Αφηρημένο

Ιστορικό

Οι μόνες θεραπευτικές επιλογές που υπάρχουν για ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα (SCC) είναι στάνταρ ακτινοβολίας και κυτταροτοξική χημειοθεραπεία. Τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) υποτίθεται ότι αντιπροσωπεύουν θεραπευτική αντίσταση, γεγονός που υποδηλώνει ότι ΚΕΠ πρέπει να απευθύνονται ειδικά. Εδώ, θα αναλύσουμε το μεταγραφικό της CSC και μη-CSC υποπληθυσμών από την RNA-επόμενα για τον εντοπισμό νέων πιθανών θεραπευτικών στρατηγικών για SCC.

Μέθοδοι

ταξινομημένο μια SCC σε CD133- και CD133 + υποπληθυσμών και Στη συνέχεια εξετάζεται τόσο από την ανάλυση αριθμού αντιγράφων (ΚΥΠΕ) και ολόκληρο το γονιδίωμα και αλληλούχιση μεταγραφικό. Αναλύσαμε τον καρκίνο Γονιδιώματος Atlas (TCGA) δεδομένα μεταγραφικό των 221 κλώνοι ενός κυττάρου για να προσδιοριστεί η γενικότητα των παρατηρήσεων μας.

Αποτελέσματα

Και οι δύο υποπληθυσμών εκφράζεται έντονα πολλές ισομορφές mRNA των οποίων τα προϊόντα πρωτεΐνης είναι ενεργά φαρμακευτικών στόχων για άλλων καρκίνων? 31 (25%) αντιστοιχούν σε 18 γονίδια υπό ενεργή έρευνα ως στόχοι mAb και ένα επιπλέον 4 (3%) έχουν θεραπευτικό ενδιαφέρον. Επιπλέον, βρήκαμε αποδείξεις ότι και οι δύο πληθυσμοί είχαν πολλαπλασιαστικώς οδηγείται από πολύ υψηλά επίπεδα του c-myc και το TRAIL μεγάλη ισομορφή (TRAIL

L) και ότι η κανονική αποπτωτικών απαντήσεις σε υψηλή έκφραση αυτών των γονιδίων αποτράπηκε με υψηλά επίπεδα Mcl- 1

L και Bcl-x

L και C-Flip

L-ισομορφές για το οποίο τα φάρμακα είναι τώρα σε κλινική ανάπτυξη. SCC RNA-seq δεδομένων (n = 221) από TCGA υποστηρίζεται ευρήματά μας. Η ανάλυσή μας δεν συνάδει με την έννοια CSC που τα περισσότερα κύτταρα σε καρκίνο έχουν χάσει πολλαπλασιαστικού δυναμικού τους. Επιπλέον, η μελέτη μας δείχνει πώς να στοχεύσουν τόσο η CSC και μη-CSC υποπληθυσμών με τη στρατηγική μία θεραπεία.

Συμπεράσματα

Η μελέτη μας είναι σχετική με SCC ιδίως για τις παρουσιάζει πολλές πιθανές επιλογές για την τυπική θεραπείας που στοχεύουν το σύνολο του όγκου. Με τον τρόπο αυτό, δείχνει πόσο αλληλουχίας μεταγραφικό παρέχει γνώσεις σχετικά με τις μοριακές βάσεις του καρκίνου του πολλαπλασιαστικού κύτταρα που, κυρίως, μπορεί να λειτουργήσει ως μοχλός για τον εντοπισμό νέων πιθανών θεραπευτικών επιλογών για τους καρκίνους πέρα ​​από ό, τι είναι δυνατό με αλληλούχιση του DNA

Αιτιολογική αναφορά.: Barrett CL, Schwab RB, Jung H, Crain Β, Goff DJ, Jamieson CHM, et al. (2013) μεταγραφικό αλληλουχίας των υποπληθυσμών των όγκων αποκαλύπτει ένα ευρύ φάσμα επιλογών Θεραπευτικές για πλακωδών κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (3): e58714. doi: 10.1371 /journal.pone.0058714

Επιμέλεια: Marc Lenburg, Boston University Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Οκτωβρίου του 2012? Αποδεκτές: 5 Φεβ του 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 Μάρτη 2013

Copyright: © 2013 Barrett et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Κέντρο Βραβείο Μεταγραφική Science (UL1RR031980 και UL1TR000100) από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων, τρεις υποτροφίες (1R21CA152613-01, 1R21CA155615-01A1, CA69375) από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, τέσσερις υποτροφίες από το California Institute for αναγεννητικής Ιατρικής (CL1-00502, RT1-01108, TR1-01250, TR2-01789) και μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Αλλεργιών και Λοιμωδών Νοσημάτων (P30 AI036214). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του πνεύμονα ευθύνεται για το 28% όλων των θανάτων από καρκίνο, το υψηλότερο ποσοστό όλων των καρκίνων [1]. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει ~85-90% των καρκίνων του πνεύμονα, εκ των οποίων το αδενοκαρκίνωμα και το καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων είναι τα πιο κοινά υποτύπους [1]. Παρά το γεγονός ότι πάνω από το 70% των ασθενών με NSCLC έχουν προχωρήσει ασθένεια που είναι σπάνια ιάσιμη όταν διαγνωστεί, οι νέες εξελίξεις για υποσύνολα αδενοκαρκινώματα πνεύμονα που φιλοξενούν τις μεταλλάξεις του EGFR ή συγχωνεύσεις γονιδίων EML4-ALK ενθαρρύνουν την ανάπτυξη στοχευμένων θεραπειών που μπορεί να μεταβάλει αυτή την τραγική κατάσταση [2] . Αυτές οι γενετικές μεταβολές συμβαίνουν κυρίως σε αδενοκαρκινώματα των ασθενών που δεν είχαν καπνίσει ποτέ, και δεν είναι συχνές στην SCC η οποία κατά κύριο λόγο σχετίζεται με το κάπνισμα [3] – [5]. Ενώ FGFR1 [6] και DDR2 [7] εμφανίστηκαν πρόσφατα ως πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι για ορισμένους ασθενείς SCC, οι αναστολείς δεν έχουν ακόμη φθάσει κλινικές δοκιμές. Πρόσφατες μελέτες αλληλουχίας υψηλής απόδοσης NSCLC εστιάζεται κυρίως στην ανάλυση του DNA έχουν δείξει ότι τα λίγα γονίδια μεταλλαγμένα σε αρκετά υψηλή συχνότητα να είναι χρήσιμο για στοχευμένη θεραπεία? Ωστόσο αυτές οι μελέτες να κάνει την πρόβλεψη αλλοιώσεις DNA που συχνά συγκεντρωμένα σε έναν περιορισμένο αριθμό σημαντικών μοριακών οδών που υποδηλώνει ότι στοχεύουν αυτές οδοί μπορεί να είναι μια βιώσιμη θεραπευτική στρατηγική [8] ​​- [12]. Βαθιά μεταγραφικό (RNA-επόμενα) των χαρακτηριστικών των NSCLC για τον εντοπισμό γονιδίων με την απορυθμισμένη έκφραση που είναι κοινή μεταξύ των όγκων δεν έχει αναφερθεί, αν και οι εκθέσεις αυτές θα πρέπει να αναμένονται με δεδομένες τις μεγάλες RNA-επόμενα σύνολα δεδομένων που δημιουργούνται από TCGA [13] και άλλα κοινοπραξίες.

