Αφηρημένο

Ιστορικό

πλακώδες καρκίνωμα κεφαλής και τραχήλου (SCCHN) είναι η έβδομη πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο. Δυστυχώς, η επιβίωση των ασθενών με SCCHN δεν έχει βελτιωθεί τα τελευταία 40 χρόνια, και ως εκ τούτου νέους στόχους για θεραπεία που απαιτείται. Πρόσφατα, οι αυξήσεις σε επίπεδο της ιντερλευκίνης 6 (IL-6) και την έκφραση του Twist σε δείγματα όγκων ορού βρέθηκαν να σχετίζονται με την κακή κλινική έκβαση σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των SCCHN. Αν και Twist έχει προταθεί ως κύριος ρυθμιστής της επιθηλιακής-μεσεγχυματικής μετάβασης και μετάστασης σε καρκίνους, οι μηχανισμοί με τους οποίους τα επίπεδα Twist είναι ρυθμιζόμενη μετα-μεταφραστικά δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Η πρόοδος του όγκου χαρακτηρίζεται από την εμπλοκή κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων και επαγωγή Twist έχει συνδεθεί με έναν αριθμό από αυτά τα μονοπάτια σηματοδότησης περιλαμβανομένων των IL-6. Δεδομένου ότι πολλά από τα αποτελέσματα της IL-6 διαμεσολαβούνται μέσω της ενεργοποίησης των καταρρακτών φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών, αυτό σημαίνει ότι η έκφραση Twist πρέπει να τελεί υπό αυστηρό έλεγχο κατά την μετα-μεταφραστικό επίπεδο, προκειμένου να ανταποκριθεί έγκαιρα σε εξωτερικά ερεθίσματα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η έκφραση της IL-6 αυξάνει Twist μέσω μιας μεταγραφής-ανεξάρτητο μηχανισμό σε πολλές κυτταρικές σειρές SCCHN. Περαιτέρω έρευνα αποκάλυψε ότι η IL-6 σταθεροποιεί Twist σε κυτταρικές σειρές SCCHN μέσω κινάσης καζεΐνης 2 (CK2) φωσφορυλίωση υπολειμμάτων Twist S18 και S20, και ότι αυτή η φωσφορυλίωση αναστέλλει την αποικοδόμηση της Twist. φωσφορυλίωση Twist όχι μόνο αυξάνει τη σταθερότητα της, αλλά επίσης αυξάνει την κινητικότητα των κυττάρων. Έτσι, μετα-μεταφραστική τροποποίηση της Twist συμβάλλει ιδιότητες προαγωγής όγκων της.

Συμπεράσματα /Σημασία

Η μελέτη μας δείχνει την έκφραση Twist μπορεί να ρυθμιστεί σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο μέσω φωσφορυλίωσης από CK2, που αυξάνει τη σταθερότητα Twist σε απόκριση στην IL-6 διέγερση. Τα ευρήματά μας δεν είναι μόνο η παροχή νέων μηχανιστικές γνώσεις σχετικά με μετα-μεταφραστική ρύθμιση των Twist, αλλά επίσης δείχνουν ότι CK2 μπορεί να είναι μια βιώσιμη θεραπευτικός στόχος στην SCCHN

Παράθεση:. Su YW, Xie TX, Sano D, Myers JN (2011 ) IL-6 Σταθεροποιεί Twist και ενισχύει την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων στον καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα μέσω της ενεργοποίησης της καζεΐνης κινάσης 2. PLoS ONE 6 (4): e19412. doi: 10.1371 /journal.pone.0019412

Επιμέλεια: Torbjorn Ramqvist, του Ινστιτούτου Καρολίνσκα, στη Σουηδία

Ελήφθη: 22 Δεκεμβρίου 2010? Αποδεκτές: 31 Μάρτη, 2011? Δημοσιεύθηκε: 29 Απριλίου 2011

Copyright: © 2011 Su et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το SPORE Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο στη καρκίνου κεφαλής και τραχήλου Ρ50 επιχορήγηση CA097007, τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας Κέντρο Καρκίνου CA016672 χορήγηση στήριξης, και το Πάνθεον και τον Broudy «Ανάληψη δέσμευσης για την Cure» θεμέλια. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πλακώδες καρκίνωμα κεφαλής και τραχήλου (SCCHN) είναι η έβδομη πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο [1]. Παρά τις βελτιώσεις στις τεχνικές χειρουργικής και ακτινοθεραπεία, το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών δεν έχει βελτιωθεί σημαντικά κατά τις τελευταίες δεκαετίες και παραμένει στο 50-55%. Παρά το γεγονός ότι οι τοπικές μεταστάσεις υποτροπής και της λέμφου λαιμό κόμβο ευθύνονται για το μεγαλύτερο μέρος των θανάτων από την ασθένεια αυτή, μόνο το 10-20% των ασθενών να επωφεληθούν από την ένταξη της συστημικής θεραπείας χημειοθεραπευτικών, με οριακά βελτιωμένη επιβίωση και σημαντικές τοξικές επιδράσεις [2], [3]. Ως εκ τούτου, οι νέοι στόχοι για θεραπεία που απαιτείται

Πρόσφατα, η υπερέκφραση του Twist σε κλινικά δείγματα όγκου βρέθηκε να συσχετίζεται με μετάσταση και φτωχή πρόγνωση σε ασθενείς με SCCHN καθώς και άλλων καρκίνων [4] – [7]. . Twist είναι μία εντόνως διατηρημένη παράγοντα μεταγραφής βασική έλικα-βρόχος-έλικα-που παίζει σημαντικό ρόλο στη διευκόλυνση της κυκλοφορίας των κυττάρων στην ανάπτυξη των εμβρύων. Στα καρκινικά κύτταρα, Twist θεωρείται ως ένα ογκογονίδιο, καθώς η αυξημένη έκφραση της προωθεί την εξέλιξη της νόσου και τη μετάσταση με διέγερση της μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) [8].

