης καρκινικά κύτταρα λύθηκαν σε 400 μΐ 1% SDS ρυθμιστικού λύσης (50 mM HEPES, ρΗ 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 4 mM NaPPi, 2 mM Na

3νο

4) για 5 λεπτά σε πάγο για να ληφθεί συνολικός προϊόντα λύσης κυττάρου. Για τη συλλογή των πυρηνικών πρωτεϊνών, οι μονοστιβάδες πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο ρυθμιστικό υποτονική λύση (HLB, ρΗ 7.5, 10 mM Tris, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM MgCl

2), και τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μεταφέρθηκαν σε έναν ομογενοποιητή (Wheaton Ltd, Millville, NJ, USA) σε 500 μλ HLB. Τα κύτταρα διογκώθηκε σε HLB για 15 λεπτά, ομογενοποιήθηκε και οι κυτταρικές πυρήνες συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA. Η δοκιμασία pull-down διεξήχθη με την ανοσοκαταβύθιση 500 μg πυρηνικών ή εκχύλισμα κυτταρολύματος (προκαταρκτική διαύγαση με G σφαιρίδια Protein Α /) με πρωτογενές αντίσωμα, και στη συνέχεια, 50-100 μg ολικού ή πυρηνικών λύμα αναλύθηκε σε ένα δωδεκυλικό νάτριο 7.5 – 12.5% θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) γέλης, ηλεκτρο-μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη Hybond ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA), μπλοκαρίστηκαν σε PBS που περιείχε 5% άπαχο ξηρό γάλα και 0,05% Tween-20, επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C, και στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα για 1 ώρα. Οι πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές με τη χρήση του Phototope-HRP Σύστημα Ανίχνευσης Western (Cell Signaling, Beverly, ΜΑ, USA) και μεμβράνη Κοντάρ (Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ, USA) και σαρώνονται και προσδιορίζονται ποσοτικά με τη χρήση ImageJ (http: //rsbweb.nih .gov /θ /). Το αντι-ΑΤΜ, αντι-φωσφο Η2ΑΧ, αντι-φωσφο ATM (Ser 1981), αντι-ΙΚΚ, αντι-φωσφο ΙΚΚ1 /2, αντι-β-ακτίνης, αντι-GAPDH, αντι-φωσφο-ΝΕΜΟ (NF-κ- β ουσιαστικό διαμορφωτή), αντι-NBS1 (Nijimegen σύνδρομο θραύση 1) αντίσωμα, αντι-κασπάσης 3 και 9, αντι-φωσφο PARP και αντι-OCT1 αντισώματα ελήφθησαν από την Cell Signaling.

6. siRNA διαμόλυνση

Η επιμόλυνση των κυττάρων TCCSup και BDEC με ΑΤΜ siRNA (50 nmol /l? Invitrogen) εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Oligofectamine (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή

7.. Σε μελέτες θεραπείας όγκου vivo

Το πείραμα που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της τέταρτης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα προ-μικτή 1:01 με Matrigel (Becton Dickinson, Πεκίνο, Κίνα) και υποδορίως (5 × 10

6 κύτταρα ανά περιοχή) στα πλευρά της 10-εβδομάδων θηλυκά SCID άτριχων ποντικών (Τμήμα πειραματόζωων, η τέταρτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Xi’an, Shaan’xi, Κίνα). Η φαρμακευτική αγωγή άρχισε 22 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου. Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία (5 ποντικοί /ομάδα) σε πέντε ομάδες. Η ομάδα ελέγχου έχει παραβιαστεί όγκους που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0,01% DMSO. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή από του στόματος με τροφή που περιείχε genistein (1 g /kg) και /ή την έγχυση διαπεριτοναϊκή 3 μg /ml HCPT. Η ποσοστιαία μεταβολή στο μέγεθος του όγκου υπολογίστηκε από συγκρίσεις με την αρχική τιμή σε 22 ημέρες.

8. δοκιμασία ηλεκτροφορητικής μετατόπισης κινητικότητας (EMSA)

εκχυλίσματα Πυρηνική κυττάρων ελήφθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως, και 10 μg πυρηνικό εκχύλισμα επωάστηκε με καθαρισμένο

32Ρ-σημασμένο ΝΡ-κΒ συναίνεση δίκλωνο ολιγονουκλεοτίδιο και 0,25 mg /mL πολυ (dI-dC) σε 5 × ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης [18]. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου 8%, τα πηκτώματα ξηράνθηκαν, εξετέθησαν σε φιλμ ακτίνων Χ όλη τη νύχτα στους -80 ° C και αναπτύχθηκε με τη χρήση ενός All-Pro Plus 100 αυτοματοποιημένο επεξεργαστή φιλμ ακτινών Χ (All-Pro Imaging Corporation, Hicksville, NY, USA).

