Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο ιός ερυθροβλάστωση E26 μετατροπή ακολουθίες (

ETS

) οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων αποτελείται από μια εξαιρετικά διατηρημένη ομάδα γονιδίων που παίζουν σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, τη μετανάστευση και την εισβολή. Οι μεταθέσεις χρωμοσωμικές fusing παράγοντες ETS στους υποψηφίους των ανδρογόνων ανταποκρίνεται γονίδια έχουν βρεθεί σε καρκίνους του προστάτη, συμπεριλαμβανομένων των πιο κλινικά επιθετικές μορφές. ERG και ETV1 είναι τα πιο συχνά μετατοπίζεται πρωτεΐνες ETS. Υπερ-έκφραση αυτών των πρωτεϊνών σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη ως αποτέλεσμα μία πιο επεμβατική φαινότυπο. Η αναστολή της δραστικότητας ETS με αναστολείς μικρού μορίου μπορεί να παρέχει μια νέα μέθοδο για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Μέθοδοι και Εκτίμηση

Δείξαμε πρόσφατα ότι το μικρό μόριο YK-4-279 αναστέλλει βιολογική δραστικότητα του ETV1 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη σύντηξης-θετικών που οδηγεί σε μειωμένη κινητικότητα και εισβολή

in-vitro

. Εδώ, σας παρουσιάζουμε τα δεδομένα από ένα

in-vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. SCID-μπεζ ποντίκια υποδόρια εμφύτευση σύντηξης θετικά LNCaP-Luc-M6 και σύντηξη-αρνητικούς όγκους PC-3M-Luc-C6. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή με YK-4-279, και αξιολογήθηκαν επιπτώσεις της στην πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση του πνεύμονα. YK-4-279 θεραπεία οδήγησε σε μειωμένη ανάπτυξη του πρωτογενούς όγκου μόνο σε LNCaP-Luc-M6 ομάδα. Όταν πρωτογενείς όγκους αναπτύχθηκαν σε συγκρίσιμα μεγέθη, YK-4-279 ανέστειλε μετάσταση όγκου στους πνεύμονες. Η έκφραση των γονιδίων στόχων ETV1 ΜΜΡ7, FKBP10 και GLYATL2 μειώθηκαν στα ζώα που έλαβαν YK-4-279. ETS σύντηξης-αρνητικών PC-3M-Luc-C6 ξενομοσχευμάτων ήταν αδιάφορη προς την ένωση. Επιπλέον, YK-4-279 είναι μία χειρόμορφη μόριο που υπάρχει ως ένα ρακεμικό μίγμα R και S εναντιομερή. Διαπιστώσαμε ότι (S) -YK-4-279 είναι το ενεργό εναντιομερές σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Συμπέρασμα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι YK-4-279 είναι ένας ισχυρός αναστολέας του ETV1 και αναστέλλει τόσο την πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου και η μετάσταση της σύντηξης θετικών ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη. Ως εκ τούτου, YK-4-279 ή παρόμοιες ενώσεις μπορούν να αξιολογηθούν ως εν δυνάμει θεραπευτικό εργαλείο για τη θεραπεία του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη σε διαφορετικά στάδια

Παράθεση:. Ραχίμ S, Μηνάς Τ, το Χονγκ SH, Justvig S, Çelik Η , Kont YS, et al. (2014) Ένα μικρό μόριο αναστολέα της ETV1, YK-4-279, Αποτρέπει προστάτη ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση σε ένα ποντίκι μοντέλο ξενομοσχεύματος. PLoS ONE 9 (12): e114260. doi: 10.1371 /journal.pone.0114260

