Αφηρημένο

Η προσκόλληση των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων του προστάτη ήταν ποσοτικά για δύο μοντέλο κυτταρικές σειρές καρκινώματος LNCaP (λεμφαδένα-ειδικό) και PC3 (μυελός ειδικά των οστών). Από time-lapse μικροσκοπία και η φασματοσκοπία δύναμη βρήκαμε κύτταρα PC3 να τηρούν κατά προτίμηση σε μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα που προέρχονται από μυελό των οστών (κυτταρική σειρά SCP1). Χρησιμοποιώντας μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM) φασματοσκοπία δύναμη με βάση, η μηχανική πρότυπο της προσκόλλησης σε κύτταρα SCP1 χαρακτηρίστηκε και για τις δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη και σε σύγκριση με ένα υπόστρωμα που αποτελείται από κύτταρα PC3 I. καθαρού κολλαγόνου τύπου διαχεόμενη περισσότερη ενέργεια (27,6 aJ) κατά τη διάρκεια οι ανάγκασε πειράματα AFM de-συγκόλληση και έδειξε σημαντικά περισσότερο κολλητική και ισχυρότερη ομολόγων σε σύγκριση με τα κύτταρα LNCaP (20.1 aJ). Οι χαρακτηριστικές υπογραφές των αποκόλλησης ίχνη δύναμη αποκάλυψε ότι, σε αντίθεση με τα κύτταρα LNCaP, κύτταρα PC3 φαίνεται να χρησιμοποιήσουν filopodia τους εκτός από τη δημιουργία ομόλογα κόλλα. Στο σύνολό τους, η μελέτη μας δείχνει καθαρά ότι τα κύτταρα PC3 έχουν μια ανώτερη κολλητική συγγένεια με το μυελό των οστών μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα, σε σύγκριση με LNCaP. Ημι-ποσοτική PCR σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές καρκινώματος προστάτη αποκάλυψε την έκφραση των δύο υποδοχείς δέσμευσης ιντεγκρίνης Col-I, α1β1 και α2β1 σε κύτταρα PC3, υποδηλώνοντας πιθανή εμπλοκή τους στην ειδική αλληλεπίδραση στα υποστρώματα. Περαιτέρω κατανόηση των ακριβείς μηχανισμοί πίσω από αυτό το φαινόμενο θα μπορούσε να οδηγήσει σε βελτιστοποιημένη θεραπευτικές εφαρμογές που στοχεύουν στην μεταστατική συμπεριφορά ορισμένων καρκινικών κυττάρων του προστάτη προς οστίτη ιστού

Παράθεση:. Sariisik E, Docheva D, Padula D, Popov C, Opfer J , Schieker M, et al. (2013) Διερευνώντας τις δυνάμεις αλληλεπίδρασης των καρκινικών κυττάρων του προστάτη με κολλαγόνο Ι και μυελού των οστών κύτταρα σχετικά με την ενιαία κυτταρικό επίπεδο. PLoS ONE 8 (3): e57706. doi: 10.1371 /journal.pone.0057706

Επιμέλεια: Daniel J. Muller, Ελβετικό Ομοσπονδιακό Ινστιτούτο Τεχνολογίας της Ζυρίχης, Ελβετία

Ελήφθη: 13 του Αυγούστου του 2012? Αποδεκτές: 28η Ιανουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαρτίου, 2013

Copyright: © 2013 Sariisik et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση που προβλέπεται από το Υπουργείο εθνικής Παιδείας της Τουρκίας (https://egitek.meb.gov.tr), η γερμανική Πρωτοβουλία αριστείας μέσω της «πρωτοβουλίας Νανοσυστημάτων του Μονάχου» (https://www.nano-initiative-munich.de/de/research -areas /) και το γερμανικό ερευνητικό ίδρυμα (https://www.dfg.de/gefoerderte_projekte/informationssysteme/index.jsp). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι ένας από τους πιο κοινούς κακοήθειες και η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες στην Ευρώπη. Σχεδόν όλοι οι ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη δείχνουν μετάσταση στα οστά, η οποία είναι συχνά η μόνη ανιχνεύσιμη περιοχή της εξάπλωσης του καρκίνου [1]. Επιπλέον, ο καρκίνος του προστάτη στα οστά, συχνά διαγιγνώσκεται πριν από την ανίχνευση του πρωτεύοντος νόσου και τη στιγμή που τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη εμφυτευμένα στο σκελετό, θεραπευτική αγωγή δεν είναι πλέον δυνατή και ανακουφιστική θεραπεία γίνεται η μόνη επιλογή [2]. Αν και οι ερευνητές αρχίζουν τώρα να κατανοούν τους μηχανισμούς της ανάπτυξης του καρκίνου στα οστά, τα αρχικά βήματα της καρκινικών κυττάρου-προς-οστό αλληλεπιδράσεων που προωθούν την επέκταση της μεταστατικής κατάθεσης δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή. Συνεπώς, υπάρχει σαφώς η ανάγκη για τη διαλεύκανση των παραγόντων που ενισχύουν την εξάπλωση του καρκίνου του προστάτη ιδιαίτερα στον σκελετό.

Έχει προταθεί ότι ο καρκίνος μετάσταση στα οστά είναι το αποτέλεσμα μιας σύνθετης αλληλεπίδρασης μεταξύ κυττάρων καρκίνου του προστάτη με την πρωτεΐνες οστικής μήτρας και με τους κυτταρικούς τύπους που διαμένουν στον ιστό των οστών, όπως οι οστεοβλάστες και οστεοκλάστες [3] – [5]. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι ο καρκίνος του προστάτη PC3 κυτταρική γραμμή, που απομονώνονται από το μυελό των οστών, έχει μια σημαντικά υψηλότερη προσκόλληση στο βασικό τύπο του κολλαγόνου του οστού πρωτεΐνη Ι (Col-I) από την κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος προστάτη LNCaP που προέρχεται από ένα μη μεταστατική εντόπιση των οστών [6], [7]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η συγγένεια προς Col-Ι θα μπορούσε να είναι ένας από τους μοριακούς παράγοντες που συμβάλλουν στην πρόοδο κάποιων κυττάρων καρκίνου του προστάτη στο οστό.