Παρά τη σημασία της στην εξέλιξη του όγκου, μετα-μεταγραφικής ρύθμιση των Twist δεν είναι καλά κατανοητή

Μια συγκριτική ανάλυση του mRNA Twist και την έκφραση της πρωτεΐνης Twist σε έμβρυα ποντικών έδειξαν άφθονη έκφραση Twist RNA σε presomitic μεσόδερμα, επιθηλιακά σωμίτες και πρόσθια μεσόδερμα, αλλά όχι πρωτεΐνη Twist θα μπορούσε να βρεθεί στο εκείνοι οι ιστοί [9]. Η διαφορά σημειώθηκε επίσης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του εμβρύου ποντικού, όπως Twist RNA φτάνει στο υψηλότερο επίπεδο σε 7,0 ημέρες μετά τη συνουσία, ενώ καμία πρωτεΐνη Twist θα μπορούσε να βρεθεί πριν σε 8,25 ημέρες μετά την συνουσία. Η έλλειψη αντιστοιχίας μεταξύ της έκφρασης του mRNA Twist και έκφραση πρωτεΐνης Twist υποδεικνύει ότι η έκφραση Twist ελεγχόμενη κατά τη μετα-μεταγραφικό επίπεδο [9]. Μετα-μεταγραφική τροποποίηση των παραγόντων μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένων των φωσφορυλίωση και ουβικιτινίωση, έχει αποδειχθεί ότι είναι σημαντική για τη λειτουργία τους, καθώς αυτό παρέχει ένα μηχανισμό με τον οποίο το κύτταρο μπορεί ταχέως να κινήσει μεταγραφική προγράμματα σε απόκριση σε εξωτερικά ερεθίσματα. Για παράδειγμα, έχει αναφερθεί ότι η συστροφή μπορεί να αποικοδομείται μέσω του μονοπατιού αποδόμησης ουμπικιτίνης /πρωτεασώματος, όπως η θεραπεία με έναν αναστολέα πρωτεασώματος αναστέλλει την αποικοδόμηση της Twist [10]. Υπάρχουν επίσης αποδείξεις ότι η λειτουργία του Twist μπορεί να διαμορφωθεί με φωσφορυλίωση [11], [12]. Επειδή φωσφορυλίωση συχνά εμπλέκεται στη ρύθμιση της ουμπικουϊτίνης /πρωτεασώματος εξαρτώμενη αποδόμηση μιας πρωτεΐνης [13], υποθέσαμε ότι η φωσφορυλίωση του Twist αυξάνει τη σταθερότητα της αυξάνοντας σχετικό επίπεδο έκφρασης του.

SCCHN ογκογένεσης και της εξέλιξης είναι γνωστό ότι να επηρεάζεται από πολλαπλούς παράγοντες ανάπτυξης και κυτοκινών σηματοδότησης παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της ιντερλευκίνης 6 (IL-6) [14] – [17]. Σε ασθενείς SCCHN, IL-6 επίπεδο αυξημένα στον ορό συσχετίζεται με κακή επιβίωση και δυσμενή κλινική έκβαση [14], [15], [18]. IL-6, που παράγεται είτε με διηθητικά κύτταρα του ανοσοποιητικού ή καρκινικά κύτταρα, όχι μόνο παρέχει σήματα επιβίωσης στα καρκινικά κύτταρα αλλά επίσης διευκολύνει την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων μέσω της ΕΜΤ [19], [20]. Η παραδοσιακή IL-6 σηματοδοτικό μονοπάτι είναι μέσω πρόσδεσης με sIL-6 υποδοχέα (gp80), η οποία επάγει διμερισμό της gp130 και την επακόλουθη ενεργοποίηση είτε Janus κινασών (JAK) /STAT3 σε μεταγραφή-εξαρτώμενο τρόπο, ή το Ras-ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ /Akt μονοπατιού [21]. Εκτός από την κανονική μονοπάτια, καζεΐνης κινάσης 2 (CK2) έχει επίσης πρόσφατα αναφερθεί κατάντη της IL-6 σηματοδότηση στον καρκίνο [22].

CK2 είναι μια εξαιρετικά διατηρημένη και εκφράζονται παντού κινάση σερίνης /θρεονίνης, η οποία αποτελείται δύο καταλυτικά (α ή α ‘) και δύο β ρυθμιστικές υπομονάδες [23]. Η σημασία των υπομονάδων CK2 μπορεί να αποδειχθεί με γενετικές μελέτες που δείχνουν ότι τα ποντίκια που στερούνται CK2α ή CK2β είναι εμβρυϊκά θανατηφόρες ενώ τα ποντίκια knockout CK2 α ‘είχε ελαττώματα μόνο σε σπερματογένεση [24] – [26]. CK2 έχει έρθει πρόσφατα να θεωρείται ως «κύριος κινάση», δεδομένου ότι ελέγχει τη δραστηριότητα πολλών άλλων κινασών και εμπλέκεται σε πολλές σημαντικές κυτταρικές διεργασίες [27]. Για παράδειγμα, CK2 ελέγχει τη σταθερότητα του ΙκΒα και PML ογκοκατασταλτικών μέσω φωσφορυλίωσης και τροποποίηση του ουμπικιτίνης /πρωτεασώματος αποικοδόμηση τους [28], [29]. CK2 έχει αναφερθεί ότι υπερεκφράζεται και να συσχετίζεται με κακή επιβίωση σε πολλούς τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένων των SCCHN [30] – [32]. Παραδοσιακά, CK2 θεωρείται ως συστατικά ενεργός κινάση πρωτεΐνης, αλλά αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι CK2 μπορεί να ανταποκριθεί σε πολλά ερεθίσματα παράγοντα ανάπτυξης, περιλαμβανομένων των IL-6 [22], [33], αν και οι μηχανισμοί ενεργοποίησης του παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφείς [34 ].

