Αφηρημένο

Ιστορικό

πρωτεΐνη Chromodomain-ελικάση-DNA-δεσμευτική 5 (CHD5 ) είναι ένα πρόσφατα ταυτοποιημένο ογκοκατασταλτικό που συχνά ρυθμίζεται προς τα κάτω σε μια ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων. προηγούμενη εργασία μας έδειξε ότι η χαμηλή έκφραση του CHD5 σε καρκίνο του παχέος εντέρου συσχετίζεται με CHD5 υποκινητή CpG νησιού υπερμεθυλίωση. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η επίδραση των microRNA-211 (miR-211) -regulated έκφραση CHD5 για ορθοκολικό ογκογένεση.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

miR-211 είχε προβλεφθεί να στοχεύσετε CHD5 από ανάλυση λογισμικού TargetScan. Ένα εκφράζουν σταθερά εξωγενές miR-211 ορθοκολικού καρκίνου κυτταρική γραμμή (HCT-116

miR-211) δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας βραδέος μεταγωγής και χρησιμοποιείται ως πρότυπο για

in vitro

και

in vivo

σπουδές. Το επίπεδο έκφρασης του miR-211 στο HCT-116

miR-211 κύτταρα ρυθμίζεται αυξητικά κατά 16 φορές σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα (HCT-116

διάνυσμα). Η εξωγενής miR-211 συνδέεται άμεσα με την 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) του mRNA CHD5, με αποτέλεσμα τη μείωση κατά 50% σε επίπεδο πρωτεΐνης CHD5 σε HCT-116

miR-211 κύτταρα. Τα επίπεδα του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την ανάπτυξη του όγκου, και η μετανάστευση των κυττάρων του HCT-116

κύτταρα miR-211 ήταν σημαντικά υψηλότερες από HCT-116

κύτταρα φορέα υπό αμφότερα

in vitro

και

σε vivo

συνθήκες, όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας τις μεθόδους της ΜΤΤ, σχηματισμό αποικιών, κυτταρομετρία ροής, δοκιμασία το μηδέν, και ξενομοσχεύματα όγκου, αντίστοιχα. Επιπλέον, βρήκαμε ότι επιβάλλεται έκφραση του miR-211 του HCT-116 κύτταρα ήταν σε θέση να μεταβάλει ρ53 συνδέονται με την πορεία ρυθμιστικές πρωτεΐνες, όπως MDM2, Bcl-2, Bcl-xL, και Bax.

Συμπέρασμα /Σημασία

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι CHD5 είναι ένας άμεσος στόχος της ρύθμισης miR-211. Η αναγκαστική έκφραση του miR-211 προάγει την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου τουλάχιστον εν μέρει από ρύθμιση προς τα κάτω του επιπέδου έκφρασης του καταστολέα όγκων CHD5. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν μια καλύτερη κατανόηση της σύνδεσης μεταξύ miR-211-ρυθμιζόμενη έκφραση CHD5 και λειτουργία CHD5 σε ορθοκολικό ογκογένεση

Παράθεση:. Cai C, Ashktorab Η, Pang Χ, Zhao Υ, Sha W, Liu Υ , et al. (2012) microRNA-211 Έκφραση Προωθεί τον καρκίνο του παχέος ανάπτυξη κυττάρων

In Vitro

και

In Vivo από

Στόχευση Ογκοκατασταλτικής CHD5. PLoS ONE 7 (1): e29750. doi: 10.1371 /journal.pone.0029750

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 5 του Οκτωβρίου 2011? Αποδεκτές: 3 Δεκέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 3 Γενάρη 2012

Copyright: © 2012 Cai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με τη χρηματοδότηση από το National Cancer Υγείας (CA118770 και CA102681) και το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων (RCMI 2 G12 RR003048), Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο εντοπισμός των γονιδίων του καρκίνου που σχετίζονται με την κατανόηση και τη συμβολή τους στην ογκογένεση είναι κρίσιμα βήματα για τον έλεγχο του καρκίνου. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση γονιδίου μπορεί να επηρεαστεί από αλλαγές στη δομή της χρωματίνης και τη σύνδεση του DNA με νουκλεοσώματα [1]. Για παράδειγμα, Swi /Snf πρωτεΐνες μπορούν να προκαλέσουν ΑΤΡ-εξαρτώμενη διαταραχή της νουκλεοσώματος δομής σε έναν προαγωγό, ο οποίος ενισχύει την δέσμευση του παραγόντων μεταγραφής για θέσεις δέσμευσης τους [1]. Οι δράσεις αυτών των πρωτεϊνών μπορεί επίσης να οδηγήσει σε νουκλεοσώματος κίνηση και αλλαγές στην χρωματίνη διαμόρφωση, με αποτέλεσμα την έντονη μεταγραφική ενεργοποίηση (ή καταστολή) ενός γονιδίου ή περιοχής [1].

Chromodomain ελικάσης-δέσμευσης DNA-γονίδια ( CHD) κωδικοποιούν μία νέα κατηγορία πρωτεϊνών Swi /Snf που όχι μόνο περιέχουν ένα Swi /Snf πεδίο που ομοιάζει ελικάσης ΑΤΡάσης αλλά επίσης πρόσθετα λειτουργικά πεδία [2], [3]. Αυτές οι πρωτεΐνες έχουν έναν τομέα δέσμευσης DNA, καθώς και ένα μοτίβο chromodomain που μπορούν να επηρεάσουν άμεσα τη δομή της χρωματίνης και την γονιδιακή μεταγραφή. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι τα σύμπλοκα πρωτεΐνης CHD μπορεί να έχει βαθιά επίδραση στη δομή της χρωματίνης και της γονιδιακής έκφρασης. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξης, τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, και ογκογένεση [4]. CHD είναι ένα σούπερ οικογένεια που μπορεί να υποδιαιρεθεί σε πέντε υποοικογένειες με βάση την παρουσία ειδικών μοτίβων πρωτεΐνης, η οποία προσδίδουν σε κάθε οικογένεια πρωτεϊνών με μια μοναδική λειτουργία. CHD5 είναι πιο παρόμοιο με CHD3 και CHD4 στο ότι είναι περιέχει μοτίβα των φυτών ομοπεδίου. CHD5 ταυτοποιήθηκε πρόσφατα ως νέο καταστολέας όγκου που χαρτογραφεί προς 1ρ36, το οποίο συχνά διαγράφεται σε πολλούς τύπους ανθρώπινων καρκίνων [5], [6], και η δραστικότητα της χρωματίνης-αναδιαμόρφωση του CHD5 απαιτείται για την κατάλληλη μεταγραφική ενεργοποίηση του ρ19