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 21, 2014? Αποδεκτές: 5, Νοεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Rahim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Αυτά τα πειράματα που υποστηρίζεται κυρίως από μια επιχορήγηση από το Υπουργείο Congressionally Σκηνοθεσία Ιατρικό Ερευνητικό Πρόγραμμα Άμυνας (PC111510, PI: Aykut Üren, http: //cdmrp.army.mil/). Οι φαρμακοκινητικές πειράματα που υποστηρίζονται από την αναλυτική Φαρμακολογία Πυρήνα του Sidney Kimmel Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου στο Johns Hopkins (ΝΙΗ επιχορηγήσεις P30 CA006973 και UL1 RR025005, και Κοινόχρηστα Μέσο Grant (1S10RR026824-01), https://grants.nih.gov/επιχορηγήσεις /oer.htm). πειράματα Biacore έγιναν στο Γονιδιωματική και Epigenomics κοινόχρηστο πόρο, το οποίο υποστηρίζεται από CCSG Grant Ρ30 CA051008-16 (Lou Weiner, PI), https://cancercenters.cancer.gov/grants_funding/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και τους συγγραφείς αυτού του χειρογράφου έχουν τα ακόλουθα ανταγωνιστικά ενδιαφέροντα: USPTO απονέμονται για YK-4-279 στο Πανεπιστήμιο Georgetown, εφευρέτες περιλαμβάνουν. Υ.Κ., Μ.Β., J.T. και Α.υ. Μια άδεια χρήσης έχει εκτελεστεί μεταξύ του Πανεπιστημίου Georgetown και Tokalas Inc για αυτά τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας, στην οποία J.T. Είναι ιδρυτικό μέτοχο. Πανεπιστήμιο Georgetown έχει καταθέσει αιτήσεις για διπλώματα ευρεσιτεχνίας για το YK-4279 καθώς και τις σχετικές ενώσεις και παράγωγα αυτών των μορίων. Παρακάτω είναι μια περίληψη των εκδοθεί και εκκρεμούν αιτήσεις για διπλώματα ευρεσιτεχνίας που σχετίζονται με αυτές τις ενώσεις. I. «Στόχευση του EWS-FLI ως αντικαρκινική θεραπεία» (GU Αναφορά # 2006-041) 1. ΗΠΑ προσωρινή εφαρμογή (60/877856) που κατατέθηκε στις 29 Δεκεμβρίου 2006. 2. PCT /US07 /089.118 που κατατέθηκε 28 του Δεκεμβρίου του 2007 . 3. ΗΠΑ προσωρινή εφαρμογή (61/177932) που κατατέθηκε στις 13 Μαΐου 2009. 4. US μη προσωρινό 12 /494.191 που κατατέθηκε 29, Ιουνίου 2009 ((CIP) αξιώνοντας προτεραιότητα τόσο για την PCT και των ΗΠΑ προσωρινές αιτήσεις? εθνικό είσοδο φάση της PCT)? που εκδίδεται ως US Patent 8,232,310. 5. US μη προσωρινό 12 /720.616 που κατατέθηκε 9 Μαρτίου του 2010 (CONT). 6. Η Ευρώπη 07.872.364,0 στις 28 Δεκεμβρίου του 2007 (έναρξη εθνικό στάδιο της PCT). 7. Καναδά 2.711.003 που κατατέθηκε 28 Δεκέμβρη 2007 (έναρξη εθνικό στάδιο της PCT). 8. Αυστραλία 2007341977 κατατεθεί 28 του Δεκέμβρη του 2007 (έναρξη εθνικό στάδιο της PCT). 9. Ηνωμένες Πολιτείες Προσωρινή 61 /405.170 που κατατέθηκε 20 του Οκτωβρίου, 2010 (περιέχει πρόσθετα δεδομένα). 10. Η Ευρώπη 13.186.704,6 διαιρεμένη Ευρώπη 07.872.364,0 προτεραιότητα στις 28 Δεκεμβρίου 2007. II. «Μέθοδοι και συνθέσεις για την αντιμετώπιση Σάρκωμα του Ewing Οικογένεια Όγκων» (GU Αναφορά # 2012-019) 1. ΗΠΑ Προσωρινή Patent Application 61 /623.349 που κατατέθηκε στις 12 Απριλίου 2012. 2. συνεργασίας ευρεσιτεχνίας Συνθήκης Application PCT /US2013 /036234 που κατατέθηκε στις 11 Απριλίου 2013. III. «Μέθοδοι και συνθέσεις για την αντιμετώπιση του καρκίνου» (GU Αναφορά # 2014-012) 1. ΗΠΑ Προσωρινή Patent Application 61 /895.308 που κατατέθηκε στις 24 Οκτωβρίου 2013. Όλα τα δεδομένα στο χειρόγραφο είναι ελεύθερα διαθέσιμα. Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν και να ακολουθούν όλες PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η χρωμοσωμική αναδιάταξη είναι ένας κοινός μηχανισμός οδήγησης ογκογένεση σε σαρκώματα και αιματολογικές κακοήθειες [1]. Πρόσφατα, συντήξεις που περιλαμβάνουν τις αλληλουχίες E26 μετασχηματισμού ιού ερυθροβλάστωση (

ETS

) οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων έχουν ανακαλυφθεί σε όγκους του καρκίνου του προστάτη [2]. Η

ETS

οικογένεια παραγόντων μεταγραφής είναι μια εξαιρετικά διατηρημένη ομάδα γονιδίων που αποτελείται από 27 μέλη, πολλά από τα οποία έχει αποδειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη μύηση ασθένεια, την εξέλιξη, τη διαφοροποίηση, τη μετανάστευση, εισβολή και την αγγειογένεση [3] , [4]. ETS πρωτεΐνες μοιράζονται σημαντική ομολογία με το άλλο και περιέχουν ένα Ο-τερματικό

ETS

τομέα που εμπλέκεται στη δέσμευσης DNA και έναν Ν-τερματικό τομέα PNT εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης [5]. Χρωμοσωματικών αναδιατάξεων που αφορούν ETS παράγοντες στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη τα τοποθετήσετε κάτω από την άμεση ρύθμιση των ανδρογόνων ανταποκρίνεται υποκινητές γονιδίων, ενεργοποιώντας έτσι την έκφρασή τους σε απάντηση ανδρογόνα. Σε αντίθεση με τα πρωτεϊνικά προϊόντα των χρωμοσωμικών μετατοπίσεων σε λευχαιμίες και σαρκώματα, γονίδιο αναδιατάξεις στον καρκίνο του προστάτη δεν δημιουργούν χιμαιρικές πρωτεΐνες σύντηξης. Αντ ‘αυτού, οι περισσότεροι χρωμοσωμικές μετατοπίσεις και γονιδιακές αναδιατάξεις που περιλαμβάνουν ETS παράγοντες αποτέλεσμα του καρκίνου του προστάτη σε έκφραση ενός πλήρους μήκους ή σχεδόν πλήρους μήκους πρωτεΐνες της οικογένειας ETS.

Οι μετατοπίσεις που αφορούν ERG και ETV1 αποτελούν την πλειοψηφία των αναδιατάξεων ETS που βρέθηκαν στον καρκίνο του προστάτη . Ενώ ERG κατά κύριο λόγο σε σύντηξη με TMPRSS2 υποκινητή, ETV1 μπορούν να αναδιαταχθούν με την 5 ‘περιοχή πολλών γονιδίων, όπως TMPRSS2, SLC45A3 και HNRPA2B1 [2], [6].

