Αφηρημένο

Ιστορικό

Claudins είναι γνωστά ως σφιχτό πρωτεΐνες διασταύρωση, και το μοτίβο έκφρασης τους σε γαστρικό καρκίνο εξακολουθεί να είναι αμφιλεγόμενη. Η σχέση μεταξύ των προτύπων έκφρασης των πρωτεϊνών σφιχτό κόμβο και τον πολλαπλασιασμό των όγκων σε πρώιμο γαστρικό καρκίνο είναι ακόμη πολύ σαφές.

Στόχοι

Για να διερευνήσει τα πρότυπα έκφρασης των κλαουδίνης-18 και Κ-67 στο νωρίς γαστρικού καρκίνου στο μεταναστευτικό μέτωπο και γύρω φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνο και να ερευνήσει τη βιολογική λειτουργία του κλαουδίνης-18 στον πολλαπλασιασμό και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων.

Μέθοδοι

Εβδομήντα πέντε νωρίς γαστρικού καρκίνου αλλοιώσεις απομακρύνεται μέσω ενδοσκοπικής βλεννογόνου εκτομή ή ενδοσκοπική εκτομή υποβλεννογόνια αξιολογήθηκαν. Όλα γαστρικό καρκίνο βλάβες διαγνώστηκαν ως διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα χρησιμοποιώντας την ιαπωνική ταξινόμηση των γαστρικού καρκινώματος. Για την εκτίμηση των επιθηλιακών πολλαπλασιασμός, ανοσοχρώση με Ki-67 εκτελέσθηκε, και ο δείκτης επισημάνσεως υπολογίσθηκε. Για να εκτιμηθεί η έκφραση των επιθηλιακών σφιχτό πρωτεϊνών διασταύρωση, ανοσοφθορισμού χρώση κλαουδίνης-18 εκτελέστηκε. Η ανοσοαντιδραστικότητα κλαουδίνης-18 βαθμολογήθηκε σύμφωνα με τον αριθμό των χρωματισμένων κυττάρων. ανάλυση συσχέτισης πραγματοποιήθηκε από ο συντελεστής Spearman του. Η επιμόλυνση του κλαουδίνης-18 μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) πραγματοποιήθηκε σε ΜΚΝ74, μία κλαουδίνης-18-θετικά γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή, για να διερευνηθεί η επίδραση της κλαουδίνης-18 επί του πολλαπλασιασμού και της εισβολής των καρκινικών κυττάρων.

Αποτελέσματα

κλαουδίνης-18 ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε καρκίνο του στομάχου σε σύγκριση με τις γύρω γαστρικό βλεννογόνο κανονική ή εντερική μεταπλασία. Ο δείκτης σήμανσης Κϊ-67 του γαστρικού καρκίνου στο μεταναστευτικό μέτωπο ήταν αντιστρόφως ανάλογη με το επίπεδο κλαουδίνης-18, αλλά ότι, κατά τη βλάβη του βλεννογόνου δεν συσχετιζόταν. Κλαουδίνης-18 knockdown προώθησε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των ΜΚΝ74 σύγκριση με κύτταρα ελέγχου siRNA επιμολυσμένα. ΜΚΝ74 εισβολή αυξήθηκε σημαντικά με κλαουδίνης-18 siRNA διαμόλυνση σε σύγκριση με την επιμόλυνση siRNA ελέγχου.

Συμπεράσματα

τα κάτω ρύθμιση του κλαουδίνης-18 συνδέεται με το πολλαπλασιαστικό δυναμικό στο μεταναστευτικό μέτωπο του γαστρικού καρκίνου, γεγονός που υποδηλώνει ότι έχει ένα κεντρικό ρόλο στη γαστρική εξέλιξης του καρκίνου

Παράθεση:. Oshima Τ, Shan J, Okugawa Τ, Chen X, Hori Κ, Tomita T, et al. (2013) κάτω ρύθμιση των κλαουδίνης-18 συνδέεται με την πολλαπλασιαστική και Επεμβατική Δυναμικό του γαστρικού καρκίνου στο μεταναστευτικό μέτωπο. PLoS ONE 8 (9): e74757. doi: 10.1371 /journal.pone.0074757