ΑΠΦ /p53 οδό [7].

είναι σαφές ότι η ανεπάρκεια CHD5 είναι ένα κοινό αρχικό γεγονός στην καρκινογένεση στον άνθρωπο. CHD5 συχνά ρυθμίζεται προς τα κάτω μέσω υπερμεθυλίωση προαγωγού σε γαστρικό, μαστού, των ωοθηκών, και όγκους γλοιώματος [8], [9], [10], [11], υποδηλώνοντας επιγενετική αποσιώπηση με μεθυλίωση CHD5 μπορεί να συνεισφέρει στην ογκογένεση σε αυτούς τους ιστούς. Ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) είναι μία από τις τρεις πιο διαδεδομένες καρκίνους στις Ηνωμένες Πολιτείες [12] και CHD5 συχνά υπερμεθυλίωση σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου και πρωτογενείς όγκους [2], [13], [14].

Αν και υπάρχουν πολλές μελέτες σχετικά με την κατάσταση μεθυλίωσης του CHD5 σε διαφορετικούς τύπους όγκων, υπάρχουν λίγες μελέτες σχετικά με το πώς ένας άλλος σημαντικός επιγενετικές μηχανισμό, microRNAs (miRNAs), μπορεί επίσης να διαδραματίσει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανεπάρκεια CHD5 κατά τη διάρκεια του παχέος ογκογένεσης. miRNAs είναι μικρά, μη κωδικοποιητικού μόρια RNA σε ζώα, τα φυτά και οι ιοί που εμπλέκονται κατά κύριο λόγο στη γονιδιακή σίγηση από ατελή ζευγάρωμα βάσης με τις 3′-αμετάφραστες περιοχές (3′-UTR) του ειδικού mRNA, το οποίο επάγει αποικοδόμηση του mRNA [ ,,,0],15]. Τα χαλαρά δεσμευτική περιορισμοί επιτρέπουν miRNA να δεσμεύονται σε διάφορες τοποθεσίες μέσα σε μία 3′-UTR και σε πολλαπλούς στόχους mRNA εντός του μεταγραφικό, προσδίδοντας miRNAs με την ικανότητα να αναστέλλουν διάφορα γονίδια ταυτόχρονα [16]. Πολλές miRNAs συντηρημένα σε όλη την ευρέως ποικίλα φύλα, δείχνει φυσιολογική σημασία τους [15]. miRNAs διαδραματίζουν βασικό ρόλο στη ρύθμιση διάφορες κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης, της κυτταρικής ανάπτυξης, την απόπτωση, ιογενής λοίμωξη, και το μεταβολισμό [17].

Μερικά από τα miRNAs που απορυθμίζεται σε λειτουργία τον καρκίνο ως καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια [18]. Αρκετές τέτοιες miRNAs έχουν ταυτοποιηθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου, περιλαμβανομένης της προς τα πάνω ρυθμισμένη miR-31, miR-96, miR-135b, και miR-183 και το μειωτικά miR-133Β και miR-145 [19]. Από miRNAs δεσμεύουν το 3′-UTR των mRNA στόχου τους με βάση την αντιστοίχιση, η περιοχή της συμπληρωματικότητας μεταξύ ενός miRNA και στόχου mRNA της είναι μικρό. Αυτή η περιοχή περιλαμβάνει τα νουκλεοτίδια 2-7 από το 5′-άκρο του miRNA και αναφέρεται ως περιοχή «σπόροι» [20]. Διαφορετικές υπολογιστικές προσεγγίσεις έχουν αναπτυχθεί για να προβλέψουμε θέσεις στόχους miRNA σε όλο το γονιδίωμα [21]. Με τη χρήση των εργαλείων πληροφορικής Miranda, PicTar, και TargetScan, miR-211 είχε προβλεφθεί να ζευγών βάσεων με το 3′-UTR του CHD5, αλλά

in vitro

και

in vivo

πειράματα είναι απαραίτητα να επιβεβαιώσει αν miR-211 στοχεύει στην πραγματικότητα CHD5.

στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε ο ρόλος του miR-211 για καρκίνο του παχέος εντέρου κυττάρων μέσω αρνητική ρύθμιση της CHD5

in vitro

και

in vivo

. Πρώτον, εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης του miR-211 και CHD5 στις ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές RKO και ΗΟΤ-116. Στη συνέχεια επιλέγεται HCT-116 και καθιέρωσε το miR-211-σταθερά επιμολυσμένη κυτταρική σειρά HCT-116

miR-211. Τέλος, χρησιμοποιήσαμε αυτό το κελί γραμμή για να εκτελέσει μια σειρά από

in vitro

και

in vivo

πειράματα προκειμένου να προσδιοριστεί αν το miR-211 στόχους CHD5.