έχει αναφερθεί ότι STAT3, η κύρια κατάντη σήματος της IL-6 μονοπάτι, μπορεί μεταγραφικά ενεργοποιούν την έκφραση Twist [35], [36]. προκαταρκτικά στοιχεία μας έδειξαν, ωστόσο, ότι η έκφραση της πρωτεΐνης Twist αυξήθηκε από την IL-6 πριν από την ρύθμιση προς τα άνω του Twist mRNA σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές επιθετικής SCCHN, γεγονός που υποδηλώνει μεταγραφή-ανεξάρτητη ρύθμιση των Twist από την IL-6. Δεδομένου ότι πολλές από τις επιδράσεις της IL-6 διαμεσολαβούνται μέσω της ενεργοποίησης καταρρακτών φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών [21], και η φωσφορυλίωση του υποστρώματος συχνά εμπλέκονται στην ρύθμιση της ουμπικουϊτίνης /πρωτεασώματος εξαρτώμενη αποδόμηση μιας πρωτεΐνης [37], μπορούμε υποτεθεί ότι η έκφραση Twist ρυθμίζεται από IL-6-ενεργοποιημένα φωσφορυλίωση.

σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η αγωγή των κυτταρικών γραμμών SCCHN με IL-6 οδηγεί σε σταθεροποίηση της πρωτεΐνης Twist. Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι η IL-6 διεγείρει φωσφορυλίωση Twist μέσω της ενεργοποίησης της κινάσης πρωτεΐνης CK2 σερίνης /θρεονίνης. Τα ευρήματά μας δεν παρέχουν μόνο ένα μυθιστόρημα μηχανιστική αντίληψη ότι Twist ενεργοποιείται μέσω φωσφορυλίωσης από την κινάση CK2 αλλά και να έχουν σημαντικές επιπτώσεις για την πρόγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου.

Αποτελέσματα

έκφραση Twist αυξορρυθμίζεται λίγο μετά IL-6 θεραπεία

πιο κυτταρικές γραμμές μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) SCCHN και εκκρίνουν IL-6 και εκφράζουν υποδοχείς για την IL-6 (Πίνακας S1 και το Σχήμα S1) [38]. Για να μελετηθεί η επίδραση της IL-6 σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές, η έκφραση Twist εξετάστηκε κατά μήκος της χρονικής πορείας της θεραπείας. Τα στυπώματα Western από αντιπροσωπευτικά κυτταρικές γραμμές φαίνεται στο Σχήμα 1Α. έκφραση Twist προκλήθηκε σε αυτά τα κύτταρα μέσα σε 15 λεπτά μετά την αγωγή με IL-6. Σε αντίθεση, τα επίπεδα mRNA Twist παρέμεινε αμετάβλητο κατά τη διάρκεια μιας περιόδου θεραπείας παρόμοια (Σχήμα 1Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η έκφραση Twist ρυθμίζεται από την IL-6 στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο.

έκφραση (Α) πρωτεΐνη Twist προκλήθηκε λίγο μετά IL-6 θεραπεία σε κύτταρα SCCHN (OSC-19, HN31) και καρκινικά κύτταρα πνεύμονα (Α549). Μετά ασιτία ορού όλη τη νύκτα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε IL-6 θεραπεία (20 ng /ml για 0-4 ώρες), και η έκφραση Twist σε κυτταρολύματα αναλύθηκε με στύπωμα Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. έκφραση του mRNA (Β) Twist όπως ποσοτικοποιείται με πραγματικού χρόνου RT-PCR παρέμεινε ουσιαστικά αμετάβλητο καθ ‘όλη την IL-6 θεραπεία (0-6 ώρες). Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν στα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου housekeeping

GAPDH

, και εκφράζονται ως μέσος όρος φορές μεταβολή από το βασικό επίπεδο ± s.e.m. Για κάθε χρονικό σημείο, διεξήχθησαν δύο έως τέσσερις επαναλήψεις. Όλα τα πειράματα έγιναν εις διπλούν για κάθε κυτταρική γραμμή. Τα δεδομένα από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα με OSC-19 κύτταρα SCCHN δείξει. (Γ) αποικοδόμηση Twist αναστάλθηκε είτε MG132 ή IL-6. Αφού τα κύτταρα OSC-19 SCCHN υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CHX (100 μΜ), CHX συν το MG132 αναστολέα πρωτεασώματος (10 μΜ), ή CHX συν IL-6 (20 ng /ml) για 0-4 ώρες, η έκφραση Twist προσδιορίστηκε με τη δυτική κηλίδα. (D) Τα εικονοστοιχεία σε κάθε διάστημα (C) μετρήθηκαν με εικόνας J και ομαλοποιήθηκε έτσι ώστε ο αριθμός των εικονοστοιχείων στο χρόνο 0 ήταν 100%. Τα δεδομένα χαράσσονται ως log

10 της σχετικής πυκνότητας εικονοστοιχείων (γ-άξονας) έναντι του χρόνου (min). Ο χρόνος ημίσειας ζωής προσδιορίστηκε από το αρχείο καταγραφής του 50% σχετική πυκνότητα pixel. Ο χρόνος ημίσειας ζωής για Twist ήταν 1,2 ώρες με την παρουσία των CHX μόνο και & gt?. 4 ώρες με την παρουσία των CHX + IL-6

Η

Αυτή η παρατήρηση ότι η IL-6 ρυθμίζει προς τα πάνω έκφραση Twist μετά μεταγραφικά μας οδήγησε να διερευνήσει κατά πόσον η υποβάθμιση της Twist είχε με τη σειρά του διαμορφώνεται από την IL-6 θεραπεία. Οι ρυθμοί αποδόμησης του Twist σε κύτταρα SCCHN εξετάστηκαν με κατεργασία με κυκλοεξιμίδιο αναστολέα σύνθεσης πρωτεΐνης (CHX) μόνο, CHX συν τον αναστολέα πρωτεασώματος MG132, ή CHX συν IL-6. Η ποσότητα της πρωτεΐνης σε κάθε χρονικό σημείο προσδιορίστηκε με κηλίδα western και ποσοτικοποιείται με πυκνομετρία. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 1C και 1D, η ενδογενής Twist είχε ένα 1,2-h ημίσειας ζωής, αλλά όταν είτε προστέθηκε IL-6 ή MG132, λιγότερο Twist ήταν υποβαθμισμένη και δεν έφθασε ημι-ζωή κατά την περίοδο θεραπείας 4-h . Τα δεδομένα είναι συνεπή με μια προηγούμενη μελέτη που δείχνει ότι η πρωτεΐνη Twist αποικοδομείται μέσω του συστήματος αποικοδόμησης πρωτεασώματος [10] και δείχνουν ότι η πρωτεΐνη Twist σταθεροποιείται μετα-μεταφραστικά μέσω της αναστολής της αποικοδόμησης της από την IL-6.