Τα καρκινικά κύτταρα στο εσωτερικό ενός όγκου υπάρχουν σε ξεχωριστή φαινοτυπική κράτη που συχνά παρουσιάζουν σημαντικές λειτουργικές διαφορές. Ένα υποπληθυσμό κυττάρων με αυτο-ανανέωση και δυνατότητες ογκογενή, που συνήθως αναφέρονται ως καρκίνος-βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (ΚΕΠ), έχουν ταυτοποιηθεί σε μια ποικιλία τύπων όγκου συμπεριλαμβανομένων NSCLC [14]. Τοποθέτηση στοιχεία δείχνουν ότι τα ΚΕΠ είναι ανθεκτικά σε αντικαρκινικών θεραπειών και τη βάση μετάσταση [15], [16], και ως εκ τούτου είναι η κύρια καρκίνος τύπο κυττάρου υπεύθυνα για την υποτροπή και την εξέλιξη των κακοηθών όγκων. Η άμεση επίπτωση είναι ότι με τη στόχευση ΚΕΠ θα πρέπει να είναι δυνατόν να εξαλειφθεί το ανθεκτικό και μεταστατικό ναρκωτικών υποπληθυσμό του καρκίνου [14]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ο φαινότυπος CSC είναι πλαστικό και μπορεί να ανασυσταθεί από άλλα, μη-CSC, κύτταρα όγκου [17], [18]? ως εκ τούτου, δεν πρέπει να απευθύνονται μόνο ΚΕΠ αλλά όλοι οι υποπληθυσμοί των όγκων που είναι «εν δυνάμει ΚΕΠ». αλληλουχίας μεταγραφικό της CSC και μη-CSC υποπληθυσμών στο NSCLC θα προσφέρουν πληροφορίες για την μοριακή βάση στην οποία στηρίζεται φαινοτυπικές ομοιότητες και τις διαφορές τους και να διευκολυνθεί η ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών στόχων. Η ανάλυση αυτή θα είναι ένα σημαντικό και απαραίτητο συμπλήρωμα για το μεγαλύτερο μεταγραφικό όγκου προφίλ που εκτελούνται από TCGA και άλλοι.

Οι παρατηρήσεις ότι τα μη-ΚΕΠ μπορεί να ανασυστήσει ΚΕΠ, και αντίστροφα, δείχνουν ότι οι φαινοτυπικές διαφορές μεταξύ αυτών των υποπληθυσμών οφείλονται σε επιγενετικές παρά γενετικές διαφορές. Ως εκ τούτου, τα πειράματα exome και η ακολουθία του γονιδιώματος για τον εντοπισμό των σωματικών μεταλλάξεων δεν αναμένεται να αποκαλύψει διαφορές μεταξύ ταξινομημένα CSC και μη-CSC υποπληθυσμών. Από την άλλη πλευρά, μεταγραφικό προφίλ, το οποίο είναι ένα αναγνώσεως του επιγονιδιώματος (δηλαδή σήματα ιστόνης και μεθυλίωσης του DNA που ρυθμίζουν την έκφραση), θα πρέπει να είναι μια εξαιρετική μέθοδος για προφίλ ΚΕΠ και μη ΚΕΠ για να αποκαλύψει μηχανιστική διαφορές. Το πλεονέκτημα του RNA-seq δεδομένων μέσω μικροσυστοιχίες είναι η ικανότητα να αναλύουν ισομορφή διαφορές έκφρασης [19]. Στα καρκινικά κύτταρα, εναλλακτικές ισομορφές mRNA μπορούν να παράγουν πρωτεΐνη ισομορφές με κυρίαρχο αρνητικό δραστηριότητα. Το παθογόνο ρόλο του καρκίνου-ειδικών ισομορφών έχει εκτενώς αποδειχθεί σε όλες τις πτυχές της κυτταρικής φυσιολογίας, συμπεριλαμβανομένων των κυτταρική προσκόλληση και τη μετάσταση (CD44 και RON), κυτταρική ανάπτυξη και ογκογένεση (PKM2, MDM2, FGFR2, CRK, μούδιασμα), του κυτταρικού κύκλου (ΡΥΚ ), την αγγειογένεση (VEGF), απόπτωση (GS3KB, CD95, Bcl-X, κασπάσης-2, κασπάσης-9), ο μεταβολισμός (ΡΚ), και αντοχή φαρμάκου (AR και MRP-1) [20] – [24]. Τα παραδείγματα αυτά υπογραμμίζουν το πλεονέκτημα των πληροφοριών ισομορφής επιπέδου μεταγραφικό πάνω έκφρασης ολόκληρο το γονίδιο για την απόκτηση γνώσεις σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς που διέπουν CSC και μη-CSC διαφορές φαινοτυπικά.