Αποτελέσματα

τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης CHD5 και miR-211 συσχετίζεται αντίστροφα σε κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπινου κόλον

miR-211 επιλέχθηκε ως υποψήφια miRNA για στόχευση CHD5 λόγω ατελούς ζευγάρωμα βάσεων της προς το 3 ‘ -UTR του CHD5 (Εικ. 1Α). Ερευνήσαμε το επίπεδο έκφρασης του miR-211 σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές από ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR (Σχ. 1Β). Για να επιλέξετε τις κατάλληλες κυτταρικές σειρές για τη μελέτη μας, αξιολογήσαμε το επίπεδο της CHD5 πρωτεΐνης σε κυτταρικές σειρές καρκίνου τέσσερις παχέος εντέρου με ανάλυση Western blot (Εικ. 1Γ), η οποία περιελάμβανε δύο προηγουμένως καθιερωμένες κυτταρικές σειρές (RKO και HCT-116) και δύο CHD5 διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές (ΚΚΟ-S και RKO-AS). Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι HCT-116 είχε την υψηλότερη έκφραση της CHD5 και RKO είχε τη χαμηλότερη έκφραση του CHD5. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα HCT-116 και RKO σειρές χρησιμοποιήθηκαν για μεταγενέστερα πειράματα. Βρήκαμε μια αντίστροφη συσχέτιση της CHD5 και την έκφραση του miR-211 (Εικ. 1D). Το επίπεδο έκφρασης του CHD5 σε HCT-116 ήταν 4 φορές υψηλότερη από ό, τι σε RKO, ενώ το επίπεδο έκφρασης της miR-211 σε HCT-116 ήταν μόνο το 20% αυτής στο RKO. Δεδομένου ότι HCT-116 κύτταρα είχαν τόσο το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης της CHD5 και το χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης του miR-211, αυτή η κυτταρική σειρά επελέγη ως υποψήφια κυτταρική γραμμή για την επιμόλυνση σταθερώς με miR-211 για περαιτέρω έρευνα σχετικά με την λειτουργία του miR-211 σε η ρύθμιση της έκφρασης CHD5 υπό συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων και ξενομοσχεύματος όγκου.

(Α) RNA αλληλουχία χάρτης της 3′-UTR του CHD5 (Gene ID 26038) mRNA με τη συμπληρωματική θέση (3′-UTR 130- 136) για την περιοχή σπόρο του miRNA-211. (Β) επίπεδα miR-211 στην RKO, HCT-116, RKO-S, και RKO-AS κυτταρικές σειρές από ποσοτική RT-PCR βασίζεται σε miR-211 /U6 τιμές φορές έκφρασης. (Γ) τα επίπεδα πρωτεΐνης CHD5 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές δύο κόλον (ΚΚΟ και HCT-116) και δύο καθιερωμένες κυτταρικές σειρές (ΚΚΟ-S και RKO-AS) με εκτέλεση έκφραση CHD5-S αναλύθηκαν με κηλίδα Western και ημι ποσοτικά με βάση την CHD5 /σχετικές εντάσεις β-ακτίνης. Bio-Rad Ποσότητα Ένα λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για πυκνομετρική ανάλυση των κηλίδων Western. (D) Σύγκριση CHD5 και τα επίπεδα έκφρασης miR-211 σε κυτταρικές γραμμές RKO HCT-116 και. * Υποδεικνύεται ως Ρ & lt?. 0.05

Η

Σταθερά επιβληθεί έκφραση του miR-211 ρυθμίζει προς τα κάτω άμεσα τα επίπεδα της πρωτεΐνης CHD5 στα κύτταρα HCT-116

Για να διερευνήσει το ρόλο του miR-211 στην η προς τα κάτω ρύθμιση των CHD5 υπό συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας, κατασκευάσαμε μία κυτταρική γραμμή HCT-116 που εκφράζεται σταθερά miR-211 χρησιμοποιώντας ένα σύστημα λεντοϊού παράδοσης για την εισαγωγή μιας κασέτας έκφρασης με ένα

υποκινητή CMV, EGFP, και πρόδρομος P miR-211 (Εικ. 2Α). Κατασκευάσαμε επίσης μία κυτταρική σειρά HCT-116, HCT-116

VEC, ότι εκφράζονται σταθερά τον φορέα ελέγχου GFP. Δεκατέσσερις ημέρες μετά την μόλυνση λεντοϊού, σχεδόν όλα τα κύτταρα HCT-116 είχε ανιχνεύσιμα επίπεδα πράσινου φθορισμού, η οποία είναι ένας δείκτης της αποδοτικής λοίμωξης. Η λεντοϊού-παραδοθεί έκφρασης EGFP-miR-211 ποσοτικά με πραγματικού χρόνου RT-PCR. έκφραση του miR-211 στο HCT-116

miR-211 αυξήθηκε κατά 16 φορές (

σ

& lt? 0,05). Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης της CHD5 μειώθηκε σημαντικά (Σχ. 2Β), με το επίπεδο πρωτεΐνης CHD5 σε HCT-116

κύτταρο miR-211 σε μόλις 50% αυτής στο HCT-116

vec κύτταρα (Σχ . 2C). Επιπλέον, CHD5 επιβεβαιώθηκε ως άμεσο στόχο του miR-211 με δοκιμασία λουσιφεράσης. δραστηριότητα φθορισμού μειώθηκε πάνω από 90% μετά από κύτταρα 293Τ συν-επιμολύνθηκαν με το φορέα έκφρασης miR-211 και 3′-UTR του mRNA CHD5 φορέα αναφοράς λουσιφεράσης σε σχέση με το διάνυσμα 3′-UTR του CHD5 ρεπόρτερ λουσιφεράσης μόνο (Σχ. 2D).