ETV1

μετατόπιση έχει ως αποτέλεσμα την έκφραση του πλήρους μήκους ή Ν-τελικό κουτσουρεμένο ETV1 [7]. Υπερ-έκφραση του ETV1 σε καλοήθη προστατική επιθηλιακών κυτταρικών σειρών έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή ενός υποσυνόλου των γονιδίων που εμπλέκονται στη μετανάστευση και εισβολή [6]. ETV1 αυξάνει επίσης την έκφραση των γονιδίων στόχων AR, καθώς και γονίδια που εμπλέκονται στην βιοσύνθεση στεροειδών και το μεταβολισμό. Συνεργασία με άλλους ογκογόνους γεγονότα, όπως απώλεια PTEN, προδιαθέτει ETV1 κύτταρα που εκφράζουν προστάτη να εξελιχθούν σε μια πιο επιθετική φαινότυπο της νόσου [8], [9]. Μελέτες σε μοντέλα ποντικών υποδεικνύουν ότι η έκφραση ETV1 είναι μια υποκείμενη αιτία για την έναρξη του καρκίνου του προστάτη. ETV1 διαγονιδιακά ποντίκια αναπτύσσουν προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία. Επιπλέον, συνδυάζοντας την έκφραση ETV1 με προϋπάρχουσα γονιδιωματική βλάβες, όπως η απώλεια του ΡΤΕΝ, έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη της διεισδυτικής αδενοκαρκινώματος [10], [11].

Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι YK-4-279, έναν αναστολέα του EWS-FLI1 ογκοπρωτείνης σε σάρκωμα του Ewing, αναστέλλει επίσης δραστηριότητα ERG και ETV1 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

in-vitro

, με αποτέλεσμα τη μείωση των μεταναστευτικών και επεμβατική φαινοτύπους [12], [13]. Με βάση την προηγούμενη μας

in-vitro έρευνες

, δοκιμάσαμε την αντι-μεταστατική ικανότητα των YK-4-279 σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Τα ζώα που έλαβαν θεραπεία με YK-4-279 μείωσε την ανάπτυξη όγκου και μείωσε τη μετάσταση του όγκου από πρωτογενή θέση στους πνεύμονες. Μπορούμε επίσης να αποδείξει ότι τα αποτελέσματα της YK-4-279 για ETV1 και κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη είναι εναντιοειδικό και (S) -YK-4-279 εναντιομερές είναι το ενεργό συστατικό που επιβεβαιώνουν παρόμοια ευρήματα σε άλλα μοντέλα όγκων [14].

Αποτελέσματα και Συζήτηση

YK-4-279 είναι ένα μικρό μόριο ανταγωνιστής του ETV1

Εμείς αρχικά επικεντρώθηκε στην αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της YK-4-279 σε μετάσταση όγκου

στο -vivo

, αφού μας

in-vitro

πειράματα με κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη πρότεινε ότι αναστέλλει πρωτίστως κινητικότητα και εισβολή [13]. Για να δοκιμαστεί η αποτελεσματικότητα του YK-4-279

in-vivo

, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού [15], [16]. Τα LNCaP-Luc-M6 και PC-3M-Luc-C6 καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές που παράγονται από σταθερή επιμόλυνση του γονικού LNCaP και PC-3 κύτταρα με ένα φορέα που εκφράζει γονίδιο λουσιφεράσης. Τα κύτταρα εγχέονται υποδορίως κάτω από το ραχιαίο πλευρό σε 8-10 εβδομάδων SCID /μπεζ αρσενικά ποντίκια. Μετάσταση στους πνεύμονες μπορεί να θεωρηθεί ως ήδη από 6-7 εβδομάδες μετά την εμφύτευση του όγκου σε αυτά τα ζώα [15], [16].

προηγουμένως αποδειχθεί ότι η αναστολή της ETV1 βιολογική δραστικότητα σε LNCaP κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα μειωμένη εισβολή και τη μετανάστευση χωρίς να επηρεάζει την ανάπτυξη σε καλλιέργεια [13]. Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται στην τρέχουσα μελέτη εμπορικώς αποκτήθηκαν από διαφορετική πηγή από προηγούμενη εργασία μας και υποβλήθηκε σε επιλεκτική πίεση για να ληφθούν σταθερές λουσιφεράση κλώνους έκφρασης. Εμείς επικυρωθεί πρώτα το αποτέλεσμα της YK-4-279 σε αυτά τα κύτταρα πριν προχωρήσετε στο

in-vivo

μοντέλα. LNCaP κύτταρα περιέχουν μια γενετική μετατόπιση όπου ολόκληρη η locus ETV1 εισάγεται στο τελευταίο ιντρόνιο της περιοχής MIPOL1 ειδικού προστατικού στο χρωμόσωμα 14. Επαληθεύσαμε την παρουσία ETV1 μετατόπιση σε LNCaP-Luc-M6 κύτταρα με γονιδιωματικό DNA PCR χρησιμοποιώντας εναρκτήρες που πλευρίζουν το περιοχή ανασυνδυασμού (Σχ. 1α). ETV1 αναδιάταξη ήταν αποκλειστικά για LNCaP-Luc-M6 κύτταρα και όχι στα κύτταρα PC-3M-Luc-C6. Ετσι, η κυτταρική σειρά PC-3M-Luc-C6 επελέγη ως αρνητικός μάρτυρας για τις μελέτες μας.