Επιμέλεια: DunFa Peng, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 28, 2013? Αποδεκτές: 6 Αυγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Oshima et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας μέσα από μια Grant-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (C) 2010-2012 (Νο 22590691). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι η τέταρτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται κακοήθεια και η δεύτερη πιο κοινή αιτία της θνησιμότητας του καρκίνου που σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1], [2]. Εντός του βλεννογόνου GC μπορεί να αντιμετωπιστεί θεραπευτικά μέσω ενδοσκοπικής θεραπείας. Επιπλέον, η (ESD) τεχνική ενδοσκοπική υποβλεννογόνια εκτομή έχει επεκτείνει τις ενδείξεις για ενδοσκοπική θεραπεία και επέτρεψε en bloc εκτομή του εντός του βλεννογόνου μεγάλα και ελαφρώς υποβλεννογόνιο επεμβατική νωρίς GCs [3]. Μια en bloc εκτομή από ESD επιτρέπει την ακριβή διάγνωση του καρκίνου του βάθους [4].

Σφιχτά κόμβους (TJS) είναι εξειδικευμένοι τομείς της μεμβράνης στην πιο ακραία περιοχή του πολωμένου επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα [5]. Claudins είναι οι κύριες πρωτεΐνες TJ? αποτελούνται από τουλάχιστον 27 πρωτεΐνες μέλος και εκφράζονται σε ένα ιστό-ειδικό τρόπο [6], [7]. Ρυθμίζουν την παρακυτταρική διαπερατότητα και να δημιουργήσουν επιθηλιακών κυττάρων πολικότητα από τη λειτουργία φράχτη τους [6], [8]. Ένα αυξανόμενο σώμα της πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι claudins αποτελούν βασικά δομικά και λειτουργικά στοιχεία των TJ σκέλη [6], [9], και μπορούν να παίξουν καθοριστικό ρόλο στην ογκογένεση και τη φλεγμονή [10], [11].

Η γαστρική επιθήλιο εμφανίζει μια σειρά αλλαγών στο κλαουδίνης έκφραση από την κανονική βλεννογόνο προς εντερικής μεταπλασίας και το αδενοκαρκίνωμα. Αν και GCs πρόσφατα χαρακτηρισθεί από την έκφραση βλεννίνης με βάση [12], [13], μια ταξινόμηση GC κλαουδίνης-based έχει επίσης προταθεί [14]. Έχουμε επίσης αναφερθεί ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του κλαουδίνης-3 σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό των εντός του βλεννογόνου GC [15]. Πρόσφατα, τα ποντίκια knock-out κλαουδίνης-18 έδειξαν να έχουν γαστρική ατροφία του βλεννογόνου και paracellular H

+ ιόντων διαρροής [16]. Κλαουδίνης-18Α2 δείχθηκε να είναι συχνά ρυθμίζεται προς τα κάτω σε GC ενός εντερικού φαινότυπο, υποδηλώνοντας ότι κλαουδίνης-18Α2 θα ήταν ένας καλός δείκτης για GC [17]. Ωστόσο, η βιολογική λειτουργία του κλαουδίνης-18, το οποίο μπορεί να εμπλέκεται στη συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων, δεν έχει ποτέ εξεταστεί. Επιπλέον, δεν είναι σαφές ποια χαρακτηριστικό των κυττάρων GC στο μεταναστευτικό μέτωπο σχετίζεται με την ταχεία ανάπτυξη ή επιθετικότητα εισβολής.

Στην παρούσα μελέτη, το επίπεδο έκφρασης της κλαουδίνης-18 σε GC στο μεταναστευτικό μέτωπο και γύρω γαστρικό βλεννογόνο εξετάστηκε για πρώτη φορά, και ο συσχετισμός μεταξύ του επιπέδου κλαουδίνης-18 και του δείκτη επισήμανσης Ki-67 (LI) σε GC αξιολογήθηκε. Η επίδραση της κλαουδίνης-18 στον πολλαπλασιασμό και τη διεισδυτικότητα