Εδώ αναφέρουμε την εφαρμογή της γονιδιωματικής τεχνολογίας σε ξενομόσχευμα SCC ότι ήταν ταξινομημένα σε CSC και μη CSC υποπληθυσμών με βάση το δείκτη CD133 (Σχήμα 1). CD133 (PROM1? Προμινίνη-1) είναι ένα 5-διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που θεωρείται ότι είναι ένας δείκτης για τον υποπληθυσμό των ΚΕΠ σε δύο υποτύπους του NSCLC [15], [25] – [27]. Σε NSCLC ο CD133 + υποπληθυσμός έχει αποδειχθεί ότι έχουν υψηλότερο ογκογόνο δυναμικό σε SCID ποντίκια, για να εκφράσουν υψηλότερα επίπεδα βλαστική ικανότητα γονιδίων και να είναι πιο ανθεκτικά στην συμβατική χημειοθεραπεία από το CD133- υποπληθυσμό [15]. Είναι σημαντικό ότι, έτσι ώστε το ξενομόσχευμα SCC θα είναι πιο αντιπροσωπευτικό του πρωτογενούς όγκου, δεν ήταν άμεσα μεταμοσχευμένα ως κιμάς πρωτογενούς όγκου σε ποντίκια NSG και ποτέ δεν αναπτύχθηκε

in vitro

. ανάλυση του DNA ολόκληρου του γονιδιώματος αποκάλυψε ότι τα χρωμοσώματα του CD133 + και CD133- υποπληθυσμών ήταν πολύ διαταραγμένο με πολύ παρόμοιο τρόπο? Ωστόσο, όπως ήταν αναμενόμενο ο όγκος δεν τρέφουν κλινικά προσφυγής μεταλλάξεις. Ανάλυση των προφίλ έκφρασης ισόμορφου mRNA ματίσματος του CD133 + και CD133- υποπληθυσμών αποτέλεσμα την ταυτοποίηση του SCC ως πιθανή νέα ένδειξη για τις πολυάριθμες φάρμακα επί του παρόντος σε ανάπτυξη και να προτείνουν διάφορα πρόσθετα νέα ελπιδοφόρα στόχους. Τέλος, η ανάλυση του καρκίνου Γονιδιώματος Atlas (TCGA) διατίθενται στο κοινό μεταγραφικό RNA-επόμενα δεδομένα των 221 ΤΣΡ [28] υποστηρίζει την γενικότητα των ευρημάτων μεταγραφικό μας για την ασθένεια αυτή. Συνολικά η μελέτη μας δείχνει την ικανότητα του προσδιορισμού αλληλουχίας μεταγραφικό των ταξινομημένων υποπληθυσμών των καρκινικών κυττάρων να ενημερώσει κλινική ανάπτυξη με τρόπους που δεν είναι δυνατόν με αλληλούχιση του DNA.

ταξινομούνται τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πλακώδους κυττάρου του πνεύμονα ξενομόσχευμα καρκίνου του σε CD133 + και CD133- υποπληθυσμών. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανάλυση CNA χρησιμοποιώντας συστοιχίες γονοτυπική επί μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC), καθώς και δύο υποπληθυσμών CD133 + και CD133-. Συγκρίναμε τα γονιδιώματα του πληθυσμού CD133 + και δείγματα PBMC να εντοπίσει σωματικές μεταλλάξεις. Τέλος, πραγματοποιήσαμε ολόκληρη αλληλουχίας μεταγραφικό (RNA-επόμενα) των υποπληθυσμών CD133 + και CD133- να αξιολογήσει τις διαφορές έκφρασης του mRNA ισομορφή τους και τις ομοιότητες.

Η

Μέθοδοι

ξενομεταμόσχευση

Ένα UCSD ανθρώπινου ερευνητικού Ξιφασκία Πρόγραμμα Διοικητικό Institutional Review (IRB) ενέκρινε την εν λόγω μελέτη πριν από οποιεσδήποτε δραστηριότητες που σχετίζονται με τη μελέτη. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες ζώων συμμορφωθεί με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση Εργαστηριακών Ζώων (Institute for Laboratory Animal Research, 1996) και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Παγκόσμιας Έρευνας και Ανάπτυξης Θεσμικών φροντίδα των ζώων και τη χρήση της Pfizer. Μια 75-year-old man με ένα 30-pack-χρόνια της ιστορίας του καπνίσματος και παρεμπιπτόντως βρέθηκε πνεύμονα οζιδίων παρέχεται γραπτή τεκμηριωμένη συγκατάθεση σύμφωνα με αυτό το IRB εγκεκριμένο πρωτόκολλο πριν από την επέμβαση. Εκτομή αποκάλυψε μια Τ1 μετρίως διαφοροποιημένο καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων. Ένα τμήμα της εκτομή φρέσκα όγκου του ελήφθη για ξενομεταμόσχευση σε NSG (ακριβές όνομα στέλεχος NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ) ποντίκια (Το Εργαστήριο Jackson). Μεταγενέστερες περάσματα έγιναν σε CB17.Cg-PrkdcscidLystbg /Crl ποντίκια από το Charles River. Κιμά φρέσκο ​​όγκου αναμίχθηκε με Matrigel (BD Biosciences) και εισάγεται υποδορίως. Τα ποντίκια παρατηρήθηκαν μέχρι ψηλαφητών όγκων μεγάλωσε και αυτά συλλέχθηκαν για σειριακή εμφύτευση και τη μελέτη. Σε διετή παρακολούθηση το θέμα παρέμεινε χωρίς κλινική ή ακτινολογική ένδειξη υποτροπής.

Απομόνωση του RNA και του DNA

Τα προϊόντα της λύσης από την CD133- /EpCAM + και CD133 + /EpCAM + ταξινομημένα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για RNA και εξαγωγή του DNA χρησιμοποιώντας Όλα Prep Mini Kit της Qiagen (Valencia, CA). Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Όχι περισσότερο από τέσσερις τόμους φορτώθηκαν σε μία μόνο στήλη RNeasy Mini Spin. Σύνολο δείγματα RNA αξιολογήθηκαν για καθαρότητα και συγκέντρωση χρησιμοποιώντας την Agilent 2100 Bioanalyzer στο GeneChip Microarray Core.