α) Γονιδιωματικό DNA από κύτταρα του προστάτη αναλύθηκε για την κατάσταση ETS αναδιάταξη εκτελώντας PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές αναδιάταξη. LNCaP-Luc-M6 κύτταρα έτρεφε ETV1 αναδιάταξη ενώ τα κύτταρα PC-3M-Luc-C6 ήταν σύντηξης αρνητικά. β) LNCaP κύτταρα-Luc-M6 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τα επίπεδα του γονιδίου στόχου 1 μΜ YK-4-279 για 48 ώρες και ETV1 αξιολογήθηκαν με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR. YK-4-279 θεραπεία οδήγησε σε μειωμένη γονιδιακή έκφραση του ΜΜΡ7, ΜΜΡ13, GLYATL2 και FKBP10 χωρίς σημαντική μείωση των επιπέδων ETV1. *? p όχι-σημαντική, t-test unpaired σπουδαστή. γ) LNCaP-Luc-M6 και PC-3M-Luc-C6 προ-επεξεργασία με 1 μΜ YK-4-279 για 48 ώρες. Μία δοκιμασία που βασίζεται χημειοταξίας ηλεκτρική αντίσταση χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της μετανάστευσης των κυττάρων με την παρουσία YK-4-279 προς τον κατώτερο θάλαμο με 10% κλίση FBS. YK-4-279 ανέστειλε τη μετανάστευση των LNCaP-Luc-M6 αλλά όχι κύτταρα PC-3M-Luc-C6. *? p όχι-σημαντική, t-test unpaired σπουδαστή. δ) Motilities των κυττάρων στο τέλος της περιόδου 24 ωρών υπολογίστηκαν με βάση τις τιμές τους σχετικός δείκτης των κυττάρων. *? p όχι-σημαντική, μη ζευγαρωμένο φοιτητή t-test.

Η

επεξεργασμένα κύτταρα LNCaP-Luc-M6 με υπο θανατηφόρα δόση (1 μΜ) του YK-4-279 για 48 ώρες και αξιολογήθηκε έκφραση του ενδογενούς ETV1 γονιδίων-στόχων από ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Έχουμε επικεντρώθηκε στην γνωστών στόχων ETV1 που εμπλέκονται στην παθογένεση του προστάτη [17] – [19]. Η έκθεση των κυττάρων LNCaP-Luc-M6 έως 1 μΜ YK-4-279 οδήγησε σε σημαντικά μειωμένα επίπεδα mRNA αρκετών γονιδίων στόχων ETV1, συμπεριλαμβανομένων ΜΜΡ7, ΜΜΡ13, FKBP10 και GLYATL2, χωρίς να επηρεάζει την έκφραση του ETV1 (Σχ. 1β).

στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία χημειόταξης ηλεκτρικό αντίσταση για να καθορίζουν τις συνέπειες της YK-4-279 επί της κινητικότητας των LNCaP-Luc-M6 και PC-3M-Luc-C6 κύτταρα. Αυτή η τεχνική περιλαμβάνει τη χρήση ενός θαλάμου Boyden που μοιάζει με ρύθμιση μικροηλεκτρονικών αισθητήρων ενσωματωθεί στο πλαίσιο ενός τερεφθαλικού μικροπορώδες πολυαιθυλένιο (ΡΕΤ) μεμβράνη. Οι αισθητήρες καταγράφουν ηλεκτρική αντίσταση ως κύτταρα μεταναστεύουν από τον άνω θάλαμο, μέσω της μεμβράνης, και εντός του θαλάμου κάτω σε απόκριση σε ένα χημειοελκτικό. Αυτή η τεχνική επιτρέπει παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο της κυτταρικής μετανάστευσης, όπως αυξήσεις στην ηλεκτρική αντίσταση συσχετίζονται με αύξηση του αριθμού των κυττάρων μετανάστευσαν στο κάτω θάλαμο. YK-4-279 επεξεργασία των κυττάρων LNCaP-Luc-M6 είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική μείωση στην κυτταρική μετανάστευση, ενώ δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση επί της κινητικότητας του αρνητικού ελέγχου κυτταρική γραμμή, PC-3M-luc-C6 (Σχ. 1c και 1δ). Αυτά τα ευρήματα επιβεβαίωσαν ότι τα εμπορικώς διαθέσιμα κύτταρα LNCaP-Luc-M6 και PC-3M-Luc-C6 είχαν τα ίδια φαινοτύπους και YK-4-279 προφίλ απόκρισης όπως LNCaP και PC-3 κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν σε προηγούμενες μελέτες μας.

YK-4-279 αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου

In-vivo

YK-4-279 πειράματα θεραπείας έγιναν σε δύο διαφορετικές μορφές: 1) πειράματα έγκαιρη θεραπεία, όπου YK-4 -279 διοίκηση ξεκίνησε την ημέρα μετά την εμφύτευση ξένου μοσχεύματος. 2) Πειράματα Καθυστερημένη θεραπεία, όπου YK-4-279 διοίκηση ξεκίνησε μόνο μετά την πρωτοπαθή όγκο ξένου μοσχεύματος φτάσει σε μια χειροπιαστή μέγεθος (~ 200 mm

3). Αυτές οι δύο προσεγγίσεις μας επέτρεψε να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της YK-4 με 279 επί του όγκου μέχρι να λάβει, την ανάπτυξη και μετάσταση του πνεύμονα και οι δύο πριν από τον σχηματισμό καθιερωμένων όγκων καθώς επίσης και μετά το σχηματισμό ψηλαφητών όγκων.

