Αφηρημένο

γλοιοβλάστωμα ( GBM) είναι η πιο κοινή πρωτογενής όγκος του εγκεφάλου, που αντιπροσωπεύουν περίπου το 40% όλων των κακοηθειών του κεντρικού νευρικού συστήματος. Παρά την τυπική θεραπεία που αποτελείται από χειρουργική εκτομή, ακτινοθεραπεία ή /και χημειοθεραπεία, η πρόγνωση για GBM είναι κακή? με μια μέση επιβίωση 14,6 μήνες. Ο καρκίνος των βλαστικών κυττάρων ή μοντέλο καρκινικού κυττάρου-κίνηση έχει προσφέρει ένα νέο πρότυπο για την κατανόηση της ανάπτυξης και της επανάληψης της GBM μετά τη θεραπεία. Berbamine (BBM) είναι μια φυσική ένωση που προέρχεται από το

Berberis amurensis

φυτό, και μαζί με τα παράγωγά της, έχει δειχθεί ότι δεικνύουν δραστικότητα κατά του όγκου σε πολλές μορφές καρκίνου. Εδώ, αναφέραμε ότι ένα νέο συνθετικό παράγωγο Berbamine, BBMD3, αναστέλλει την κυτταρική βιωσιμότητα και επάγει την απόπτωση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν (ΚΕΠ) σε ένα χρονικό και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, όταν οι ΚΕΠ από τέσσερις ασθενείς GBM (PBT003, PBT008, PBT022 , και PBT030) καλλιεργήθηκαν. Αυτά τα ΚΕΠ μεγάλωσε στην νευροσφαιρίδια και εξέφρασε CD133 και νεστίνης ως δείκτες. Η θεραπεία με BBMD3 κατέστρεψε τη μορφολογία νευροσφαιρών, και οδήγησε στην επαγωγή της απόπτωσης στα ΚΕΠ. Διέγερση απόπτωσης σε αυτά τα ΚΕΠ εξαρτάται από την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και διάσπαση πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP). MicroRNA-4284 (miR-4284) φάνηκε να είναι υπερ-εκφράζεται περίπου 4 φορές στα ΚΕΠ μετά τη θεραπεία BBMD3. Επιπλέον, η επιμόλυνση των συνθετικών αντι-νόημα ολιγονουκλεοτίδιο κατά της ανθρώπινης miR-4284 μπλοκάρει εν μέρει τις αντικαρκινικές επιδράσεις του BBMD3 για το GBM προέρχεται ΚΕΠ. BBMD3 αύξησε επίσης φωσφορυλίωση του c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) /στρες-ενεργοποιημένης κινάσης πρωτεΐνης (SAPK), με αποτέλεσμα την αύξηση της έκφρασης του φωσφορυλιωμένου c-Jun και συνολικό c-Fos? τα κύρια συστατικά του μεταγραφικού παράγοντα ΑΡ-1. Η JNK-c-Jun /ΑΡ-1 μονοπάτι σηματοδότησης παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της απόπτωσης σε απόκριση στην υπεριώδη ακτινοβολία και ορισμένες φαρμακευτικές αγωγές. Στόχευση γλοιοβλάστωμα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με BBMD3 εκ τούτου, είναι μυθιστόρημα, και μπορεί να έχει την υπόσχεση ως μια αποτελεσματική θεραπευτική στρατηγική για τη θεραπεία ασθενών GBM

Παράθεση:. Yang F, Βιετνάμ S, Μπράουν CE, Zhao R, Starr R, Horne DA, et al. (2014) Ένα παράγωγο Novel Berbamine Αναστέλλει τη βιωσιμότητα των κυττάρων και επάγει την απόπτωση σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με του ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος, μέσω προς τα πάνω ρύθμιση του miRNA-4284 και ΙΝΚ /ΑΡ-1 σηματοδότηση. PLoS ONE 9 (4): e94443. doi: 10.1371 /journal.pone.0094443