RNA αλληλουχίας

Το συνολικό RNA τόσο από την CD133- /EpCAM + και CD133 + /EpCAM + όγκου υποπληθυσμών ( ~ 230 ng έκαστο) χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία βιβλιοθηκών ολόκληρο μεταγραφικό για αλληλούχιση επί του στερεού πλατφόρμα ακόλουθη σύσταση του κατασκευαστή (Life Technologies, Carlsbad CA, USA). Τα δείγματα RNA διαμελισμένο από RNAse III και συμπυκνώθηκαν χρησιμοποιώντας μονάδα συγκέντρωσης RiboMinus (Invitrogen, Carlsbad CA, USA). θραύσματα RNA συνδέθηκαν με τα στερεά μίγματα προσαρμογέα και ανάστροφη μεταγραφή εκτελείται. Καθαρισμένα cDNAs επιλέχθηκαν μεγέθους (150-250 bp) χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού MinElute PCR (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA), και στη συνέχεια ενισχύεται από 15 κύκλους που χρησιμοποιούν στερεά 3 ‘και ΣΤΕΡΕΩΝ 5’ εκκινητές. Το ενισχυμένο cDNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας PureLink PCR Micro kit (Invitrogen, Carlsbad CA, USA), QC’ed από το Bioanalyzer 2100 DNA 1000 σετ (Agilent, Santa Clara, CA, USA), και ποσοτικοποιείται με τη χρήση του qubit 2.0 φθοριόμετρο (Invitrogen, Carlsbad CA, USA). Το σύνολο βιβλιοθήκες μεταγραφικό χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή στερεών templated χάντρες παρακάτω το στερεό Templated Χάντρα Οδηγός Προετοιμασίας και αλληλουχία με τη χρήση του 50 × 25 ζεύγη-end πρωτόκολλο, για κάθε δείγμα που παράγουν περισσότερα από 500 m διαβάστε ζεύγη ανά δείγμα.

Υπολογιστική ανάλυση του RNA-επόμενα δεδομένα

αλληλουχίας μεταγραφικό των υποπληθυσμών CD133 + και CD133- παράγονται 529 Μ και 531 Μ 50 × 25 ζεύγη ανάγνωσης, αντίστοιχα. Πρέπει πρώτα να ευθυγραμμίζονται ολόκληρο το μεταγραφικό ζεύγη τέλος διαβάζει σε γονίδια rRNA και tRNA χρησιμοποιείτε την έκδοση 0.6.4 στ της bfast + BWA [29] και διατηρούνται μόνο εκείνα τα ζευγάρια στα οποία ευθυγραμμίστηκε ούτε ανάγνωση, με αποτέλεσμα σύνολα δεδομένων που περιλαμβάνουν 77 Μ και 79 Μ διαβάστε ζεύγη. Στη συνέχεια ευθυγραμμίζονται κάθε σετ των διατηρούμενων διαβάσετε ζεύγη με bfast + BWA σε ένα προσαρμοσμένο μη πλεονασματική βάση δεδομένων των ισομορφών mRNA κατασκευάστηκε με το πρόγραμμα «cuffcompare» από την έκδοση 0.9.3 της σουίτας λογισμικού Μανικετόκουμπα (79) και όλα τα μοντέλα ισομορφή στο REFSEQ [30], UCSC γνωστά γονίδια [31], και Ensembl [32] βάσεις δεδομένων. Είμαστε δίπλα μετατραπεί η ευθυγράμμιση ανάγνωσης συντεταγμένες στο mRNA των ισομορφών βάση δεδομένων για να hg19 γονιδιωματικής συντεταγμένες χρησιμοποιώντας μια προσαρμοσμένη δέσμη ενεργειών. Από αυτές τις ευθυγραμμίσεις που υπολογίζεται στατιστικά στοιχεία έκφρασης και διαφορικής έκφρασης με τις «μανικετόκουμπα» και «cuffdiff» προγράμματα μανικετόκουμπα, αντίστοιχα. Όταν χρησιμοποιείτε και τις δύο προγράμματα που χρησιμοποιούνται επάνω εξομάλυνση τεταρτημόριο και το hg19 ανθρώπινη αλληλουχία αναφοράς γονιδιώματος για τη διόρθωση προκατάληψη. Υπολογίσαμε ότι 13.612 γονίδια και 43.120 ισομορφές γονίδιο είχε κάποια μη μηδενική επίπεδο έκφρασης σε τουλάχιστον ένα από τα δύο υποπληθυσμών. Σχήμα S1 στα Πληροφοριακά S1 δείχνει ένα ιστόγραμμα αυτών προ-φιλτραρισμένες τιμές έκφραση ισομορφή σε αμφότερες τις κυτταρικές υποπληθυσμούς. Η πλειοψηφία αυτών των περιπτώσεων επρόκειτο να διαβάσει το θόρυβο χαρτογράφηση ή «διαρροή» έκφραση γονιδίων που είναι αγνώστου φυσιολογική σημασία [33], έτσι ώστε να εφαρμοστεί ελάχιστη έκφραση και να διαβάσετε τα κριτήρια κάλυψης (& gt? 1 FPKM και% κάλυψη 60) για να ληφθεί μια αρχική έκφραση ισομορφή υπολογίζει στους δύο υποπληθυσμούς. Παρατηρήσαμε ότι 3.844 γονίδια με 7.558 ισομορφές mRNA πληρούνται αυτά τα ελάχιστα κριτήρια. Για να είναι πολύ σίγουροι για την έκφραση και τη διαφορική έκφραση αποτελέσματά μας, εφαρμόσαμε αυστηρό φιλτράρισμα με τις αρχικές εκτιμήσεις της έκφρασης ισομορφή? εμείς περιορίζεται ανάλυσή μας να ισομορφές mRNA που εκφράζεται σε ένα επίπεδο τουλάχιστον 30 FPKM σε μία από τις υποπληθυσμών και οι οποίες καλύφθηκαν επί τουλάχιστον το 60% του μήκους τους με αλληλούχιση διαβάζει. Επιπλέον, για μια ισομορφή να ονομάζεται διαφορικά εκφρασμένων, διαφορική έκφραση του έπρεπε να ονομάζεται σημαντικές σε FDR 0.01 και να έχουν αλλάξει τουλάχιστον τέσσερις φορές μεταξύ των δύο υποπληθυσμών. Η εφαρμογή αυτών των κριτηρίων απέδωσε 572 γονίδια είχαν τουλάχιστον μία ισομορφή που ήταν σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο. Ως τελικό αποτέλεσμα, υπολογίσαμε 671 των 43.120 ισομορφές (1,6%) ήταν σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο. Πίνακας S1 στα Πληροφοριακά S1 δείχνει πώς αλλάζουν οι αριθμοί για διαφορετικές FPKM και διπλώστε τα κριτήρια αλλαγής.