Twist φωσφορυλιώνεται σε απόκριση στην IL-6 θεραπεία, και CK2 βρίσκεται στην οδό μεταξύ IL-6 και Twist

Επειδή η IL-6 έχει δειχθεί ότι ενεργοποιούν πολλαπλές κυτταρικές οδούς σηματοδότησης μέσω της ενεργοποίησης καταρρακτών κινάσης πρωτεΐνης, εμείς επόμενη εξετάστηκε αν Twist φωσφορυλιώνεται σε απόκριση στην IL-6 θεραπεία. Κύτταρα επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί ένα αιμοσυγκολλητίνης (ΗΑ) -Twist πρωτεΐνη σύντηξης υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-6? επακόλουθη ανοσοκαταβύθιση με αντίσωμα ΗΑ και κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα μη ειδικό αντίσωμα φωσφοσερίνη αποκάλυψε αυξημένη φωσφορυλίωση της σερίνης /θρεονίνης σε Twist (Σχήμα 2Α), επιβεβαιώνοντας ότι Twist φωσφορυλιώνεται σε απόκριση στην IL-6 διέγερση.

(Α ) Twist φωσφορυλιώθηκε σε απόκριση στην IL-6 θεραπεία. κύτταρα OSC-19 SCCHN διαμολύνθηκαν είτε με το πλασμίδιο ΗΑ-Twist ή φορέα ελέγχου για 48 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με IL-6 (20 ng /ml) για 30 λεπτά? θεραπεία και λύματα μη κατεργασμένο κυτταρικό ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντίσωμα ΗΑ και αναλύθηκαν με western blot χρησιμοποιώντας ένα μη ειδικό αντίσωμα φωσφοσερίνη. (Β) αναστολείς με γνωστές καθοδικών πορειών της IL-6 δεν ήταν σε θέση να αναστείλουν Twist αυξορρύθμιση από τον IL-6. OSC-19 κύτταρα SCCHN προκατεργάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες αναστολείς κινάσης ή διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO? Έλεγχος) για 1 ώρα, στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-6 (20 ng /ml) για 30 λεπτά. έκφραση Twist προσδιορίστηκε με κηλίδα western. (Γ) Η θέση φωσφορυλίωσης CK2 (SNSE) στο Twist, που προβλέπεται από τη χρήση των https://scansite.mit.edu/motifscan_seq.phtml, διατηρείται σε όλα τα είδη. (D) δραστηριότητα CK2 αυξήθηκε από την IL-6 και αναστέλλεται από αναστολέα CK2 DMAT σε κύτταρα SCCHN. Μετά ασιτία ορού όλη τη νύκτα, συλλέχθηκαν προϊόντα λύσης κυττάρων HN31 αγωγή με PBS (έλεγχος), IL-6 (20 ng /ml, 30 λεπτά), ή IL-6 συν DMAT (10 μΜ). Η ενδογενής δραστηριότητα CK2 στα προϊόντα λύσης κυττάρων (5 μg) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα συνθετικό υπόστρωμα πεπτιδίου CK2 (RRRADDSDDDDD? 0,1 mM) και γ-

32Ρ-ΑΤΡ ως δότη φωσφορικών όπως περιγράφηκε προηγουμένως [49]. Ο γ-άξονας αντιπροσωπεύει την αρίθμηση ανά λεπτό (CPM) της ραδιενέργειας μετά την ομαλοποίηση με τον έλεγχο χωρίς υπόστρωμα. *

P

& lt? 0,05 το Φοιτητικό

t-test

. (Ε) IL-6 που προκαλείται από έκφραση Twist αναστάλθηκε από αναστολείς CK2. έκφραση Twist μετρήθηκε μετά από θεραπεία με IL-6 (30 λεπτά) σε προϊόντα λύσης του OSC-19 SCCHN ή καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 προηγουμένως επωάζονται σε CK2 αναστολείς DMAT ή ΤΒΒ (1 ώρα). έκφραση Twist αναστάλθηκε σε δόσεις τόσο χαμηλές όσο 0.8 μΜ και δεν περιορίζεται σε ένα συγκεκριμένο κυτταρική γραμμή. (F) εξόντωση της καταλυτικής υπομονάδας της CK2 (CK2α) με shRNA έκφραση ανέστειλε πρωτεΐνη Twist. Νοκ ντάουν της CK2α στο OSC-19 κύτταρα SCCHN για 24 ώρες μείωσε σημαντικά την έκφραση Twist και μπλοκάρει την επαγωγή της από την IL-6 θεραπεία (20 ng /ml, 30 λεπτά).

Η

Για να προσδιορίσετε την κινάση υπεύθυνη για η IL-6 που προκαλείται φωσφορυλίωση της Twist, χρησιμοποιήσαμε μία στρατηγική διαλογής αναστολέα χημικών να προσδιοριστεί αν η IL-6 με τη μεσολάβηση αυξητική ρύθμιση Twist μπορεί να μπλοκαριστεί από αναστολείς κινάσης που είναι γνωστό ότι είναι προς τα κάτω του μονοπατιού σηματοδότησης. Twist ρυθμίζεται αυξητικά από την IL-6, παρά την εφαρμογή των αναστολέων κλείδωμα JAK (AG490), PI-3K (Wortmannin), Erk (U0126), p38 ΜΑΡΚ (SB202130), ή Jun

Ν

-τερματική κινάση (SP600125) , υποδεικνύοντας ότι η ρύθμιση προς τα πάνω Twist είναι ανεξάρτητη από αυτές τις οδούς (Σχήμα 2Β). Εφόσον καμία από τις γνωστές οδούς που δοκιμάσαμε φαίνεται να εμπλέκεται στην μεσολάβηση της IL-6 που προκαλείται από την έκφραση Twist, έχουμε την επόμενη σαρωθεί την αλληλουχία αμινοξέων στην υπολογιστική πρωτεΐνη πρόβλεψη οικογένεια webserver https://scansite.mit.edu/motifscan_seq.phtml και προσδιόρισε μια συναίνεση υπόστρωμα CK2 μοτίβο (SNSE) εντός Twist στα κατάλοιπα 18 έως 21, που είναι διατηρημένη μεταξύ των ειδών (Σχήμα 2C)