(Α) Σχηματική αναπαράσταση του φορέα miR-211, το οποίο περιέχει μια κασέτα έκφρασης του Ρ

υποκινητή CMV, EGFP, και προδρόμου του miR-211 και ενός επιλεκτικού κασέτα του Ρ

PGK υποκινητή και Puro

r. επίπεδα (Β) πρωτεΐνη CHD5 σε κυτταρικές σειρές HCT-116

VEC και HCT-116

miR-211 αξιολογήθηκαν με στύπωμα Western και (C) ημι-ποσοτικοποιήθηκαν με βάση τις σχετικές εντάσεις /β-ακτίνης CHD5. (D) δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας κύτταρα ΗΕΚ 293Τ που επιμολύνθηκαν με είτε το λουσιφεράσης /3′-UTR miR-211 φορέα αναφοράς, ο φορέας miR-211, ή και τα δύο. Σχηματική αναπαράσταση του φορέα δημοσιογράφος και ανταποκριτής λουσιφεράσης φορέα ελέγχου λουσιφεράσης-CHD5 επίσης εισαχθεί. * Υποδεικνύεται ως Ρ & lt?. 0.05

Η

έκφραση Αναγκαστικές miR-211 αυξάνει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου

in vitro

Η

Η επίδραση του miR-211 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία σχηματισμού χρωματομετρικό και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με χρήση της ανάλυσης ΜΤΤ. HCT-116

VEC και HCT-116

miR-211 κύτταρα εμβολιάστηκαν σε ξεχωριστές πλάκες 6-φρεατίων και την ανάπτυξη των κυττάρων παρακολουθήθηκε καθημερινά με μικροσκόπιο για δέκα ημέρες μέχρις ότου οι αποικίες ήταν σαφώς ορατές με γυμνό μάτι. Όπως αναμενόταν, HCT-116

miR-211 κύτταρα εμφάνισαν σημαντικά αυξημένο πολλαπλασιασμό, οδηγώντας στο σχηματισμό περισσότερες αποικίες. Η ικανότητα σχηματισμού αποικιών των HCT-116

miR-211 κυττάρων ήταν 221% (

σ

& lt? 0,05) περισσότερο από ότι HCT-116

vec κύτταρα (Σχήμα 3Α.). Η δοκιμασία ΜΤΤ έδειξε ότι οι αναγκαστικές έκφραση του miR-211 στο HCT-116

miR-211 κύτταρα οδήγησε σε αύξηση κατά 30% του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με HCT-116

vec κύτταρα (Εικ. 3Β). Οι μετρήσεις του κυτταρικού κύκλου με FCM έδειξε ότι η αναλογία των κυττάρων στη φάση G1 μειώθηκαν κατά 53% (

ρ

& lt? 0,05), και ότι σε S φάση αυξήθηκε κατά 51% (

ρ

& lt ? 0,05) σε HCT-116

miR-211 κύτταρα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με HCT-116

vec κύτταρα (Σχήμα 3C, D).. Δοκιμάσαμε επίσης την επίδραση του miR-211 στην κυτταρική μετανάστευση με δοκιμασία μηδέν (Σχ. 4Α). Βρήκαμε ότι επιβάλλεται miR-211 έκφραση αυξήθηκε σημαντικά το δυναμικό των HCT-116 κυττάρων να μεταναστεύουν σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Τα κύτταρα HCT-116

miR-211 καλύφθηκαν κυρίως μετανάστευσαν στην περιοχή μηδέν κατά το χρόνο αναφοράς 5 ώρες, και τα κύτταρα σχεδόν πέρασε πάνω από την περιοχή μηδέν κατά το χρόνο 24 ώρες (Σχ. 4Α). Υπήρξε περίπου 42,2% περισσότερα κύτταρα στην περιοχή μηδέν της HCT-116

πλάκα κυττάρων miR-211 από HCT-116

vec κύτταρα (Εικ. 4Β).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η κυτταρική βιωσιμότητα καλλιεργημένα HCT-116

vec και HCT-116

κυτταρικές σειρές miR-211 συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας (Α) δοκιμασία σχηματισμού αποικιών, (Β) δοκιμασία ΜΤΤ, και (Γ και Δ) τα προφίλ του κυτταρικού κύκλου και η κατανομή των κυττάρων σε G1, S, G2 και Μ φάσεις, για κάθε ομάδα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από δύο ανεξάρτητα πειράματα με τριπλούν και * υποδεικνύεται ως Ρ & lt?. 0.05

Η

(Α) Οι γρατσουνιές ανοικτές περιοχές παρατηρήθηκαν σε ώρες 0, 5, 8, και 24 για HCT-116

vec και HCT-116

κυτταρικές σειρές miR-211 κάτω από ένα οπτικό μικροσκόπιο σε μεγέθυνση × 400. (Β) Τα κύτταρα μετρήθηκαν από τα διάφορα χρονική περίοδο στο ίδιο μέγεθος της περιοχής μηδέν ως αναφορά στο χρόνο 0 ώρες. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης μηδέν ήταν από δύο ανεξάρτητα πειράματα με τριπλότυπα και * υποδεικνύεται ως Ρ & lt?. 0.05

Η

Αναγκαστικές miR-211 αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου

in vivo

Εκτός από την εξέταση των βιολογικών λειτουργιών του miR-211

in vitro

, αξιολογήσαμε επίσης το

in vivo

λειτουργία των miR-211 χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο μεταμόσχευσης ξένου μοσχεύματος. Με υποδόρια μεταφύτευση την HCT-116

VEC ή HCT-116

miR-211 κυττάρων σε γυμνά ποντίκια, παρακολουθήσαμε την ανάπτυξη του όγκου σε μια περίοδο 6 εβδομάδων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, μετά από 6 εβδομάδες ένας συμπαγής όγκος σχηματίστηκε στο δεξί πλευρό του καθενός από τους ποντικούς με το μέσο μέγεθος των 284 mm

3 και ένα μέσο βάρος 0,592 g. Ωστόσο, πολύ μικρότερους όγκους σχηματίστηκαν στο αριστερό πλευρό με ένα μέσο μέγεθος των 13,55 mm

3 και το μέσο βάρος των 0.028 g, γεγονός που υποδηλώνει ότι miR-211 αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου

in vivo

.