Αποτελέσματα

Απομόνωση της CSC και μη-CSC υποπληθυσμών

Εμείς απομονωθεί ανθρώπινη ΚΕΠ ( CD133 + /EpCAM +) και μη-ΚΕΠ (CD133- /EpCAM +) από ένα εκ πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα ξενομόσχευμα καρκίνου χρησιμοποιώντας ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) και αντίστοιχα συλλέχθηκαν συνολικά 9,19 × 10

4 (3,4%) και 2,18 × 10

6 (96,6%) ζωντανών κυττάρων που αντιστοιχούν στα δύο υποπληθυσμούς (Σχήμα 2). Για να εκτιμηθεί η ποιότητα του είδους μας, μετρήσαμε τα επίπεδα έκφρασης του CD133 ισομορφές (Σχήμα S2 με πληροφορίες S1) στις συνόλου των δεδομένων που μεταγραφικό (περιγράφεται παρακάτω) και παρατηρήθηκε μέτρια έκφραση των τριών ισομορφών στον υποπληθυσμό CD133 + και μη ανιχνεύσιμο επίπεδο έκφρασης του CD133 – υποπληθυσμός. Πραγματοποιήσαμε μια δεύτερη FACS για την ίδια ξενομοσχεύματος που απομονώθηκε από ένα διαφορετικό ζώο και λαμβάνεται ένα παρόμοιο αριθμό και την αναλογία των CD133 + και κυττάρων CD133- (Σχήμα S3 στα Πληροφοριακά S1). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι είμαστε σε θέση να ταξινομήσετε σε καθαρό υποπληθυσμούς CD133 + και CD133- και ότι το CD133 + υποπληθυσμό αποτελεί ένα μικρό κλάσμα των καρκινικών κυττάρων του πλακώδους όγκου του πνεύμονα, το οποίο είναι σύμφωνο με προηγουμένως δημοσιευμένες μελέτες [15], [26] .

(Α) Τα ζωντανά κύτταρα εμφανίζονται διακριτά πληθυσμούς είτε το ποντίκι CD45 /MHC Ι ή έκφραση της ανθρώπινης EpCAM. (Β) Απομόνωση ανθρώπινων CD133 + κύτταρα (κόκκινο) από ανθρώπινα κύτταρα CD133- (πράσινο) και θετικά κύτταρα ποντικού (μπλε). (C) Reanalysis των κυτταρικών πληθυσμών στο πάνελ Β δείχνει ότι η C133 + κυττάρων (κόκκινο) είναι 3,4% του EpCAM + πληθυσμού.

Η

Η μεταλλάξεων τοπίο των πλακωδών κυττάρων των πνευμόνων υποπληθυσμών όγκου

πραγματοποιήσαμε Copy Number Τροποποίηση (ΚΥΠΕ) ανάλυση με μικροσυστοιχίες (βλέπε αποτελέσματα και οι μέθοδοι της Πληροφορίας S1) της βλαστικής σειράς, CD133 +, και CD133- DNA και διαπίστωσε ότι περίπου το ήμισυ του συνόλου του γονιδιώματος τόσο στην CD133- και CD133 + υποπληθυσμών είχε εμπλακεί σε μεγάλο προσαρμογείς CNA (Σχήμα S4 στα Πληροφοριακά S1). Επικάλυψη ανάλυση αποκάλυψε την πιθανή ύπαρξη CNAs ειδικά για κάθε υποπληθυσμό, αλλά μόλις το εγχειρίδιο επιθεώρηση όλων των CNA και λαμβάνοντας υπόψη την ακρίβεια των μικροσυστοιχιών [34], δεν μπορούσε με βεβαιότητα να εντοπίσει διαφορές. Έτσι καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι τα χρωμοσώματα του CD133 + και CD133- υποπληθυσμών ήταν ιδιαίτερα μεταβληθεί σε μεγάλο βαθμό δυσδιάκριτες τρόπο. Επιπρόσθετα, αναλύσαμε ολόκληρη δεδομένα αλληλουχίας του γονιδιώματος του υποπληθυσμό CD133 + και ταιριάζουν DNA βλαστικής σειράς και κατέληξε στο συμπέρασμα ότι ο όγκος που μελετήθηκαν δεν περιέχει κανένα κλινικά προσφυγής μεταλλάξεις (Πίνακες S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10 , S11, S12 στα Πληροφοριακά S2 και το Σχήμα S8 στα Πληροφοριακά S1).

Αξιολόγηση του mRNA ισομορφές γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας

η απορρύθμιση της έκφρασης των ισομορφών mRNA μπορεί να οδηγήσει στη δημιουργία καρκινογόνες συνδέονται πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας που είναι δυνητικοί αντιγονικούς στόχους για θεραπευτική μονοκλωνικά αντισώματα. Για τον προσδιορισμό των στόχων αυτών, μετρήσαμε την έκφραση των 1.191 mRNA ισομορφών του 426 CD Molecule [35], 354 GPCR [36], και 212 διαύλων ιόντων [36] γονίδια (992 συνολικές γονίδια). Έχουμε περιορισμένες ανάλυσή μας για να ισομορφές που ήταν τουλάχιστον μέτριας εκφράσεως (30 FPKM) και καλύπτει πάνω από το 60% τουλάχιστον του μήκους τους με αλληλούχιση διαβάζει σε μία ή και τις δύο υποπληθυσμών CD133 + και CD133-, αποδίδοντας ένα σύνολο αξιολόγηση των 124 ισομορφών που αντιπροσωπεύουν το 80 γονίδια (10,4% των 1.191 ισομορφών και 8,0% των 992 γονίδια) (Σχήμα 3? Σχήματα S5A, S5B σε πληροφορίες S1). Από τους 124 εντόνως εκφρασμένων ισομορφών, 43 (σε 25 γονίδια) έχουν τουλάχιστον τετραπλάσια διαφορές έκφρασης (FDR & lt? 0,01), με 24 παρουσίαζαν μειωμένη και 19 δείχνει αυξημένη έκφραση σε κύτταρα CD133 + σε σχέση με CD133- κύτταρα (Σχήμα 3). Είναι ενδιαφέρον, 31 (25%) από τα 124 υψηλής έκφρασης ισομορφές αντιστοιχούν σε 18 γονίδια υπό ενεργή έρευνα ως στόχοι φαρμάκων για πολλές καρκίνους (ειδικά ABCG2 [37], ADAM10 [38], ALCAM [39], [40], BSG [ ,,,0],41], CD151 [42], CD44 [43], CD47 [44], [45], CD9 [46] – [50], CEACAM5 [51], [52], CEACAM6 [52], CXCR4 [53], ΕρΟΑΜ [54], erbB2 [55], ICAM1 [56], IGF1R [57], NRP1 [58], NT5E [59], TRPM7 [60]. Από τη σημείωση, η ισομορφή ABCG2 (16Χ υψηλότερη έκφραση στον υποπληθυσμό CD133 +) και την ισομορφή CXCR4 (4Χ υψηλότερη έκφραση στον υποπληθυσμό CD133 +) έχουν προηγουμένως ταυτοποιηθεί ως βιοδείκτες του όγκου πνεύμονα καρκίνος κύτταρα έναρξης γλιτώσει από κατεργασία σισπλατίνη [15]. Εκτός από αυτές τις 18 γονίδια υπό ενεργή έρευνα ως φάρμακο στοχεύει σε δύο άλλα γονίδια υψηλής έκφρασης -CD97 [61], και IFITM1 [62] -έχουν προταθεί αλλά δεν επιδιωχθεί ενεργά ως στόχοι θεραπευτικό αντίσωμα για την πρωτογενή ή μεταστατικών όγκων. πιστεύουμε ότι και άλλα γονίδια υψηλής έκφρασης κυτταρικής επιφάνειας που φαίνεται στο Σχήμα 3 μπορεί επίσης να είναι πιθανοί στόχοι φαρμάκων. Για παράδειγμα, μια ισομορφή DDR1, ένα ομόλογο του DDR2 που είναι υποσχόμενο στόχο για SCC [7], εκφράζεται έντονα σε κύτταρα CD133 +. ICAM4, η οποία έχει αποδειχθεί ρόλο στην καρκινογένεση και βρίσκεται στην θέση ευαισθησίας 19p13.2 για πολλαπλούς καρκίνους [63], [64], είναι επίσης εξαιρετικά εκφράζεται. Όπως αυτές επιφάνεια 22 κυτταρική γονίδια των θεραπευτικών κωδικοποιούν το ενδιαφέρον για τις πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου, κυτταρική προσκόλληση, η μετανάστευση, και χημειοαντίσταση, ομοιότητες έκφρασή τους και τις διαφορές εντοπίζονται εδώ δείχνει πώς αναλύσεις ισομορφή επίπεδο μπορεί να προσφέρει ένα νέο επίπεδο των πληροφοριών τόσο για την κατανόηση η φυσιολογία του, και για στόχευση, ειδικοί υποπληθυσμοί όγκου.

που εμφανίζονται είναι τα επίπεδα έκφρασης των 1.191 ισομορφών των 426 CD Molecule, 354 GPCR και 212 ιόντων γονίδια κανάλι. Γκρι κύκλοι αντιστοιχούν σε ισομορφές που δεν πληρούν τα κριτήρια ελάχιστο επίπεδο έκφρασης μας και μπλε κύκλους σε ισομορφές που έκανε, αλλά δεν ήταν εξέφρασε σημαντικά διαφορικά. Χρωματιστά τρίγωνα δείχνουν σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων ισομορφών? πράσινο κάτω δείχνοντας τρίγωνα υποδεικνύουν μειωμένη έκφραση και κόκκινο up-δείχνοντας τρίγωνα υποδεικνύουν αυξημένη έκφραση στα κύτταρα CD133 +. Οι διαγώνιες γκρίζες γραμμές είναι φορές κλινή αλλαγή. Οι ισομορφές συζητούνται στο κείμενο το όνομα. Σημειώστε ότι CD133 /PROM1 δεν πληροί το κριτήριο της έκφρασης μας, βασίζεται η αυστηρότητα των φιλτράρισμα δεδομένων μας? αλλά παρουσιάζεται για σύγκριση. Εδώ χρησιμοποιούμε HGNC εγκεκριμένο σύμβολα γονιδίου [96] και UCSC ονομασίες ισομορφή [31].

Η

Για να αξιολογηθεί ο βαθμός στον οποίο η υψηλή έκφραση των θεραπευτικά ελκυστικές πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας που περιγράφονται παραπάνω για τη μελετηθεί όγκος είναι ένα κοινό φαινόμενο σε SCC εξετάσαμε TCGA δεδομένων μεταγραφικό των 221 πλακώδους καρκίνων του πνεύμονα [28], [65]. Σημαντικά, αλληλούχιση TCGA εκτελείται σε χύδην όγκου, έτσι ώστε η σύνθεση υποπληθυσμός αναμένεται να είναι αρκετά διαφορετική από ό, τι των υποπληθυσμών CD133 + και CD133- του καρκινώματος πλακωδών κυττάρων στη μελέτη μας. Η δημόσια διαθέσιμα δεδομένα έκφρασης TCGA αναλύεται στο exon-, junction- συναρμογής, και γονιδιακών επίπεδο. Δεδομένου ότι δεν υπάρχει καθιερωμένη τρόπος να συμπεράνουμε έκφραση ισομορφή επιπέδου από το εξώνιο και την έκφραση κόμβο ματίσματος, επιλέξαμε να συγκρίνουμε έκφρασης επίπεδο ισομορφής μας υπολογίζει με τις εκτιμήσεις επίπεδο έκφρασης του γονιδίου TCGA. Με βάση το γεγονός ότι η ανάλυσή μας επικεντρώθηκε σε ισόμορφα με υψηλή έκφραση, Σκεφθήκαμε ότι εάν τα ευρήματά μας είναι η γενική να SCC τότε θα παρατηρήσουμε υψηλή έκφραση των αντίστοιχων γονιδίων ολόκληρο σε μια πλειονότητα των δειγμάτων όγκου 221. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, 4C, η πλειοψηφία των 22 γονιδίων κυτταρικής επιφάνειας θεραπευτικού ενδιαφέροντος είναι γερά εκφράζονται σε όλα τα 221 δείγματα με 12 διάθεση στο top 10% (διάμεση έκφραση & gt? 31 RPKM) από τα πιο υψηλά εκφραζόμενα γονίδια. Είναι ενδιαφέρον, ABCG2 και ICAM4, οι οποίες έχουν τα δύο χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης των 22 γονιδίων, ήταν κυρίως εκφράζεται στο υποπληθυσμό CD133 +. Η κατάσταση αυτή αντανακλά εκείνη του CD133 /PROM1 (Σχήμα 3), έτσι ώστε να εικάζουν ότι η φαινομενικά χαμηλό όγκο ευρεία έκφραση ABCG2 και ICAM4 είναι επειδή είναι δυναμικά εκφράζονται μόνο σε CD133 + κύτταρα, τα οποία αποτελούν ένα μικρό κλάσμα των κυττάρων του όγκου. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι τα ευρήματά μας είναι γενικά για SCC και έτσι θα μπορούσαν να επηρεάσουν την κλινική ανάπτυξη, επειδή προσδιορίζουν αυτή την ασθένεια ως μια πιθανή νέα ένδειξη για πολλά φάρμακα επί του παρόντος υπό ανάπτυξη και να προτείνουν διάφορα πρόσθετα νέα ελπιδοφόρα στόχους.