9. Ποσοτικοποίηση και στατιστικών μεθόδων

Ομάδες συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το Student του

t-test

?

P

values≤0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

1. Επιδράσεις της HCPT και γενιστεΐνης στην βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης

κύτταρα της ουροδόχου κύστης υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με genistein για 3 ημέρες, και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Η θεραπεία μιας ποικιλίας κυτταρικών σειρών καρκίνου της ουροδόχου κύστης και κυττάρων ουροδόχου κύστης BDEC με genistein είχε ως αποτέλεσμα την δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, η οποία κατέδειξε ότι η γενιστεΐνη αναστέλλει επαναλήψιμα την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων κύστης. Ωστόσο, παρατηρήθηκε μία συνεργική δράση όταν J82, Τ24, TSGH8301 και TCCSup καρκινικών κυττάρων κύστης και τα κύτταρα της ουροδόχου κύστης BDEC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της γενιστεΐνης και HCPT (Εικ. 1Α). προσδιορισμοί ΜΤΤ έδειξε ότι η συνεργιστική δράση της γενιστεΐνης και HCPT ήταν εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση (Σχ. 1 Β).

A. ΜΤΤ δοκιμασία κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης και κυττάρων BDEC σε επεξεργασία με 10 μΜ γενιστεΐνης και /ή 1 μΜ HCPT? Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό κυττάρων ελέγχου. B. ΜΤΤ δοκιμασία κυττάρων TCCSup και BDEC υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις HCPT ή /και γενιστεΐνη για 48 ώρες. C. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου του TCCSup ή BDEC επεξεργασία με 1 μΜ HCPT ή /και 10 μΜ γενιστεΐνης για 24 ώρες. D. Η απόπτωση μετρήθηκε με FACS σε TCCSup, και BDEC υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μΜ γενιστεΐνης και /ή 1 μΜ HCPT. Οι τιμές είναι μέση ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? *

P

& lt? 0,05 και **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. #

P

& lt? 0,05 και ##

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με HCPT? @

P

& lt? 0.05 και @@ P & lt?. 0.01 σε σύγκριση με genistein

Η

2. Synergistic διακοπή του κυτταρικού κύκλου με HCPT και γενιστεΐνη

Τόσο HCPT (1 μm) και γενιστεΐνη (10 μm) για μια περίοδο 24 ωρών έδειξε μία στατιστικά σημαντική ικανότητα να συλλάβει τον κυτταρικό κύκλο (Σχ. 1 C). Σε σύγκριση με το όχημα, HCPT προκάλεσε διακοπή του κυτταρικού κύκλου, τόσο στην φάση S (έλεγχος: 57,6%, HCPT: 46,5%, genistein: 57,9%, HCPT + genistein: 31,1% για τα κύτταρα TCCSup? Έλεγχος: 57,2%, HCPT: 43.1 %, genistein: 53,6%, HCPT + genistein: 29,1% για τα κύτταρα BDEC) και η φάση G2-M (έλεγχος: 21,5%, HCPT: 30,6%, genistein: 22,1%, HCPT + genistein: 41,6% για τα κύτταρα TCCSup? ελέγχου : 21,7%, HCPT: 30,3%, genistein: 26,7%, HCPT + genistein: 36,3% για τα κύτταρα BDEC). Παρά το γεγονός ότι η γενιστεΐνη (10 μm) από μόνη της δεν επηρέασε τον κυτταρικό κύκλο σημαντικά σε σύγκριση με τους ελέγχους, η προσθήκη της γενιστεΐνης να HCPT επεξεργασμένα κύτταρα (1 μm) ευαισθητοποιημένα σημαντικά τα κύτταρα να HCPT μέσω επαγωγής G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου.

