Αφηρημένο

Το εκχύλισμα του τζίντζερ (

Zingiber officinale Roscoe

) και των μεγάλων πικάντικο συστατικά του, [6] -shogaol και [6] -gingerol, έχει αποδειχθεί ότι έχει αντι -proliferative επίδραση σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, η αντικαρκινική δραστικότητα του εκχυλίσματος τζίντζερ σε καρκίνο του παγκρέατος είναι ελάχιστα κατανοητή. Εδώ, αποδεικνύουμε ότι η αιθανόλη εκχυλίζονται ύλες τζίντζερ κατέστειλε πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και κατά συνέπεια προκαλούμενη τον θάνατο του ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων Panc-1. Ο υποκείμενος μηχανισμός συνεπάγεται autosis, ένα πρόσφατα χαρακτηρίζεται μορφή κυτταρικού θανάτου, αλλά δεν απόπτωση ή necroptosis. Το εκχύλισμα σημαντικά αύξησε την αναλογία LC3-II /LC3-Ι, μειωμένη πρωτεΐνης /ρ62 SQSTM1, και ενισχυμένη σχηματισμό κενοτοπίων του κυτταροπλάσματος σε κύτταρα Panc-1. Είναι ενεργοποιημένη ΑΜΡΚ, μια θετική ρυθμιστής της αυτοφαγία, και ανέστειλε την mTOR, μια αρνητική ρυθμιστή αυτοφαγικά. Οι αναστολείς αυτοφαγία 3-μεθυλαδενίνη και χλωροκίνη εμπόδισε μερικώς κυτταρικό θάνατο. Μορφολογικά, ωστόσο, ρήξη εστιακό μεμβράνη, την πυρηνική συρρίκνωση, εστιακή διόγκωση του περιπυρηνικών χώρου και ηλεκτρονίων πυκνά μιτοχόνδρια, τα οποία είναι μοναδικά μορφολογικά χαρακτηριστικά της autosis, παρατηρήθηκαν. Το εκχύλισμα ενισχυμένη αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), και το αντιοξειδωτικό Ν-ακετυλοκυστεϊνη εξασθενημένο κυτταρικό θάνατο. Η μελέτη μας έδειξε ότι η ημερήσια ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση του εκχυλίσματος σημαντικά παρατεταμένη επιβίωση (Ρ = 0,0069) σε ένα μοντέλο περιτοναϊκή διάχυση και κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο καρκίνου του παγκρέατος (Ρ & lt? 0,01) χωρίς σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες. Αν και [6] -shogaol αλλά όχι [6] -gingerol έδειξε παρόμοια αποτελέσματα, χρωματογραφικές αναλύσεις πρότεινε την παρουσία άλλων συστατικών (ες) ως δραστικές ουσίες. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το εκχύλισμα τζίντζερ έχει ισχυρή αντικαρκινική δράση έναντι του καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα επάγοντας ROS μεσολάβηση autosis και εγγυάται περαιτέρω έρευνα, προκειμένου να αναπτυχθεί ένα αποτελεσματικό υποψήφιο φάρμακο

Παράθεση:. Akimoto Μ, Iizuka Μ, Kanematsu R, Yoshida Μ, Takenaga Κ (2015) αντικαρκινική δράση της Τζίντζερ Απόσπασμα από κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος Κυρίως μέσω Reactive Oxygen Είδος Μεσολαβεί Autotic κυτταρικό θάνατο. PLoS ONE 10 (5): e0126605. doi: 10.1371 /journal.pone.0126605

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Guillermo Velasco, Πανεπιστήμιο Complutense, Ισπανία

Ελήφθη: 6 Γενάρη του 2015? Αποδεκτές: 5, Απριλίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 11 Μαΐου 2015

Copyright: © 2015 Akimoto et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από επιχορηγήσεις-in-Aid από: Σιμάνε Πανεπιστήμιο Project «SUIGANN» (https://www.shimane-u.ac .jp) (σε kt)? Επιστημονική έρευνα από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας, την Ιαπωνία (https://www.mext.go.jp) (δεν 25.430.110 σε ΚΤ.)? και την Ιαπωνία Ίδρυμα αρτηριοσκλήρωση Ερευνών (με ΚΤ). Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από την Υποστήριξη για το Super Επιστήμης Λύκεια από την Ιαπωνία Επιστήμης και Τεχνολογίας του Οργανισμού για Izumo Γυμνάσιο (https://rikai.jst.go.jp) (σε kt). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια πολύ επιθετική νεόπλασμα με πολλές χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία ανθεκτικά φαινοτύπων. Η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του παγκρέατος αυξάνεται ετησίως σε όλο τον κόσμο και γίνεται η τέταρτη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τον κόσμο. Πράγματι, ο εκτιμώμενος αριθμός των νέων περιπτώσεων καρκίνου του παγκρέατος ήταν 277.000 το 2008 και 338.000 το 2012, ενώ υπήρχαν και 266.000 θάνατοι από καρκίνο του παγκρέατος το 2008 και 331.000 θάνατοι από καρκίνο του παγκρέατος το 2012 [1, 2]. Καθώς η πλειονότητα των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος διαγιγνώσκονται σε ακατάλληλο στάδιο [3, 4], το συνολικό σχετικό ποσοστό επιβίωσης 5-ετών είναι χαμηλή, και ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης είναι μόνο 6 μήνες ακόμη και σε ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία ποιότητας. Για την απόκτηση νέων οδηγεί για την ανάπτυξη προληπτικών και θεραπευτικών στρατηγικών, πολλές ερευνητικές προσπάθειες έχουν επικεντρωθεί στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την εξέλιξη του καρκίνου του παγκρέατος [3, 4].