Α) επιφάνεια του κυττάρου και Β) ολόκληρο το γονίδιο εκτιμήσεις της έκφρασης σχετίζονται με την απόπτωση από δείγματα ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα 221 πνεύμονα. Γ) Η κατανομή των επιπέδων έκφρασης που υπολογίζεται για 20.533 γονίδια ανά δείγμα, κατά μέσο όρο σε όλα τα 221 δείγματα. Η διακεκομμένη οριζόντια γραμμή δείχνει την top 5% των γονιδίων, όταν ανάλογα με την έκφραση.

Η

Η αξιολόγηση του mRNA ισομορφές των γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση

Με δεδομένη την έκταση της γονιδιωματικής αλλοιώσεις που παρατηρήθηκαν στο CNA ανάλυση του μελέτησαν SCC και το πλήθος των γνωστών μηχανισμών κυτταρικού θανάτου που ανταποκρίνονται στην βλάβη του DNA, έχουμε την υποψία ότι τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να έχουν αλλαγμένη έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση, προκειμένου να επιβιώσουν σε ένα τέτοιο υψηλό μεταλλακτικό φορτίο. Για να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με την ικανότητα επιβίωσης των + και CD133- υποπληθυσμών CD133, πραγματοποιήσαμε μια εστιασμένη ανάλυση της έκφρασης σε ένα σύνολο 106 γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση (Πίνακας S2 με πληροφορίες S2) που είχαν συνολικά 434 ισομορφές mRNA. Όπως παραπάνω, εμείς περιορίζεται ανάλυσή μας σε ισόμορφα που εκφράστηκαν στο επίπεδο τουλάχιστον 30 FPKM και ότι καλύφθηκαν πάνω από τουλάχιστον το 60% του μήκους τους με αλληλούχιση διαβάζει σε μία ή και τις δύο υποπληθυσμών. Τριάντα από τα 106 γονίδια (28%) και 37 από τα 434 ισομορφές (9%) ικανοποιεί τα κριτήρια αυτά (Σχήμα 5? Σχήμα S6 στα Πληροφοριακά S1). Είναι ενδιαφέρον, μόνο 9 ισομορφών σε 6 γονίδια ήταν σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο με τουλάχιστον μία διαφορά τετραπλάσια μεταξύ των δύο υποπληθυσμών (FDR & lt? 0,01). Αξιοσημείωτη είναι η υψηλή έκφραση της ισομορφής L-Myc (MYCL1, uc001cer) και μία ισομορφή ΧΙΑΡ (ΧΙΑΡ, ucoo4etx) σε δύο υποπληθυσμούς, με τέσσερις φορές προς τα πάνω ρύθμιση στο CD133 + και των υποπληθυσμών CD133-, αντίστοιχα. L-Μγο είναι μια παγκοσμίως ενεργεί παράγοντα μεταγραφής και όλων των πρωτεϊνών στην οικογένεια Myc (Ν-myc, c-Myc, και L-Myc) που έχει την ισχυρότερη και πιο εξειδικευμένη δράση στην προώθηση των ανθρωπίνων iPSC γενεά-πιθανώς μέσω του ικανότητα να καταστέλλουν τα γονίδια διαφοροποίησης που σχετίζεται με [66]. ΧΙΑΡ είναι ένα πολύ γνωστό καταστολέα απόπτωσης πέραν των άλλων φυσιολογικών ρόλων που σχετίζονται με λιγάσης ουβικουϊτίνης Ε3 του [67]. Επίσης αξιοσημείωτο είναι τα λίγα ισομορφές (δηλαδή BCLAF1 και BFAR ισομορφές) με & gt? 16x διαφορική έκφραση. BCLAF1, η οποία έχει μια ισομορφή εκφράζεται έντονα μόνο στον υποπληθυσμό CD133-, παίζει κρίσιμο ρόλο σε πολλές διαδικασίες [68], συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης των πνευμόνων [69]. BFAR, μια Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης που πιθανόν μεσολαβεί αλληλοπαρεμβολές μεταξύ των ενδογενών και εξωγενών αποπτωτικών οδών [70], έχει ένα ισομορφή εκφράζεται αποκλειστικά σε CD133 + και μια άλλη αποκλειστικά σε CD133-. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι, αν και συνολικά οι υποπληθυσμοί CD133 + και CD133- εκφράζουν παρόμοια γονίδια σχετίζονται με την απόπτωση, διαφορές έκφραση των ισομορφών των βασικών γονιδίων της απόπτωσης μπορεί εν μέρει να συμβάλλουν σε διαφορές αυτο-ανανέωση και την επιβίωση μεταξύ αυτών των τύπων καρκινικών κυττάρων.