Ιδρύσαμε προστάτη ξενομοσχεύματα από υποδόρια ένεση LNCaP-Luc-M6 ή PC-3M-Luc-C6 κύτταρα στην ραχιαία πλευρά του μπεζ ποντίκια SCID /. Στη μελέτη έγκαιρη θεραπεία, αρχίσαμε ενδοπεριτοναϊκή φαρμακευτική αγωγή με kg YK-4-279 ή όχημα ελέγχου /75 mg την ημέρα μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή 3 φορές την εβδομάδα και οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν εβδομαδιαίως. Η μελέτη τερματίστηκε μετά από 14 εβδομάδες για την ομάδα LNCaP-Luc-M6 και 6 εβδομάδες για την ομάδα PC-3M-Luc-C6, λόγω του σχετικά ταχύτερο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων PC-3M-Luc-C6. Ενώ μόνο 4 από τους 13 ποντικούς που εγχύθηκαν υποδορίως με LNCaP κύτταρα-Luc-M6 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με YK-4-279 ανέπτυξαν όγκους, σε πλήρη αντίθεση, 9 από τις 13 ζώα στην ομάδα ελέγχου φορέα ανέπτυξαν όγκους. Δεν υπάρχει τέτοια διαφορά ήταν παρούσα στο σύντηξης-αρνητικών PC-3M-Luc-C6 ομάδα (Εικ. 2). Σε ζώα που ανέπτυξαν όγκους, υπήρξε μια σημαντική μείωση στο μέγεθος των όγκων σε ομάδα που έλαβε αγωγή YK-4-279 σύγκριση με το μάρτυρα DMSO. Μείωση του μεγέθους του όγκου ήταν παρούσα μόνο στο LNCaP-Luc-M6 ομάδα και δεν έχουν παρατηρηθεί με το PC-3M-Luc-C6 ξενομοσχεύματα (Σχ. 3α). Μας πριν από

in-vitro

έρευνες αποκάλυψαν ότι ETV1 αναστολή από YK-4-279 οδηγεί σε μειωμένη κινητικότητα και την εισβολή χωρίς να επηρεάζει την ανάπτυξη των κυττάρων και την επιβίωση. Ως εκ τούτου, δεν περιμέναμε να δούμε μια διαφορά στην πρόσληψη από τον όγκο ή το ρυθμό ανάπτυξης πρωτογενούς όγκου σε αυτά τα ζώα. Το πείραμα έγκαιρη θεραπεία σχεδιάστηκε για να μετρήσει τη μετάσταση του πνεύμονα, και όλα τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία στο προκαθορισμένο τελικό σημείο (6 εβδομάδες για PC-3M-Luc-C6 και 14 εβδομάδες για την LNCaP-Luc-Μ6) για τη συγκομιδή των ιστών για περαιτέρω ανάλυση.

ξενομοσχεύματα προστάτη θεσπίστηκαν με υποδόρια έγχυση κυττάρων κάτω από το ραχιαίο πλευρό στην παλιά 8-10 εβδομάδων SCID αρσενικά ποντίκια /μπεζ. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 75 mg /kg σωματικού βάρους YK-4-279 τρεις φορές την εβδομάδα, αρχίζοντας την ημέρα μετά τις ενέσεις ξενομοσχεύματος. LNCaP-Luc-M6 ζώα που υπέστησαν αγωγή με την ένωση που εμφανίζεται μειωμένο σχηματισμό όγκων (4/13) σε σύγκριση με τον έλεγχο οχήματος (9/13). PC-3M-Luc-C6 ζώα δεν εμφανίζουν σημαντική διαφορά στο σχηματισμό όγκων μεταξύ της ένωσης αγωγή (12/13) και τον έλεγχο του οχήματος (13/13) τα ζώα. *? p όχι-σημαντική, t-test unpaired σπουδαστή.

Η

α) SCID /μπεζ ποντίκια εγχύθηκαν υποδορίως με LNCaP-Luc-M6 ή PC-3M-Luc-C6 κύτταρα κάτω από το ραχιαίο πλευρό. Στην ομάδα έγκαιρη θεραπεία μελέτης, τα ζώα ενέθηκαν με 75 mg /kg YK-4-279 αρχίζοντας την ημέρα μετά την ένεση ξενομοσχεύματος. β) Ένα άλλο σύνολο των ζώων άρχισε να λαμβάνει YK-4-279 θεραπεία μία φορά οι όγκοι ήταν ψηλαφητοί (-200 mm

3). Αυτά τα ζώα διαιρέθηκαν περαιτέρω σε 2 ξεχωριστές ομάδες: μία ομάδα υποβλήθηκε σε θεραπεία τρεις φορές την εβδομάδα με 75 mg /kg YK-4-279 (καθυστερημένη αγωγή μελέτη χαμηλής δόσης). γ) Μια άλλη ομάδα υπέστη αγωγή 5 φορές την εβδομάδα με 150 mg /kg ενώσεως (καθυστερημένη αγωγή μελέτη υψηλής δόσης). Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν εβδομαδιαίως. YK-4-279 μειωμένη ανάπτυξη του όγκου σε LNCaP-Luc-M6 ζώα, αλλά όχι σε ζώα PC-3M-Luc-C6. *? p μη σημαντική.

Η

Οι μελέτες τέλη θεραπεία ξεκίνησε με την εμφύτευση ξένου μοσχεύματος και στενή παρακολούθηση. Όταν τα ζώα παρουσίασαν ψηλαφητό όγκο (~ 200 mm

3), τυχαιοποιήθηκαν να YK-4-279 και το όχημα ελέγχου (DMSO) ομάδες. Το τελικό σημείο της μελέτης αργά αγωγή επιλέχθηκε ως κύρια μέγεθος του όγκου φθάσει 2 cm

3 σε όλες τις ομάδες, έτσι ώστε μεταστατικό φορτίο μεταξύ των ομάδων θα μπορούσε να αξιολογηθεί με την ίδια πρωτογενή μέγεθος του όγκου σε όλες τις ομάδες. Επιπλέον, η μελέτη αργά αγωγή επαναλήφθηκε δύο φορές με δύο διαφορετικές YK-4-279 δόσεις? 75 mg /kg YK-4-279 τρεις φορές την εβδομάδα και 150 mg /kg YK-4-279 πέντε φορές την εβδομάδα.