Όσον αφορά τις κυτταρικούς παράγοντες, εκτός από οστεοβλάστες και οστεοκλάστες, μια άλλη ενδιαφέρουσα συμμετέχοντα που έχει αναφερθεί πρόσφατα είναι ο κυτταρικός πληθυσμός που κατοικεί στο μυελό των οστών, που ονομάζονται μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSC). MSCs είναι τα πρώτα πρόγονοι των οστεοβλαστών και μπορεί να επεκταθεί περαιτέρω και να διαφοροποιηθούν σε εξειδικευμένα μεσεγχυματικά κύτταρα όπως λιποκύτταρα, χονδροκύτταρα, οστεοβλάστες ή in vitro [8]. Cross et al., 2007, έχουν δείξει ότι MSCs μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην υποστήριξη της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη και την επιβίωση στο οστό [9].

Από την αρχική σύσταση για τη μεταγενέστερη επέκταση στο οστό, ο προστάτης καρκινικά κύτταρα απαιτούν επεμβατική ικανότητα. Nabha et al., 2008 διαπιστώθηκε ότι MSCs διέγειρε την επεμβατική ικανότητα των κυττάρων PC3 μέσω Col-I επάγοντας την έκκριση της πρωτεάσης ΜΜΡ-12 από το PC3 κύτταρα [10]. Επιπλέον, ένα πρόσφατο άρθρο έδειξε ότι τα μεσεγχυματικά ινοβλάστες μπορεί να οδηγήσει τη συλλογική εισβολή του καρκίνου με την αναδιαμόρφωση περιβάλλουσα ύλη τους, και ως εκ τούτου η δημιουργία φυσικού χώρου μέσα από την οποία τα καρκινικά κύτταρα μπορεί απλά να ακολουθήσετε [11].

Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ήδη συγκεκριμένες cross-talk μεταξύ καρκινικών κυττάρων του προστάτη και MSCs, αλλά ακόμα δεν είναι σαφές εάν και πόσο ισχυρή αυτοί οι δύο τύποι κυττάρων μπορούν να αλληλεπιδράσουν και τι θα μπορούσε να τους μηχανισμούς πίσω από αυτήν την αλληλεπίδραση. Ειδικά μόρια πάνω στην κυτταρική επιφάνεια μπορεί να μεσολαβήσει κυτταρικές αλληλεπιδράσεις. Τέτοιες μοριακές αλληλεπιδράσεις έχουν μετρηθεί μηχανικά από τον εντοπισμό τη δύναμη που απαιτείται για το διαχωρισμό ζεύγη υποδοχέα-συνδέτη ή αλληλεπιδρά κυττάρων με οπτική λαβίδα, ο ανιχνευτής δύναμη βιομεμβράνης ή μικροσκοπία ατομικής δύναμης [12] – [14]. Τέτοια πειράματα δεν είναι μόνο σε θέση να μετρήσουν τα γεγονότα μοριακό απόσπαση, αλλά και για την ανίχνευση της μηχανικής ενσωμάτωσης και αγκύρωση των μετρημένων μορίων στα κύτταρα [15] – [17]. Έτσι, ο κύριος στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αποκτήσουν νέες γνώσεις σχετικά με τις αλληλεπιδράσεις των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη με στρωματικά κύτταρα μυελού με έμφαση στις μηχανικές δυνάμεις που συμβαίνουν σε μοριακό επίπεδο. Ειδικότερα, η ποσοτικοποίηση των συγκολλητικών δυνάμεων μεταξύ του προστάτη καρκινικών κυττάρων και την πρωτεΐνη μήτρας Col-Ι φαίνεται να είναι απαραίτητη, επειδή προηγούμενες μελέτες που διερευνούν τη συγγένεια των κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε διάφορες πρωτεΐνες μήτρας δεν καθορίζουν δύναμη αλληλεπίδρασή τους.

ως καρκινικά κύτταρα προστάτη, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα PC3, τα οποία έχουν προέλθει από μετάσταση μυελού των οστών και ως μάρτυρες, κύτταρα LNCaP, τα οποία απομονώθηκαν από μετάσταση λεμφαδένων. Όπως μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα που χρησιμοποιούνται για την απαθανάτισε MSC κυτταρική σειρά που ονομάζεται SCP1 [18], η οποία κατέχει τα τυπικά χαρακτηριστικά της MSC, όπως η αυτο-ανανέωση και πολυδυναμικότητα και επιτρέπει την μακροπρόθεσμη τυποποιημένη ανάλυση. Εμείς οπτικοποιείται για πρώτη φορά το ποσοστό πρόσφυσης και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη σε μονοστιβάδες MSC από το χρόνο μικροσκοπία φθορισμού παρέλευση στο πολυκύτταρους επίπεδο. Στη συνέχεια, χαρακτηριζόμενη τις πραγματικές φυσικές δυνάμεις που εμπλέκονται σε μονές επαφές κυττάρου-προς-υπόστρωμα με μικροσκοπία δύναμη με AFM: και οι δύο κύτταρα καρκίνου προστάτη γραμμές ακινητοποιήθηκαν σε AFM προβόλου και φέρεται σε επαφή με ένα Col-Ι επικαλυμμένου υποστρώματος. Τέλος, μετρήσαμε κύτταρο-προς-κύτταρο συγκολλητικές δυνάμεις μεταξύ PC3 ή LNCaP κύτταρα καρκίνου προστάτη, που συνδέονται προς μία πρόβολο AFM, και ένα μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων (SCP1) μονοστοιβάδα.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια για Time-lapse Μικροσκοπία

PC3 (που προέρχεται από μετάσταση στα οστά) και κύτταρα LNCaP (που προέρχονται από μετάσταση λεμφαδένα) ελήφθησαν από την ATCC (Wesel, Γερμανία). PC3 κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 μέσο κυτταρικής καλλιέργειας (ΡΑΑ, Cölbe, Γερμανία) και 10% FBS (Sigma-Aldrich, Μόναχο, Γερμανία). Η κυτταρική γραμμή SCP1 είναι ένα αθανατοποιημένο ανθρώπινα μεσεγχυματικά βλαστικά κυτταρική γραμμή περιγράφεται πλήρως στο Böker et al. 2008 [18]. LNCaP και SCP1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ άλφα GlutaMAX μέσα καλλιέργειας (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) συμπληρωμένο με 10% FBS. Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας ρουτίνας κυττάρων, όλοι οι τύποι κυττάρων αναπτύχθηκαν μέχρι 80% συρροή σε φιάλες καλλιέργειας Τ-25 ή Τ-75 και διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε 5% υγροποιημένο CO

2. Το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε τρεις φορές την εβδομάδα και για την κυτταρική ανακαλλιέργεια, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με επεξεργασία με 1χ διάλυμα θρυψίνη /ΕϋΤΑ (ΡΑΑ). Η προετοιμασία των κυττάρων πριν από μετρήσεις AFM περιγράφεται παρακάτω στην παράγραφο «σύλληψη τηλέφωνο».