Επιμέλεια: Jeffrey K. Harrison, το Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 Νοέμβρη του 2013? Αποδεκτές: 17 Μάρ 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 του Απριλίου 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση η μελέτη που παρέχεται από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας /Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου # CA-1155674 για να RJ και χρηματοδότηση εκκίνησης για να RH από το Ερευνητικό Ινστιτούτο Beckman. Έρευνα που αναφέρονται στην παρούσα έκδοση περιλαμβάνονται εργασίες που εκτελούνται στο Μεταγραφική βιοδεικτών Discovery πυρήνα, η οποία υποστηρίζεται εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας με τον αριθμό βραβείο P30CA33572. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γλοιοβλάστωμα (GBM) είναι η πιο κοινή και θανατηφόρα πρωτοπαθούς όγκου του εγκεφάλου. Παρά τις τρέχουσες εξελίξεις στη θεραπεία πολυτροπικότητα, οι οποίες περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία, πρόγνωση παραμένει πολύ κακή για τους ασθενείς, οι οποίοι έχουν συνήθως ένα μέσο χρόνο επιβίωσης μικρότερο από 15 μήνες [1], [2]. Η πλειονότητα των GBM βλάβες αναπτύσσονται ταχέως από ένα λιγότερο κακοήθη πρόδρομος αλλοίωση για την οποία υπάρχει μικρή ή καμία κλινική, ακτινολογική ή μορφολογική ένδειξη, και έχει αποδειχθεί ότι μια άκρως ογκογονική υποπληθυσμός των καρκινικών κυττάρων, που ονομάζονται βλαστικά κύτταρα GBM, προάγει αντοχή σε χημειοθεραπείας και της ακτινοθεραπείας [3] – [5]. Αυτά τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα ή ογκογενή κύτταρα έχουν ορισμένα κρίσιμα χαρακτηριστικά με φυσιολογικά νευρικά βλαστικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων έκφραση αρκετών βιοδείκτες, και την ικανότητα για αυτο-ανανέωση, διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμό. Λόγω της κακής πρόγνωσης για ασθενείς GBM ακόλουθο σήμερα διαθέσιμες θεραπείες, ανάπτυξη αποτελεσματικότερων πρωτοκόλλων για τη θεραπεία της GBM απαιτείται επειγόντως. Ωστόσο, η πρόοδος επιβράδυνση της ανάπτυξης το πρωτόκολλο παραμένει εξαρτάται από την περαιτέρω ενίσχυση της κατανόησης των διαδικασιών οδήγηση εισβολή του καρκίνου, την έναρξη της αντίστασης σε θεραπευτικές παρεμβάσεις και τους μηχανισμούς οδήγησης υποτροπή του όγκου σε ασθενείς GBM. Ετσι, η αποτελεσματική θεραπεία της GBM απαιτεί άμεσα τη στόχευση αυτών των GBM βλαστικά κύτταρα εντός της μάζας του όγκου, δεδομένου ότι είναι τα κύτταρα που είναι ανθεκτικά σε καθιερωμένες θεραπείες [6]. Από αυτή την άποψη, Brown et al [7] παρείχε πρόσφατα ένα σκεπτικό για την ανάπτυξη μιας ανοσοθεραπευτική προσέγγιση για την εξάλειψη της GBM βλαστικών κυτταρικό πληθυσμό αναφέροντας ότι τα βλαστικά ανθρώπινου όγκου /εναρκτήρια κύτταρα από ασθενείς GBM μπορούσε να αναγνωριστεί και θανατώνονται από CD8

+ κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα.

Εκτός από αυτή την ανοσολογική προσέγγιση, microRNA (miRNA), η οποία είναι μια σχετικά νέα κατηγορία των μικρών μη-κωδικοποίησης μόριο RNA που βρέθηκε σε ευκαρυωτικά κύτταρα, έχει δειχθεί ότι ρυθμίζει ένα ευρύ φάσμα της γονιδιακής έκφρασης μοτίβα μέσω μιας μετα-μεταγραφικό μηχανισμό [8]. Και ένα σημαντικό σώμα της στοιχεία δείχνουν τώρα ότι miRNAs παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεση του καρκίνου, και μπορεί να λειτουργήσει είτε ως ογκογονίδια ή καταστολείς των όγκων [9]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι η υψηλή έκφραση του miR-196 και miR10b σε ασθενείς GBM συσχετίζεται με μία φτωχή πρόγνωση [10], και ότι κάτω ρύθμιση miR-128 οδηγεί σε μείωση της ικανότητας αυτο-ανανέωση του γλοιώματος βλαστικών κυττάρων με αναστολή γονιδιακή έκφραση Bmi1. Έτσι, miRNAs είναι ταχέως αναδυόμενες ως υποσχόμενους στόχους για την ανάπτυξη νέων, αλλά εξαιρετικά επιλεκτική αντικαρκινικών θεραπευτικών παραγόντων.

Αρκετά χρόνια πριν, Berbamine (BBM), ένα φυσικό δις-βενζυλισοκινολίνης αλκαλοειδές, εντοπίστηκε από την παραδοσιακή κινεζική ιατρική

Berberis amurensis

, και μαζί με αρκετούς από τα παράγωγά του, αναφέρθηκε ότι έχουν ισχυρή αντικαρκινική δραστικότητα έναντι του λεμφώματος, μυελώματος, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, ο καρκίνος του πνεύμονα και ο καρκίνος του μαστού και χαμηλής μη ειδική τοξικότητα [12] – [16] . BBM αναφέρθηκε ότι επάγει απόπτωση σε ανθρώπινα μυελώματος, και να καταστείλει την ανάπτυξη, τη μετανάστευση και την εισβολή του εξαιρετικά μεταστατικό ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού μέσω της αναστολής της NF-κΒ (NF-KB) δραστηριότητα και κατάντη της στόχους, όπως η κυκλίνη D1, Bcl-xL και survivin [13], [14]. Έτσι, η χαμηλή μη-ειδική τοξικότητα του ΒΒΜ, και ορισμένα από τα παράγωγά του, καθιστά τη συνεχή ανάπτυξη αυτών των νέων ενώσεων ελπιδοφόρων ως αποτελεσματικά αντικαρκινικά φάρμακα για διάφορους τύπους καρκίνου. Προς αυτό το στόχο, το εργαστήριο μας εξέτασε δεκατριών νέων παραγώγων BBM (BBMDs), οι οποίες συντίθενται από φυσικές BBM. Βρήκαμε ότι BBMD3 είναι το πιο ισχυρό από αυτή τη σειρά των νέων BBMDs για τη θανάτωση καρκινικών κυττάρων. BBMD3 εκδηλώνεται για αύξηση 6 φορές σε αντικαρκινική δραστικότητα έναντι του μελανώματος και του καρκίνου του προστάτη κύτταρα σε σύγκριση με το φυσικό ΒΒΜ. Αυτό αποδόθηκε στην αναστολή του μονοπατιού σηματοδότησης JAK2 /STAT3 [17]. Πρόσφατα, ανέφεραν επίσης ότι BBMD3 αναστέλλει την κυτταρική βιωσιμότητα, και επάγει την απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα οστεοσαρκώματος, τα οποία, στην περίπτωση αυτή, αποδόθηκε στην ενεργοποίηση της JNK /μονοπάτι ΑΡ-1 σηματοδότηση [18].