Ginger (

Zingiber officinale Roscoe

), ένα rhizomatous πολυετές φυτό, χρησιμοποιείται ευρέως ως καρύκευμα σε τρόφιμα και ποτά και χρησιμοποιείται κυρίως ως φάρμακο για πεπτικές διαταραχές, συμπεριλαμβανομένων δυσπεψία, ναυτία, γαστρίτιδα, έμετος, κολικούς, διάρροια και [5, 6]. εκχύλισμα Ginger και πικάντικη συστατικά του, όπως [6] -gingerol και [6] -shogaol, είναι επίσης γνωστό ότι εμφανίζουν πολλές βιολογικές επιδράσεις συμπεριλαμβανομένων αντι-φλεγμονή, αντιοξειδωτική και αντικαρκινική δράση [5, 6]. Λόγω της ισχυρής αντιφλεγμονώδους δραστικότητας του, το τζίντζερ επέστησε πρόσφατα την προσοχή ως θεραπεία για την οστεοαρθρίτιδα και τη ρευματοειδή αρθρίτιδα [7, 8]. Όσον αφορά την αντικαρκινική δράση, το τζίντζερ και τα συστατικά του έχουν αποδειχθεί ότι αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και διεγείρουν απόπτωση μιας ποικιλίας τύπων καρκινικών κυττάρων

in vitro

[9-15]. Επιπλέον, η χρήση του τζίντζερ για τη χημειοπρόληψη του καρκίνου του παχέος εντέρου έχει προσελκύσει την προσοχή [16-18]. Ωστόσο, η αντικαρκινική δράση του εκχυλίσματος τζίντζερ και των συστατικών του κατά του καρκίνου του παγκρέατος έχει φτωχά διερευνηθεί.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την αντικαρκινική δράση του εκχυλίσματος τζίντζερ κατά του καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα τόσο

in vitro

και

in vivo

και διερευνάται πιθανός μηχανισμός του. Εδώ, αναφέρουμε ότι το εκχύλισμα τζίντζερ οδηγεί στη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων και ανάπτυξη όγκου του Panc-1 κύτταρα κυρίως μέσω ROS μεσολάβηση autosis, ένα πρόσφατα χαρακτηριζόμενη μορφή κυτταρικού θανάτου.

Υλικά και Μέθοδοι

κύτταρα και κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος, Panc-1, AsPC-1, BxPC-3, Capan-2, CFPAC-1, MIAPaCa-2 και SW1990, και το ποντίκι παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, Panc02 , χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Panc-1 και MIAPaCa-2 κύτταρα ελήφθησαν από το RIKEN BRC Τράπεζας Κυττάρων (Tsukuba, Japan), και άλλες ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές παγκρεατικού αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA). κύτταρα Panc02 έγιναν ευγενώς από τον Dr. Τ Hollingsworth, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικού Κέντρου [19, 20]. κύτταρα Panc-1-Luc-ZsGreen και τα κύτταρα Panc02-Luc-ZsGreen εκφράζουν λουσιφεράση πυγολαμπίδας και ZsGreen καθορίστηκαν με λεντοϊού μεταγωγή του πλασμιδίου pHIV-Luc-ZsGreen, το οποίο έχει κατατεθεί με Addgene (https://www.addgene.org /Bryan_Welm /), και επακόλουθη κλωνοποίηση. Ανθρώπινο πνευμονικό κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα (HPAEpiC) αγοράστηκαν από ScienCell (Carlsbad, CA, USA) και διατηρήθηκαν σε κυψελιδικά μέσου επιθηλιακών κυττάρων (AEpiCM) συμπληρωμένο με ορό 2% εμβρυϊκό ορό (FBS), συμπλήρωμα ανάπτυξης επιθηλιακού κυττάρου (EpiCGS) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVEC) ελήφθησαν από την Lonza Walersville, Inc. (Walkersville, MD, USA) και αναπτύχθηκαν σε ΕΒΜ-2 συμπληρωμένο με EGM SingleQuats (Lonza). Μιτοχόνδρια DNA-λιγότερο Ρ29 (ρ

0P29) κύτταρα και τα κύτταρα cybrid P29mtP29 που είχαν εκ νέου με Ρ29 mtDNA σε ρ

0P29 κύτταρα ιδρύθηκε από τον Lewis κύτταρα Ρ29 καρκινώματος του πνεύμονα [21]. καρκινικά κύτταρα κόλου (ΟοΙο320ϋΜ, ΗΤ29, LoVo, LS174T, SW480, SW620) [22], γαστρικό καρκίνο κύτταρα (MKN1, ΜΚΝ45) [23], καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα (Α549, QG56, PC-10, το PC-1) [24 ], κύτταρα καρκίνου του μαστού (MCF7, ΒΤ549, MDA-MB-231, ΜϋΑ-ΜΒ-468) [25, 26], κύτταρα λευχαιμίας (ΤΗΡ-1, Κ562) [27], τα κύτταρα οστεοσαρκώματος (Saos-2) [28 ], του τραχήλου της μήτρας καρκινικά κύτταρα (HeLa) [29], τα κύτταρα ηπατώματος (HepG2) [30], τα κύτταρα ινοσαρκώματος (ΗΤ1080) [29], και καρκινώματος του κόλου κύτταρα ποντικού LuM1 που προέρχονται από κόλον 26 όγκου [31] χρησιμοποιήθηκαν επίσης σε αυτή τη μελέτη . ΗΤ29, LS174T, SW480, SW620 και ΜϋΑ-ΜΒ-468 αγοράστηκαν από την ATCC. MCF7 και ΗΤ1080 κύτταρα ελήφθησαν από την JCRB Τράπεζας Κυττάρων. ΤΗΡ-1 και Κ562 κύτταρα ευγενώς από το Δρ Γ Honma, Σιμάνε Πανεπιστήμιο Ιατρική Σχολή. Γαστρικό κυτταρικές σειρές καρκίνου του δόθηκαν από το Τμήμα Παθολογίας (Δρ Σ Morikawa), Σιμάνε Πανεπιστήμιο Ιατρική Σχολή. Άλλες κυτταρικές γραμμές που παρέχονται από τον Dr. Α Nakagawara, Chiba Cancer Center Research Institute. Τα χαρακτηριστικά των κυτταρικών γραμμών που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη περιγράφεται αλλού [19-31]. κυτταρικές σειρές λευχαιμίας καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI1640 που περιείχε 10% ορό απενεργοποιημένο με θερμότητα εμβρυϊκό ορό (FBS) και 40 μg /ml γενταμυκίνη. Άλλες κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) που περιέχει 10% FBS και 40 μg /ml γενταμικίνη σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 21% O