Time-lapse Μικροσκοπίας και Ποσοτικοποίηση των κυττάρων πρόσφυσης

κύτταρα SCP1 (10

6 κύτταρα ) αναπτύχθηκαν σε 6-φρεατίων σε πλήρη συρροή (όπως φαίνεται στο Σχ. 1 C). PC3 και LNCaP κύτταρα σημάνθηκαν με 10 μΜ πράσινη φθορίζουσα χρωστική CFDA (διοξικής καρβοξυφλουορεσκεΐνης, ακετοξυμεθυλ εστέρα, Invitrogen) και μετά απλώθηκαν σε σχηματιζόμενων μονοστιβάδες SCP1 (5 × 10

5 καρκινικά κύτταρα /φρεάτιο). Αμέσως μετά, οι εικόνες μικροσκοπία συλλέχθηκαν με διαστήματα 25 λεπτών για τουλάχιστον 12 ώρες. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου τα κύτταρα διατηρούνται σε βιο-θάλαμο, παρέχοντας σταθερή 37 ° C και 5% ατμόσφαιρα CO2 υγροποιημένο (Pecon, Erbach, Germnay), τοποθετημένο σε ένα ανεστραμμένο οπτικό μικροσκόπιο (Axiovert 100, Carl Zeiss Hallbergmoos, Γερμανία). Οι εικόνες ελήφθησαν με μια φωτογραφική μηχανή AxioCam MRM CCD (Carl Zeiss) και με τη χρήση μη αυτόματο τρόπο το εργαλείο μετρητή κυττάρων του λογισμικού Image J version1.40 (Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας των ΗΠΑ) ο αριθμός των προσκολλημένων κυττάρων εκτιμήθηκε και παρουσιάζεται ως ποσοστό της αρχική εισαγωγή των κυττάρων σε 4 και 12 ώρες.

(Α) αντίθεσης φάσης και φθορισμού μικροσκοπία του CFDA-επισημασμένου PC3 και LNCaP κύτταρα επιστρώθηκαν σε SCP1 μονοστιβάδες σε 6-φρεατίων. Οι εικόνες που λαμβάνονται μετά από 4 ώρες. (Β) Ποσοτικοποίηση των προσκολλημένων PC3 και LNCaP κύτταρα μετά από 4 και 12 ώρες καλλιέργεια σε SCP1 μονοστιβάδες. Το ποσοστό των προσκολλημένων κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε πρώτα, με χειροκίνητη καταμέτρηση των CFDA-επισημασμένων κυττάρων με το εργαλείο μετρητή κυττάρων σε λογισμικό J Εικόνα και δεύτερο, με σύγκριση προς τον αρχικό αριθμό των επιστρώθηκαν κύτταρα (5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο ). Στις εικόνες, επίσης, μια μικρή φόντο σωματίδια χρωστικής CFDA είναι ορατό (περισσότερο εμφανής στην εικόνα LNCaP). Οι αναλύσεις αποκάλυψαν ότι ήδη στους 4 κύτταρα PC3 h προσκολληθεί εντελώς SPC1 κύτταρα ενώ τα κύτταρα LNCaP είχαν σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό πρόσφυσης σε 4 ώρες και 12 ώρες. Οι ράβδοι γράφημα δείχνουν μέση τιμή ± SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα (ρ & lt? 0,0001, unpaired t-test). (Γ) Υ και LNCaP κύτταρα (2 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) καλλιεργούνται σε μονοστοιβάδες SCP1 σε 6-φρεατίων για μέχρι 8 ημέρες. εικόνες αντίθεσης φάσης κατέδειξε τον σχηματισμό και τον πολλαπλασιασμό των αποικιών PC3 (περιγράφονται) στην κορυφή των κυττάρων SCP1 μεταξύ ημερών 1 και 8. Σε αντίθεση, τα κύτταρα LNCaP που σχηματίζονται μικρές συστάδες κυττάρων (βέλη) που δεν επεκτείνει αλλά μάλλον οπισθοχωρούν από την ημέρα 8. (D) Ποσοτικός προσδιορισμός των αριθμών PC και LNCaP κυττάρων μετά από 1, 5 και 8 ημέρες καλλιέργειας για SCP1 μονοστοιβάδες. Ο πολλαπλασιασμός των PC3 και LNCaP κυττάρων υπολογίζεται με την αφαίρεση των μονοστιβάδων ελέγχου SCP1 από το συνολικό αριθμό των κυττάρων του συν-καλλιέργεια. Ομοίως με τα δεδομένα μικροσκοπία, η ποσοτική ανάλυση επιβεβαίωσε ότι τα κύτταρα PC3 αλλά δεν LNCaP ήταν σε θέση να διαιρέσει και περαιτέρω επέκταση σε κύτταρα SCP1. Το γράφημα δείχνει μέση ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων για κάθε χρονικό σημείο (ρ & lt? 0,0001, unpaired t-test).

Η

Ανάλυση Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

SCP1 μονοστιβάδες που σχηματίζονται όπως περιγράφηκε παραπάνω και 2 × 10

5 PC3 και LNCaP κύτταρα προστέθηκαν και αφέθηκαν να επεκτείνει πάνω SPC1 κυττάρων για μία περίοδο 8 ημερών. Επιπλέον, αρκετές φρεάτια καλλιέργειας επελέγησαν μόνο με κύτταρα SCP1 (

SCP1

mono

), προκειμένου να χρησιμοποιηθεί ως έλεγχοι για την ποσοτική ανάλυση. Οι συν-καλλιέργειες (

PC3

+ SCP1, LNCaP

+ SCP1

) παρακολουθούνταν μικροσκοπικά και φωτογραφήθηκαν με την κάμερα AxioCam MRM (Zeiss). Την ημέρα 1, 5 και 8, οι συν-καλλιέργειες τρυψινοποιήθηκαν και χρησιμοποιώντας Neubauer κύτταρο θάλαμο μέτρησης, ο συνολικός αριθμός των κυττάρων εκτιμήθηκε. Ο πολλαπλασιασμός των PC3 και LNCaP κύτταρα σε SCP1 μονοστοιβάδα (

PC3

σχετικά με μονο

,

LNCaP

σχετικά με μονο

) υπολογίστηκε ως εξής:

Ανοσοκυτοχημεία

Πριν από την επικάλυψη πρωτεΐνης, γυάλινα πλακίδια καθαρίζονται με 70% αιθανόλη και στη συνέχεια σε αυτόκαυστο. Προκειμένου να επαληθευτεί η κολλαγόνο τύπου Ι (Col-I) -coating των γυάλινων slides και Ι έκφραση κολλαγόνου επί SCP1, διαφάνειες και μονοστοιβάδες SCP1 παρασκευάστηκαν ως εξής. κύτταρα SCP1 αναπτύχθηκαν σε γυάλινες πλάκες για δύο ημέρες για να σχηματιστεί συρρέουσες μονοστοιβάδες κυττάρων, ενώ Col-I – επικαλυμμένα γυάλινα πλακίδια παρασκευάστηκαν με προσθήκη 1 mg /ml διάλυμα Col-Ι στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, SCP1 μονοστιβάδες και οι Col-Ι-επικαλυμμένες πλάκες μονιμοποιήθηκαν με καθαρή ακετόνη για 20 λεπτά στους -20 ° C, ξεπλένονται με PBS. Εικόνα-iT FX Signal Enhancer (ένα προϊόν Invitrogen για μείωση υποβάθρου και την εντατικοποίηση του σήματος του Alexa Flour δευτερογενή αντισώματα) εφαρμόστηκε για 30 λεπτά και αποκλείστηκαν με 10% BSA για 1 ώρα. Το αντι-κολλαγόνου-Ι αντίσωμα πρωτεύον μονοκλωνικό ποντικού (Sigma) εφαρμόστηκε επί μία νύκτα στους 4 ° C. Αυτό το στάδιο ακολουθήθηκε από επώαση με το δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού συζευγμένο με Alexa Flour 488 για 1 ώρα και το DAPI πυρηνική χρώση για 5 λεπτά. Παράλληλα, αρνητικοί έλεγχοι διεξήχθησαν με παράλειψη του πρωτογενούς αντισώματος. Μικροφωτογραφίες ελήφθησαν με μια φωτογραφική μηχανή AxioCam MRM σε Axioskope 2 μικροσκόπιο (Carl Zeiss) χρησιμοποιώντας 40χ αντικειμενικό.

AFM Ρύθμιση

πειράματα Force Φασματοσκοπία διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα NanoWizard II μαζί με μια μονάδα CellHesion ( JPK Συσκευές, Βερολίνο, Γερμανία), τοποθετημένη σε ένα Zeiss Axiovert 200 Μ (Carl Zeiss, Γκέτινγκεν, Γερμανία) με ένα custom made μονάδα θερμοκρασία για 37 ° C. Για μειωμένη επίδραση του θορύβου περιβάλλοντος, η Axiovert τοποθετήθηκε σε ένα ενεργό τραπέζι απομόνωση (Micro 60, Halcyonics, Göttingen, Γερμανία) έναντι δονήσεων και η όλη εγκατάσταση τοποθετήθηκε σε m

3 κουτί ηχομόνωση 1 και τη σταθεροποίηση της θερμοκρασίας του ολόκληρο το πείραμα.

Οι αισθητήρες δύναμης που χρησιμοποιούνται για τη φασματοσκοπία δύναμης ήταν χωρίς άκρη προβόλους νιτρίδιο του πυριτίου με ονομαστική σταθερά ελατηρίου 0,01 N /m (χωρίς άκρη, MLCT-Ο10, Veeco, USA). Αυτοί οι αισθητήρες δύναμης με σταθερή χαμηλή ελατήριο αποδείχθηκε ότι ήταν πιο κατάλληλο για τις μετρήσεις κυτταρικής προσκόλλησης. Ειδικότερα, η επίπεδη επιφάνεια χωρίς άκρη παρέχει μια περιοχή πρόσφυσης για ένα μόνο κύτταρο. Με την επικάλυψη αυτή επιφάνεια με κόλλες κυττάρου, όπως λεκτίνες (π. Χ. Κονκαβαλίνης Α) ή θετικά φορτισμένα πολυμερή (π.χ. πολυλυσίνη) διαφόρων τύπων κυττάρων μπορεί να είναι σταθερά και γρήγορα προσαρτημένο στον αισθητήρα [16], [19], [20]. Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα αποδείχθηκε να προσκολληθούν σταθερά με τη λυσίνη ηλεκτροστατικά και επιπλέον διατηρούν σφαιρικό σχήμα τους σε όλη τη διαδικασία μέτρησης και όχι ως διασπορά σε Col-I επικαλυμμένες επιφάνειες. Πριν από την κυτταρική πειράματα φασματοσκοπίας πρόσφυση, οι αισθητήρες δύναμης επομένως επικαλύφθηκαν με πολυ-D Λυσίνη (PDL, Millipore, USA) σε ένα διάλυμα 100 μg /ml PDL όλη τη νύκτα. PDL χρησιμοποιήθηκε αντί του PLL, επειδή είναι λιγότερο αποικοδομήσιμα και τα κύτταρα δεν έχουν την τάση να εξαπλωθεί. Οι σταθερές ελατηρίου των αισθητήρων δύναμης προσδιορίσθηκαν μεμονωμένα με τη μέθοδο θερμικού θορύβου [21].

καμπύλες δύναμης-απόστασης καταγράφηκαν ενώ η πιεζοηλεκτρική ταξιδέψει σε ένα κλειστό βρόχο μέχρι 20 μm σε ταχύτητα προσέγγισης 7 μm /s έως ότου επιτεύχθηκε μια δύναμη ενεργοποίησης των 100pN, και ταχύτητα συστολής των 3 m /s.

Προετοιμασία Υποστρώματος

Έχουμε χρησιμοποιήσει τύπου Ι κολλαγόνο (Col-Ι) επικαλυμμένη γυαλί καλύπτουν ολισθήσεις και μονοστιβάδες SCP1 ως υποστρώματα για τα πειράματα φασματοσκοπίας AFM ισχύουν εντός της ίδιας καπάκι πολιτισμό πιάτο. Για το σχηματισμό SCP1 μονοστιβάδες, τα κύτταρα SCP1 αναπτύχθηκαν σε μη επεξεργασμένα καπάκια καλλιέργειας πιάτο (τριβλίο Petri 35 χ 10 mm, Nunc Α /δ, Roskilde, Denmark) για δύο ημέρες στους 37 ° C, 5% CO

2. Πριν από τη χρήση, αυτά πλύθηκαν με και καλύπτονται από 1,5 ml φρέσκο ​​μέσο ΜΕΜ-άλφα χωρίς ορό (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) συμπληρωμένο με 15 mM Hepes (Sigma-Aldrich, Germany) με αποτέλεσμα ένα CO