υπεροικογένεια του ενεργοποιείται από μιτογόνο κινασών πρωτεΐνης (MAPKs) περιλαμβάνει: c-Jun Ν-τερματικής κινάσης πρωτεΐνης (JNK) /στρες-ενεργοποιημένης κινάσης πρωτεΐνης (SAPK)? p38? και εξωκυττάριο κινάση σήματος ρυθμίζεται (ΕΚΚ). Σε γενικές γραμμές, JNK και ρ38 είναι βασικοί μεσολαβητές της απόκρισης σε στρες και φλεγμονή, ενώ ο καταρράκτης ERK είναι πιο συχνά επάγεται σε απόκριση σε διέγερση αυξητικού παράγοντα [19], [20]. Η οδός JNK στρες συμμετέχει σε πολλές διαφορετικές ενδοκυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης, μετασχηματισμό και απόπτωση [21], [22]. Οι πρωτεϊνικές κινάσες JNK που κωδικοποιούνται από τρία γονίδια, τα οποία

JNK1

και

JNK2

εκφράζονται από όλους τους ιστούς, και το

JNK3

γονιδίου περιορίζεται σε ένα πιο περιορισμένο μοτίβο της έκφρασης όπως στον εγκέφαλο και την καρδιά [22]. JNK αρχικά πιστοποιήθηκε από την ικανότητά της να φωσφορυλιώνει ειδικά τον παράγοντα μεταγραφής c-Jun επί Ν-τερματικό πεδίο τρανς-ενεργοποιήσεως της σε Ser63 και Ser73 [23]. c-Jun είναι ένα σημαντικό συστατικό της πρωτεΐνης ενεργοποίησης-1 (ΑΡ-1), η οποία είναι μια διμερής παράγοντας μεταγραφικό, και αποτελείται από πρωτεΐνες από διάφορες οικογένειες γονιδίων [24]. Αν και η JNK /c-Jun ή JNK /ΑΡ-1 μονοπάτι έχουν διπλή ρόλους στην απόπτωση, είναι σαφές ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού ΙΝΚ εμπλέκεται στην επαγωγή απόπτωσης με συγκεκριμένα ερεθίσματα κυτταρικού θανάτου, όπως UV ακτινοβολία και θεραπεία με ορισμένες φάρμακα [25] – [27].

στην παρούσα μελέτη μας, δείχνουμε ότι μια νέα συνθετική BBM παράγωγο (BBMD3) προκαλεί απόπτωση στα καρκινικά βλαστικά κύτταρα όμοια, τα οποία καλλιεργούνται από ασθενείς GBM. Δείχνουμε επίσης ότι η θανάτωση των κυττάρων συνδέεται με αυξητική ρύθμιση του miRNA-4284 και την JNK /ΑΡ-1 μονοπάτι σηματοδότησης.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

BBMD3 συντέθηκε με αντίδραση φυσικού ΒΒΜ με NH

2 περιέχει υποκαταστάτες. Η δομή και η καθαρότητα των προϊόντων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία HNMR. BBMD3 εμφανίζεται πάνω από 98% καθαρότητα με ανάλυση NMR. Ανθρώπινα αναστολείς miRNA (συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια) έναντι HSA-miRNA-4284 και έχει-miRNA-27α αγοράστηκαν από GeneCopoeia. RNAiFect Επιμόλυνση αντιδραστήριο αγοράστηκε από την Qiagen Inc. Ανασυνδυασμένος παράγοντας ανάπτυξης ανθρώπινου επιδερμικού (EGF) και παράγοντα ανάπτυξης ινοβλαστών βασικό (FGF) ελήφθησαν από την Κ & amp? D Systems Inc., και Accutase αγοράστηκε από την Innovative Technologies Cell. Β-27 χωρίς ορό συμπλήρωμα (50Χ) για την ανάπτυξη και συντήρηση των νευρώνων ελήφθη από την Gibco. Η ηπαρίνη (1000 μονάδες /ml) αγοράστηκε από την ΑΡΡ Pharmaceuticals, LLC. δευτερογενή αντισώματα υπεροξειδάση χράνου-επισημασμένο αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού αγοράστηκαν από την GE Healthcare. Αντι-νεστίνης αντίσωμα αγοράστηκε από την EMD Millipore. Όλα τα άλλα αντισώματα αγοράστηκαν από την κυτταρική σηματοδότηση, Inc.