(Α) Η ανάπτυξη των όγκων ξενομοσχεύματος των HCT-116 και HCT-116

miR-211 εμφανίζονται στο πλαίσιο ενός συστήματος απεικόνισης φωτός και φθορισμού. Η μάζα του όγκου (g) μετρήθηκε με την τελική πειραματική ημέρα αμέσως μετά ο ιστός του όγκου αφαιρέθηκε από το ποντίκι με χειρουργική εκτομή. ανάπτυξης ξενομόσχευμα όγκου για HCT-116 και HCT-116

miR-211 ομάδες συγκρίθηκε. (Β) Η ημέρα ενοφθαλμισμό των κυττάρων ήταν η πειραματική ημέρα έναρξης και όλοι οι ποντικοί θανατώθηκαν την ημέρα 43. Η ανάπτυξη στερεών ξενομοσχευμάτων όγκου παρακολουθήθηκε μία φορά την εβδομάδα και μετρήθηκε χρησιμοποιώντας παχύμετρο.

Η

εξαναγκαστικές έκφραση του miR-211 μεταβάλλει την έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την ανάπτυξη και ρ53 πρωτεϊνών που σχετίζονται με μονοπάτι

τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών κυτταρικής επιβίωσης-υποστήριξης Bcl-2 και Bcl-xL σε HCT-116

ΜΙΚ 211 αυξήθηκαν κατά 37% και 29%, αντίστοιχα, ενώ το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης θανάτου προάγουν Bad μειώθηκε κατά 22% (Σχ. 6Α, Β). Η έκφραση της Mdm-2, ένας αρνητικός ρυθμιστής της ρ53, αυξήθηκε κατά 33% σε HCT-116

miR-211 κυττάρων σε σύγκριση με HCT-116

VEC κύτταρα. Ωστόσο, η έκφραση της ρ53 και του γονιδίου-στόχου του Βαχ μειώθηκε κατά 18% και 51%, αντίστοιχα (Σχ. 6C, D).

(Α) Τα επίπεδα των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την ανάπτυξη των κυττάρων σε HCT-116

vec και HCT-116

κυτταρικές σειρές miR-211 αναλύθηκαν με κηλίδα Western και (Β) ημι-ποσοτικά με βάση στοχευμένες /σχετικές εντάσεις β-ακτίνης πρωτεΐνης. Τα επίπεδα του ρ53 πρωτεϊνών που σχετίζονται με μονοπάτι σε HCT-116

VEC και HCT-116

κυτταρικές σειρές miR-211 αναλύθηκαν με κηλίδα Western (C) και ημι-ποσοτικοποιήθηκαν με βάση στοχευμένες /σχετικές εντάσεις β-ακτίνης πρωτεΐνη (D).

η

Συζήτηση

CHD5 είναι ένα πρόσφατα εντοπίστηκαν ογκοκατασταλτικό γονίδιο [2] που βρίσκεται στο 1ρ36 [7]. μειωμένη έκφραση του εμφανίζεται σε πολλούς τύπους όγκων λόγω υπερμεθυλίωση προαγωγέα του [8], [9], [11]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι CHD5 ρυθμίζει θετικά ρ53-διαμεσολαβούμενη οδούς. Η ρύθμιση προς τα κάτω και υπερμεθυλίωση των CHD5 έχει βρεθεί σε CRC [2], [13], [15]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το αν miRNAs, μια άλλη πτυχή της επιγενετικής ρύθμισης, η έκφραση CHD5 επιπτώσεων και του φαινοτύπου των κυττάρων CRC.

Είναι

miRNAs προβλέπεται να ρυθμίσει πάνω από 30% του συνόλου των γονιδιακής έκφρασης και μπορεί να ευθύνεται για ορισμένα από τα έκτροπη γονιδιακή έκφραση σε καρκινικά κύτταρα. Χρησιμοποιήσαμε εργαλείων βιοπληροφορικής και διαπίστωσε ότι miR-211 προβλέπεται να ζευγών βάσεων στην 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) του CHD5 (Εικ. 2Α). miR-211 είναι σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε άλλους τύπους καρκίνου [22] και μπορεί να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο, το οποίο είναι σύμφωνο με τη λειτουργία καταστολέα όγκου του CHD5. Ωστόσο, αν miR-211 στοχεύει άμεσα CHD5 και επηρεάζει τον φαινότυπο των κυττάρων από το έντερο χρειάζεται να επιβεβαιωθεί. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι επιβάλλεται έκφραση του miR-211 σε ένα καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή ρυθμίζει προς τα κάτω απ ‘ευθείας CHD5, με αποτέλεσμα την αύξηση της βιωσιμότητας των κυττάρων, στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, και την ικανότητα της μετανάστευσης και μειωμένη απόπτωση. Επιβεβαιώσαμε τα αποτελέσματά μας σε διάφορα επίπεδα, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής καλλιέργειας, ξενομοσχεύματα όγκου, και οι αλλαγές πρωτεΐνη στα μονοπάτια CHD5 σχετίζονται.