2 ανεξάρτητη μέτρηση μέσον. Για να COL-I κύτταρο καλυπτρίδες μετρήσεις γυαλί (Ø 15 πλύθηκε σε 70% αιθανόλη και απεσταγμένο νερό) επικαλύφθηκαν με Col-Ι (100 μg /ml) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Πριν από τις μετρήσεις κυτταρικής προσκόλλησης, οι Col-Ι-επικαλυμμένα καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν στην κορυφή του μονοστοιβάδας SCP1 στα καπάκια καλλιέργεια πιάτο (όπως απεικονίζεται στο Σχ. 2Β). Ένα πρόσθετο καλυπτρίδα γυάλινη επικαλυμμένα με BSA (0.5% β /ο) στους 4 ° C όλη τη νύκτα τοποθετήθηκε στην κορυφή ενός άλλου τμήματος της μονοστιβάδας SCP1 και χρησιμοποιήθηκε για τη δέσμευση των κυττάρων (βλέπε επόμενο τμήμα). Το καπάκι του τρυβλίου καλλιέργειας, που περιέχει και τους τρεις τύπους υποστρωμάτων (BSA, Col-Ι και SCP-1 μονοστιβάδα) στη συνέχεια τοποθετείται σε ελεγχόμενης θερμοκρασίας στάδιο στην AFM και αφέθηκε να ισορροπήσει για 10 λεπτά στον αέρα του περιβάλλοντος στους 37 ° Γ

(Α) εικόνες αντίθεσης φάσης ενός κυττάρου καρκίνου του προστάτη συνδέεται με το έλασμα (βέλη) πάνω από μία μονοστοιβάδα SCP1 (αριστερά) και ένα Col-Ι-επικαλυμμένα ολίσθησης (δεξιά). Οι ράβδοι κλίμακας δεικνύουν 10 μm. Στην κάτω αριστερή γωνιά παρεμβάλλονται εικόνες ανοσοφθορισμού. Col-Ι, σημαίνονται με χρωστική φθορισμού AlexaFluor488 εμφανίζεται στο πράσινο και πυρήνες των κυττάρων, χρωματίζονται με DAPI σε μπλε χρώμα. (Β) Single κύτταρα από δύο διαφορετικούς καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές (PC3 και LNCaP) ακινητοποιήθηκαν σε μια χωρίς άκρη AFM πρόβολος (αισθητήρα δύναμης) με σκοπό τη μελέτη δυνάμεις αλληλεπίδρασης τους με την ακραία επιφάνεια ενός μονοστιβάδας SCP-1 (που αντιπροσωπεύουν μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα ) ή με Col-Ι (που αντιπροσωπεύει μήτρα οστού). (C) Σχηματική κάτοψη του καπακιού καλλιέργειας πιάτο με BSA επικαλυμμένα γυάλινη καλυπτρίδα (ως υπόστρωμα για την αλιεία μία εγχέεται απαλά καρκίνου του προστάτη κύτταρο) και μια Col-I επικαλυμμένο γυάλινο κάλυμμα γλιστρήσει τόσο στην κορυφή ενός μονοστιβάδας μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων . Για τη βαθμονόμηση και την αλιεία σε ένα κελί, ο αισθητήρας δύναμης επισκέπτεται το slide BSA, για το πείραμα για κολλαγόνου το Col-Ι γλιστρήσει και για το πείραμα για μεσεγχυματικά κύτταρα μονοστοιβάδα SCP1.

Η

Cell Culture and Cell Capture για Force Φασματοσκοπία

Cells (LNCaP ή PC3) αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή επωάστηκαν σε διάλυμα θρυψίνη /EDTA (0,02%) για 5 λεπτά έως 10 λεπτά έως ότου απελευθερωθούν από το υπόστρωμα μετά από έκπλυση με PBS χωρίς ασβέστιο και μαγνήσιο . Η διαδικασία αυτή θα πρέπει να αφαιρέσει οποιεσδήποτε πρωτεΐνες μήτρας, ενδεχομένως, που καλύπτει τις επιφάνειες των κυττάρων χωρίς να επηρεάζονται οι υποδοχείς ιντεγκρίνης [22], [23]. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν με επιπλέον μέσο ΜΕΜ-άλφα σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης. Τα κύτταρα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν (1000 rpm, 3 λεπτά) πριν επαναιώρηση του ιζήματος με φρέσκο ​​μέσο ΜΕΜ-άλφα. Τα κύτταρα αφέθηκαν σε μια συσκευή επώασης στους 37 ° C για 15 λεπτά., Προκειμένου να τα προσαρμόσει στην θερμοκρασία μέτρησης 37 ° C στο AFM.

Είτε PC3 ή κύτταρα LNCaP (περ. 2 μ

l

περιέχουν 100 έως 300 κύτταρα) στη συνέχεια εγχέεται απαλά πάνω στο μη συγκολλητική BSA επικαλυμμένα κάλυμμα ολίσθησης, προκειμένου στη συνέχεια να συλλάβει ένα από αυτά με το συγκολλητικό PDL επικαλυμμένο με πρόβολο: Η συγκολλητική πρόβολος τοποθετήθηκε πάνω από ένα από τα προφανώς υγιή κύτταρα (μεσαίου μεγέθους, κυκλικού σχήματος σε κανονική Αντιθέτως, δεν φλύκταινες, δεν υπάρχουν άλλα μη φυσιολογική ενδείξεις σε σχήμα) επί της BSA επικαλυμμένα με κάλυμμα ολίσθησης, και μείωσε με σταδιακό τρόπο έως ότου ήταν κοντά στην επιφάνεια αυτού του κυττάρου. Στη συνέχεια, ο πρόβολος ήταν ήπια σε κρατούμενη επαφή με το κύτταρο για μερικά δευτερόλεπτα πριν από την άρση κάθετα από περίπου 100 μm [24] ο πρόβολος δεσμευμένο κύτταρο. Το κύτταρο αφέθηκε να καθιερώσει σταθερή πρόσφυση σε προβόλου για μερικά λεπτά. Ορισμένα κύτταρα (περ. 10%) αρνήθηκε να τηρούν σταθερά ο μοχλός μάλλον κρέμονται χαλαρά, όπως καθορίζεται από απαλά κουνώντας το μικροσκόπιο και βλέποντας το κελί κίνηση με το που προκαλείται διέγερση. Στην περίπτωση αυτή το κύτταρο πλύθηκε από το έλασμα με ανύψωση έξω του υγρού και πίσω πάλι, προκειμένου να συλλάβει ένα νέο κύτταρο. Στην περίπτωση της επιχείρησης πρόσφυσης, το κύτταρο χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα πρόσφυση και παρακολουθείται από τον πειραματιστή μέσω του οπτικού μικροσκοπίου εικόνα σε όλη τη διάρκεια των μετρήσεων.