Κυτταροκαλλιεργειών

δείγματα GBM που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, (αξιολογήθηκαν από τον θεράποντα νευροπαθολόγο, και αποδίδεται ταξινόμηση βαθμού IV με τη χρήση του Παγκόσμιου Υγείας οργάνωση Υγείας (ΠΟΥ) θέσπισε κατευθυντήριες γραμμές), ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική θεραπεία στο City of Hope Ιατρικό Κέντρο, σύμφωνα με το συμβούλιο Institutional Review (IRB) -approved πρωτόκολλα. δείγματα όγκου δόθηκαν μοναδικό ασθενή με όγκο στον εγκέφαλο αριθμούς (PBT), (δηλαδή PBT003, PBT008, PBT022 και PBT030). GBM νευροσφαιρών (NS) καλλιέργειες καλλιεργήθηκαν και επεκτάθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7]. Εν συντομία, NS καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε νευρικά μέσων βλαστοκυττάρων (DMEM /F-12), συμπληρωμένο με Β27 δύο παρα δέκα χωρίς ορό συμπλήρωμα, 20 ng /ml EGF, 20 ng /ml FGF βασικά και 0,84 μονάδες /ml ηπαρίνης. Κανονικό ανθρώπινο νευρόσφαιρες ή μη κακοήθεις νευρόσφαιρες καλλιεργήθηκαν από ανθρώπινο ιστό εγκεφάλου εμβρύου κάτω από τις ίδιες συνθήκες καλλιέργειας όπως τα νευροσφαιρία GBM. Η καθιερωμένη ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος U87 κυτταρική γραμμή, αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC), και τόσο η U87 και τα συνημμένα ή διαφοροποιημένα κύτταρα που προέρχονται από τα νευροσφαιρία GBM (κύτταρα όπως βλαστικά), καλλιεργήθηκαν σε μέσα DMEM (περιέχον L -γλουταμίνη), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και 1% αντιβιοτικό-αντιμυκητικό (ΑΑ). Όλα τα καλλιεργημένα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2.

Θεραπεία της BBMD3

BBMD3 διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και αραιώνεται με κύτταρο μέσο καλλιέργειας. Για τη λήψη μεμονωμένων κυττάρων από νευρόσφαιρες GBM, νευροσφαίρες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Accutase για 10 λεπτά στους 37 ° C και διέρχονται από ένα πλέγμα κυττάρων (70 μm νάιλον). Τα κύτταρα στη συνέχεια σπείρονται σε φιάλη καλλιέργειας κυττάρων ή πιάτα με μέσο πλήρους καλλιέργειας βλαστοκυττάρων σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται στο πειραματικό τμήμα σχεδιασμού. Πέντε ώρες αργότερα, διαφορετικές συγκεντρώσεις αραιωμένου BBMD3 προστέθηκαν στα κύτταρα? ενώ οι έλεγχοι έλαβαν ίσο ποσό μόνο το όχημα.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασίες

δοκιμές βιωσιμότητας των κυττάρων διεξήχθησαν με το CellTiter 96 Υδατικό Ένα διάλυμα της δοκιμασίας κυτταρικού πολλαπλασιασμού από την Promega, η οποία περιέχει 3- (4 , 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο (MTS). Κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων σπάρθηκε με 5,000 κύτταρα εναιωρούνται σε μέσο καλλιέργειας. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του φαρμάκου. Μετά από 24 ώρες ή 48 ώρες της αγωγής, MTS προστέθηκε στα κύτταρα σύμφωνα με το πρωτόκολλο του προμηθευτή, και η απορρόφηση του προϊόντος αντίδρασης που σχηματίζεται από τα καλλιεργημένα κύτταρα μετρήθηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας ELISA.

Προσδιορισμός απόπτωσης

τα κύτταρα (2 χ 10

5) που προέρχεται από τις σφαίρες νευρικών σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων με πλήρες μέσο βλαστοκυττάρων. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί άλλες 48 ώρες με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις BBMD3. Μετά την αγωγή, όλα τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αννεξίνης V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences). Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V-FITC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή. Βιώσιμη και αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με κυτταρομετρία ροής στην Αναλυτική κυτταρομετρίας μας Πυρήνας εδώ στο City of Hope Εθνικό Ιατρικό Κέντρο. Αποπτωτικών κυττάρων περιλαμβάνουν τόσο την πρώιμη αποπτωτική τμήμα (Αννεξίνη V-θετικά) και ο αείμνηστος αποπτωτικών τμήμα (αννεξίνη V και ΡΙ-θετικό).

Φωτογραφία

Κανονική NS πολιτισμό, μη επεξεργασμένες καλλιέργειες GBM NS προέρχεται από όγκους του εγκεφάλου του ασθενούς (δηλαδή, PBT003, PBT008, PBT022, PBT030) ή PBT003 NS σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις BBMD3 φωτογραφήθηκαν σε μεγέθυνση 10Χ χρησιμοποιώντας ένα Nikon ECLIPSE TE2000-U μικροσκόπιο.

Σύνολο Protein Assay Προετοιμασία και πρωτεΐνης

Μετά από 24 ώρες επώασης με 5 μΜ BBMD3, κύτταρα που προέρχονται από όγκους ασθενών εγκέφαλο (δηλαδή, PBT003, PBT008, PBT022 και PBT030) συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με ψυχρό ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS). Στη συνέχεια, κάθε σφαιρίδιο κυττάρων προστέθηκαν σε 150 μΐ Cell Signaling ρυθμιστικού Λύσης (EMD Millipore), στην οποία είχαμε τοποθετήσει ένα δισκίο αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Roche, Inc., Indianapolis, ΙΝ). Μετά από τρεις διαδοχικούς κύκλους κατάψυξης σε ένα λουτρό ξηρού πάγου /αιθανόλης και αποψύξεως σε λουτρό C νερό 37 °, η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης του προϊόντος λύσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα Bio-Rad κιτ Δοκιμασίας Πρωτεΐνης.