CK2 είναι μία κινάση σερίνης /θρεονίνης.? αυξάνοντας πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του SCCHN [32], [39]. Είχε προηγουμένως θεωρηθεί ως συστατικά ενεργός ενδοκυτταρική κινάση, αλλά αρκετά πρόσφατα ευρήματα έδειξαν ότι CK2 μπορεί να ενεργοποιηθεί σε απόκριση σε εξωτερικά ερεθίσματα όπως η IL-6, αν και οι υποκείμενοι μηχανισμοί για αυτήν την ενεργοποίηση παραμένουν ασαφείς [22], [34]. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, η δραστικότητα CK2 στα κυτταρολύματα SCCHN ρυθμίζεται αυξητικά από την IL-6 και αναστέλλεται από CK2-ειδικό αναστολέα 2-διμεθυλαμινο-4, 5, 6, 7-τετραβρωμο-1Η-βενζιμιδαζόλιο (DMAT), όπως καθορίζεται από μια CK2 δοκιμασία δραστικότητας κινάσης που χρησιμοποιείται ένα συνθετικό υπόστρωμα πεπτιδίου CK2 και γ-

32Ρ-ΑΤΡ ως δότη φωσφορικών (Σχήμα 2D).

Για να καταδειχθεί περαιτέρω ότι CK2 είναι στη διαδρομή μεταξύ IL-6 και Twist, εξετάσαμε έπειτα έκφραση Twist παρουσία IL-6 και CK2 αναστολείς DMAT ή 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole (ΤΒΒ). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Ε, IL-6 που προκαλείται από έκφραση Twist αναστάλθηκε είτε αναστολέα CK2 και αυτή η αναστολή παρατηρήθηκε σε διάφορες κυτταρικές σειρές. Οι επιδράσεις της CK2 επί IL-6 που προκαλείται από έκφραση Twist επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με knockdown του καταλυτικού CK2α υπομονάδα σε κυτταρικές γραμμές SCCHN, στην οποία μειώθηκαν τόσο τα βασικά επίπεδα της έκφρασης Twist και εκείνων μετά IL-6 θεραπεία (Σχήμα 2F). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά επιβεβαιώνουν περαιτέρω τη σημασία της CK2 με την IL-6 που προκαλείται από τη σταθεροποίηση της Twist.

CK2 συνεργάτες με, φωσφορυλιώνει και σταθεροποιεί Twist

επόμενο εξέτασε κατά πόσον CK2 και Twist είναι που συνδέονται μεταξύ τους με τη χρήση πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης. Πρώτα χρησιμοποιήσαμε προϊόντα λύσης που παρασκευάζονται από κύτταρα ΗΕΚ 293Τ επιμολύνθηκαν με αμφότερα άγριου τύπου Myc-Twist και CK2α. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, CK2α ανιχνεύθηκε σε κηλίδες Western ανοσοκαταβύθισης διεξήχθη με Myc αντίσωμα και Myc-Twist ανιχνεύθηκε στα στυπώματα Western του ανοσοκαταβύθισης διεξήχθη με CK2α αντίσωμα. Ελέγχου ανοσοκαθιζάνει τη χρήση μη ειδικής IgG δεν καθιζάνουν είτε πρωτεΐνη. Τα στοιχεία δείχνουν ότι οι πρωτεΐνες μπορούν να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Για να εξεταστεί περαιτέρω η αλληλεπίδραση μεταξύ ενδογενούς CK2α και πρωτεΐνη στα κύτταρα Twist SCCHN, η κυτταρική γραμμή FaDu επιλέχθηκε επειδή εκφράζει ένα υψηλό βασικό επίπεδο CK2 πρωτεΐνης? HN31 SCCHN κύτταρα που εκφράζουν σταθερά Myc-tagged Twist (κύτταρα HN31 Myc-Twist SCCHN) καθορίστηκαν για τους σκοπούς ανοσοκατακρήμνιση λόγω της κακής απόδοσης από τα εμπορικά διαθέσιμα αντισώματα Twist. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, ενδογενή Twist σε κύτταρα FaDu SCCHN συν-ανοσοκαταβυθίζεται με ένα αντίσωμα αντι-CK2α. Σε HN31 Myc-Twist κύτταρα SCCHN, τα οποία εκφράζουν σταθερά με Myc Twist, ενδογενής CK2α ήταν επίσης συν-καθιζάνει με τις ανοσοκαθιζήματα αντι-Μγο. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι μπορεί να ρυθμίσει CK2 Twist δείχνοντας ότι αυτές οι δύο πρωτεΐνες φυσικώς συνδέουν μεταξύ τους

(Α) & amp?. (Β) Bi-directional συν-ανοσοκατακρήμνιση έδειξε ότι CK2α σχετίζεται με συστροφή. (Α) συνανοσοκαθίζησης έγινε σε λύματα από κύτταρα ΗΕΚ 293Τ επιμολυσμένα με τόσο WT Myc-Twist και CK2α. CK2α συν-ανοσοκαταβυθίστηκε με Myc-Twist και το αντίστροφο. (Β) Κυτταρολύματα από FaDu (αριστερά) ή HN31 κύτταρα, τα οποία εκφράζουν σταθερώς WT Myc-Twist (δεξιά), ανοσοκαταβυθίστηκαν με CK2α (σε κύτταρα FaDu) ή αντισώματος Myc (σε κύτταρα HN31 WT Myc-Twist) και υποβλήθηκε σε δυτικές ανάλυση κηλίδος. Η ενδογενής Twist συν-ανοσοκαταβυθίζεται με CK2α σε κυτταρολύματα FaDu, και ενδογενών CK2α βρέθηκε στα Myc-ανοσοκαταβυθίσματα από προϊόντα λύσης κυττάρου Twist HN31 Μγο-WT. (C) Co-ανοσοκαταβυθίστηκαν CK2α στα ανοσοκαθιζήματα HN31 Myc-Twist αυξήθηκε από την IL-6 (20 ng /ml, 20 λεπτά) και αναστέλλεται από προ-θεραπεία με ένα αντίσωμα έναντι υποδοχέα IL-6, tocilizumab (50 ng /ml, 45 min). (D) CK2 φωσφορυλιωμένη Twist. Μια δοκιμασία κινάσης ανοσοσυμπλόκου έγινε σε Myc-ανοσοϊζήματα από λύματα κυττάρων ΗΕΚ 293Τ παροδικά υπερεκφράζουν WT Myc-Twist ή Myc -S18,20A Twist. Η ανασυνδυασμένη κινάση CK2 και γ-