Πρωτογενής ανάπτυξης όγκου ήταν σημαντικά μειωμένη σε μελέτη αργά θεραπεία καθώς και (Σχ. 3β ). Αυτή η διαφορά ενισχύθηκε όταν η δόση του φαρμάκου και η συχνότητα αυξήθηκαν (Σχ. 3c). Στην ομάδα υψηλής δόσης, όμως, τα ζώα άρχισαν να δείχνουν σημάδια υπεραερισμός και λήθαργο, προκαλώντας μια μείωση της δόσης σε 150 mg /kg χορηγούμενη 4 ημέρες την εβδομάδα μετά από την εβδομάδα 4 και 3 ημέρες την εβδομάδα μετά την εβδομάδα 8. Η φαρμακευτική αγωγή δεν επηρέασε την ανάπτυξη ποσοστό της σύντηξης αρνητικών PC-3M-Luc-C6 ξενομοσχεύματα είτε δόση.

Μια ομάδα δειγμάτων πρωτογενούς όγκου αξιολογήθηκαν επίσης για ιστοπαθολογική παραμέτρους (Εικ. S1). Τομείς νέκρωσης όγκου εντοπίστηκαν στην Η όχι-σημαντική, t-test unpaired σπουδαστή.

Η

συνεχεία πραγματοποιήθηκε η ίδια δοκιμασία λουσιφεράσης στους πνεύμονες των ζώων που ξενομοσχεύματος μεταφέρουν σε επεξεργασία με YK-4-279 ή όχημα ελέγχου. Σε όλα τα πειράματα 3 (μελέτη έγκαιρη θεραπεία, μελέτη αργά θεραπεία χαμηλής δόσης, μελέτη αργά θεραπεία υψηλής δόσης), η ένωση αγωγή οδήγησε σε σημαντική μείωση στη μετάσταση πνεύμονα σε LNCaP-Luc-M6 ζώα ξενομοσχεύματος, αλλά όχι σε PC-3M-luc- C6 ζώα (Εικ. 4γ). Χρησιμοποιήσαμε επίσης μία δοκιμασία που βασίζεται σε PCR για να ποσοτικοποιηθεί μετάσταση πνεύμονα στη μελέτη καθυστερημένη αγωγή κοόρτης υψηλής δόσης με χρήση ανθρώπινων ειδικούς εκκινητές για την ριβονουκλεάση Ρ RNA συστατικό H1 (RPPH1) και ποντικού ειδικούς εκκινητές που ανιχνεύουν το γονίδιο υποδοχέα τρανσφερίνης (TFRC). Αυτή η ανάλυση επιβεβαίωσε προηγούμενες παρατηρήσεις μας αποκαλύπτουν σημαντικά μειωμένη μετάσταση στους πνεύμονες, στο υπό επεξεργασία LNCaP-Luc-M6 ομάδα YK-4-279 (Εικ. S4) και επικυρώνεται ότι λουσιφεράσης μέτρησης στον πνευμονικό ιστό ήταν μια αξιόπιστη μέθοδο. Σε δύο πειράματα (μελέτη αρχή της θεραπείας και μελέτη αργά θεραπεία υψηλής δόσης), οι πνεύμονες συλλέχθηκαν από LNCaP-Luc-M6 ζώα ξενομοσχεύματος που επέδειξαν μειωμένη πρωτογενή μεγέθη όγκου στην ομάδα αγωγής κατά τον χρόνο της απόκτησης ιστού (Σχ. 3α και το Σχ. 3c ). Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι οι διαφορές στη μετάσταση του πνεύμονα μπορεί να είναι ένα άμεσο αποτέλεσμα των μικρότερων όγκων του όγκου σε ομάδες θεραπείας. Ωστόσο, η ομάδα χαμηλής δόσης μελέτη αργά θεραπεία είχαν παρόμοια όγκοι πρωτογενούς όγκου (2 εκατ

3) όταν οι ιστοί συλλέχθηκαν από τα ζώα (Σχ. 3β). YK-4-279 μειωμένη πνευμονική μετάσταση σε αυτά τα ζώα, καθώς, υποδηλώνοντας ότι η φαρμακευτική αγωγή επηρεάζει μετάσταση όγκου με αναστολή της δραστικότητας ETV1, ανεξάρτητα από το αρχικό μέγεθος του όγκου.

Εκτιμήσαμε επίσης την έκφραση του γονιδίου-στόχου ETV1 σε πρωτογενείς όγκους κατόπιν YK-4-279 θεραπεία. ETV1 αναστολή από YK-4-279 οδήγησε σε μειωμένη ΜΜΡ-7, η έκφραση FKBP10 και GLYATL2, χωρίς να επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης ETV1 (Εικ. 5α και Σχ. 5β). Για να προσδιοριστεί εάν οι διαφορές στην απόκριση του φαρμάκου μεταξύ LNCaP-Luc-M6 και τα ζώα PC-3M-Luc-C6 είναι ένας παράγοντας της διαφορικής διείσδυση του όγκου της ένωσης μεταξύ των δύο ομάδες, μετρήθηκε η συγκέντρωση του YK-4-279 στο πλάσμα και οι όγκοι των ζώων μετά την τελευταία δόση του YK-4-279. LNCaP-Luc-M6 ποντίκια επέδειξαν μία μέση συγκέντρωση 106,9 ± 64,1 μg /mL YK-4-279 στο πλάσμα και 27,8 ± 14,5 μg /g στον όγκο για έναν όγκο αναλογία πλάσματος 0,30 ± 0,20. αναλογία πλάσμα 0.15 ± 0.10: PC-3M-Luc-C6 ζώα κατέδειξαν 174,8 ± 53,5 μg /mL YK-4-279 στο πλάσμα και 23,3 ± 12,3 μg /g στον όγκο για έναν όγκο. Δεν υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά όσον αφορά τη διείσδυση της YK-4 με 279 μεταξύ των δύο ομάδων, σε σύγκριση με ένα τεστ chi-square.