in vitro

εξετάστηκε επίσης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς

Μια συνεχόμενη σειρά 74 ασθενών με πρώιμη GC μελετήθηκαν (Πίνακας 1). αλλοιώσεις GC (n = 75) που είχαν υποβληθεί σε θεραπευτική EMR ή ESD αξιολογήθηκαν. GCs με υποβλεννογόνια εισβολή (n = 31) συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Διπλό καρκίνοι ανιχνεύθηκαν μόνο σε ένα άνδρα ασθενή. Όλα τα GC ταξινομήθηκαν ως διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα χρησιμοποιώντας την ιαπωνική ταξινόμηση των γαστρικού καρκινώματος [18]. ανωνυμία των ασθενών διατηρήθηκε. Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι και εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας /επιτροπή δεοντολογίας του Hyogo College of Medicine. Το θέμα έδωσαν γραπτή συγκατάθεση.

Η

Η ανοσοϊστοχημεία

Τα δείγματα μονιμοποιήθηκαν με διάλυμα φορμόλης 10% και ενσωματωμένα σε παραφίνη. Οι τομές κόβονται σε πάχος 3 μm και βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ). Για την εκτίμηση των επιθηλιακών πολλαπλασιασμός, τα δείγματα επωάστηκαν με Ki-67 μονοκλωνικό αντίσωμα (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενές αντίσωμα βιοτινυλιωμένο αλόγου-αντι-ποντικού (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Η στρεπταβιδίνης-βιοτίνης πολύπλοκη μέθοδο (Vector Laboratories) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση της ανοσοαντιδραστικότητας. Οι πυρήνες με αιματοξυλίνη.

χρώση ανοσοφθορισμού συνενώσεως Πρωτεΐνες

Rabbit anti-κλαουδίνης-18 πολυκλωνικό αντίσωμα (Invitrogen) και Cy3-συζευγμένο IgG αίγας αντι-κουνελιού (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove , ΡΑ, USA) δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκαν για να απεικονίσει ανοσοαντιδραστικότητα. Η εξειδίκευση της αντίδρασης ελέγχθηκε με επώαση με μη-άνοσο ορό κουνελιού (Dako, Glostrup, Δανία).

Βαθμολόγηση Ανοσοβαφή κλαουδίνης-18 και Ki-67

Η ανοσοαντιδραστικότητα αξιολογήθηκε από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές (T.Ok., XC), και οι δύο ήταν τυφλοί στα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και τα κλινικά αποτελέσματα που σχετίζονται με κάθε δείγμα. αξιολογήθηκαν μη νεοπλασματικές γαστρικό βλεννογόνο χωρίς εντερική μεταπλασία (μη-IM) και με εντερική μεταπλασία (IM) και περιοχές καρκίνο. Η ανοσοαντιδραστικότητα κλαουδίνης-18 βαθμολογήθηκε χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα κριτήρια: 0, απουσία χρώσης μεμβράνης? 1+, λιγότερο από το 10% των καρκινικών κυττάρων με πλήρη λεκέ μεμβράνη? 2+, 10% έως 50% των κυττάρων όγκου με πλήρη χρώση μεμβράνη? 3+, περισσότερο από το 50% έως 75% των κυττάρων όγκου με πλήρεις, χρώση ισχυρή μεμβράνη? και 4+, περισσότερο από το 75% των κυττάρων με πλήρη, χρώση πολύ ισχυρή μεμβράνη. Πέντε πεδία υψηλής ισχύος αναλύθηκαν σε κάθε περιοχή των περιπτώσεων και η μέση βαθμολογία υπολογίστηκε. Όλα τα τμήματα βαθμολογήθηκαν δύο φορές για να επιβεβαιωθεί η αναπαραγωγιμότητα των αποτελεσμάτων. Το Ki-67 LI υπολογίστηκε μετά την καταμέτρηση 1000 καρκινικά κύτταρα.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) Νοκ ντάουν Πειράματα

Για siRNA αποσιώπηση της ανθρώπινης κλαουδίνης-18, ON-TARGET συν SMARTpool και μη -ειδικές siRNA ελέγχου αγοράστηκε από Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, USA). Η κυτταρική σειρά ΜΚΝ74 (ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources Τράπεζας Κυττάρων, Osaka, Japan), η οποία είναι