2/5% CO

2 (νορμοξία) ή 1% O

2.5% CO

2 (υποξία). Υποξικές συνθήκες καλλιέργειας επιτεύχθηκαν σε υγροποιημένη αυτόματη O

2 /CO

2 θερμοκοιτίδα (Wakenyaku, Κιότο, Ιαπωνία).

Αντιδραστήρια

[6] -Shogaol και [6 ] -gingerol αγοράστηκαν από TOKIWA φυτοχημικές CO., Ltd (Chiba, Ιαπωνία).

Παρασκευή του εκχυλίσματος τζίντζερ (SSHE)

Ξηρά σκόνη από τα τμήματα της ρίζας του Syussai Shoga (τζίντζερ Ιαπωνικά), η οποία καλλιεργούνται στην περιοχή Hikawa στο νομό Izumo, Shimane, εκχυλίζεται με αιθανόλη (10: 1? όγκος για το βάρος) για 20 λεπτά σε ένα λουτρό υπερήχων νερό. Η αιθανόλη εξατμίστηκε στους 80 ° C για να αποδώσει ένα ακατέργαστο εκχύλισμα αιθανόλης του τζίντζερ (που αναφέρεται ως SSHE). Το εκχύλισμα ζυγίστηκε και διαλύθηκε σε αιθανόλη ή διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) στην επιθυμητή συγκέντρωση.

Η κυτταρική ανάπτυξη και δοκιμασία βιωσιμότητας

Η κυτταρική ανάπτυξη και η βιωσιμότητα μετρήθηκε με τη χρήση του ΜΤΤ (3- (4 , 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου) δοκιμασίας. Εν συντομία, τα κύτταρα (2×10

4 κύτταρα /φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία εις τριπλούν σε 100 μΙ ϋΜΕΜ /10% FBS που περιείχαν διαφορετικές συγκεντρώσεις SSHE ή διαλύτη μόνο για την ενδεικνυόμενη περίοδο. Στο τέλος της επώασης, 10 μΐ ΜΤΤ (2,5 mg /ml) (Sigma-Aldrich Japan, Τόκιο, Ιαπωνία) προστέθηκε στα φρεάτια για να επιτραπεί ο σχηματισμός του ΜΤΤ φορμαζάνης κρυστάλλων για 4 ώρες. Αφού το μέσο απομακρύνθηκε, οι κρύσταλλοι διαλυτοποιήθηκαν σε 100 μΙ DMSO. Η απορρόφηση καταγράφηκε στα 550 nm. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε επίσης με trypan blue δοκιμή χρωστικής αποκλεισμό.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Panc-1 κύτταρα κατεργασμένα με SSHE για 20 ώρες σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη και αποθηκεύονται στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Τα στερεωμένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS Dulbecco (DPBS) και επωάστηκαν με 100 μg /ml RNase Α και 50 μg /ml ΡΙ (Sigma-Aldrich Japan). Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιώντας ένα ροής FACSCalibur κυτταρόμετρο (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).

Μέτρηση της μεμβράνης μιτοχονδρίων δυνητικών

δυναμικό της μεμβράνης μιτοχονδρίων παρακολουθήθηκε με την JC- 1 δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης Assay Kit (Cayman Chemical, Αηη Arbor, ΜΙ). Για αυτή τη δοκιμασία, 100 μl /ml του JC-1 Χρώση διάλυμα προστέθηκε σε Panc-1 κύτταρα κατεργασμένα με SSHE για 20 ώρες σε πλάκες των 6 φρεατίων, και τα κύτταρα επωάστηκαν για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με τρυψινοποίηση, πλένεται δύο φορές με το ρυθμιστικό δοκιμασίας, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε κυτταρομετρία ροής.

αννεξίνης V /ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση

Η Annexin V-FITC απόπτωση κιτ ανίχνευσης (BECKMAN COULTER Inc., Pasadena, CA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση αννεξίνης V ή /και ΡΙ-θετικά κύτταρα. Εν συντομία, τα κύτταρα Panc-1 πλύθηκαν με παγωμένο DPBS και στη συνέχεια βάφονται με Annexin V-FITC για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι και ΡΙ σε ρυθμιστικό δέσμευσης παγωμένο. Αννεξίνης V ή /και ΡΙ-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ροής FACS Calibur κυτταρόμετρο.

Μέτρηση της παραγωγής ROS

Η παραγωγή ROS παρακολουθήθηκε με κυτταρομετρία ροής με 2 ‘, 7’- dichlorodihydrofluorescein διοξεικό (H2DCFDA) (Molecular Probe-Life Technologies, Carlsbad, CA) και μιτοχονδριακή υπεροξειδική δείκτης MitoSOX Red (Invitrogen) ως ανιχνευτές. Εν συντομία, Panc-1 κύτταρα κατεργασμένα με SSHE επωάστηκαν με 10 μΜ από H2DCFDA ή 5 μΜ MitoSOX Red σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό για 10 λεπτά. Το μέσο αφαιρέθηκε και τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με μια σύντομη θεραπεία του 0,25% θρυψίνη σε ισορροπημένο διάλυμα άλατος Hank. Μετά την προσθήκη φρέσκου μέσου καλλιέργειας, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση, πλύθηκαν μία φορά με DPBS και εναιωρήθηκε σε DPBS. Ο φθορισμός παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας το κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur ή κάτω από ένα συνεστιακό λέιζερ μικροσκόπιο (Fluoview FV1000, τον Όλυμπο, το Τόκιο).