α) RNA εξήχθη από όγκους ένωση και το όχημα αντιμετωπίζεται LNCaP-luc- ζώα M6 (τέλη θεραπεία της μελέτης χαμηλή δόση) 15 λεπτά μετά την τελευταία ένεση. επίπεδα έκφρασης γονιδίων προσδιορίστηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν με την έκφραση 18s rRNA. Διεξήχθησαν πειράματα εις τριπλούν με 5 ποντίκια αναλύθηκαν ανά ομάδα. YK-4-279 θεραπεία οδήγησε σε μειωμένη γονιδιακή έκφραση του ΜΜΡ7, GLYATL2 και FKBP10 χωρίς σημαντική μείωση των επιπέδων ETV1. *? p όχι-σημαντική, t-test unpaired σπουδαστή. β) τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου-στόχου ETV1 στη μελέτη καθυστέρηση της θεραπείας ομάδα υψηλής δόσης. *? p όχι-σημαντική, t-test unpaired σπουδαστή.

Η

εναντιο επιδράσεις της YK-4-279

YK-4-279 έχει ένα χειρόμορφο κέντρο και η ρακεμική ένωση μπορεί να διαχωριστεί σε συστατικό R του και S εναντιομερών με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC), ή κάθε εναντιομερές μπορεί να συντεθεί ξεχωριστά. Σε μοντέλα σάρκωμα Ewings, το S-εναντιομερές έχει καθιερωθεί ως το δραστικό συστατικό που αναστέλλει EWS-FLI1, ενώ το R-εναντιομερές έχει ουσιαστικά καμία ειδική δραστηριότητα [14], [21]. Δοκιμάσαμε το αν το ίδιο φαινόμενο ισχύει και για την αναστολή της ETV1 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων (SPR) πειράματα πραγματοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της πρόσδεσης του ρακεμικού YK-4-279 και κάθε επιμέρους εναντιομερές να ETV1. Οι ενώσεις εγχύθηκαν σε μια επιφάνεια πλακιδίου Biacore περιέχουν ανασυνδυασμένο ETV1. Ρακεμικό YK-4-279 και το S-εναντιομερές συνδέεται προς ETV1 ενώ το R-εναντιομερές έδειξε μια ασθενέστερη δέσμευση με ETV1 (Σχ. 6α). Στη συνέχεια αξιολογήθηκε YK-4-279 για την επίδρασή της επί ETV1 μεταγραφική δραστηριότητα μέσω μιας παροδικά επιμολυσμένα κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης, το οποίο περιέχει μια ελάχιστη περιοχή προαγωγού ID2 με δύο θέσεις σύνδεσης για ETV1. Η συν-επιμόλυνση του ETV1 και ID2 ρεπόρτερ σε κύτταρα COS-7 είχε ως αποτέλεσμα μία αύξηση στη δραστικότητα λουσιφεράσης. δραστηριότητα Promoter μειώθηκε με κατεργασία των κυττάρων με το ρακεμικό YK-4-279 και (S) -YK-4-279. Ωστόσο, (R) -YK-4-279 δεν ανέστειλε ETV1 μεταγραφική δραστικότητα (Εικ. 6β).

α) Ρακεμικό YK-4-279, (R) -YK-4-279 και (S ) -YK-4-279 εγχύθηκαν πάνω σε μια επιφάνεια πλακιδίου Biacore περιέχει ανασυνδυασμένο ETV1. Ρακεμικό YK-4-279 και το S-εναντιομερές συνδέεται προς ETV1 ενώ το Κ-εναντιομερές είχε μικρότερη συγγένεια δέσμευσης με ETV1. β) Ένα διεξήχθη δοκιμασία λουσιφεράσης σε κύτταρα COS-7 συν-επιμολύνθηκαν με ETV1 και ένα κατασκεύασμα λουσιφεράσης Id-2. δραστηριότητα υποκινητή Id-2 μειώθηκε κατά την αγωγή με το ρακεμικό YK-4-279 και (S) -YK-4-279. *? p όχι-σημαντική, μη ζευγαρωμένο φοιτητή t-test.

Η

Chiral διάκριση μεταξύ εναντιομερών είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό πολλών φαρμάκων, όπως μόρια, ως ενιαίο ενεργά εναντιομερή μπορούν να παρέχουν μεγαλύτερη επιλεκτικότητα για την βιολογική τους στόχους, βελτίωση του θεραπευτικού δείκτη, και εμφανίζουν καλύτερη φαρμακοκινητική από το ρακεμικό μίγμα [22]. Μπορεί επίσης να μειώσει τη συνολική δόση του φαρμάκου και να μειώσει αλληλεπιδράσεις και τοξικές παρενέργειες. Κατά την υποβολή ενός νέου φαρμάκου για την έγκριση, η αμερικανική Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) απαιτεί την ανάπτυξη για να δικαιολογήσει την επιλογή της χρήσης ενός ρακεμικού μίγματος πάνω σκευάσματα μονής εναντιομερούς.