CLDN18

-θετικό, επιλέχθηκε για τη μελέτη των επιπτώσεων της κλαουδίνης-18 νοκ ντάουν στον πολλαπλασιασμό και την εισβολή ιδιότητες των κυττάρων GC . Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 25 ηΜ siRNA χρησιμοποιώντας DharmaFECTTM3 (Dharmacon, Inc.). Οι ομάδες ελέγχου και siRNA ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τα αντιδραστήρια διαμόλυνσης χωρίς siRNA και των αντιδραστηρίων διαμόλυνσης με μη ειδικό έλεγχο siRNA, αντίστοιχα. Οι δοκιμασίες εκτελέστηκαν 3 ημέρες μετά τα κύτταρα ΜΚΝ74 επιμολύνθηκαν.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με χρωματομετρική ανάλυση της βιωσιμότητας των κυττάρων βασίζεται στη διάσπαση του άλατος τετραζολίου WST-1 από μιτοχονδριακών αφυδρογονασών (Takara Bio Inc., Οτσού, Ιαπωνία). Η απορρόφηση του χρωστικής φορμαζάνης που σχηματίζεται, η οποία συσχετίζεται με τον αριθμό των μεταβολικώς δραστικά κύτταρα στην καλλιέργεια, μετρήθηκε στα 450 nm 1 ώρα μετά την προσθήκη του αντιδραστηρίου.

Εισβολή Δοκιμασία

εισβολή των κυττάρων ΜΚΝ74 αναλύθηκε σε θαλάμους 24 φρεατίων Biocoat Matrigel εισβολής (8 μm? Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα χαμηλότερα θάλαμοι πληρώθηκαν με RPMI1640 με 10% FBS, και τα κύτταρα (2 χ 10

5) τοποθετήθηκαν σε θαλάμους ένθετο, το οποίο περιείχε RPMI1640 χωρίς FBS. Μετά από 24-h επώαση, τα μη επιθετικά κύτταρα απομακρύνθηκαν με ένα βαμβάκι. Τα κύτταρα που έχουν μεταναστεύσει διαμέσου της μεμβράνης και να κολλήσει με την κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη και χρωματίζονται με αιματοξυλίνη. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, τα κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο σε πέντε τυχαία πεδία υψηλής ισχύος. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν. Ο λόγος εισβολή για τον έλεγχο μέσο υπολογίστηκε.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση SPSS13.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). ανάλυση συσχέτισης πραγματοποιήθηκε από ο συντελεστής Spearman (RS). Πολλαπλές συγκρίσεις έγιναν χρησιμοποιώντας το τεστ Kruskal-Wallis ακολουθούμενη από δοκιμή Scheffe του. Ενιαία συγκρίσεις έγιναν με τη δοκιμασία Mann-Whitney.

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Η έκφραση της κλαουδίνης-18 στο γαστρικό βλεννογόνο και το καρκίνωμα

Ένα σύνολο των 75 διαφοροποιημένη περιπτώσεις GC αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Οι τομές χρωματίστηκαν με κλαουδίνης-18, και το επίπεδο της χρώσης βαθμολογήθηκε. Κλαουδίνης-18 ανιχνεύθηκε σε υψηλά επίπεδα σε γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα στα ακραία και πλευρικά πλευρά των συνόρων σε μη-ΙΜ, αλλά όχι σε ΙΜ ή διαφοροποιημένα κύτταρα αδενοκαρκινώματος (Εικ. 1Α). Τα επίπεδα της κλαουδίνης-18 ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε καρκινικά κύτταρα παρά σε μη-IM και IM, καθώς και σημαντικά χαμηλότερη σε IM σε σύγκριση με μη-IM (Εικ. 1Β).

(Α) HE χρώση των γαστρικό βλεννογόνο με μη-εντερικής μεταπλασίας (μη-ΙΜ), εντερικής μεταπλασίας (ΙΜ), και ο καρκίνος. Κλαουδίνης-18 ανιχνεύεται σε γαστρικό βλεννογόνο με μη-ΙΜ στα σύνορα επιφάνεια και πλευρική μεμβράνη των επιθηλιακών κυττάρων, αλλά όχι με ΙΜ ή καρκίνο. Λευκή γραμμή = 100 μm, Κίτρινη γραμμή = 50 μm. (Β) κλαουδίνης-18 επίπεδο είναι σημαντικά χαμηλότερο σε GC από ό, τι σε μη-IM ή IM. Το επίπεδο είναι επίσης σημαντικά χαμηλότερη σε IM από ό, τι στους μη-IM.