3. Συνεργική επαγωγή απόπτωσης με HCPT και γενιστεΐνη

Χρησιμοποιώντας FACS για την ποσοτικοποίηση της απόπτωσης, παρατηρήσαμε ότι 10 μΜ γενιστεΐνης και 1 μΜ HCPT συνεργικά και δοσοεξαρτώμενο απόπτωση που επάγεται σε καρκινικά κύτταρα κύστης (Σχ. 1D). Η επαγωγή της απόπτωσης ήταν δοσοεξαρτώμενη και συσχετίζεται άμεσα με μια αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης (Εικ. 1 Β, D).

4. ενεργοποίηση ATM NBS1-εξαρτώμενη προκαλείται από βλάβες του DNA

Τα αποτελέσματα που περιγράφονται στην ενότητα 3.3 αναφέρεται ότι η genistein μπορεί να δρουν συνεργικά με HCPT να επάγει απόπτωση. Όπως προαναφέρθηκε, HCPT θα μπορούσε να προκαλέσει κυτταρική απόπτωση μέσω της επαγωγής διπλής διαλείμματα σκέλος (DSB) στο DNA. Συνεπώς, διερευνήσαμε αν αυτό συνέργεια της απόπτωσης σχετίζεται με DSB. κύτταρα TCCSup υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ HCPT και /ή 10 μΜ γενιστεΐνης για 1 ώρα, και της συνολικής πρωτεΐνης από κάθε ομάδα εκχυλίστηκε και υποβλήθηκε σε κηλίδωση Western για την πρωτεΐνη ιστόνης χρωμοσωμικές, γ-Η2ΑΧ [19]. Το στύπωμα Western κατέδειξε ότι HCPT και γενιστεΐνη μπορεί να συνεργικά διεγείρει φωσφορυλίωση Η2ΑΧ σε 1 ώρα μετά την φαρμακευτική αγωγή, η οποία έδειξε ότι τα φάρμακα αυτά θα μπορούσαν να επάγουν DSB. Επιπλέον, η ισχυρή φωσφορυλίωση Η2ΑΧ μπορούσε ακόμα να δει στο συν-θεραπεία ομάδα 24 ώρες μετά την θεραπεία σε σύγκριση με τα κύτταρα χορηγούνται με μία μόνο φάρμακα, τα οποία έδειξαν μια καθυστερημένη διαδικασία επιδιόρθωσης βλαβών του DNA (Σχ. 2Α). Επιπλέον, 1 μΜ HCPT και 10 μΜ γενιστεΐνης ενεργοποιηθεί συνεργικά την φωσφορυλίωση ΑΤΜ σε Ser 794 σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 2Β). Η χωρική κατανομή των ΑΤΜ και γ-Η2ΑΧ μετά την αγωγή του φαρμάκου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα πολυπλεγμένο δοκιμασία ανοσοφθορισμού (Σχ. 2C). Σημαντικά περισσότεροι ATM και γ-Η2ΑΧ πυρηνικών εστίες παρατηρήθηκαν σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με TCCSup τόσο HCPT και genistein για 30 λεπτά σε σύγκριση με τον έλεγχο, και τα κύτταρα HCPT- genistein-θεραπεία. Επιπλέον, η θεραπεία με αυτά τα φάρμακα και οι δύο αύξησαν σημαντικά την συν-εντοπισμό των ΑΤΜ και γ-Η2ΑΧ στον πυρήνα του κυττάρου. Ο αναστολέας ΑΤΜ, Ku55933, μειώθηκε σημαντικά το σχηματισμό ATM εστίες, και ως εκ τούτου ανέστειλε γ-H2AX /ATM συν-εντοπισμό στην HCPT- και τα κύτταρα genistein-αγωγή (Σχ. 2C). Μια δοκιμασία ανοσοκαταβύθισης διεξήχθη για να διερευνήσει τον τρόπο ATM φωσφορυλιώνεται μετά HCPT και genistein θεραπεία. Η θεραπεία με τόσο HCPT και genistein ενεργοποιηθεί ΑΤΜ και προκαλείται από μια αλληλεπίδραση μεταξύ ATM /H2AX και NBS1 /H2AX στα κύτταρα TCCSup και BDEC. Ο αναστολέας NBS1, mirin, σημαντικά εξασθενημένη HCPT- ή /και genistein που προκαλείται από ΑΤΜ ή NBS1 και H2AX δεσμευτικός ως προς όλα HCPT- και τα κύτταρα genistein-αγωγή (Σχ. 2D).