κηλίδωση Western

εκχυλίσματα κυττάρων παρασκευάστηκαν με λύση των κυττάρων με ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό, 0.1% δωδεκυλοθειικό νάτριο, 2 mM EDTA, κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και φωσφατάσης αναστολέα κοκτέιλ) σε πάγο για 20 λεπτά. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 12,000 χ

g

για 10 λεπτά στους 4 ° C, και τα υπερκείμενα χρησιμοποιήθηκαν για μεταγενέστερες αναλύσεις. SDS-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση πηκτής αναλύσεις και ανοσοαποτύπωμα έγιναν όπως περιγράφεται προηγουμένως [32]. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα μονοκλωνικά αντι-SQSTM1 /Ρ62 (D5E2, αραίωση 1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-LC3B (αραίωση 1: 1000, Cell Signaling), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-φωσφο- mTOR (S2481) (1: 1000 αραίωση, Cell Signaling), μονοκλωνικά αντι-mTOR (7C10, αραίωση 1: 1000, Cell Signaling), μονοκλωνικά αντι-φωσφο-AMPKα (T172) (40H9, αραίωση 1: 1000, Cell σηματοδότηση), και μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-AMPKα (23A3, 1: 1000 αραίωση, Cell Signaling). Τα δευτερεύοντα αντισώματα ήταν ΗΚΡ-συζευγμένα κουνέλι ή αντι-ποντικού IgG (1: 3000 αραίωση, Cell Signaling). Για τους ελέγχους φόρτωση, αντίσωμα αντι-β-ακτίνης (SC-47778, 1: 3000 αραίωση, Santa Cruz Biotechnology) χρησιμοποιήθηκε. Σήματα απεικονίστηκαν με τη χρήση ECL plus (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Οι μεμβράνες σαρώθηκαν με Luminoimaging Analyzer LAS4000 (GE Healthcare).

χρώση ανοσοφθορισμού

Panc-1 κύτταρα επεξεργασμένα μόνο με διαλύτη ή SSHE μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη /5% σακχαρόζη σε DPBS για 20 λεπτά, ξεπλύθηκαν με DPBS, και διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100 σε DPBS για 4 λεπτά. Σε μερικά πειράματα, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 100 ηΜ Mitotracker Red CMXRos (Invitrogen) για 10 λεπτά πριν την μονιμοποίηση. Τα κύτταρα αποκλείστηκαν με 3% BSA /0,1% γλυκίνη σε ϋΡΒδ για 1 ώρα, ξεπλύθηκε, και κατόπιν επωάστηκαν με μονοκλωνικά αντι-ΟΕΕ (D39D2, αραίωση 1: 200, Cell Signaling) ή αντίσωμα αντι-LC3B πολυκλωνικό κουνελιού (1: 200 αραίωση) για 1 ώρα. Μετά από εκτεταμένη πλύση με DPBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με Alexa Fluor 488 αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (αραίωση 1: 300, Invitrogen) για 1 ώρα. Τα κύτταρα βάφτηκαν αντίθετα με DAPI και παρατηρήθηκαν κάτω από σάρωση με λέιζερ συνεστιακό μικροσκόπιο.

μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίου (ΤΕΜ) ανάλυση

Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα Panc-1 και τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 200 μg /ml για SSHE 28 ώρες τοποθετήθηκαν σε 2% παραφορμαλδεΰδη και 2% γλουταραλδεϋδη σε 30 mM ρυθμιστικού HEPES (30 mM HEPES, 100 mM NaCl, 2 mM ΟαΟ

2, ρΗ 7.4) για 2 ώρες στους 4 ° C και μετα-σταθεροποιήθηκαν με 1 % ΟΣΟ

4 για 1 ώρα στους 4 ° C. Τα δείγματα αφυδατώθηκαν με διαβαθμισμένη αλκοόλη και ενσωματωμένα σε TAAB812 ρητίνη (TAAB Εργαστήρια Εξοπλισμός Ltd., Berkshire, UK). Εξαιρετικά λεπτές τομές χρωματίστηκαν για 1 ώρα σε 3% υδατικό οξικό ουρανύλιο, πλύθηκαν, και αντίθετα με 0,3% κιτρικό μόλυβδο, και εξετάστηκαν σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (ΕΜ-002B, JEOL Ltd., Tokyo, Japan).

πλασμίδιο GFP-LC3 και την επιμόλυνση

πλασμίδιο σύντηξης ΕΟΡΡ- LC3B (ρΟΜΧ-δΑΗ /Y145F-LC3B-GFP) δομήθηκε με κλωνοποίηση LC3B cDNA, η οποία ενισχύθηκε με PCR, σε μία ρΟΜΧ-SAH /διάνυσμα Y145F-GFP [33]. Το κατασκεύασμα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας DNA. Panc-1 ells επιμολύνθηκαν παροδικά με το πλασμίδιο χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen-Life Technologies, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε SSHE και εξετάζεται κάτω από μια σάρωση με λέιζερ ομοεστιακό μικροσκόπιο.