32Ρ-ΑΤΡ προστέθηκαν στα ανοσοϊζήματα στους 30 ° C για 15 λεπτά, και η αντίδραση διακόπηκε με προσθήκη ρυθμιστικού δείγματος SDS και θέρμανση στους 95 ° C για 5-10 λεπτά. Τα δείγματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση και μεταφέρθηκαν επί μεμβράνης πολυβινυλιδενο φθοριδίου για αυτοραδιογραφία ή ανάλυση κηλίδος western. (Ε) Η σταθερότητα των Twist επηρεάστηκε από την ιστοσελίδα της φωσφορυλίωσης CK2. [Κύτταρα HN31 SCCHN εκφράζουν σταθερά WT Myc-Twist, τη CK2 hypophosphomimetic μεταλλαγμένο Myc-S18,20A Twist, ή τη φωσφορυλίωση-μιμητική μεταλλαγμένο Twist Myc-S18,20D ήταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με CHX (100 μΜ) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. έκφραση Myc-Twist στα κυτταρικά λύματα προσδιορίστηκε με κηλίδα western. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι υπολογισθείσες ημιζωές (t1 /2) από τα τριπλά πειράματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± s.e.m. *

P

& lt?. 0.05 από το Φοιτητικό

t-test

Η

Για να εξεταστεί κατά πόσον η αλληλεπίδραση μεταξύ Twist και CK2α είναι η IL-6 που εξαρτώνται, συνεργασία ανοσοκαθίζηση επαναλήφθηκε σε Myc-Twist-σταθερή κυτταρική γραμμή HN31 μετά από σύντομη κατεργασία με IL-6 (20 λεπτά). Επειδή HN31 εκφράζει υψηλά επίπεδα ενδογενούς IL-6 (Πίνακας S1), ένα μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του υποδοχέα της IL-6, tocilizumab, χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση της αλληλεπίδρασης τους υπό αποκλεισμό της IL-6 σηματοδότηση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, αυξημένη CK2α συν-ανοσοκαταβυθίζεται με Μγο-Twist μετά IL-6 θεραπεία, αλλά δεν βρέθηκε στα ανοσοϊζήματα από κύτταρα προκατεργάστηκαν με tocilizumab για 45 λεπτά.

Για να καθοριστεί εάν CK2 φωσφορυλιώνει Twist στο υπολείμματα S18 /S20, η υποθετική θέση φωσφορυλίωσης από την υπολογιστική πρόβλεψη μας, πραγματοποιήσαμε ένα ανοσοσύμπλοκο δοκιμασία κινάσης σε κύτταρα ΗΕΚ 293Τ που υπερεκφράζουν είτε άγριου τύπου (WT) Myc-Twist ή μεταλλαγμένες Myc-Twist στην οποία S18 και S20 είναι υποκατεστημένα με αλανίνη ( S18,20A Twist). Καθαρισμένο CK2 κινάσης φωσφορυλιωμένη WT Twist, αλλά φωσφορυλίωση καταργήθηκε με την παρουσία του DMAT αναστολέα CK2 και έντονα μειωμένη σε μεταλλαγμένα S18,20A Twist (Σχήμα 3D).

Για να ελέγξετε αν η σταθερότητα του Twist επηρεάζεται από το θέση φωσφορυλίωσης, είχαν καθιερώσει σταθερές κύτταρα HN31 υπερεκφράζουν WT Twist, S18,20A Twist, ή φωσφορυλίωση μιμούνται στην οποία S18 και S20 είναι μεταλλαγμένη σε ασπαρτικό οξύ (S18,20D Twist). Μετά την κατεργασία των κυττάρων με CHX, οι υπολογιζόμενες ημίσειας ζωής για S18,20D Twist, S18,20A Twist, και WT Twist από τα τρία πειράματα ήταν 9,62 ± 0,99 h για S18,20D Twist, 2,45 ± 0,59 h για S18,20A Twist , και 4,69 ± 0,73 ώρες για WT Twist (Σχήμα 3Ε). Όλα τα

P

τιμές για τη σύγκριση των μέσων από οποιεσδήποτε δύο ομάδες με το Student

t-test

ήταν μικρότερη από 0,05. Αυτό υποστηρίζει την υπόθεση ότι η φωσφορυλίωση της Twist από CK2 ενισχύει τη σταθερότητα Twist. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η CK2 συνεργάτες με και φωσφορυλιώνει Twist, και ότι η φωσφορυλίωση σε S18 και S20 σταθεροποιεί Twist.