#

P

& lt? 0,05 έναντι IM. **

P

& lt?. 0.01 έναντι μη-IM

Η

Ανίχνευση κλαουδίνης-18 σε GCs με υποβλεννογόνια εισβολή

Εκπρόσωπος περιπτώσεις GC με υποβλεννογόνια εισβολή έδειξε ότι πυκνή χρώση κλαουδίνης-18 ήταν εμφανής στο μεταναστευτικό μέτωπο του υποβλεννογόνου εισέβαλαν-καρκινικά κύτταρα, και Ki-67 LI ήταν χαμηλή στο βλάβης (Εικ. 2Α). Σε μια περίπτωση με χρώση χαμηλής κλαουδίνης-18 στην επεμβατική μπροστά από υποβλεννογόνια εισέβαλε-καρκινικά κύτταρα, Ki-67 LI ήταν υψηλή κατά τη βλάβη (Εικ. 2Α).

HE χρώση δείχνει περιπτώσεις υποβλεννογόνια επεμβατική GC. Τα Ki-67 θετικών πυρήνων ανιχνεύθηκε στα καρκινικά κύτταρα. Το Ki-67 LI είναι χαμηλή σε περίπτωση υποβλεννογόνια θετικών κλαουδίνης-18 χρώση (3+) (αριστερά) και υψηλή σε περίπτωση υποβλεννογόνια-αρνητική χρώση κλαουδίνης-18 (0) (δεξιά). Bar = 100 μm. (Β) Το Ki-67 LI είναι αντιστρόφως ανάλογη με το επίπεδο κλαουδίνης-18 (rs = -0,550,

P

= 0,0010).

Η

Συσχέτιση του κλαουδίνης-18 Επίπεδο και Ki-67 LI

το Ki-67 LI της GC στο βλεννογόνο και υποβλεννογόνιο χιτώνα προσδιορίστηκε από το ποσοστό των Ki-67 θετικών πυρήνων. Για να προσδιοριστεί η συσχέτιση μεταξύ του Ki-67 LI και το επίπεδο κλαουδίνης-18, πραγματοποιήθηκε ανάλυση συσχέτισης. Το επίπεδο έκφρασης του βλεννογόνου του κλαουδίνης-18 δεν συσχετίστηκε σημαντικά με το Ki-67 LI (rs = 0,07,

P =

0.60). Από την άλλη πλευρά, το επίπεδο έκφρασης υποβλεννογόνια κλαουδίνης-18 ήταν σημαντικά αντιστρόφως ανάλογη με την υποβλεννογόνια Ki-67 LI (rs = -0,550,

P

= 0.0010) (Σχ. 2Β).

Επίδραση της κλαουδίνης-18 siRNA στον πολλαπλασιασμό και την εισβολή του GC κύτταρα

Μια κυτταρική σειρά GC, ΜΚΝ74, εκφράζουν συντακτικά κλαουδίνης-18, και το επίπεδο του mRNA της κλαουδίνης-18 μειώθηκε σημαντικά από siRNA εναντίον claudin- 18 (Σχ. 3Α). χρώση ανοσοφθορισμού με κλαουδίνης-18 επίσης μειώθηκε μετά την επιμόλυνση (Σχ. 3Β). Σε κλαουδίνης-18 ρυθμισμένα προς τα κάτω ΜΚΝ74, κυτταρική ανάπτυξη ήταν σημαντικά αυξημένη (Σχ. 4Α), και η εισβολή των κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένη (Σχ. 4Β).