ανάλυση ανοσοκηλίδωσης

Είκοσι μικρογραμμάρια συνολικής πρωτεΐνης επιλύθηκαν μέσω ενός προ-cast 4-15% κλίσης Tris-HCl πολυακρυλαμιδίου γέλη αγοράστηκε από την ΒΙΟ-RAD (Hercules, CA). Μετά την ηλεκτροφόρηση πηκτώματος, οι πρωτείνες μεταφέρθηκαν σε Ηγοοηά-C μεμβράνες (Amersham), αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (RT) σε 10% άπαχο ξηρό γάλα, το οποίο διαλύθηκε σε PBST (1Χ PBS που περιείχε 0,1% Tween-20 ), και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα (αναγνωρίζοντας τις πρωτεΐνες που περιγράφονται στο κείμενο) εναιωρήθηκε σε PBST που περιείχε 2% άπαχο ξηρό γάλα. Μετά από πλύση των μεμβρανών σε PBST, ραφανιδική υπεροξειδάση σημασμένο δευτερεύοντα αντισώματα αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού επωάστηκαν με τις μεμβράνες για 1 ώρα σε RT. Η τοποθεσία επί της μεμβράνης Hybond-C των αντιγονικών πρωτεϊνών ειδικά δεσμεύεται με τα αντισώματα ανιχνεύεται με υπόστρωμα SuperSignal West Pico (Pierce).

Ποσοτική Ανάλυση των microRNAs

Σύνολο microRNA απομονώθηκε από PBT003 , PBT008, PBT022 και PBT030 νευρόσφαιρες μετά από 15 ώρα της αγωγής με 5 μΜ BBMD3 ή τον έλεγχο του οχήματος με τη χρήση του κιτ miRNeasy Mini (Qiagen). Η ποσοτικοποίηση της σχετικής αφθονίας του κάθε microRNA, με ή χωρίς επεξεργασία BBMD3, ολοκληρώθηκε στο Integrative Genomics πυρήνα στο City of Hope Εθνικό Ιατρικό Κέντρο. Εν συντομία, ο προσδιορισμός αλληλουχίας μικρο-RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Illumina HiSeq2000 ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (TruSeq Μικρό RNA δείγμα κιτ Prep, φωτίζουν, Inc.) με μικρές βελτιστοποίηση. 500 ng του μικρο-RNA συνδέθηκε με το «προσαρμογέα (5 ‘3 TCTCTGTAGGCACCATCAATC) με Τ4 RNA 2 για 1 ώρα στους 22 ° C. Οι μη συνδεδεμένοι 3 ‘προσαρμογείς μπλοκαρίστηκαν με αναδιάταξη τους με RT εκκινητή (5’ ATTGATGGTGCCTACAGAGA) στους 75 ° C για 5 λεπτά και 25 ° C για 15 λεπτά. Η ποσοτικοποιημένη μετουσιωμένη βιβλιοθήκη μικρο-RNA φορτώθηκε σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος υβριδισμού σε μια τελική συγκέντρωση των 10 ρΜ.

Κατεργασία Αναστολείς μικρο-RNA

8.000 μονά κύτταρα που προέρχονται από PBT008 και PBT030 νευροσφαιρών σε πλήρες στέλεχος μέσα κυτταρικής καλλιέργειας σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο πλακών 96 φρεατίων. Πέντε ώρες αργότερα, 60 ηΜ miR-4284 ή miR-27a αναστολείς αντι-νόημα επιμολύνθηκαν μέσα στα κύτταρα με αντιδραστήριο επιμόλυνσης RNAiFect. Τα κύτταρα μάρτυρες επιμολύνθηκαν με έναν αναστολέα ελέγχου μικρο-RNA. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με αναστολείς μικρο-RNA, 5 μΜ BBMD3 προστέθηκε στις πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας. 24 ώρες μετά την αγωγή BBMD3, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε.

Στατιστικά

του Student

t

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της στατιστικής σημασίας των διαφορών μεταξύ των δύο ομάδων και

p

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Νευροσφαίρες Καλλιεργημένα από δείγματα της GBM Οι ασθενείς εμφανίζουν χαρακτηριστικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα

Εμείς καλλιεργηθούν και να επεκταθεί βραχυπρόθεσμα. όρος νευρόσφαιρες όγκου σε μέσο βλαστοκυττάρων χωρίς ορό, (συμπληρωμένο με EGF και FGF), που προήλθαν από τέσσερις κύριες ασθενείς GBM, (δηλαδή, PBT003, PBT008, PBT022 και PBT030). Αυτές οι νευροσφαίρες GBM επέδειξε μία παρόμοια μορφολογία με εκείνη των φυσιολογικών νευρικών βλαστικών κυττάρων (Εικ. 1Α). Έχει αναφερθεί ότι GBM βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (GBMSCs) και φυσιολογικά νευρικά βλαστικά κύτταρα (NSCs) μοιράζονται την έκφραση αρκετών δεικτών, όπως CD133 και νεστίνης [28]. CD133 είναι ένας δείκτης της κυτταρικής επιφάνειας που εκφράζονται σε φυσιολογικά ανθρώπινα NSCs, και η έκφρασή του ρυθμίζεται προς τα κάτω σε διαφοροποιημένες κυτταρικές σειρές. Νεστίνη είναι μία πρωτεΐνης ενδιάμεσων νηματίων που παράγονται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης σε βλαστικά κύτταρα που προέρχονται από το κεντρικό νευρικό σύστημα των θηλαστικών. Συν-έκφραση του CD133 και νεστίνης σχετίζεται με κακή πρόγνωση για τους ασθενείς με κακοήθες γλοίωμα [28]. Παρατηρήσαμε με ανάλυση κηλίδος Western που CD133 και νεστίνης εκφράστηκαν σε GBM νευρόσφαιρες καλλιεργηθούν από κάθε μία από τις τέσσερις ασθενείς GBM, ενώ δεν έκφραση του CD133 και νεστίνης παρατηρήθηκε σε μία καθιερωμένη κυτταρική γραμμή GMB, (δηλαδή, U87 κύτταρα), (Σχ. 1Β). β-ακτίνης επίπεδα έκφρασης παρακολουθήθηκαν για να εξασφαλιστεί ότι ισοδύναμες ποσότητες κυτταρικής πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε κάθε λωρίδα του πηκτώματος. Όταν καλλιεργούνται σε μέσα με ορό, οι νευροσφαίρες που προέρχονται από PBT003, PBT008, PBT022 και οι ασθενείς PBT030 GBM έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε προσκολλημένα και νευρώνες, όπως κύτταρα, (Εικ. 1 C). Καλλιέργειες κυττάρων που προέρχονται από τα δείγματα από τους τέσσερις ασθενείς GBM (PBT003, PBT008, PBT022 και PBT030) αυξήθηκαν σε τυπικές νευροσφαιρίων, και διατήρησαν την ικανότητα για αυτο-ανανέωση και εξέφρασε νευρικούς δείκτες βλαστικών κυττάρων, όπως CD133 και νεστίνης όταν καλλιεργούνται σε ελεύθερο ορού ελεύθερα μέσα ενημέρωσης. Αυτές οι νευροσφαίρες είχε επίσης την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει ορό. Στην έκθεση αυτή, εμείς, ως εκ τούτου ορίζονται αυτές νευροσφαιρίδια είτε ως GBM βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν ή καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν.

(Α) Μορφολογία των PBT003, PBT008, PBT022 και PBT030 νευρόσφαιρες σε μέσο καλλιέργειας βλαστοκυττάρων. (Β) νευροσφαίρες GBM εξέφρασαν συγκεκριμένες βιοδείκτες για την κανονική νευρικά βλαστικά κύτταρα. (C) νευροσφαιρίδια GBM επιδεικνύουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται.

Η

BBMD3 διαταράσσει τη δομή του Νευροσφαίρες και αναστέλλει τη βιωσιμότητα του καρκίνου Stem-όπως κύτταρα καλλιεργημένα από τις τέσσερις GBM ασθενείς

GBM προέρχεται καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν, είναι λιγότερο ευαίσθητα σε, (ή να γίνουν ανθεκτικά στην), συμβατική χημειοθεραπεία [4], [5]? τονίζοντας την επιτακτική ανάγκη για εξεύρεση νέων και πιο επιλεκτικά ισχυρά φάρμακα για τη θεραπεία του γλοιοβλαστώματος. Berbamine, ένα φυσικό προϊόν που προέρχεται από την

Berberis amurensis

φυτό, φαίνεται να έχουν κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι μιας ποικιλίας καρκίνων? προτρέποντας την παρασκευή μιας σειράς αναλόγων του Berbamine. Αυτά τα ανάλογα αξιολογήθηκαν για να προσδιοριστεί αν κάποια από αυτές θα μπορούσε να είναι πιο αποτελεσματική στην θανάτωση των καρκινικών κυττάρων από την μητρική ένωση. Βρήκαμε ότι η αντικαρκινική αποτελεσματικότητα ενός από τα νέα συνθετικά παράγωγα, (δηλαδή, BBMD3), σχετικά με μελάνωμα και καρκινικά κύτταρα προστάτη υπερέβαινε εκείνη των άλλων αναλόγων [17]. Έτσι, ερευνήσαμε τις αντικαρκινικές επιδράσεις του BBMD3 στην GBM βλαστικά κύτταρα όμοια, τα οποία προήλθαν από νευρόσφαιρες καλλιεργηθούν από GBM ασθενούς PBT003, PBT008, PBT022 και PBT030. Κατά τη διάρκεια της μελέτης, τα κύτταρα αυτά υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ή 48 ώρες παρουσία μέσου καλλιέργειας πλήρους βλαστοκυττάρων που περιέχουν 1, 3, 5, 8 ή 10 μΜ BBMD3. κυτταρικές καλλιέργειες ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μόνο φορέα (DMSO) στη θέση του BBMD3, και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίσθηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. BBMD3 παρεμποδίζει ισχυρά την βιωσιμότητα του κάθε σετ των βλαστικών κυττάρων, όπως ο καρκίνος GBM, που προέρχονται από τις επιμέρους νευροσφαιρία ασθενή, τον χρόνο και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 2Α). Μια θεραπεία 48 ώρες της νευροσφαιρών με 10 μΜ BBMD3 ανέστειλε κυτταρική βιωσιμότητα σχεδόν 100%, και διαταράσσεται η δομή των νευροσφαιρών με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Το Σχήμα 2Β δείχνει ότι PBT003 προέρχονται νευροσφαιρών, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0, 1, 3, 5 ή 10 μΜ BBMD3 για 48 ώρες, διαταράσσεται η σφαιρική μορφολογία των νευροσφαιρών μετά τη θεραπεία BBMD3, και ότι η διάσπαση του neurospherical σχήμα ήταν συνοδευόμενες από την εμφάνιση των πλωτών νεκρά κύτταρα.