CK2 και Twist εμπλέκονται στην IL-6-προωθείται κυτταρική κινητικότητα

επόμενη εξέτασαν τις επιδράσεις της IL-6, η αναστολή CK2, και Twist knockdown στην κινητικότητα των κυττάρων SCCHN, όπως μετράται με την επούλωση πληγών και προσδιορισμούς μετανάστευσης Boyden θαλάμου. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 4Α και 4Β, η μετανάστευση των OSC-19 κύτταρα SCCHN σε μία δοκιμασία επούλωση πληγών μηδέν 12-h προωθήθηκε από την IL-6 και καταστέλλεται από την DMAT αναστολέα CK2, ενώ το ποσοστό σχετικής πολλαπλασιασμού σε κάθε ομάδα υποβλήθηκαν σε καμία σημαντική μεταβολή (Σχήμα 4C). Εξόντωση Twist σε OSC-19 κύτταρα βαθιά κατασταλεί κυτταρική κινητικότητα, υποδεικνύοντας σημαντικό ρόλο της στην κυτταρική μετανάστευση (Σχήμα 5Α, άνω πάνελ). Μετά την επεξεργασία με IL-6 επί 24 ώρες, η μετανάστευση αυξήθηκε, αλλά η αύξηση αυτή αναστράφηκε στα Twist knockdown ομάδες (Σχήμα 5Α, μεσαίο πλαίσιο). IL-6-προωθείται κυτταρική μετανάστευση αναστέλλεται από αναστολέα CK2 καθώς knockdown του Twist, υποδηλώνοντας ότι και οι δύο CK2 και Twist εμπλέκονται στο σήμα που προκαλείται από τη μετανάστευση. Είμαστε δίπλα σε σύγκριση με την κινητικότητα των κυτταρικών σειρών που εκφράζουν σταθερά WT ή μεταλλαγμένης Twist

in vitro

. Παρά το φόντο της υψηλής ενδογενούς έκκριση IL-6 και η ύπαρξη των ενδογενών Twist σε κύτταρα HN31 SCCHN, η υπερέκφραση του WT, αλλά όχι S18,20A, Twist προωθείται κυτταρική μετανάστευση σε σχέση με το μάρτυρα (Σχήμα 5Β, άνω πάνελ?

P

& lt? 0,05). Επιπλέον, η υπερέκφραση του S18,20D συστροφή αυξήθηκε περαιτέρω κυτταρική κινητικότητα σε σχέση με εκείνη των κυττάρων που εκφράζουν είτε WT ή S18,20A Twist, υποδεικνύοντας ότι αυτή η μετάλλαξη οδηγεί σε αυξημένη κυτταρική κινητικότητα.

(Α) Εικόνες για την κυτταρική μετανάστευση SCCHN με δοκιμασία επούλωση της πληγής παρουσιάζονται. OSC-19 κύτταρα SCCHN υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS (έλεγχος), IL-6 (20 ng /ml), DMAT (20 μΜ), ή και των δύο IL-6 και DMAT σε μέσο 2% όπως υποδεικνύεται. Οι συρρέουσες μονοστοιβάδες κυττάρων τραυματίστηκαν με απόξεση με ρύγχος πιπέτας 200 μL. Εικόνες από τις γρατζουνιές αποκτήθηκαν σε 0 και 12 ώρες. (Β) Οι ποσοτικές μετρήσεις της σχετικής μετεγκατεστημένα απόσταση αναλύθηκαν με Image J. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± s.e.m. της σχετικής μετεγκατεστημένο απόσταση. *

P

& lt? 0,05 το Φοιτητικό

t-test

. ρυθμό πολλαπλασιασμού (C) Cell υπό κάθε συνθήκη στο (Α) μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ για 12 ώρες. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων δεν έχουν στατιστική σημασία.

Η

(Α) Νοκ ντάουν του Twist ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων SCCHN στη δοκιμασία μετανάστευσης θάλαμο Boyden. κύτταρα OSC-19 SCCHN πρώτα επιμολυσμένα με φορέα μάρτυρα ή Twist Τα siRNAs για 24 ώρες σε μέσο με ή χωρίς IL-6 (20 ng /ml). Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θρυψίνη, μετρήθηκαν, και προσδιορίστηκαν για κινητικότητα κυττάρου χρησιμοποιώντας δοκιμασία μετανάστευσης θάλαμο Boyd μετά από 20 ώρες. Άνω & amp? μεσαίο πάνελ: Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± s.e.m. των κυττάρων μετράει από τέσσερις διαφορετικές μικροσκοπικές προβολές κάτω πεδίο ισχύος. *

P

& lt? 0,05 το Φοιτητικό

t-test

. Κάτω πίνακας: έκφραση Twist για τα αντίστοιχα πειράματα στα ανώτερα και μεσαία πάνελ ανιχνεύθηκε με στύπωμα Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Η μετάλλαξη Twist μεταβληθεί μετανάστευση των κυττάρων SCCHN. Η κινητικότητα των κυττάρων HN31 SCCHN σταθερώς εκφράζουν WT Myc-Twist ή υποδεικνύονται μεταλλαγμένη πρωτεΐνη Myc-Twist εξετάστηκε με τη δοκιμασία μετανάστευσης θάλαμο Boyden μετά από 20 ώρες. Πάνω πίνακας: Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± s.e.m. των κυττάρων μετράει από τέσσερις διαφορετικές μικροσκοπικές προβολές κάτω πεδίο ισχύος. *

P

& lt? 0,05 το Φοιτητικό

t-test

. Μεσαίο πάνελ: αντιπροσωπευτικό εικόνες από τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν από τις αντίστοιχες μεμβράνες μεταξύ φρεατίων σε χαμηλή μεγέθυνση τομέα ηλεκτρικής ενέργειας. Κάτω πίνακας: κηλίδες Western για τα αντίστοιχα πειράματα στο άνω φύλλο του (Β). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C) Cell πολλαπλασιασμό κάθε συνθήκη στο (Β) όπως μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ για 20 ώρες. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων δεν έχουν στατιστική σημασία.

Η

Συζήτηση

Αυτή η έκθεση δείχνει μια νέα μετα-μεταφραστική phosphoregulation των Twist από την IL-6 μέσω της ενεργοποίησης των CK2 στα κύτταρα SCCHN. Αυτή η μετα-μεταφραστική τροποποίηση μπορεί να σταθεροποιήσει Twist, επιτρέποντάς της να ρυθμίζει την κυτταρική κινητικότητα, παρέχοντας στοιχεία ενός νέου μηχανισμού για τη ρύθμιση Twist σε καρκινικά κύτταρα.