Τα πειράματα σε ζώα

Όλα τα ζωικά πειράματα διεξήχθησαν σε συμμόρφωση με τις οδηγίες του ιδρύματος για τη φροντίδα και τη χρήση των έρευνα για τα ζώα. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Πανεπιστημιούπολη επιτροπή Izumo ζώων Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου του Σιμάνε (Αριθμός Άδεια: IZ26-7). Όλα τα ποντίκια στεγάζονται στο κέντρο ζώο του Σιμάνε Πανεπιστήμιο Ιατρική Σχολή υπό ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων σε ελεγχόμενη θερμοκρασία 23 ± 2 ° C, σχετική υγρασία 55 ± 10%, και με 12 ώρες φως /12 ώρες σκοτάδι κύκλους. Τους δόθηκε τροφή και νερό

κατά βούληση

. Τα ποντίκια ελέγχθηκαν για την υγεία τους κατά τη διάρκεια ολόκληρης της πειραματικής περιόδου τουλάχιστον μία φορά την ημέρα μετά την ένεση του όγκου. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό τη μεδετομιδίνη (0,3 mg /kg) /μιδαζολάμη (4,0 mg /kg) /βουτορφανόλη (5,0 mg /kg) αναισθησία. Οι ποντικοί κανονικά σε ευθανασία με CO

2 εισπνοή στο τέλος της μελέτης. Για την περιτοναϊκή μοντέλο διάδοσης, κύτταρα Panc02-Luc-ZsGreen (5×10

5 κύτταρα /ποντικό) εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκά σαν ένα κυτταρικό εναιώρημα σε 7-εβδομάδων αρσενικών C57BL /6 ποντίκια (Crea Ιαπωνία, Tokyo, Japan), και οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν και ομαδοποιήθηκαν σε έλεγχο (η = 8) και τις ομάδες SSHE (n = 8). Τα θεραπευτικά σχήματα ξεκίνησαν την ημέρα μετά τον εμβολιασμό του όγκου. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία σε CO

2 θάλαμο όταν ήταν ετοιμοθάνατοι, μετρούμενο από την έλλειψη της παρατεταμένης σκόπιμη απάντηση σε ήπια ερεθίσματα. Όλες οι προσπάθειες συμπεριλαμβανομένης της υποδόριας χορήγηση μελοξικάμης (5 mg /kg) έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Το πείραμα διεξήχθη δύο φορές, και τα συνδυασμένα δεδομένα υποβλήθηκαν σε αναλύσεις. Για την ορθοτοπικό μοντέλο καρκίνου του παγκρέατος, τα κύτταρα Panc-1-Luc-ZsGreen (1×10

6 κύτταρα /ποντικό) εμφυτεύθηκαν με 50% Matrigel στο πάγκρεας των 6-εβδομάδων ηυ θηλυκών γυμνών ποντικών (BALB /c /nu, Ιαπωνία SLC, Shizuoka, Ιαπωνία) [32]. Μία εβδομάδα μετά την ένεση, τυχαιοποιήθηκαν και ομαδοποιήθηκαν σε έλεγχο (n = 6) και τις ομάδες SSHE (n = 6). Τα θεραπευτικά σχήματα ξεκίνησαν μία εβδομάδα μετά την ένεση του όγκου. Για πειράματα καρκίνωμα κόλου ποντικού, κύτταρα LuM1 (3 χ 10

5 κύτταρα) εμφυτεύθηκαν υποδορίως σε αρσενικούς ποντικούς Balb /c (n = 6 για τον έλεγχο και την ομάδα SSHE). Οι όγκοι των όγκων LuM1 αξιολογήθηκαν με μέτρηση δύο κάθετων διαμέτρων με δαγκάνες. Ο όγκος του όγκου (V) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: V =

(α

2

xb) /2

, όπου

μια

είναι η μικρή διάμετρο και

β

της μεγάλης διαμέτρου. Στην ομάδα SSHE, ποντίκια ενδοπεριτοναϊκώς 80 mg /kg μία φορά την ημέρα SSHE. Στην ομάδα ελέγχου, τα ποντίκια χορηγήθηκαν διαλύτη μόνο σε ϋΡΒδ.

απεικόνιση βιοφωταύγειας

In vivo

bioluminescent απεικόνισης διεξήχθη με τη χρήση του συστήματος απεικόνισης IVIS (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton , ΜΑ). Όλα τα ποντίκια ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με 150 mg /kg d-λουσιφερίνης (Promega, Fitchburg, WI) και αναισθητοποιήθηκαν με 2.5% ισοφλουράνιο. Δέκα λεπτά αργότερα, τα φωτόνια από ολόκληρα σώματα ζώων απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα απεικόνισης IVIS (δαγκάνας Life Sciences) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη διαβίωση εικόνα 2.50 του λογισμικού (δαγκάνα Life Sciences).

αιματολογία αίματος και βιοχημικές δοκιμή

Ποντίκια αναισθητοποιούνται και συλλέγεται αίμα από την καρδιά. Περιφερικό προφίλ του αίματος αναλύθηκαν από το Sysmex KX-21NV αυτοματοποιημένο αναλυτή αιματολογίας (Sysmex, Κόμπε, Ιαπωνία). Τα επίπεδα των λευκών αιμοσφαιρίων (WBC), ερυθρά αιμοσφαίρια (RBC), τα αιμοπετάλια (PLT), της αιμοσφαιρίνης (HGB), αιματοκρίτη (HCT), μέσος όγκος (MCV), μέση σωματιδιακής αιμοσφαιρίνης (MCH), και η μέση σωματιδιακή αιμοσφαιρίνης εξετάστηκαν συγκέντρωση (MCHC). Γλυκόζη (Glu) επίπεδα, τα επίπεδα ολικής χοληστερόλης (Τ-ΟΗΟ), αμινοτρανσφεράση αλανίνης (ALT) και ασπαρτική αμινοτρανσφεράση (AST) επίπεδα, και άζωτο ουρίας αίματος επίπεδα (BUN) αναλύθηκαν με ένα αυτοματοποιημένο αναλυτή κλινικής χημείας, SPOTCHEM EZ SP- 4430 (ARKRAY, Inc., Kyoto), χρησιμοποιώντας SPOTCHEM II δοκιμαστικές ταινίες.