(Β) Χρώση κλαουδίνης-18 είναι μειωμένη κατά κλαουδίνης-18 θεραπεία siRNA. Bar = 50 μm. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. **

P

& lt? 0,01 ενάντια στον έλεγχο ή τον έλεγχο siRNA

Η

(Α) θεραπεία κλαουδίνης-18 siRNA επάγει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.. (Β) κλαουδίνης-18 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα ΜΚΝ74 εμφανίζουν σημαντικά υψηλότερη αναλογία εισβολή σε σύγκριση με τον έλεγχο ή κύτταρα ελέγχου siRNA επιμολυσμένα. Τυπικές εικόνες που παρουσιάζονται στην κορυφή. Bar = 500 μm. Κάθε τιμή αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. **

P

& lt?. 0.01 ενάντια στον έλεγχο ή τον έλεγχο siRNA

Η

Συζήτηση

Η αλλαγμένη έκφραση claudins στο υποβλεννογόνια επεμβατική μέτωπο θα μπορούσε να σχετίζεται με την εξέλιξη της του GC. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι ακόμη και σε ελαφρά υποβλεννογόνιο επεμβατική GC χωρίς λεμφικού και αγγειακές εισβολή, ESD μπορεί να είναι εφικτή ως θεραπευτική πράξη [19]. Ωστόσο, δεν είναι ακόμα σαφές ποια περιπτώσεις ελαφρά υποβλεννογόνιο επεμβατική GC μπορεί να ακολουθηθεί χωρίς περαιτέρω χειρουργική επέμβαση μετά από ESD. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώθηκε ότι υπήρχε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου κλαουδίνης-18 και Κ-67 θετικότητα στην επεμβατική μπροστά από υποβλεννογόνια επεμβατική GC, και ότι κλαουδίνης-18 ρυθμιζόμενη κυττάρων GC εισβολής και του πολλαπλασιασμού. Ki-67 ανοσοϊστοχημεία έχει υποκατασταθεί για μιτωτική καταμέτρηση κατά την εκτίμηση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Μελέτες έχουν αποδείξει ότι Ki-67 συσχετίζεται με αδιαφοροποίητα και μεταστατικών κυττάρων σε κακοήθειες [20]. Σε αυτή τη μελέτη, μόνο EMR /ESD-εκτομή GC στην οποία η ένδειξη περιορίζεται στον διαφοροποιημένο τύπο του GC μελετήθηκε. Συνεπώς, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το επίπεδο Ki-67 στο μεταναστευτικό μέτωπο σχετιζόταν με μεταστατικά κύτταρα σε κακοήθειες, και ότι η απώλεια του κλαουδίνης-18 ήταν ένα από τους δείκτες της επιθετικότητας GC και θα μπορούσε να σχετίζεται με την ανάπτυξη της μετάστασης, η οποία απαιτεί επιπλέον χειρουργική επέμβαση μετά από θεραπεία ESD

Claudins είναι ασυνήθιστα ρυθμιζόμενη σε μια ποικιλία κακοηθειών όπως GC, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, καρκίνωμα των χοληφόρων οδών, του καρκίνου του μαστού, καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων, και το μεσοθηλίωμα [15], [21] -. [ ,,,0],25]. Η μεταβολή στην claudins σε διασταυρώσεις συνδέεται με την απώλεια του σφιχτή πρόσφυση και την πολικότητα σε επιθήλια. Η απώλεια της πολικότητας σχετίζεται με αυξημένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό και επιθηλιακών-to μεσεγχυματικά μετάβασης, ενώ διαταραχές στη σφιχτή σύμπλοκα διασταύρωση μεταβάλλουν τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου, οι οποίες σχετίζονται με την εισβολή και τη μετάσταση [23], [26], [27]. Σε μελέτες παρατήρησης, μειώσεις στις κλαουδίνης-3 και έχουν -4 αναφερθεί σε κύτταρα GC στο μεταναστευτικό μέτωπο και βρέθηκαν να συσχετίζονται με την εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση [14]. Κάτω ρύθμιση των claudins έχει επίσης αναφερθεί σε ορισμένες άλλες επιθηλιακούς όγκους, συμπεριλαμβανομένης της απώλειας κλαουδίνης-1 σε καρκίνο του μαστού [28] και του κόλου καρκίνου του [29], καθώς και την απώλεια του κλαουδίνης-7 στον καρκίνο του μαστού [30] και καρκίνου κεφαλής και τραχήλου [31]. Όσον αφορά την εισβολή των καρκινικών κυττάρων, μειωμένη έκφραση κλαουδίνης-7 στο μεταναστευτικό μέτωπο βρέθηκε να συσχετίζεται με το βάθος της εισβολής και του λεμφικού συμμετοχή σε πλακώδες καρκίνωμα του οισοφάγου [32]. Αν και κλαουδίνης-3 και κλαουδίνης-7 εκφράσεις ήταν χαμηλότερες στην υποβλεννογόνια επεμβατική εμπρός σε σχέση με βλάβες του βλεννογόνου σε προηγούμενη μελέτη μας, κλαουδίνης-3 και κλαουδίνης-7 επίπεδα στο μεταναστευτικό μέτωπο δεν συσχετίστηκαν με την Ki-67 LI [15]. Από την άλλη πλευρά, κλαουδίνης-18 στο μεταναστευτικό μέτωπο ήταν αντιστρόφως ανάλογη με την Ki-67 LI στην παρούσα μελέτη. Αυτά τα δεδομένα μπορούν να σχετίζονται με τα ευρήματα που κλαουδίνης-3 και κλαουδίνης-4 δεν είχαν σχέση με λεμφαδένα μετάσταση [33]. Επιπλέον, αυτές οι μελέτες παρατήρησης δεν μπορεί να εξηγήσει εάν αυτές οι αλλαγές επηρεάζουν άμεσα την εισβολή και μετάσταση όγκων.