Έχουμε δημιουργήσει με επιτυχία μια κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου, που εκφράζεται σταθερά EGFP-miR-211, HCT- 116

miR-211, χρησιμοποιώντας σταθερή τεχνολογία γονιδιακής επιμόλυνσης (Εικ. 2Α). RKO και HCT-116 είναι και οι δύο ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. CHD5 ήταν ταπεινός εκφράζεται σε RKO και εντόνως εκφρασμένα σε HCT-116 κύτταρα [14]. Τα επίπεδα έκφρασης των CHD5 και miR-211 στην RKO, RKO-S, RKO-AS, και HCT-116 ανιχνεύθηκαν με κηλίδα Western και σε πραγματικό χρόνο PCR. Ενώ RKO-S είναι CHD5-σταθερώς επιμολυσμένη κυτταρική γραμμή, HCT-116 είχε το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης του CHD5. Δεδομένου ότι HCT-116 είχε επίσης το χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης του miR-211, επιλέξαμε αυτό το κυτταρική σειρά για να επιμολύνει σταθερά με το miR-211 (Εικ. 1D). Ιδρύσαμε την επιτυχή επιβολή έκφρασης EGFP-miR-211 στην κυτταρική σειρά παχέος εντέρου HCT-116

miR-211, χρησιμοποιώντας το σύστημα έκφρασης Lenti-X ™ λεντοϊών. Ιδρύσαμε επίσης μια κυτταρική γραμμή επιμολυσμένα με τον άδειο φορέα EGFP, HCT-116

vec. Εφόσον το γονίδιο EGFP μοιράζεται το ίδιο Ρ

CMV προαγωγού με το γονίδιο miR-211, ήμασταν σε θέση να παρακολουθούν εύκολα miR-211 έκφραση στα κύτταρα κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Δεδομένου ότι η έκφραση του miR-211 σε HCT-116 και HCT-116

vec κύτταρα ήταν παρόμοια, HCT-116

vec χρησιμοποιήθηκε ως η κυτταρική γραμμή ελέγχου για τα ακόλουθα πειράματα. Το επίπεδο έκφρασης του miR-211 ήταν 15 φορές υψηλότερη σε HCT-116

miR-211 κυττάρων σε σύγκριση με HCT-116

veccells.

Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης CHD5 μειώθηκε σημαντικά σε HCT-116

miR-211 κυττάρων σε σύγκριση με HCT-116

vec κύτταρα (Εικ. 2Β, C). Η αναγκαστική έκφραση του miR-211 σε HCT-116 κύτταρα αυξημένο πολλαπλασιασμό, σχηματισμό αποικίας, βιωσιμότητας (Σχ. 3), και την ικανότητα μετανάστευσης (Εικ. 4)

in vitro

. Κυττάρων διέλευση από G0 /G1 στην S φάση επιταχύνθηκε (Σχ. 3C, D) και την έκφραση των πρωτεϊνών επιβίωση-υποστηρικτικού κυττάρου Bcl-2 και Bcl-xL αυξημένη ενώ η έκφραση της πρωτεΐνης θανάτου προάγουν Bad μειώθηκε (Σχ. 6Α, Β ). Προς τα πάνω ρύθμιση του miR-211 ενισχύεται τον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων μπορεί να γίνει με ρύθμιση προς τα κάτω CHD5 (Σχ. 2D) και προωθείται η ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Έξι εβδομάδες μετά από υποδόρια μεταμόσχευση HCT-116

miR-211 και HCT-116 κυττάρων σε γυμνά ποντίκια, HCT-116

miR-211 αναπτύχθηκε σε όγκους με ένα μέσο βάρος 0,592 g ενώ HCT-116 κύτταρα σχηματίζονται μόνο πολύ μικρότερους όγκους με ένα μέσο βάρος 0,028 g. Λαμβάνοντας λογαριασμούς που HCT-116 και HCT-116

vec δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές στην βιολογική συμπεριφορά, τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ότι το miR-211 προάγει την ανάπτυξη του όγκου των ξενομοσχευμάτων

in vivo

(Εικ. 5 ).

Είναι ενδιαφέρον ότι, ρύθμιση προς τα κάτω του CHD5 με miR-211 επιπτώσεις ο φαινότυπος του ορθοκολικού κυτταρικής γραμμής επηρεάζοντας την έκφραση του p53 που σχετίζονται με πρωτεΐνες οδού (Σχ. 6C, D). ρ53 είναι ένα από τα πιο μελετημένα καταστολείς όγκων και πάνω από το 50% των ανθρώπινων όγκων φέρουν μεταλλάξεις απώλειας λειτουργίας [23]. ρ53 καταστέλλει ογκογένεση μέσω της επαγωγής των προγραμμάτων κυτταρικού κύκλου-σύλληψης ή απόπτωση σε απόκριση προς μια πληθώρα διαφορετικών σημάτων κυτταρικού στρες [24]. Η λειτουργία ογκοκατασταλτικό του p53 περιλαμβάνει επίσης άλλους μηχανισμούς, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης μεταβολικών οδών [25]. CHD5 φαίνεται να ρυθμίζει την καρκινογένεση μέσω ενός μονοπατιού ρ53 σχετίζεται [7]. Στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι προς τα πάνω ρύθμιση του miR-211 του HCT-116 κύτταρα είχαν ως αποτέλεσμα μειορύθμιση της CHD5, επηρεάζοντας την έκφραση αρκετών ρ53-ρυθμιζόμενη πρωτεΐνες οδού, συμπεριλαμβανομένης της Mdm-2, ρ53, και Bax. Το επίπεδο της Mdm-2, ένας αρνητικός ρυθμιστής της ρ53, αυξήθηκε ενώ τα επίπεδα του ρ53 και του γονιδίου-στόχου του, Βαχ, μειώθηκαν, υποδεικνύοντας ότι η ανεπάρκεια CHD5 διακυβεύει ρ53-ρυθμιζόμενη οδούς και διευκολύνει την ογκογένεση. Η κακοήθης φαινότυπος των κυττάρων HCT-116 αυξήθηκε κατά αυξητική ρύθμιση του miR-211 και την ενίσχυση του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των HCT-116 κυττάρων που μπορεί να εμπλέκεται μεταγενέστερες μεταβολές στην οδούς ρ53 που σχετίζονται. Περαιτέρω μελέτες θα χρειαστούν για να καθοριστεί αν η σηματοδότηση p53 που σχετίζονται είναι ο μοναδικός στόχος για miRNA-211 ρύθμιση των CHD5.