αντίστροφης φάσης υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC)

υγρής χρωματογραφίας διαχωρισμοί επιτεύχθηκαν χρησιμοποιώντας μια αντίστροφης φάσης C -18, 3 μm, 2.4 χ 250 mm στήλη (COSMOSIL. Nakarai TESQUE, Inc., Kyoto, Japan) σε ρυθμό ροής 1 ml /min. Η κινητή φάση ήταν 70% μεθανόλη. Το προφίλ έκλουσης παρακολουθήθηκε με υν φασματοφωτομετρία στα 228 nm.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ των συνόλων δεδομένων ελέγχθηκε από

t

τεστ αταίριαστο του Student. Η επιβίωση των ποντικών αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το τεστ log-rank. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

SSHE αναστέλλει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και προκαλεί το θάνατο των κυτταρικών σειρών καρκίνου του παγκρέατος

Κατεργασία Panc-1 κύτταρα με SSHE για 20 ώρες είχε ως αποτέλεσμα την σύλληψη στην φάση G0 /G1 του κυτταρικού κύκλου (σχήμα 1Α). Μια αύξηση στο κλάσμα subG1, ένα χαρακτηριστικό απόπτωσης, ήταν οριακή. SSHE επαγόμενη τελικά τον θάνατο των Panc-1 κύτταρα και άλλα ανθρώπινα και τον καρκίνο του παγκρέατος ποντικού κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 1Β). Τα φυσιολογικά κύτταρα όπως HUVEC και HPAEpiC ήταν πιο ανθεκτικά στην SSHE σύγκριση με Panc-1 κύτταρα (Σχήμα 1 C). Στα μεταγενέστερα στάδια του κυτταρικού θανάτου των κυττάρων Panc-1, ρήξη εστιακή μεμβράνης πλάσματος και την συρρίκνωση του πυρήνα ήταν εμφανείς (Σχ 1D). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ο κατακερματισμός του πυρήνα, ένα άλλο χαρακτηριστικό της απόπτωσης, σπάνια παρατηρήθηκε σε αυτό το στάδιο. SSHE ήταν επίσης αποτελεσματική στην επαγωγή του θανάτου των κυττάρων Panc-1 υπό συνθήκες υποξίας (Σχήμα 1 Ε). Προκάλεσε επίσης μια σημαντική καθυστέρηση της ανάπτυξης και του θανάτου σε μια ποικιλία επιπρόσθετων κυτταρικών γραμμών όγκου, όπως ο καρκίνος του παχέος εντέρου, του καρκίνου του στομάχου, ο καρκίνος του πνεύμονα, ο καρκίνος του μαστού, της λευχαιμίας, οστεοσάρκωμα, ηπάτωμα, καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και ινοσαρκώματος (S1 Σχήμα).

(Α) του κυτταρικού κύκλου. κύτταρα Panc-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα μόνο, 100 μg /ml SSHE ή 200 μg /ml SSHE για 20 ώρες, σταθερό, χρωματίστηκαν με ΡΙ, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε κυτταρομετρία. (Β) Η βιωσιμότητα των κυττάρων. Παγκρέατος κυτταρικές γραμμές καρκίνου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα μόνο ή διάφορες συγκεντρώσεις του SSHE για 42 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. μπαρ? SD. (C) Επίδραση της SSHE στα φυσιολογικά κύτταρα. HUVEC, HPAEpiC και Panc-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο με όχημα ή 100 μg /ml SSHE για 38 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. μπαρ? SD. (Δ) Μορφολογία. κύτταρα Panc-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα μόνο (αριστερά) ή 200 μg /ml SSHE για 40 ώρες (δεξιά). (Ε) Επίδραση των SSHE σε κύτταρα Panc-1 υπό συνθήκες υποξίας. κύτταρα Panc-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα μόνο ή διάφορες συγκεντρώσεις του SSHE για 42 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ.

Η

SSHE προκαλεί autotic κυτταρικό θάνατο παρά απόπτωση ή necroptosis σε κύτταρα Panc-1

Για να διερευνήσει το μηχανισμό με τον οποίο SSHE που προκαλείται από το θάνατο του Panc -1 κύτταρα, διερευνήσαμε διάφορους δείκτες των αποπτωτικών κυττάρων. Η δοκιμασία JC-1 απεκάλυψε μία αξιοσημείωτη μείωση του δυναμικού της μεμβράνης μιτοχονδρίων μετά από θεραπεία SSHE (Σχήμα 2Α). χρώση /ΡΙ αννεξίνης V έδειξαν επίσης μία αύξηση στο ποσοστό αννεξίνης ν-θετικής ή /και ΡΙ-θετικών κυττάρων, ανάλογα με τη συγκέντρωση του SSHE (Σχήμα 2Β). Ωστόσο, ο αναστολέας παν-κασπάσης-ίτηκ δεν βελτιώνει την επιβίωση των κυττάρων (Σχήμα 2C). Επιπλέον, διασπασμένη κασπάση 3 ήταν δύσκολα ανιχνεύσιμη μετά από θεραπεία με 200 μg /ml SSHE για 24 ώρες. Μετά τη θεραπεία SSHE, σχεδόν το 30% των κυττάρων ήταν ΡΙ θετικά, ενώ η θεραπεία των κυττάρων με pifithrin-μ και TRAIL της ενεργοποιημένης κασπάσης-3 (Σχήμα 2D), που συμπίπτει με μια προηγούμενη αναφορά [34]. Με βάση τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι SSHE ούτε αύξησε το ποσοστό του κλάσματος subG1 (Σχήμα 1Α), ούτε επαγόμενη κατάτμηση της πυρήνες (Εικ 1D), δεν θα μπορούσαμε να λάβουν συγκεκριμένα στοιχεία της απόπτωσης στα SSHE-κατεργασμένων κυττάρων Panc-1. Επιπλέον, η μετατόπιση του παράγοντα που επάγει την απόπτωση (ΟΕΕ), ένα μιτοχονδριακό κασπάσης-ανεξάρτητο τελεστή θάνατο, εντός του πυρήνα δεν ήταν εμφανής (S2 Σχήμα), και necrostatin-1, ένας αναστολέας της κινάσης RIP1 μεσολάβηση necroptosis, απέτυχε να αποτρέψει SSHE- που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο (S2 σχήμα). Έτσι, ούτε μιτοχόνδρια-ανεξάρτητης απόπτωσης ούτε necroptosis είχε εμπλακεί σε SSHE-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο.