Α. κηλίδα Western και ποσοτικοποίηση του Η2ΑΧ επιδιόρθωση του DNA βλάβη μετά την προεπεξεργασία των 10 μΜ γενιστεΐνης και /ή 10 μΜ HCPT. HP-1α χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης? Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε σχέση με την ομάδα ελέγχου σε 0 h. Β Western blot και ποσοτικοποίηση των ATM Ser 1981 φωσφορυλίωση μετά την προεπεξεργασία των κυττάρων TCCSup με 10 μΜ γενιστεΐνης και /ή 10 μΜ HCPT για 1 ώρα. C. Αντιπροσωπευτικές εικόνες και ποσοτικοποίηση της φωσφορυλίωσης και H2AX εστίες σχηματισμού ATM 30 λεπτά μετά την αγωγή των κυττάρων TCCSup με 1 μΜ HCPT ή /και 10 μΜ γενιστεΐνης? διακριτές εστίες ATM αυτοφωσφορυλίωσης εμφανίζονται σε υποθετικές θέσεις της διπλής διαλείμματα σκέλος. Δ Προσδιορισμός της αλληλεπίδρασης /H2AX ATM NBS1-εξαρτώμενη. κύτταρα και τα κύτταρα TCCSup BDEC υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ HCPT ή /και 10 μΜ γενιστεΐνης για 1 ώρα με ή χωρίς τον αναστολέα NBS1, mirin, ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-ATM ή αντι-NBS1 αντισώματα και ανοσοσύμπλοκα ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western. ATM εστίες αυξήθηκαν γραμμικά με τη δόση μετά από 1 ώρα genistein και θεραπεία HCPT. Οι τιμές είναι μέση ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? IP: ανοσοκατακρήμνιση, W: Δυτική κηλίδας. *

P

& lt? 0,05 και **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. #

P

& lt? 0,05 και ##

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με HCPT? @

P

& lt? 0.05 και @@ P & lt?. 0.01 σε σύγκριση με genistein

Η

5. αναστολή ATM ρυθμίζει προς τα κάτω NF-kB και επάγει την απόπτωση σε HCPT- και τα κύτταρα genistein επεξεργασμένα

Τα επίπεδα ενεργοποιηθεί, φωσφορυλιωμένη ATM ερευνήθηκαν σε κύτταρα TCCSup. TCCSup κύτταρα κατεργασμένα με 1 μΜ HCPT για 1 ώρες επέδειξε μία ισχυρή ιδιοσυστατική φωσφορυλίωση ΑΤΜ, η οποία θα μπορούσε να ανασταλεί από ATM siRNA ή τον συγκεκριμένο αναστολέα μικρού μοριακού ΑΤΜ, KU55933 (Εικ. 3Α). προσδιορισμοί ανοσοκαθίζησης έδειξαν ότι ΑΤΜ siRNA μείωσε δεσμευτικός ως προς όλα τα κύτταρα TCCSup ATM /NEMO? Ωστόσο, HCPT και γενιστεΐνη μπορεί να αυξήσει συνεργικά δέσμευσης (Σχ. 3Β) ATM /NEMO, η οποία έδειξε ότι NEMO διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην καταστολή της επαγόμενης HCPT ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ. Επιπλέον, η συνεργιστική αύξηση του ATM /NEMO δεσμευτικός HCPT- και τα κύτταρα genistein επεξεργασμένο συνοδεύτηκε από αυξημένη έκφραση ΙκΒα (Σχήμα 3C.) Και μειωμένο ΙΚΚ1 /2 φωσφορυλίωση (Σχήμα 3D.)? με τη σειρά του, αυτά που επάγεται την αυξημένη διάσπαση της κασπάσης 3, κασπάσης 9 και PARP (Σχ. 3Ε).