(Α) κύτταρα από PBT003, PBT008, PBT022 και PBT030 νευρόσφαιρες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 1, 3, 5, 8, 10 μΜ BBMD3 για 24 και 48 ώρες, και η βιωσιμότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το MTS δοκιμασία, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν. Η κορυφή του κάθε γραφήματος μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο των 3 πειραμάτων, και το

μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν

± την τυπική απόκλιση από το μέσο όρο (SD). (Β) BBMD3 διαταράσσει τη δομή των νευροσφαιρών, και επάγεται θανάτωσης κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε αυτούς που προέρχονται PBT003 νευροσφαιρών, όταν τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία για 48 ώρες με το φάρμακο.

Η

BBMD3 Προκαλεί Caspase -3 Εξαρτημένη απόπτωσης των καρκινικών Stem-όπως κύτταρα καλλιεργημένα από τέσσερις GBM ασθενείς

Επειδή η θεραπεία BBMD3 σκότωσε GBM προέρχεται καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν, εξετάσαμε αν η θανάτωση κυττάρων που προκαλείται από την αποπτωτική διαδικασία. Τα κύτταρα (2 χ 10

5) από PBT003, PBT008, PBT022 και PBT030 νευρόσφαιρες σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας ιστού των έξι φρεατίων, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 48 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0, 1, 3, 5, 10 μΜ) του BBMD3. Όλα τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για έκφραση αννεξίνης V χρησιμοποιώντας αντι-αννεξίνης V-FITC χρώση με ιωδιούχο προπίδιο και αντίσωμα που ακολουθείται από τη σχετική ποσοτικοποίηση μέσω κυτταρομετρίας ροής. Τα αποπτωτικά κύτταρα, που φαίνεται στο Σχήμα 3Α, ήταν Αννεξίνη V θετική (πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων), ή αννεξίνης V και ιωδιούχου προπιδίου διπλά θετικά (εσχάτων αποπτωτικών κυττάρων). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι BBMD3 επαγόμενη απόπτωση σε αυτά GBM βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Μια θεραπεία 48 ώρα με 10 μΜ BBMD3 σκότωσε σχεδόν όλα τα κύτταρα του όγκου. Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3, ένα κρίσιμο επαγωγέας της αποπτωτικής διαδικασίας [29], είχε ως αποτέλεσμα τη διάσπαση του (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP), το οποίο βοηθά τα κύτταρα να διατηρούν το πολυ τη βιωσιμότητά τους [30]. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι η θανάτωση των κυττάρων που προκαλείται από BBMD3 είναι μια αποπτωτική διαδικασία, Western αναλύσεις blotting πραγματοποιήθηκαν για την ανίχνευση της ενεργοποίησης της κασπάσης-3 και την διάσπαση της PARP σε συνολικό κυτταρικό λύμα μετά από αγωγή 24 ωρών με 5 μΜ BBMD3. BBMD3 αύξησε την διάσπαση της κασπάσης-3 σε ενεργή μορφή της, και η διάσπαση της PARP σε ανενεργούς μορφής σε κύτταρα που προέρχονται από τις τέσσερις νευροσφαιρών καλλιέργειες (Σχ. 3Β). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν προς BBMD3 επαγωγή απόπτωσης σε αυτά τα GBM βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν μέσω ενεργοποίησης της κασπάσης-3 καταρράκτη. Τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης ότι πολλαπλοί μηχανισμοί μπορεί να εμπλέκονται στην επαγωγή θανάτωσης κυττάρων και την απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων, δεδομένου ότι, στο χρονικό σημείο προσδιορίστηκε, PBT003 NS επωάστηκαν με 5 μΜ BBMD3 προκάλεσε μια σχεδόν πλήρη απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων, με μια απόπτωση ποσοστό περίπου 60%? ενώ για την βιωσιμότητα των κυττάρων PBT030 NS ήταν περίπου 20% μετά από επώαση με 5 μΜ BBMD3, ενώ η απόπτωση ήταν σχεδόν 100% σε αυτή την καλλιέργεια.