Κυττάρου δύναμη συγκόλλησης Μετρήσεις

Το κύτταρο ακινητοποιημένο στον αισθητήρα δύναμης πιέζεται είτε μονοστιβάδας SCP1 ή το Col-Ι-επικαλυμμένη πλάκα με μία δύναμη επαφής 100 ρΝ. Ο χρόνος επαφής μεταξύ του κυττάρου ανιχνευτή και του υποστρώματος του ορίστηκε σε 0s αποτέλεσμα μια αναγκαστική επαφή αποτελεσματικά 0,3 s, προκειμένου να περιοριστεί ποσοστά πρόσφυσης (ποσοστό των καμπυλών με κόλλα γεγονότα) σε ένα εύρος όσο το δυνατόν χαμηλότερα. τα ποσοστά πρόσφυσης κάτω από το 30% παρέχουν μια υψηλή πιθανότητα ανίχνευσης μόνο μοριακές αλληλεπιδράσεις [24]. Σε υψηλότερες τιμές πρόσφυσης επιμέρους λύειν βήματα τείνουν να προκύψουν από πολλαπλούς μοριακούς δεσμούς δρουν παράλληλα. Για την ποσοτικοποίηση των διαφορών μεταξύ των κυτταρικών σειρών και επιφανειών, αυτό το σύντομο χρόνο επαφής και η χαμηλή δύναμη επαφής των 100pN εφαρμόστηκε σε ολόκληρο το πειραμάτων. Η ταχύτητα ανάσυρσης ορίστηκε σε 3 m /s ως συμβιβασμός μεταξύ υδροδυναμική αντίσταση, η οποία αυξάνεται με την ταχύτητα (εδώ σε περίπου 5 PN) και θερμικές επιδράσεις drift που μειώνονται με ταχύτητα. Η απόσταση επαναφοράς ορίστηκε έως 20 μm να λογοδοτήσει για πολύ πρόσδεσης (Εικ. 2Α) και για να εξασφαλιστεί το κύτταρο είχε διαχωριστεί από το υπόστρωμα εντελώς μετά από κάθε κύκλο. μετρήσεις ισχύ την μονοστιβάδα SCP1 και Col-Ι πραγματοποιήθηκαν μέσα στο ίδιο πιάτο πολιτισμού, ενώ για κάθε κελί ακινητοποιημένο σε ένα πρόβολο ένα νέο πιάτο παρασκευάζεται. Αυτό οδήγησε σε δύο πειράματα ανά δίσκο καλλιέργειας: Είτε ένα LNCaP κυττάρων επί του προβόλου έναντι του Col-Ι-επικαλυμμένο γυαλί και στη συνέχεια εναντίον της κορυφαίας επιφάνειας της μονοστιβάδας SCP1 ή ένα κύτταρο PC3 επί του προβόλου εναντίον Col-I και τότε εναντίον SCP1 μονοστοιβάδας (Εικ. 2Β). Η σειρά των υποστρωμάτων ήταν επίσης αντιστρέφεται εντός πειράματα PC3, που δείχνει τα ίδια αποτελέσματα. Σε κάθε πείραμα (ανίχνευση ενός τύπου κυττάρου σε έναν τύπο υποστρώματος) τουλάχιστον ελήφθησαν 80 καμπύλες δύναμης μεταξύ ενός κυττάρου επί του προβόλου και έναν τύπο υποστρώματος. Συνολικά, τουλάχιστον 10 ανεξάρτητα πειράματα για κάθε συνδυασμό των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-υποστρώματος (LNCaP εναντίον Col-Ι? LNCaP εναντίον SCP1? PC3 εναντίον Col-Ι? PC3 vs. SCP1) διεξήχθησαν, αποδίδοντας τουλάχιστον 800 καμπύλες ισχύος ανά τάξη της αλληλεπίδρασης. Κατά τη διάρκεια ολόκληρης πείραμα, χρησιμοποιήσαμε το οπτικό μικροσκόπιο για την παρακολούθηση της σφαιρικό σχήμα και τη σταθερή προσκόλληση του κυττάρου είναι ακινητοποιημένη στο επικαλυμμένο με PDL αισθητήρας δύναμης (Εικ. 2Α). Επιπλέον, αποδεικνύεται από την παρατεταμένη κυτταρική επαφές 1 λεπτό στους 500 ΡΝ για COL-Ι ότι το κύτταρο ακινητοποιημένο στον αισθητήρα δύναμης μπορεί να αντέξει τις δυνάμεις προσκόλλησης τουλάχιστον 8,5 nN χωρίς αποκόλληση από τον αισθητήρα.

κυτταρικής προσκόλλησης Force

αξιολόγηση

Για την ανάλυση των δεδομένων μόνο τα μέρη σύμπτυξη των κύκλων προσέγγισης-επαναφοράς αξιολογήθηκαν. Για να αποκτήσει χαρακτηριστικά ποσοτικά στοιχεία από τις καμπύλες δύναμης-απόστασης, με την αξιολόγηση και την ανίχνευση βήμα λογισμικό ειδικά σχεδιασμένο δεδομένων [25] χρησιμοποιήθηκε για να Denoise το σήμα (μαύρες γραμμές στο Σχ. 3), βρείτε τη γραμμή βάσης (διακεκομμένες γραμμές στο σχήμα . 3), σωστές για υδροδυναμική αντίσταση και την πιθανή ολίσθηση και να εξαγάγετε τις ακόλουθες παραμέτρους:

το χαμηλότερο σημείο δεδομένων προς τα αριστερά σηματοδοτεί την δύναμη επαφής 100 pN? η λευκή διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει την βασική γραμμή που τέμνει την καμπύλη επανασάρωση στο μαύρο κύκλο που ορίζει την επιφάνεια των κυττάρων? η μαύρη γραμμή είναι η de-noised σήμα και το κόκκινο σταυρούς δείχνουν ανιχνεύεται βήματα de πρόσφυσης, όπου η αξιολόγηση δύναμη προσκόλλησης λαμβάνει χώρα. καμπύλη (Α) Force από PC3 κυττάρων αλληλεπιδρούν με Col-Ι για την παρουσίαση της αξιολόγησης δύναμη πρόσφυσης: Κόκκινο βέλος # 1: ύψος βήμα της πρώτης εκδήλωσης de-προσκόλληση στην καμπύλη συστολής. Η απόσπαση δύναμη είναι το απόλυτο μέτρο από τον κόκκινο σταυρό προς τα κάτω τη γραμμή βάσης? # 2: ύψος βήμα της δεύτερης εκδήλωσης de-συγκόλληση μετά από μια δύναμη οροπέδιο των 0,9 μm σε μήκος? # 3: βήμα θέση του πρώτου συμβάντος de-συγκόλληση? # 4: βήμα θέση του δεύτερου συμβάντος de-προσκόλλησης. (Για τους ορισμούς βλέπε κελί δύναμη συγκόλλησης Αξιολόγησης στα Υλικά και Μέθοδοι). Χαρακτηριστικές καμπύλες από καθεμία από τις τέσσερις διαφορετικούς τύπους πειραμάτων αντιπροσωπεύονται: (Β) PC3 επί Col-Ι, (C) PC3 επί SCP1 μονοστιβάδας, (D) LNCaP επί Col-Ι και (Ε) LNCaP επί SCP1 μονοστοιβάδα

το ύψος βήμα [pn] περιγράφει τη διαφορά στη δύναμη που μετρήθηκε πριν και μετά από ένα άτομο αποκόλληση εκδήλωση, ορατή ως ένα βήμα δύναμη. Ο αλγόριθμος εντοπίζει ένα τέτοιο βήμα από μέγιστα στο παράγωγο του απαλλαγμένου από θόρυβο σήματος που ξεπεράσει ένα συγκεκριμένο όριο και σηματοδοτεί ότι από ένα μικρό κόκκινο σταυρό (βλέπε επίσης Σχ. 3). Το τελευταίο βήμα σε μια καμπύλη δύναμης είναι η πιο αξιόπιστη μία δεδομένου ότι, σε αντίθεση με όλα τα άλλα (ενδιάμεσο) βήματα καμία άλλη σύνδεση μεταξύ των κυττάρων και του υποστρώματος παραμένει. Ως εκ τούτου, το τελευταίο βήμα δεν είναι δυνητικά μειώνεται με άλλα ομόλογα υπάρχουσες παράλληλα.

ποσοστό πρόσφυσης [%] που περιγράφει το κλάσμα των καμπυλών με τουλάχιστον μία ανιχνευθεί βήμα δύναμη.

αριθμό των βημάτων που περιγράφουν το μέσος αριθμός των βημάτων ανιχνεύθηκαν ανά καμπύλη (μετρώντας μόνο καμπύλες με τουλάχιστον ένα ανιχνευθεί το βήμα ισχύει).

βήμα θέση [μm] περιγράφει την απόσταση μεταξύ του σημείου επαφής (μαύρο κύκλο στη διασταύρωση της βάσης και η καμπύλη επιστροφής) και ένα βήμα δύναμη.

το έργο της απόσπασης [aJ] περιγράφει την ενέργεια που διαχέεται κατά τη διάρκεια αυτού του πειράματος δύναμη με την ενσωμάτωση της περιοχής μεταξύ της βάσης αναφοράς (μηδέν δύναμη) και ανασύρετε καμπύλη. (Σημείωση:. Αυτό δεν έχει καμία ασήμαντο σχέση με την ενέργεια πρόσφυση Στην πραγματικότητα, η ταχύτητα εξαρτάται από ιξώδες και πλαστική παραμόρφωση του κυττάρου και την ίδια την κυτταρική μεμβράνη συμβάλλουν σημαντικά στο έργο της απόσπασης μακριά από τη θερμοδυναμική ισορροπία).

δύναμης αποκόλλησης [pn] περιγράφει την υψηλότερη μετρημένη πρόσφυσης (συνολική ανώτατη) ανά καμπύλη.

αιχμής θέση [nm] περιγράφει την απόσταση μεταξύ του σημείου επαφής και όπου εντοπίστηκε η αποκόλληση δύναμη πρόσφυσης.

Όλες οι δυνάμεις που μετρήθηκαν είναι σχετικές δυνάμεις και συνεπώς ανεξάρτητη από τη σταθερή δύναμη μετατόπιση (της 5pN) οφείλεται στην υδροδυναμική αντίσταση του αισθητήρα δύναμης που ταξιδεύουν στο σταθερή ταχύτητα 3 m /s.

βήματα

οροπέδιο, για αυτό το σύνολο των δεδομένων που εμφανίζονται μετά μια δύναμη οροπέδιο τουλάχιστον 500 nm μήκος με ρυθμούς φόρτωσης μικρότερο από 2.7pN /s (ανατρέξτε στο βήμα 2 στην Εικ. 3Α).

σε ρυθμούς φόρτωσης μεταξύ 2,7 και 4,0 ρΝ /s το κριτήριο δεν ήταν αρκετά σαφής για να αποφευχθεί η ψευδώς θετική ή αρνητική διάκριση βήμα.

απότομες σκάλες, κατά συνέπεια, να προκύψει μετά την αύξηση σε ισχύ τουλάχιστον 4,0 ρΝ /s.

Η

Ημι-ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

Η ημι-ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο Popov κ.ά., 2011 [26]. Εν συντομία, ολικό RNA εκχυλίστηκε από PC3 και LNCaP κύτταρα με RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) και 1 μg RNA χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση cDNA με AMV First-Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). PCR για ιντεγκρίνης α1, α2, β1 και GAPDH (που χρησιμοποιείται για την ομαλοποίηση της εισόδου cDNA) πραγματοποιήθηκε με Taq DNA πολυμεράση (Invitrogen) σε ένα μέσο MGResearch (BioRad, Munich, Germany). Οι αλληλουχίες των εκκινητών και PCR συνθήκες που περιγράφονται στο Popov κ.ά., έχουν το 2011. Όλα τα αποτελέσματα της PCR έχουν αναπαραχθεί τρεις φορές ανεξάρτητα.