Στο σύνολό τους, η παρεκκλίνουσα έκφραση του miR-211 και την επακόλουθη αλλαγή στο επίπεδο της CHD5 συνδέονται με ορθοκολικό ογκογένεση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι επιβάλλεται η έκφραση του miR-211 στο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρική σειρά HCT-116 αύξησε την κακοήθη φαινότυπο των κυττάρων με απευθείας προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του CHD5 και μπορεί να είναι με ρύθμιση οδοί ρ53 που σχετίζονται. Συγκεκριμένα, επιβάλλεται η έκφραση του miR-211 ενισχυμένη προώθηση και τη μετανάστευση, μειωμένη απόπτωση, επιτάχυνε τη μετάβαση από G0 /G1 στην S φάση

in vitro

και ενισχυμένο πολλαπλασιασμό

in vivo

. Ωστόσο, δεδομένου ότι ένα ενιαίο miRNA μπορούν να διαμορφώσουν πολλές διαφορετικές στόχους οι άλλοι πιθανοί ρόλοι του miR-211 σε καρκίνο του παχέος εντέρου χρειάζεται περαιτέρω μελέτη. Επιπλέον, οι περισσότερες μελέτες που απαιτούνται για την επικύρωση της σχέσης μεταξύ miR-211 και CHD5 στην ανάπτυξη του ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου και πρόγνωση. Η μελέτη μας παρέχει μια καλύτερη κατανόηση της ρυθμιστικής ικανότητας του miR-211 στην προώθηση του παχέος ογκογένεση με τη στόχευση της έκφρασης CHD5.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό

Ανθρώπινο παχύ έντερο καρκινικές κυτταρικές γραμμές (RKO και HCT-116) και μία ανθρώπινη εμβρυϊκή νεφρική κυτταρική γραμμή (ΗΕΚ293Τ) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Χρησιμοποιήσαμε δύο CHD5-Sens και CHD5-antiSens ανάγκασε την έκφραση σταθερά καθορισμένες σειρές κυττάρων RKO (CHD5 ρυθμίζεται προς τα πάνω γραμμή κυττάρων RKO-S και αντι-νόημα της RKO-AS) [26]. RKO κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ και RKO-S και τα κύτταρα RKO-AS καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ που περιέχει 900 μg /ml G418. HCT-116 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α (ATCC). κύτταρα ΗΕΚ293Τ καλλιεργήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ? Gibco, USA). Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, και όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 και 95% υγρασία.

Προσδιορισμός των στόχων microRNA

Οι αλγόριθμοι της Miranda (https://www.sanger.ac.uk), PicTar (https://pictar.bio.nyu.edu), και TargetScan (http: //www.targetscan. org /) χρησιμοποιήθηκαν για να προβλεφθεί ποια ανθρώπινα miRNAs μπορεί να συνδέεται με το 3′-UTR του CHD5 (Gene ID 26038). Εν συντομία, αυτοί οι αλγόριθμοι παρέχουν 3′-UTR ευθυγραμμίσεις με προβλεπόμενες θέσεις και τις συνδέσεις με διάφορες δημόσιες βάσεις δεδομένων για την πρόβλεψη των θέσεων δέσμευσης των miRNAs.

εξόρυξη miRNA και ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA). Μια miR-211 προς τα εμπρός εκκινητή (5′-TTCCCTTTGTCATCCTTCGCCT-3 ‘) συντέθηκε στο Sigma (Woodlands, Τέξας). Ολικό RNA πολυαδενυλιωμένο από ροΙγΑ πολυμεράση από

Ε. coli

, και στη συνέχεια σύνθεση του πρώτου κλώνου cDNA και ποσοτική PCR διεξήχθησαν με το High-Ειδικότητα κιτ miRNA QRT-PCR ανίχνευσης (Stratagene, La Jolla, CA). Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) εκτελέστηκε σε ένα όργανο Mx3000P ™ (Stratagene Laboratory), με U6 ως εσωτερικό έλεγχο, λόγω της σταθερής έκφρασης του σε όλη ανθρώπινους ιστούς και κυτταρικές σειρές, όπως προτείνεται από τον κατασκευαστή και άλλοι ερευνητές [27]. Χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο της συγκριτικής κύκλο κατωφλίου (Ct) για τη μέτρηση της σχετικής αλλαγές στην έκφραση των miRNAs. Ct είναι ο αριθμός κύκλος στον οποίο το σήμα φθορισμού του οικοπέδου ενίσχυσης περνά ένα σταθερό κατώφλι. ΔCt = Ct (miR-211) -Ct (U6), ΔΔCt = ΔCt (vector) -ΔCt (miR-211). αξία έκφραση φορές = 2

-ΔΔCt. Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν. Ένα αρνητικό έλεγχο χωρίς μήτρα τρέχουν παράλληλα να εκτιμηθεί η συνολική ειδικότητα της αντίδρασης.