A. Western blot της φωσφορυλίωσης ΑΤΜ σε κύτταρα TCCSup κατεργάστηκε με 1 μΜ HCPT για 1 ώρα επιμολυσμένα με μη φίμωση ελέγχου (NSC) siRNA, ATM siRNA ή σε επεξεργασία με τον αναστολέα ΑΤΜ, Ku55933 (10 μΜ, 2 ώρες). Β Ανοσοκαθίζηση και στύπωμα Western ΑΤΜ και NEMO σε κύτταρα επιμολυσμένα με TCCSup NSC siRNA ή ΑΤΜ siRNA, ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με 10 μΜ Ku55933, 10 μΜ γενιστεΐνης και /ή 1 μΜ HCPT. IP: ανοσοκατακρήμνιση, W: Δυτική κηλίδας. Γ EMSA blot της έκφρασης ΝΡ-κΒ σε κύτταρα TCCSup σε επεξεργασία με 10 μΜ γενιστεΐνης και /ή 1 μΜ HCPT παρουσία NSC siRNA και ATM siRNA. Δ Western blot του ΝΡ-κΒ, ΙΚΚ2, έκφραση ΙκΒα και /2 φωσφορυλίωση ΙΚΚ1 σε κύτταρα TCCSup σε επεξεργασία με 10 μΜ γενιστεΐνης και /ή 1 μΜ HCPT παρουσία NSC siRNA και ATM siRNA, υποδηλώνοντας ότι η γενιστεΐνη και HCPT επάγουν την φωσφορυλίωση της ΙΚΚ1 /2 και να αυξήσει την έκφραση ΙκΒα μέσω ΑΤΜ. Ε Western blot του PARP, κασπάσης 3 και κασπάσης 9 διάσπαση σε προϊόντα λύσης ολόκληρου κυττάρου παρασκευάστηκαν από κύτταρα TCCSup σε επεξεργασία με 10 μm γενιστεΐνη ή /και 1 μΜ HCPT παρουσία ATM siRNA ή Ku55933. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές, και παρόμοια αποτελέσματα λήφθηκαν σε κάθε επανάληψη.

Η

6. Η γενιστεΐνη εξασθενημένος HCPT επαγόμενη ΝΡ-κΒ-ενεργοποίηση και έτσι συνεργικά την απόπτωση που επάγεται in vivo

Για να επαληθευτεί η συνεργιστική ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη με η γενιστεΐνη και η HCPT σε καρκινικά κύτταρα κύστης, προσδιορίσαμε τα αποτελέσματά τους σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος του SCID ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με την κυτταρική σειρά καρκίνου TCCSup κύστης. Η γενιστεΐνη και HCPT εμφάνισαν μια συνεργιστική ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου σε ξενομόσχευμα (Σχ. 4Α). Επιπλέον, οι όγκοι που έλαβαν θεραπεία με HCPT έδειξαν ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ, ενώ η γενιστεΐνη εξασθενημένο αυτή την ενεργοποίηση (Σχ. 4Β). Μειωμένη ενεργοποίηση των κατάντη μορίων ΙΚΚ1 /2, αυξημένη φωσφορυλίωση του ΙκΒα και αυξημένη διάσπαση της κασπάσης 3, κασπάσης 9 και PARP παρατηρήθηκαν σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με genistein και HCPT (Εικ. 4C).

TCCSU καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρο όγκοι αφέθηκαν να καθορίσει για 22 ημέρες, στη συνέχεια τα ζώα εγχύθηκαν εντός του όγκου με 10 μΜ γενιστεΐνης και /ή 10 μΜ HCPT την ημέρα 0 και 7 της θεραπείας. Α καμπύλη ανάπτυξης TCCSup ξενομοσχεύματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε επεξεργασία με γενιστεΐνη και /ή HCPT? όγκος του όγκου εκφράζεται σε σχέση με το μέγεθος του όγκου κατά την έναρξη της θεραπείας. B. EMSA δοκιμασίας της έκφρασης ΝΡ-κΒ σε ξενομόσχευμα ιστούς όγκων από κάθε ομάδα. ανάλυση κηλίδος Γ Western φωσφορυλιωμένου ΙΚΚ1 /2, ΙΚΚ2, έκφραση ΙκΒα σε ιστούς ξενομοσχεύματος όγκου από κάθε ομάδα.

Η

Συζήτηση

Γενιστεΐνη θεωρείται ότι είναι ένα δυνητικά ιδανικό παράγοντα χημειοθεραπείας για καρκίνο της ουροδόχου κύστης, όπως είναι φυσικό, ασφαλές, με ελάχιστες παρενέργειες και σχετικά χαμηλό κόστος [20]. Προηγούμενες έρευνες έχουν δείξει ότι ισοφλαβόνης σόγιας, η οποία είναι παρούσα σε μεγάλες ποσότητες προϊόντων σόγιας, μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην αναστολή της ογκογένεσης [21]. Έχει επίσης δειχθεί ότι επάγει απόπτωση των κυττάρων μέσω μειώνοντας την έκφραση του προδρόμου 32 kDa κασπάσης 3 και αύξηση των επιπέδων της διασπώνται δραστικής μορφής της παρούσας κασπάσης [22]. Zhou et al. ανέφεραν ότι οι ισοφλαβόνες σόγιας και σόγιας φυτοχημικό συμπυκνώματα θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των ποντικού και ανθρώπου κυτταρικές γραμμές κύστη in vitro και in vivo με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο [23]. Προηγούμενες έρευνες αποκάλυψαν ότι η συνεργιστική ανασταλτική επίδραση της γενιστεΐνης και καμπτοθεκίνης σε καρκίνο του τραχήλου, κύτταρα καρκινώματος και ινοβλαστών ποντικού ωοθηκών προέκυψαν από την αναστολή της NF-κΒ μετατόπιση και την επαγωγή της G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης [16].