(Α) το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης. κύτταρα Panc-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα μόνο, 100 μg /ml SSHE ή 200 μg /ml SSHE για 20 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε δοκιμασία JC-1. Υγιή κύτταρα με λειτουργικά μιτοχόνδρια που περιέχουν κόκκινο JC-1 J-αδρανών υλικών και αποπτωτικών ή ανθυγιεινά κύτταρα με κατέρρευσε μιτοχόνδρια που περιέχουν κυρίως πράσινο μονομερή JC-1 ανιχνεύθηκαν με κυτταρομετρία. χρώση (Β) αννεξίνη V /PI. κύτταρα Panc-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα μόνο, 100 μg /ml SSHE ή 200 μg /ml SSHE για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβάλλεται σε αννεξίνη V /χρώση ΡΙ. (C) Επίδραση-ίτηκ (zVAD) επί SSHE-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. κύτταρα Panc-1 επωάστηκαν για 42 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. μπαρ? SD. (D) Caspase-3 ενεργοποίησης. κύτταρα Panc-1 επωάστηκαν με 200 μg /ml SSHE για διάφορες χρονικές περιόδους ή σε επεξεργασία με 10 μΜ pifithrin-μ και 100 ng /ml TRAIL για 60 h (χρησίμευσε ως θετικός μάρτυρας). Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση στυπώματος Western με αντι-κασπάσης 3 αντίσωμα.

Η

Από την άλλη πλευρά, SSHE σημαντικά αύξησε την αναλογία LC3-II /LC3-Ι, ένας δείκτης σχηματισμού autophagosome, σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. SSHE μείωσε επίσης τα επίπεδα SQSTM1 /ρ62 πρωτεΐνη, ένα από τα ειδικά υποστρώματα αποδομούνται μέσω της autophagy-λυσοσωμικής οδού, σε κύτταρα Panc-1 (Σχήμα 3Α και 3Β). SSHE ενεργοποιηθεί ΑΜΡΚ, μια θετική ρυθμιστής της αυτοφαγία, και ανέστειλε την mTOR, μια αρνητική αυτοφαγικά ρυθμιστή (Εικ 3C και 3D). Οι αναστολείς autophagy 3-μεθυλαδενίνη και χλωροκίνη εμπόδισε μερικώς κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 3Ε). Μορφολογικά, SSHE κατεργασμένα κύτταρα έδειξαν μαζική σχηματισμό κενοτοπίων του κυτταροπλάσματος περίπου 24 ώρες μετά την αγωγή (Σχήμα 4Α). Αυτά τα κυτταροπλασματικά κενοτόπια ήταν πιθανόν αυτοφαγοσώματα επειδή GFP-LC3 puncta εμφανίστηκε μετά από θεραπεία με SSHE (Σχήμα 4Β). Μερικά puncta LC3 συν-εντοπισμένη με Mitotracker-θετικά μιτοχόνδρια στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 100 μg /ml SSHE για 20 ώρες, γεγονός που υποδηλώνει την εμφάνιση mitophagy (σχήμα 4Γ). Έτσι, SSHE-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο φάνηκε να είναι αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο. Ωστόσο, ΤΕΜ αναλύσεις 28 ώρες μετά την αγωγή SSHE έδειξε πυκνά σε ηλεκτρόνια μιτοχόνδρια, κενοτόπια άδειο και εστιακή περιπυρηνική διόγκωση (Σχήμα 4D), που δεν παρατηρούνται σε κλασικές autophagy τύπου [35]. Έτσι, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι SSHE-κυτταρικό θάνατο που επάγεται ήταν κασπάσης-ανεξάρτητη και έμοιαζε με θάνατο αυτοφαγία των κυττάρων. Αυτή η μορφή κυτταρικού θανάτου συμπίπτει καλά με autosis, ένα πρόσφατα χαρακτηρίζεται Na

+, K

+ – ΑΤΡ-ρυθμιζόμενη μορφή κυτταρικού θανάτου [36]. Δυστυχώς, επειδή το καρδιακό γλυκοσίδιο διγοξίνη, ένας ανταγωνιστής του Na

+, Κ

+ – ΑΤΡάσης που αναφέρεται ότι αναστέλλει autosis [36], ήταν πολύ κυτταροτοξική προς Panc-1 κύτταρα, δεν θα μπορούσαμε να αξιολογήσει τα αποτελέσματά της επί SSHE-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο.