Δημοσιεύθηκε εκθέσεις έχουν ενοχοποιηθεί τόσο Twist και IL-6 στην ανάπτυξη /εξέλιξη του καρκίνου, ως εκφράσεις τους είναι ανιχνεύσιμα σε πολλούς επιθηλιακούς όγκους ή στον ορό των ασθενών και σχετίζονται με δυσμενή κλινικά αποτελέσματα [4], [16], [18]. Αν και έχει αναφερθεί ότι η IL-6 και κατάντι μεσολαβητής σήματος, STAT3, μπορεί να αυξήσει την έκφραση Twist μέσω μεταγραφή σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού [20], [35], [36], αυτό δεν αποκλείει το μηχανισμό μετα-μεταφραστικών τροποποίηση της έκφρασης Twist. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, η έκφραση επάγεται Twist λίγο μετά IL-6 θεραπεία παρά την αναστολή της φωσφο-STAT3 με χημικό αναστολέα AG490 ή SB202130 σε υψηλότερες δόσεις, υποδεικνύοντας ότι η αυξητική ρύθμιση Twist είναι ανεξάρτητη STAT3. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 1Α και 1Β, η έκφραση της πρωτεΐνης Twist σημαντικά αυξημένη πριν τις αλλαγές στην έκφραση του mRNA Twist σε κυτταρικές γραμμές SCCHN. Τα ευρήματα αυτά δεν έρχονται σε αντίθεση με εκείνα μιας προηγούμενης μελέτης από Lo

et al

[36], στο οποίο πρωτεΐνη Twist προκλήθηκε σε 1 ώρα μετά την ενεργοποίηση του EGFR-φωσφο-STAT3 μονοπατιού ενώ τα επίπεδα mRNA Twist αυξήθηκε μόνο μετά από 2 ώρες της θεραπείας. Παρά το γεγονός ότι δεν συζητήθηκε στην προηγούμενη εργασία, η διαφορά μεταξύ του mRNA Twist και η έκφραση της πρωτεΐνης στη μελέτη μας υποδεικνύει την ύπαρξη μιας μετα-μεταγραφικό ρυθμιστικό μηχανισμό σε διάφορες κυτταρικές σειρές.

Τα στοιχεία μας αποδεικνύουν ότι η πρωτεΐνη Twist μπορεί να είναι φωσφορυλιωμένη και σταθεροποιείται με IL-6 σε κυτταρικές γραμμές SCCHN, υποστηρίζοντας την ιδέα ότι phosphoregulation μεταγραφικών παραγόντων χρησιμοποιείται συχνά με πολλαπλές οδούς κυτταρικής σηματοδότησης για την έγκαιρη απόκριση σε εξωτερικά ερεθίσματα [37]. Αν και Twist phosphoregulation έχει περιγραφεί σε μελέτες μεταλλάξεων Twist σε ασθενείς με σύνδρομο Saethre-Chotzen, αυτοσωματικό κυρίαρχο διαταραχή κρανιοσυνοστέωση [11], ο ρόλος των phosphoregulation του Twist σε καρκινικά κύτταρα, με τις γνώσεις μας, έχει συζητηθεί σε λίγα μόνο μελέτες [12], [40]. Η θέση φωσφορυλίωσης CK2 (S18 και S20) που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη βρίσκεται εντός του μοτίβου NSEEE, ένας από τους πέντε τομείς εξελικτικά συντηρημένη στην αλληλουχία αμινοξέων Twist, των οποίων η λειτουργία δεν είναι σαφής [41]. Το εύρημά μας μπορεί να βοηθήσει στη βελτίωση της κατανόησης του τομέα αυτού, αφού CK2 είναι συνδεδεμένο με πολλούς αυξητικό παράγοντα ή κυτοκίνη μονοπάτια, όπως IL-6 και επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF), στην οποία Twist συμμετέχει επίσης [20], [22], [ ,,,0],33], [36].

είναι ενδιαφέρον ότι, οι παράγοντες αυτοί είναι επίσης πολύ γνωστό ότι επηρεάζουν την ογκογένεση και την εξέλιξη του SCCHN [16]. Αναλύσαμε την μετα-μεταγραφική ρύθμιση των Twist σε απόκριση σε άλλες SCCHN-σχετικές κυτοκίνες /αυξητικούς παράγοντες και διαπίστωσε ότι η λειτουργία της σταθεροποίησης Twist δεν περιορίζεται σε IL-6. Άλλοι σημαντικοί παράγοντες ανάπτυξης σε SCCHN, όπως EGF και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα C, σταθεροποιούν επίσης τα επίπεδα Twist [Εικόνα S2]. Αυτό υποδηλώνει ότι ένας κοινός μηχανισμός μπορεί να συμμετέχει στη ρύθμιση της Twist σε SCCHN, και ότι μπορεί να είναι ενδιαφέρον να γνωρίζουμε τον ρόλο της CK2 σε αυτά τα μονοπάτια σηματοδότησης.

Ο μηχανισμός μέσω του οποίου ενεργοποιείται CK2 παραμένει ασαφές [34] . Αν και έχει δειχθεί ότι η ενεργοποίηση CK2 είναι Erk-εξαρτώμενη σε κύτταρα νευροβλαστώματος [33], η φαρμακολογική αναστολή της Erk με U0126 στη μελέτη μας δεν αποκλείουν την IL-6 μεσολάβηση αύξηση στην έκφραση Twist (Σχήμα 2Β). Αυτό υποδηλώνει ότι μπορεί να υπάρχουν κύτταρο μεσολαβητές πλην Erk που μπορούν να ενεργοποιήσουν CK2. Είτε αυτό είναι το είδος των κυττάρων ειδικές ανάγκες που πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω.

Η μετάσταση είναι η κύρια απειλή για την υγεία και την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο και τη διαχείρισή του αποτελεί πρόκληση για τους επαγγελματίες υγείας. Από Twist θεωρείται ως κύριος ρυθμιστής της ΕΜΤ και μετάσταση για καρκίνους [8], ρύθμιση προς τα κάτω του Twist σε καρκινικά κύτταρα έχει προταθεί ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση, δεδομένου ότι ευαισθητοποιεί όχι μόνο τα κύτταρα στη χημειοθεραπεία και προάγει την κυτταρική απόπτωση αλλά επίσης αναστέλλει τα κύτταρα «μεταναστευτικών και επεμβατική ικανότητες [33], [42].