Είτε genistein θα μπορούσε να ευαισθητοποιήσει κύτταρα της ουροδόχου κύστης σε θεραπεία καμπτοθεκίνη δεν έχει μελετηθεί στο παρελθόν. Σε αυτή τη μελέτη, genistein και HCPT βρέθηκαν να αναστέλλουν την ανάπτυξη των πολλαπλών κυτταρικών σειρών καρκίνου της ουροδόχου κύστης και τον πρωταρχικό επιθηλιακών κύστη κυτταρική γραμμή BDEC (Εικ. 1Α). Η γενιστεΐνη και HCPT συνεργικά και την επιβίωση των κυττάρων με δοσοεξαρτώμενο τρόπο ανέστειλε την (Εικ. 1Β), που επάγεται G2 /M του κυτταρικού κύκλου σύλληψης (Σχ. 1C) και την απόπτωση (Σχ. 1D) στην κυτταρική σειρά καρκίνου TCCSup κύστης και BDEC κύστη επιθηλιακά κύτταρα. Όσον αφορά τον υποκείμενο μηχανισμό, η επαγωγή εξαρτάται από τη δόση συνεργική βλάβης του DNA από genistein και HCPT και ανασταλτική δράση τους επί της διαδικασίας επισκευής της βλάβης του DNA παρατηρήθηκε για μέχρι 24 ώρες, σε σύγκριση με γενιστεΐνη ή θεραπεία HCPT μόνο (Σχ. 2Α) . Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι δύο HCPT [24] και γενιστεΐνη [25] θα μπορούσε να αναστείλει άμεσα DNA τοποϊσομεράση Ι Υποθέτουμε ότι η επαγωγή της βλάβης του DNA από HCPT και genistein οφείλεται στην αναστολή τους στην τοποϊσομεράσης DNA και έτσι τα αποτελέσματά τους επί του σχηματισμού του η διχάλα αντιγραφής, το οποίο απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση.

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε τα κατάντη επιδράσεις σηματοδότησης των genistein- και HCPT που προκαλείται από βλάβη του DNA για να καθορίσει πώς η συνεργιστική επαγωγή της φωσφορυλίωσης ΑΤΜ σχετίζεται με την προ-αποπτωτική δράση τους. ATM κινάση είναι ένας βασικός ρυθμιστής που ενεργοποιείται από βλάβη του DNA [26]. Έχει αναφερθεί ότι συσχετίζεται στενά με την κυτταρική απόπτωση σε πολλαπλά καρκινικά κύτταρα. Zuco et al. ανέφεραν ότι το παράγωγο καμπτοθεκίνης, ST1968, μπορεί να διεγείρει απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης του ATM [27]. Kawakami et al. ανέφεραν ότι η δοξορουβικίνη μπορεί να επάγει απόπτωση σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος Α549 πνεύμονα μέσω ενεργοποίησης ATM [28]. Σε αυτή τη μελέτη, βρέθηκε ότι μια συνδυασμένη θεραπεία με genistein και HCPT συνεργικά επάγεται ATM Ser 1981 φωσφορυλίωσης (Εικ. 2Β) σε θέσεις βλάβης του DNA. Σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με genistein και HCPT, η αναστολή της ΑΤΜ με ειδικό αναστολέα του, Ku55933, ανέστειλε την φωσφορυλίωση του ΑΤΜ και Η2ΑΧ, και έτσι παρεμποδίζεται συν-εντοπισμό τους (Σχ. 2C).