Προβολή είναι τα επίπεδα έκφρασης των ισομορφών 434 106 γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση. Γκρι κύκλοι αντιστοιχούν σε ισομορφές που δεν πληρούν τα κριτήρια ελάχιστο επίπεδο έκφρασης μας και μπλε κύκλους σε ισομορφές που έκανε, αλλά δεν ήταν εξέφρασε σημαντικά διαφορικά. Χρωματιστά τρίγωνα δείχνουν σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων ισομορφών? πράσινο κάτω δείχνοντας τρίγωνα υποδεικνύουν μειωμένη έκφραση και κόκκινο up-δείχνοντας τρίγωνα υποδεικνύουν αυξημένη έκφραση στα κύτταρα CD133 +. Οι διαγώνιες γκρίζες γραμμές είναι φορές κλινή αλλαγή. Οι ισομορφές συζητούνται στο κείμενο το όνομα. Οι ισομορφές συζητούνται στο κείμενο το όνομα. Εδώ χρησιμοποιούμε HGNC εγκεκριμένο σύμβολα γονιδίου [96] και UCSC ονομασίες ισομορφή [31].

Η

Είμαστε δίπλα επικεντρώθηκε στα πιο υψηλά εκφραζόμενα γονίδια σχετίζονται με την απόπτωση τόσο στα υποπληθυσμών CD133 + και CD133- να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με τους μηχανισμούς επιβίωσης κοινά μεταξύ αυτών των τύπων καρκινικών κυττάρων. Αυτό επικεντρώθηκε ανάλυση αποκάλυψε c-Myc (MYC, uc003ysi), καθώς και τις μεγάλες ισομορφές του TRAIL /TNFSF10 (TNFSF10, uc003fid), Mcl-1 (MCL1, uc010pch), και Bcl-x (BCL2L1, uc002wwl) να είναι μεταξύ των πιο υψηλά εκφραζόμενα γονίδια σχετίζονται με την απόπτωση (Σχήμα 5). Επιβεβαιώσαμε με RT-qPCR την υψηλή έκφραση του c-myc, Mcl-1

L, και ΒοΙ-χ

L τόσο στον CD133 + και υποπληθυσμών CD133- (Σχήμα S7 στα Πληροφοριακά S1). Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η έκφραση υψηλού c-Myc επάγει ισχυρά την ενδογενή (μιτοχόνδρια μεσολάβηση) μονοπατιού κυτταρικού θανάτου? ωστόσο ταυτόχρονη υψηλή έκφραση του Mcl-1

L και Bcl-x

L μπορεί απομονώσει τα μιτοχονδριακών πρωτεϊνών εξωτερικής μεμβράνης Bak και Βαχ [71], [72], και με τον τρόπο αυτό εμποδίσει τις αποπτωτικές συνέπειες του c-myc. Ένας τέτοιος ρόλος για Mcl-1

L και Bcl-x

L έχει καταδειχθεί πρόσφατα σε 14 c-Myc καθοδηγείται μη πλακώδους κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα του ανθρώπου [73], σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο του πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα [74], και σε άλλα περιβάλλοντα κακοήθειας [75]. Τα δεδομένα μας εμπλέκουν Mcl-1

L και Bcl-x

L σε μπλοκάρισμα των αποπτωτικά αποτελέσματα του c-myc τόσο στην CSC και τον υποπληθυσμό μη CSC του μελέτησαν καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων. Σημειώνουμε ότι ενώ οι μεγάλες ισομορφές του Mcl-1 και ΒοΙ-Χ έδειξαν λειτουργίες προ-επιβίωσης, οι κοντές ισομορφές αυτών των γονιδίων, τα οποία δεν εκφράζονται, είναι προ-αποπτωτικά [76]. Υψηλή έκφραση του μακριά ισομορφή του TRAIL (TRAIL

L) και στους δύο υποπληθυσμούς είναι σημαντική, καθώς αυτή η κυτοκίνη είναι υπό έρευνα σαν αντικαρκινικός παράγοντας [77], επειδή μπορεί επιλεκτικά να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα μέσω απόπτωσης τη μεσολάβηση υποδοχέων. Ωστόσο, η παρατεταμένη έκθεση σε υψηλά επίπεδα του TRAIL

L μπορεί να οδηγήσει σε TRAIL

αντίσταση L, μετά την οποία TRAIL

L γίνεται ένας ισχυρός επαγωγέας του πολλαπλασιασμού και της μεταστάσεως [78]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει τόσο Mcl-1

L, και ΒοΙ-χ

L να είναι υπεύθυνη για τα κεκτημένα TRAIL

αντίσταση L σε μη πλακώδους καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές [79] και σε άλλες καρκινικές κυτταρικές γραμμές [ ,,,0],80] – [83]. Αξίζει να σημειωθεί ότι ένα άλλο σημαντικό καθοριστικό παράγοντα της αντίστασης TRAIL, γ-Flip

L (CFLAR, uc002uxb) -το μεγάλη ισομορφή του Flip /CFLAR που είναι καταλυτικά ανενεργό ομόλογο της κασπάσης-8-είναι επίσης εξαιρετικά εκφράζεται σε δύο υποπληθυσμούς μας μελέτησαν SCC (Σχήμα 5) [79], [84] – [87]. Οι κοντές ισομορφές τόσο του TRAIL και c-Flip έχουν επίσης αντίθετες προ-αποπτωτικών ρόλους σε σύγκριση με τις μεγάλες ισομορφές [79], [88]. Συνολικά ανάλυση γονιδιακής έκφρασης ισόμορφου επιπέδου μας δείχνει ότι στο μελετήθηκε SCC τόσο των υποπληθυσμών CD133 + και CD133- οδηγήθηκαν από πολύ υψηλά επίπεδα του c-myc και TRAIL

L και ότι η κανονική αποπτωτική απόκριση στην υψηλή έκφραση αυτών των γονιδίων αποτράπηκε με πολύ υψηλά επίπεδα Mcl-1

L και Bcl-x

L και C-Flip

L.

και πάλι χρησιμοποιήσαμε TCGA δεδομένων μεταγραφικό των 221 πλακώδους καρκίνων του πνεύμονα να προσδιοριστεί η γενικότητα των αποτελεσμάτων των αναλύσεων ισομορφής γονίδιο απόπτωση μας. Όπως παραπάνω για ABCG2 και ICAM4, αποδίδουμε το φαινομενικά χαμηλό όγκο ευρεία έκφραση της L-Myc (MYCL1) (Εικόνα 4Β, 4Γ) στην πιθανότητα ότι το SCC είναι γερά εκφράζεται μόνο στο CD133 + κύτταρα, τα οποία αποτελούν ένα μικρό κλάσμα τα καρκινικά κύτταρα.