(Α) Επίδραση της SSHE για την έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με αυτοφαγία. κύτταρα Panc-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα μόνο, 100 μg /ml SSHE ή 200 μg /ml SSHE για 24 ώρες. Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση στυπώματος Western με αντι-SQSTM1 /Ρ62 ή αντισώματος αντι-LC3. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Χρόνος-πορεία της μετατροπής της LC3-Ι LC3-II. κύτταρα Panc-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 200 μg /ml SSHE για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. (C) ΑΜΡΚ και mTOR έκφρασης. κύτταρα Panc-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 200 μg /ml SSHE για διάφορους χρόνους. Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση στυπώματος Western με αντι-ΑΜΡΚ, αντι-φωσφο-ΑΜΡΚ αντίσωμα, αντι-mTOR, ή αντι-φωσφο-mTOR. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (D) ενεργοποίηση ΑΜΡΚ και mTOR αναστολή από SSHE. Η ένταση των ζωνών σε (C) ποσοτικά με λογισμικό Image J. (Ε) Επίδραση του 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ) και χλωροκίνη (CQ) επί SSHE-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. κύτταρα Panc-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με SSHE στην ενδεικνυόμενη συγκέντρωση εν τη απουσία ή παρουσία 10 μΜ 3-ΜΑ (αριστερά) ή 40 μΜ CQ για 42 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Οι εικόνες Western blot (Α-Γ) έχουν περικοπεί για την παρουσίαση. Οι εικόνες σε πλήρες μέγεθος παρουσιάζονται στο Μπαρ S13 σχ? SD.

Η

(Α) αντίθεση φάσης. κύτταρα Panc-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο με όχημα ή 100 μg /ml SSHE για 40 ώρες. μπαρ? 100 μm. (Β) LC-3 puncta. Panc-1 κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα ρΟΜΧ-δΑΗ /Y145F-LC3B-GFP υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο με όχημα ή 100 μg /ml SSHE για 24 ώρες και παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο συνεστιακό laser. μπαρ? 20 μm. (C) Διπλή χρώση με Mitotracker και αντίσωμα αντι-LC3. κύτταρα Panc-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα μόνο, 100 μg /ml ή 200 μg /ml SSHE για 24 ώρες, χρωματίστηκαν με 100 ηΜ Mitotracker Red επί 10 λεπτά, σταθερό, και στη συνέχεια σε επεξεργασία για LC3 ανοσοχρώση. μπαρ? 20 μm. (D) Ultrastructure. κύτταρα Panc-1 θεραπεία με όχημα μόνο ή με 200 μg /ml SSHE για 28 ώρες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση ΤΕΜ. Αρχική μεγέθυνση, x2,500. PC, περιπυρηνική χώρο.

Η

γενιάς μιτοχονδριακού ROS εμπλέκεται σε SSHE-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο

Οι αλλαγές στην παραγωγή ROS, όπως εκτιμάται με χρώση H2DCFDA, μετά την επεξεργασία των Panc-1 κύτταρα με SSHE έδειξαν ένα διφασικό πρότυπο. Στα πρώτα στάδια (περίπου 10 ώρες), παραγωγή ROS αναστέλλεται από SSHE (S3 Εικ). Ωστόσο, η παρατεταμένη θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα μια ισχυρή αύξηση των ROS γενιάς (Σχήμα 5Α και 5Β). MitoSOX Red χρώση έδειξε επίσης την αύξηση της παραγωγής των μιτοχονδριακών υπεροξειδίου (S4 σχήμα). Το αντιοξειδωτικό Ν-ακετυλοκυστεϊνη (NAC) εξασθενεί σημαντικά τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από SSHE όπως αξιολογήθηκε από την trypan δοκιμασία αποκλεισμού μπλε χρωστική (Σχήμα 5C). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν παραγωγή ROS ως αιτία της SSHE-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο.

(Α) κύτταρα Panc-1 υποβάλλεται σε επεξεργασία με όχημα μόνο, 100 μg /ml SSHE ή 200 μg /ml SSHE για 20 ώρες βάφτηκαν με 10 μΜ H2DCFDA για 10 λεπτά και αμέσως παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο συνεστιακό laser. (Β) Panc-1 κύτταρα που κατεργάζονται όπως στο Α υποβλήθηκαν σε κυτταρομετρία. (C) Επίδραση της NAC στην SSHE που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο. κύτταρα Panc-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 200 μg /ml SSHE παρουσία ή απουσία 10 mM NAC επί 42 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με μία trypan δοκιμή αποκλεισμού μπλε βαφής. μπαρ? SD.

Η

Τα μιτοχόνδρια έχουν αναφερθεί να είναι η κύρια πηγή των ROS που απαιτείται για την επαγωγή αυτοφαγία [37]. Να εξετάσει κατά πόσον το μιτοχονδριακό ROS παίζουν ρόλο στην SSHE που προκαλείται autotic κυτταρικό θάνατο, χρησιμοποιήσαμε το μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) -λιγότερο ρ

0P29 κύτταρα που προέρχονται από τον Lewis κύτταρα Ρ29 καρκινώματος πνεύμονα και κύτταρα P29mtP29 που είχαν θεσπιστεί με την επαναφορά της άγριας πληκτρολογήστε mtDNA σε ρ

0P29 κύτταρα. Όταν ρ

0P29 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με SSHE που μόλις και μετά βίας παράγεται ROS, ενώ τα κύτταρα P29mtP29 επαρκώς παράγονται ROS (S5 σχήμα). Είναι ενδιαφέρον, ρ

0P29 κύτταρα αποκαλύφθηκε για να είναι ανθεκτικά σε SSHE σε σύγκριση με τα κύτταρα P29mtP29 (S5 σχήμα).

SSHE επιβραδύνει την ανάπτυξη του όγκου του παγκρέατος

καρκίνου

Όταν τα κύτταρα Panc02-Luc-ZsGreen (5 χ 10

5 κύτταρα) ενδοπεριτοναϊκά μεταμοσχεύθηκαν σε ποντικούς C57BL /6, έτειναν να σχηματίσουν διαδίδονται οζίδια κατά προτίμηση γύρω από το πάγκρεας και στην περιτοναϊκή επιφάνεια, και τα ποντίκια ανέπτυξαν ασκίτη (περίπου 2,4 ml /ποντικό όταν ετοιμοθάνατα) ( S6 σχήμα). Εξετάσαμε την θεραπευτική αποτελεσματικότητα του SSHE σε αυτό το μοντέλο περιτοναϊκή διάχυση.