NBS1 έχει αποδειχθεί να είναι το βασικό στοιχείο της MRE11 /RAD50 /NBS1 συγκρότημα, το οποίο σχηματίζει αμέσως μετά από ένα DNA DSB έντυπα για την πρόσληψη πρωτεϊνών που σχετίζονται με την επισκευή των κατεστραμμένων χώρων του DNA [29]. ΑΤΜ και NBS1 δύο συνδέονται με H2AX, μια πρωτεΐνη ικρίωμα σε περιοχές της βλάβης του DNA. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30], βρήκαμε ότι η ικανότητα της γενιστεΐνης και HCPT να επάγει συνεργικά βλάβη του DNA σε καρκινικά κύτταρα κύστης μέσω ενεργοποίησης ΑΤΜ εξαρτάται NBS1, όπως ο αναστολέας NBS1 mirin καταργηθεί ειδικά HCPT- και δεσμευτική genistein επαγόμενη ATM /Η2ΑΧ και NBS1 /Η2ΑΧ δέσμευσης (Σχ. 2D). Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι η συνεργιστική DNA επιζήμια επίδραση αυτών των δύο φαρμάκων οφείλεται στην αναστολή της ΑΤΜ, η οποία είναι NBS1-εξαρτώμενη. Η φωσφορυλίωση του ΑΤΜ θα μπορούσε να ενεργοποιήσει NF-κΒ μέσω μονοπατιού NEMO [31], που οδηγεί στην ενεργοποίηση και την έκφραση μιας ποικιλίας pro-πολλαπλασιαστική και αντι-αποπτωτικών γονιδίων, προστατεύοντας έτσι τα καρκινικά κύτταρα από την απόπτωση. NEMO πιστεύεται ότι είναι μια δεσμευτική πολυουβικιτίνης υπομονάδα, η οποία προσλαμβάνει ΙΚΚ σε γραμμικά ή Κ63-συνδεδεμένη ικριώματα πολυουμπικιτίνης που αποτελούν ως συνέπεια των γεγονότων σηματοδότησης υποδοχέα ξεκίνησε [32]. Ως εκ τούτου, μετά από κατεργασία με DNA τοξικών φαρμάκων, όπως HCPT, DSB επαγόμενη ενεργοποίηση ΑΤΜ, και ο μεταγενέστερος μονοπατιού ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται μέσω ΝΕΜΟ (Σχ. 3Β). Ωστόσο, η οδός ΝΡ-κΒ έχει δειχθεί ότι προστατεύει τα κύτταρα από την απόπτωση των κυττάρων, η οποία θα μπορούσε εν μέρει να εξασθενήσουν τις τοξικές επιδράσεις του HCPT. Στην έρευνά μας, genistein θεραπεία θα μπορούσε να αδρανοποιήσουν την οδό ΝΡ-κΒ σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης και των επιθηλιακών κυττάρων. Εν περιλήψει, κατά την κατεργασία HCPT, βλάβη του DNA μπορεί να επάγει φωσφορυλίωση ΑΤΜ, το οποίο ενεργοποιεί το μονοπάτι ΝΡ-κΒ να προστατεύουν τα κύτταρα από την απόπτωση. Ωστόσο, η ικανότητα πολλαπλών πρωτεάσης της γενιστεΐνης βοηθά να καταργήσει HCPT επαγόμενη ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ [33]. Η knockdown του ΑΤΜ μπλοκάρει τελείως την ικανότητα των HCPT και genistein για να επάγει την ενεργοποίηση του ΝΕΜΟ /ΙΚΚ (Εικ. 3D) και ανέστειλαν την διάσπαση της κασπάσης 3, κασπάσης 9 και PARP (Σχ. 3Ε). Αυτό έδειξε ότι η ATM διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην HCPT- και genistein-επαγόμενη απόπτωση.

Για να επιβεβαιώσετε τα συνεργιστικά αποτελέσματα της HCPT και genistein, πραγματοποιήσαμε in vivo πειράματα ξενομοσχεύματος. Σε ξενομοσχεύματα κυττάρων TCCSup αναπτύσσονται σε SCID ποντίκια, συνδυασμένη θεραπεία με ΕΠΕΤΚ και γενιστεΐνη συνεργικά ανάπτυξη ανέστειλαν όγκου (Σχ. 4Α). Αυτή η ενδοκυτταρική μοριακό γεγονός είναι σύμφωνα με τα προηγουμένως ανακαλυφθεί ευρήματα σε κύτταρα της κύστης. HCPT δείχθηκε να ενεργοποιεί NF-κΒ, η οποία αντισταθμίζεται από genistein σε ποντίκια SCID (Εικ. 4Β). Συν-θεραπεία με αυτά τα δύο φάρμακα ενεργοποιούνται συνεργικά ATM και ανέστειλαν ΙκΒα (Εικ. 4C).