Σταθερή επιμόλυνση του miR-211

Εμείς τροποποίησε το εμπορικό φορέα pLVX-Tight-Puro (Clontech, Mountain View, CA) με μια κασέτα έκφρασης που περιέχει το P

CMV προαγωγό, EGFP, miRNA συνδετήρα, και προ-miR-211, αντικαθιστώντας το P

σφιχτό υποκινητή [28]. Ο συνδέτης miRNA περιείχε μια θέση πολλαπλής κλωνοποίησης. Η ακολουθία διπλό σκέλος προ-miR-211 σχεδιάστηκε με βάση miRBase Ακολουθία έκδοση της βάσης δεδομένων 12.0. Οι κατασκευασμένοι φορείς επαληθεύτηκαν με καθορισμό αλληλουχίας DNA. Τα ανασυνδυασμένα λεντοϊού σωματίδια που περιέχουν είτε τον φορέα miR-211 ή τον φορέα ελέγχου EGFP διαμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ 293Τ συσκευασίας με χρήση του συστήματος συσκευασίας HT lentiphos ™ και ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (Clontech, Mountain View, CA). HCT-116 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70-80% συρροή σε πλάκες 6-φρεατίων και μολύνθηκαν με 200 μΙ λεντοϊού που περιέχουν είτε τον φορέα miR-211 ή το φορέα ελέγχου για 2 ώρες. Στη συνέχεια, 2 ml μέσου McCoy 5Α με 10% FBS προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 48 ώρες, τα μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 5 μg /ml πουρομυκίνη για 4-5 περάσματα. Οι κυτταρικές σειρές που εκφράζουν σταθερά είτε miR-211 ή το φορέα ελέγχου δημιουργήθηκαν και τα μολυσμένα κύτταρα θα μπορούσαν να προβληθούν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού.

λουσιφεράσης δημοσιογράφος δοκιμασία

Μια δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης για να επαληθεύσει ότι η συμπληρωματική αλληλουχία του miR-211 συνδέεται με το 3′-UTR του CHD5 mRNA. Ένα θραύσμα CHD5 mRNA, η οποία περιελάμβανε θέση σύνδεσης miR-211 ήταν κλωνοποιήθηκε στον pHCMV-FSR φορέα αναφοράς λουσιφεράσης (Genlantis, San Diego, CA). κύτταρα ΗΕΚ 293Τ σπάρθηκαν σε πλάκα 24 φρεατίων, έτσι ώστε να ήταν 50% συρρέοντα κατά τη στιγμή της διαμόλυνσης. Ο φορέας αναφοράς λουσιφεράσης και είτε τον φορέα ελέγχου GFP ή miR-211 φορέας έκφρασης συν-επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ 293Τ χρησιμοποιώντας καθίζηση φωσφορικού ασβεστίου. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σε ζωντανά κύτταρα 48 ώρες αργότερα σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας απεικόνιση βιοφωταύγεια με όργανο Xenogren IVIS (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ).

3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2- υλ) 2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ)

Μία δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [29]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων με αρχική πυκνότητα 5,000 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από 72 ώρες, 200 μΐ διαλύματος ΜΤΤ (5 mg /ml, Sigma, St Louis, ΜΟ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C. Το υπερκείμενο στη συνέχεια απορρίφθηκε και 200 ​​μΐ διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για να διαλυθεί το ίζημα. Μετά από 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου οι πλάκες σαρώθηκαν φασματοφωτομετρικά με ένα αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-Rad, Hercules, CA) ρυθμισμένη σε 560 nm για τη μέτρηση της απορρόφησης. Κάθε δοκιμή επαναλήφθηκε σε πέντε φρεάτια.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Μια δοκιμασία σχηματισμού αποικιών διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [29]. Εν συντομία, HCT-116

VEC και HCT-116

miR-211 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας ιστού των 6 φρεάτων (Palo Alto, CA). Πεντακόσια κύτταρα HCT-116

VEC και HCT-116

miR-211 σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο εις τριπλούν, επωάστηκαν για 10 ημέρες, και οι αποικίες βάφτηκαν με 0.1% κυανούν τρυπανίου σε 50% αιθανόλη. Αποικίες που περιέχουν 50 ή περισσότερα κύτταρα μετρήθηκαν ως βιώσιμα κλωνογόνων κυττάρων. Τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα.

κυτταρικού κύκλου δοκιμασία

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Εν συντομία, HCT-116

VEC και HCT-116

miR-211 κυττάρων στην λογαριθμική φάση ανάπτυξης συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή αιθανόλη 75% και αποθηκεύεται στους -20 ° C για 24 ώρες. Μετά η αιθανόλη απομακρύνθηκε, τα κύτταρα επωάστηκαν με 1 mg /ml RNase Α σε PBS για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 επιπλέον λεπτά στο σκοτάδι σε 0,5 ml 50 mg /ml ιωδιούχου προπιδίου. Η κατανομή των κυττάρων σε όλο τον κυτταρικό κύκλο αναλύθηκε με Becton-Dickinson FACScan, και τα ιστογράμματα DNA αναλύθηκαν με τροποποιημένο λογισμικό. Κάθε δοκιμή επαναλήφθηκε εις τριπλούν.

Η

δοκιμασία μηδέν

Εν συντομία, μια ανοιχτή περιοχή ή «μηδέν» παρήχθη σε 90% HCT-116 μονοστοιβάδων κυττάρων

miR-211 χρησιμοποιώντας ένα 200 μl ρύγχος πιπέτας όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. HCT-116

miR-211 κύτταρα πλύθηκαν με PBS για την απομάκρυνση των εκτοπισμένων κυττάρων στην ανοικτή περιοχή, και καλλιεργήθηκαν σε McCoy 5Α για καθορισμένους χρόνους. HCT-116

vec είχαν υποστεί παρόμοια επεξεργασία και καλλιεργούνται σε McCoy 5Α. Μετανάστευση στην ανοιχτή περιοχή παρατηρήθηκε με γυμνό μάτι.

ανάλυση Western blot

HCT-116

vec και HCT-116

miR-211 κύτταρα πλύθηκαν με κρύο PBS και λύθηκαν σε RIPA ρυθμιστικό διάλυμα λύσης σε πάγο για 30 λεπτά.