Σε μας

in-vivo

πειράματα, LNCaP-Luc-M6 αναστολή ανάπτυξης όγκου ήταν μεγαλύτερη στα 150 mg /kg YK-4-279 σε σύγκριση με 75 mg /kg. Ωστόσο, τα ζώα που έλαβαν την υψηλότερη δόση του φαρμάκου δεν θα μπορούσε να θεωρηθεί για περισσότερο από 10-12 εβδομάδες, λόγω της εκδήλωση νεκρωτικών όγκων, η οποία απαιτούσε τα ζώα να γίνει ευθανασία. Έτσι, εκτός από την αναστολή της μετάστασης, YK-4-279 μπορεί να έχει άμεση επίδραση στον πολλαπλασιασμό σε ETS-θετικά κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Το μόνο μειονέκτημα της θεραπείας ζώων με υψηλότερες δόσεις YK-4-279 ήταν η εμφάνιση των συμπτωμάτων τοξικότητας του φαρμάκου που ξεκίνησε στις 4 εβδομάδες. Σε αυτή τη μελέτη, καταφέραμε τα συμπτώματα με τη μείωση της συχνότητας φαρμακευτική αγωγή, δίνοντας έτσι τα ζώα περισσότερο χρόνο αποκατάστασης μεταξύ των ενέσεων. Ωστόσο, προκειμένου να κινηθεί η ένωση αυτή σε κλινικό επίπεδο, περαιτέρω έρευνα είναι απαραίτητη για τη βελτίωση της

in-vivo

αποτελεσματικότητα και την αντιμετώπιση των συμπτωμάτων που προκύπτουν σε υψηλότερες δόσεις. Αυτή τη στιγμή διερευνά διάφορα σχήματα και σκευάσματα δοσολογίας για να βρείτε το ιδανικό σενάριο θεραπεία που μεγιστοποιεί on-στόχο επιπτώσεις ελαχιστοποιώντας ταυτόχρονα off-στόχου τοξικότητας του φαρμάκου. Λόγω της δομής του υδρόφοβο, η βιοδιαθεσιμότητα του YK-4-279 είναι μόνο 2% -15%, όταν χορηγείται σε ποντικούς από του στόματος καθετηριασμό [14]. Επιπλέον, η πρόσφατη φαρμακοκινητική πειράματα στο εργαστήριο μας έχουν δείξει ότι οι ενδο-περιτοναϊκή διοικήσεις των 75 mg /kg YK-4-279 αρχικά οδηγεί σε μια απότομη αύξηση στις συγκεντρώσεις του πλάσματος, αλλά ουσιαστικά καθαριστεί οδηγεί σε ~ 1 μΜ επίπεδα κατά 2 ώρες [ ,,,0],14]. Οι φαρμακοκινητικές ιδιότητες της YK-4-279, μαζί με την αδυναμία να παραδώσει μια βιώσιμη υψηλή δόση την πάροδο του χρόνου, μέσω ενέσεων βλωμού υποδηλώνει την ανάγκη να αναπτυχθεί μια συνεχή έγχυση μοντέλο για την εξασφάλιση επαρκούς παροχής φαρμάκου. Έχουμε δοκιμάσει αυτό το μοντέλο σε μοντέλο ξενομοσχεύματος σάρκωμα Ewing ενός στο γυμνό αρουραίους. Αυτά τα ζώα λαμβάνουν συνεχή έγχυση φαρμάκου μέσω ενός κεντρικού φλεβικού καθετήρα και παρουσιάζουν καλύτερη απάντηση στην YK-4-279 μεταχείρισης από την καθημερινή ενδο-περιτοναϊκή ή ενδο-φλεβική ενέσεις [21]. Περαιτέρω συνδυάζοντας φαρμακοκινητικές μετρήσεις,

in-vivo

μελέτες μοντελοποίησης και των εργαστηριακών θα μας επιτρέψει να δημιουργήσουμε μια βέλτιστη διαμόρφωση χορήγησης φαρμάκων που είναι κατάλληλη για κλινική χρήση. Επιπλέον, η επιτυχής επικύρωση της (S) -YK-4-279 ως το δραστικό συστατικό της YK-4-279 μπορεί να επιτρέψει δραστικά μειωμένη δόση θεραπείας

in-vivo.

Η

Ένα αυξανόμενο σώμα από στοιχεία δείχνουν ότι συντήξεις ETS λειτουργούν ταυτόχρονα με άλλες γονιδιωματικές μεταβολές στην έναρξη και διατήρηση των κακοηθειών προστάτη. Ανδρογόνων επαγώγιμο ειδικού προστατικού υπερέκφραση ETV1 σε διαγονιδιακά ποντίκια επάγει προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ), αλλά δεν οδηγεί σε σχηματισμό καρκινώματος. Διασχίζοντας αυτά τα διαγονιδιακά ποντίκια σε ένα PTEN

+/- φόντο ή μόνιμα ενεργό ειδικού προστατικού PI3K /Akt μονοπατιού προκαλεί διηθητικό καρκίνωμα εντός 6 μηνών, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι μετατοπίσεις ETS να συνεργάζεται με άλλες γενετικές βλάβες για την πρόκληση καρκίνου του προστάτη στους ανθρώπους [10 ], [11]. Πρόσφατα ευρήματα έχουν επίσης εντοπιστεί Poly (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP), μια βασική πρωτεΐνη επιδιόρθωσης του DNA, για να αλληλεπιδρούν με τους παράγοντες ETS σε ένα ανεξάρτητο τρόπο DNA [23]. PARP1 φαίνεται να είναι σημαντική για τη λειτουργία της πρωτεΐνης ETS, και η αναστολή της PARP1 εξασθενίζει ETS μεσολάβηση ογκογένεση και τη κυτταρική εισβολή. Οι αναστολείς PARP και PI3K /Akt μονοπατιού, όπως olaparib, rucaparib, perifosine και μιλτεφοσίνη είναι σε προχωρημένο στάδιο κλινικών δοκιμών [24] – [26]. Ένα σημαντικό κλινικό πλεονέκτημα αυτών των ευρημάτων είναι η δυνατότητα να συνδυάσει YK-4-279 με άλλα φάρμακα για να επιτευχθεί μια πιο ισχυρή και συνεργιστική ανταπόκριση, ανοίγοντας ένα ευρύ φάσμα νέων στρατηγικών με στόχο παράγοντες ETS.

Οι μεταγραφικοί παράγοντες έχουν