Αυτή η έρευνα δείχνει ότι η ισοφλαβόνη, genistein, μπορούν να ενισχύσουν σημαντικά τις επιδράσεις του παράγοντα χημειοθεραπείας καρκίνου της ουροδόχου κύστης, HCPT, τόσο σε vivo και in vivo. Τα συνεργιστικά προ-αποπτωτικά αποτελέσματα αυτών των δύο φαρμάκων να προκαλέσουν περισσότερα ϋδΒδ και να καθυστερήσει τη διαδικασία επιδιόρθωσης βλαβών του DNA με την ενεργοποίηση του ATM /NBS1 /ΝΕΜΟ /ΙΚΚ οδού. Ωστόσο, ορισμένες πτυχές αυτού του μηχανισμού παραμένουν να διευκρινισθούν. Πρώτον, παραμένει άγνωστο το κατά πόσον η συνεργιστική DSB επαγωγική δράση του HCPT και genistein συμβαίνει μέσω παρεμβολής με την διχάλα αντιγραφής και toposoimerase I. Δεύτερον, είναι ακόμα ασαφές πως καθυστερεί η διαδικασία επιδιόρθωσης DSB, αν αυτό είναι μέσω της αναστολής της ομόλογης ανασυνδυασμού, ή η αναστολή της μη-ομόλογων τέλος ενώνει. Τρίτον, ο ρόλος του συνεργική αναστολή της NBS-1 ενεργοποίηση με HCPT και γενιστεΐνη στην δυσμορφία του συγκροτήματος MRN απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Στο τέλος, γενιστεΐνης είναι ένα πολύ γνωστό βοτανικό οιστρογόνων, και τα οιστρογόνα έχει δειχθεί ότι εκφράζεται σε κύστη μεταβατική καρκινικών κυττάρων, και ήταν αρνητική συσχέτιση με το βαθμό του όγκου [34]. Το αν η επίδραση των οιστρογόνων της γενιστεΐνης συσχετίζεται με την συνεργική δράση ανασταλτική ανάπτυξης παραμένουν για να εξερευνηθούν στο μέλλον.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι η genistein μπορεί να ευαισθητοποιήσει καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές γραμμές να ΕΠΕΤΚ, που οδηγεί σε μια συνεργιστική δόση εξαρτώμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού και την επαγωγή της διακοπής κύκλου κυττάρου και απόπτωση. Η γενιστεΐνη και ΕΠΕΤΚ επάγουν θραύσεις δίκλωνου DNA, η οποία οδηγεί στην συνεργική ενεργοποίηση των ΑΤΜ, εξασθενίζει NEMO /ΝΡ-κΒ /ΙΚΚ /κασπάσης μεταγωγής σήματος, και ως εκ τούτου προκαλεί απόπτωση τόσο in vitro όσο και in vivo. Η genistein θα μπορούσε επίσης να εξουδετερώσει HCPT επαγόμενη ενεργοποίηση μονοπατιού ΝΡ-κΒ, και έτσι εξασθενούν την αντι-αποπτωτική δράση του μονοπατιού ΝΡ-κΒ, όπως συνοψίζεται στο σχ. 5. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι, αν και οι υποκείμενοι μηχανισμοί απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση, η συνδυασμένη χορήγηση ΕΠΕΤΚ και genistein μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την θεραπεία του ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

ATM φωσφορυλιώνεται στις θέσεις της διπλής έλικος DNA διαλείμματα από NBS1 παρουσία φωσφορυλίωση Η2ΑΧ. Ενεργοποιημένος ATM μεταφέρεται στο κυτταρόπλασμα, και ενεργοποιεί NEMO, η οποία φωσφορυλιώνει ΙΚΚ1 /2. ΙΚΚ1 /2 ενεργοποιεί και ubiquitinizes ΙκΒα, οδηγώντας σε υποβάθμιση ΙκΒα. Αυτό διεγείρει την απελευθέρωση και μεταφορά του NF-κΒ στον πυρήνα, όπου συνδέεται με το DNA, ενεργοποιεί τη διάσπαση της κασπάσης και ενεργοποιεί την απόπτωση.

Η

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Claudia Buehnemann ( Πανεπιστήμιο της Οξφόρδης, Ηνωμένο Βασίλειο) για την άριστη τεχνική βοήθεια της.