κλαουδίνης-18 εκφράζεται κυρίως στο στομάχι και επιθηλιακά κύτταρα των πνευμόνων. Κλαουδίνης-18Α2 είναι η μορφή για το στομάχι, και οι ισομορφές είναι λίγο διαφορετικά. Σε μια προηγούμενη έκθεση, γαστρικό τύπου κλαουδίνης-18 χάθηκε στο GCs [17]. Ωστόσο, κατά τη διάρκεια της εντερικής μεταπλασίας, το πρότυπο έκφρασης του claudins διαφέρει ήδη από αυτό του κανονικού γαστρικού επιθηλίου. Η εξαφάνιση του κλαουδίνης-18 βρέθηκε να συνδέονται με την εντερική μεταπλασία στο στομάχι [17]. Ως εκ τούτου, η απώλεια της κλαουδίνης-18 έκφραση σε προχωρημένο GC [17] δεν μπορεί απλά να αποδείξει το χαρακτήρα του καρκίνου. Ακόμη και κατά τη διαδικασία της εξέλιξης GC, το επίπεδο έκφρασης μπορεί να αλλάξει. Για να διερευνήσουν τη λειτουργία αυτών των μορίων στόχων, σκεφτήκαμε ότι θα ήταν σημαντικό να εξεταστούν οι όγκοι στο ίδιο στάδιο, και αξιολογήσαμε το επίπεδο των κλαουδίνης-18, τα οποία θα μπορούσαν να επηρεάσουν την εισβολή και τη μετάσταση, σε ελαφρά υποβλεννογόνιο επεμβατική βλάβες GC. Επιπλέον, γαστρικού βλεννογόνου κλαουδίνης-18 μπορεί να μην λειτουργεί μόνο στο TJs, επειδή η εκφρασμένη εντοπισμός στην κυτταρική επιφάνεια δεν ήταν μόνο στο TJs. Περαιτέρω έρευνες απαιτούνται για να εξετάσει φυσιολογικές και παθοφυσιολογικές εκφράσεις πρωτεΐνης TJ στην πλευρική μεμβράνη.