Στατιστική Ανάλυση

Για να ληφθεί υπόψη για την ετερογενή σύνολα δεδομένων δύο στατιστικές αναλύσεις που εφαρμόζεται:

Πρώτον, T-test του Student υποθέτοντας άνισες διακυμάνσεις χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του ρυθμού πρόσφυση, ο μέσος αριθμός των βημάτων ή το κλάσμα πρόσδεσης που μοιάζει να filopodia-όπως βήματα συγκρίνοντας τα μέσα που συλλέγονται από μεμονωμένα κύτταρα μεταξύ PC3 και LNCaP κύτταρα. Κάθε μέση τιμή ενός κυττάρου χαρακτηρίζεται ως ένα κόκκινο σταυρό? ο μέσος όρος των μέσων αυτών αναφέρεται ως ράβδος με σφάλμα του μέσου στο Σχ. 4 Α Β και το Σχ. 5. Δεύτερον, ένα μη παραμετρικό τεστ Kolmogorov-Smirnov, χωρίς παραδοχές που εφαρμόστηκε για να συγκρίνουν το ύψος βήμα, η θέση βήμα, με την απόσπαση εργατικού και το έργο της απόσπασης από όλες τις καμπύλες δύναμης μεταξύ PC3 και LNCaP κύτταρα. Οι διάμεσοι υποδεικνύονται ως μπαρ με τεταρτημόρια. Κάθε διάμεσος ενός κυττάρου αντιπροσωπεύεται από ένα κόκκινο σταυρό στο Σχ. 4 C και D. Αποτελέσματα με τιμή p μικρότερη από 0,05 σημειώνονται σημαντικές από αστερίσκο.

(Α) Τα ποσοστά των καμπυλών δύναμης με τουλάχιστον μία εκδήλωση de-συγκόλληση. (Β) Αριθμός εκδηλώσεων de-συγκόλληση μέσα σε μία καμπύλη κόλλα. Οι ράβδοι σφάλματος αντιστοιχούν σε τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. Ένα σημαντικό p-value από μη ζευγαρωμένο t-test των δεδομένων PC3 σε σχέση με τα δεδομένα LNCaP σημειώνεται με * (ρ & lt? 0,05). Η μέση τιμή του κάθε μεμονωμένου κυττάρου δίδεται από ένα κόκκινο σταυρό. (Γ) διάμεσοι του ύψους του επιμέρους βήματα de-προσκόλλησης. (D) διάμεσες της θέσης αυτών των γεγονότων απο-προσκόλλησης. (Ε) διάμεσες της δύναμης αποκόλλησης. (F) διάμεσοι του έργου της απόσπασης. Τα τεταρτημόρια που υποδεικνύεται από διπλά σημαίες και η διάμεση τιμή της κάθε μεμονωμένο κύτταρο δίνεται από έναν κόκκινο σταυρό. δεδομένα δύναμη προσκόλλησης κυττάρου αποκτήθηκαν από 16 ή 10 PC3 κύτταρα LNCaP που αλληλεπιδρούν με Col-I (1485 και 760 καμπύλες δύναμης αντίστοιχα), και 17 ή 11 PC3 κύτταρα LNCaP που αλληλεπιδρούν με SCP1 μονοστιβάδες (1.526 και 878 καμπύλες δύναμης αντίστοιχα).

Μέσα του ποσοστού των επιμέρους βήματα de πρόσφυσης που αντιπροσωπεύει το τυπικό μοτίβο της ισχύος του filopodia που μοιάζει με τα βήματα (στερεά) και πρόσδεσης που μοιάζει με τα βήματα (ριγέ) για τις δύο κυτταρικές σειρές PC3 και LNCaP. Κάθε μέση τιμή ενός κυττάρου αντιπροσωπεύεται από ένα κόκκινο σταυρό. Οι ράβδοι σφάλματος αντιστοιχούν σε τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. Μια σημαντική p-τιμή από ένα t-τεστ μεταξύ των διαφορετικών σταδίων μέσα σε μια κυτταρική γραμμή καρκινώματος προστάτη υποδεικνύεται με * (p & lt? 0,05).

Η

Αποτελέσματα

PC3 και LNCaP πρόσφυσης και της διάδοσης σε συγκαλλιέργεια με SCP1

Πρώτα προσκόλλησης κυττάρων αναλύθηκε με τη χρήση απεικόνισης time-lapse για έως και 12 ώρες. CFDA προ-σημασμένα PC3 και LNCaP κύτταρα παρακολουθήθηκαν σε μια μονοστοιβάδα SCP1 και μετά από 4 ώρες, τα περισσότερα κύτταρα PC3 εμφανίστηκε απλώνεται επί της μονοστιβάδας SCP1 ενώ τα κύτταρα LNCaP εμφανίστηκαν μικρά και στρογγυλά (Εικ. 1Α). Όπως φαίνεται στο Σχ. S1, PC3 κύτταρα που αναπτύχθηκαν στο γυαλί ή Col-Ι-επικαλυμμένο γυαλί έχουν χαμηλότερο συντελεστή σχήματος επιπεδότητας σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP, υποδεικνύοντας μεγαλύτερη χωρητικότητα για να εξαπλωθεί. Ωστόσο, η ανάλυση σχήμα και των δύο τύπων κυττάρων που καλλιεργούνται σε μονοστοιβάδες SCP1 δεν πραγματοποιήθηκαν λόγω του κινδύνου της ανακριβείς μετρήσεις περιοχής, διαμέτρου και του όγκου λόγω της υποκείμενης κυτταρικά σώματα των κυττάρων SCP1. Επιπλέον, με την εκτέλεση ποσοτικής ανάλυσης σε 4 και 12 ώρες, θα μπορούσαμε να δείξουμε ότι περίπου. 90% των κυττάρων PC3 ήταν σε θέση να τηρούν την μονοστιβάδα SCP1 ήδη μετά από 4 ώρες και ότι η προσκόλληση τους παρέμεινε επίσης κοντά στο 90% μετά από 12 h (Σχ. 1Β). Σε αντίθεση, τα κύτταρα LNCaP είχαν χαμηλότερη πρόσφυση σε SCP1 (περ. 25%), η οποία δεν αυξήθηκε σημαντικά μετά μεγαλύτερο χρόνο καλλιέργειας.

Προκειμένου να διερευνηθεί PC3 και LNCaP πολλαπλασιασμού των κυττάρων επί SCP1 μονοστιβάδες, εκτελέσαμε συνεργασία πειράματα καλλιέργειας για μέχρι 8 ημέρες. μικροσκοπία φάσης αντίθεσης κατά την ημέρα 1 και 8 κατέδειξε τον σχηματισμό και τον πολλαπλασιασμό των αποικιών PC3 στην κορυφή των SCP1cells, ενώ τα κύτταρα LNCaP που σχηματίζονται μικρές συστάδες κυττάρων, η οποία δεν επεκτείνει αλλά μάλλον υποχώρησαν κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου (σχ. 1C).

Σύκο. Σύκο.