Για να εξεταστεί κατά πόσον οι μεταβολές στην κλαουδίνης-18 επίπεδα στο υποβλεννογόνια επεμβατική μπροστά συνέβαλε στη διάδοση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων, ένα siRNA προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε για να knockdown της πρωτεΐνης στην κυτταρική σειρά ΜΚΝ74 GC, το οποίο είναι θετικό για κλαουδίνης-18. Έτσι, η παρούσα μελέτη έδειξε για πρώτη φορά τη λειτουργία του κλαουδίνης-18 σε GC χρησιμοποιώντας μια γενετική προσέγγιση, και ότι η απώλεια του κλαουδίνης-18 ενεπλάκη σε πολλαπλασιασμό και για εισβολή κυττάρων GC. Μαζί με αυτά τα δεδομένα, η απώλεια κλαουδίνης-18 στο υποβλεννογόνιο επεμβατική μέτωπο έδειξε την απόκτηση του πιο επιθετική χαρακτηριστικά και θα μπορούσε να επιτρέψει κυττάρου-κυττάρου κατά τη διάρκεια της διάσπασης εισβολής. Ωστόσο, ένας περιορισμός αυτής της μελέτης ήταν ότι μόνο ΜΚΝ74 θα μπορούσαν να εξεταστούν, γιατί ήταν ο μόνος διαφοροποιημένο γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή που εκφράζεται κλαουδίνης-18 όσο εξετάσαμε. Ως εκ τούτου, παρόμοια φαινόμενα δεν μπορεί να αναπαραχθεί με άλλες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου.

Τόσο τα πάνω ρύθμιση και ρύθμιση προς τα κάτω του claudins έχουν αναφερθεί ότι εμπλέκονται στη διαδικασία του καρκίνου [34], [35]. Για την ανάλυση της λειτουργίας του claudins σε καρκινικά κύτταρα, η γενετική προσεγγίσεις για claudins έχουν επίσης αναφερθεί σε διάφορα καρκινικά κύτταρα. Εξόντωση κλαουδίνης-1 με siRNA είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της μετανάστευσης σε κολικό καρκινικά κύτταρα [36]. Η υπερέκφραση του κλαουδίνης-6, κλαουδίνης-7, ή κλαουδίνης-9 αύξησε την επιθετική πιθανότητα ενός γαστρικού αδενοκαρκινώματος κυτταρική γραμμή [37]. Τέτοια κλαουδίνης-επαγόμενο πολλαπλασιασμό και εισβολή μπορεί να φαίνεται παράδοξο, επειδή οι claudins γνωστό ότι εμπλέκονται σε στεγανή επιθηλιακά διασταυρώσεις. Αυτά τα αμφιλεγόμενα στοιχεία δείχνουν ότι οι λειτουργίες του claudins είναι τόσο υποτύπου και τον κυτταρικό τύπο.

Ως περιορισμός της παρούσας μελέτης, εξακολουθεί να μην είναι σαφές ότι αυτή η μειωμένη κλαουδίνης-18 επίπεδο στο υποβλεννογόνια επεμβατική μέτωπο είναι πράγματι εμπλέκονται στη μετάσταση του καρκίνου, επειδή είναι δύσκολο να ακολουθεί τη φυσική ιστορία της πρώιμης GCs. Ωστόσο, τα δεδομένα σε αυτή τη μελέτη έδειξε ότι ένα χαμηλότερο επίπεδο κλαουδίνης-18 στο μεταναστευτικό μέτωπο συσχετίστηκε με μεγαλύτερη πολλαπλασιαστική τάση. Είναι απαραίτητο να εξεταστεί μελλοντικά εάν αυτή η μείωση του επιπέδου κλαουδίνης-18 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα μεταστατικό και προγνωστικές βιοδείκτη μετά ενδοσκοπική εκτομή σε μια μελλοντική μελέτη.

Εν ολίγοις, έχει αποδειχθεί για πρώτη φορά ότι η κλαουδίνης-18 ετερογενώς εκφράζεται στο υποβλεννογόνιο επεμβατική μπροστά από νωρίς GC, και τα κάτω ρύθμιση κλαουδίνης-18 συνδέεται με την πολλαπλασιαστική και διηθητική δυναμικό της GC. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι κλαουδίνης-18 έχει ένα κεντρικό ρόλο στην εξέλιξη του GC και μπορεί να είναι ένας υποψήφιος βιοδείκτης της εξέλιξης της νόσου. Μια κλαουδίνης-18 νοκ ντάουν πείραμα επιβεβαίωσε ότι η καταστολή των συνάψεων κλαουδίνης-18 προώθησε τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή των κυττάρων του GC.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε την κα Noriko Kamiya για τεχνική βοήθεια.