(Α) κύτταρα αποπτωτικά αναλύθηκαν για αντιδραστικότητα και ΡΙ χρώση αννεξίνης V-FITC με κυτταρομετρία ροής. Κύτταρα από τα νευροσφαιρία PBT003, PBT008, PBT022 και PBT030 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BBMD3 (0, 1, 3, 5, 10 μΜ) για 48 ώρες. Τα αποπτωτικά κύτταρα αναγνωρίστηκαν ως αντιδραστικά με αντίσωμα Annexin V-FITC (πρώιμο στάδιο απόπτωσης) ή ΡΙ και κυττάρων αννεξίνης V-FITC /ΡΙ διπλά θετικά (όψιμο στάδιο απόπτωσης). Κάθε πείραμα διεξήχθη εις διπλούν ή εις τριπλούν, και επαναλήφθηκε δύο φορές ως ανεξάρτητη επανάληψη. Η κορυφή του κάθε γραφήματος μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο των τιμών που παρατηρήθηκαν από αυτές τις επαναλήψεις, και τα

μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν

± την τυπική απόκλιση από το μέσο όρο (SD). (Β) Η έκταση της διάσπασης της κασπάσης-3 και PARP προσδιορίστηκε μετά από μια αγωγή 24 ωρών με BBMD3 χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western αναλύσεις. β-ακτίνη χρησιμεύει ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

BBMD3 Μειώνει επίσης τη βιωσιμότητα και επάγει την απόπτωση σε μη-στελέχους-όπως GBM κύτταρα

Όπως έχουμε αναφέρει, BBMD3 είναι κυτταροτοξική να ανακόψει -όπως καρκινικά κύτταρα GBM? γεγονός που υποδηλώνει ότι θα πρέπει επίσης να είναι κυτταροτοξικά για μη-stem-σαν GBM καρκινικά κύτταρα. Να εξετάσει τη δυνατότητα αυτή, χρησιμοποιήσαμε καλλιεργημένα κύτταρα U87, η οποία είναι μια καθιερωμένη μη-στελέχους-όπως GBM καρκινική κυτταρική σειρά. Παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα U87 δεν εκφράζουν το νευρικό σημειωτές βλαστοκυττάρων CD133 και νεστίνης (βλέπε Εικ. 1 Β για σύγκριση με τα βλαστικά-όπως καρκινικές κυτταρικές σειρές GBM). Όπως περιμέναμε, BBMD3 ανέστειλε τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την απόπτωση που επάγεται στα κύτταρα U87 (Σχ. 4Α) με τρόπο παρόμοιο με εκείνο που παρατηρήθηκε με τα GBM βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (Εικ. 2Α και 3Α). Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι BBMD3 μπορεί να σκοτώσει και τους δύο στελέχους-όπως και μη-βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με όγκο GBM.

(Α)

Αριστερό πάνελ

, κύτταρα U87 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 0, 1, 3, 5, 8, ή 10 μΜ BBMD3 για 24 και 48 ώρες, και η βιωσιμότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MTS, όπως περιγράφεται στις μεθόδους.

Δεξιό πλαίσιο

, κύτταρα U87 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 1, 3, 5, ή 10 μΜ BBMD3 για 48 ώρες και αποπτωτικά κύτταρα αναλύθηκαν ως προς την αντιδραστικότητα και ΡΙ χρώση αννεξίνης V-FITC με κυτταρομετρία ροής. (Β)

Αριστερό πλαίσιο

δείχνει τη μορφολογία ενός φυσιολογικού ανθρώπινου νευροσφαιρών.

Δεξιό πλαίσιο

δείχνει τη βιωσιμότητα των φυσιολογικών εμβρύου που προέρχεται προέρχεται εγκεφάλου και του όγκου νευρόσφαιρες μετά από 24 ώρες επεξεργασίας με 1, 5, ή 10 μΜ BBMD3. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν, και να αναπαραχθεί ως ανεξάρτητο πείραμα τουλάχιστον δύο φορές. Η κορυφή του κάθε γραφήματος μπάρα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο των τιμών που παρατηρήθηκαν από αυτές τις επαναλήψεις, και τα

ράβδοι σφάλματος σημαίνουν ±

την τυπική απόκλιση από το μέσο όρο (SD).

Η

Κανονική Ανθρώπινου νευρόσφαιρες είναι λιγότερο ευαίσθητες σε BBMD3 από GBM Παράγωγο νευρόσφαιρες

Berbamine και τα παράγωγά του έχουν επίσης αναφερθεί ότι ασκούν λιγότερο από μια κυτταροτοξική δράση προς τα κανονικά ανθρώπινα κύτταρα [17] από προς GBM και άλλων τύπων καρκινικών κυττάρων. Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η διαφορική κυτταροτοξικότητα της BBMD3 προς τα φυσιολογικά νευροσφαιρών, εξετάσαμε τις επιδράσεις της BBMD3 σε φυσιολογικά ανθρώπινα νευροσφαίρες που προέρχεται από την κανονική εμβρυϊκού εγκεφάλου. Το Σχήμα 4Β δείχνει τη μορφολογία των κανονικών νευροσφαιρίων, και τα αποτελέσματα της BBMD3 επί κανονικών νευροσφαιρίων και τα νευροσφαιρών που προέρχονται από τις τέσσερις ασθενείς GBM κατόπιν έκθεση 24 ωρών στο φάρμακο. Σε σύγκριση με τα παράγωγα του όγκου νευροσφαιρών, η κανονική βιωσιμότητα νευροσφαιρών μειώνεται κατά την έκθεση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις BBMD3, αλλά αυτές οι κανονικές καλλιέργειες νευροσφαιρών είναι λιγότερο ευαίσθητα στην κυτταροτοξική δράση των BBMD3 από τις καλλιέργειες νευροσφαιρών που προέρχονται από τους 4 ασθενείς GBM.

BBMD3 αυξάνει την έκφραση του miR-4284 και miR-27a σε PBT003, PBT008, PBT022 και PBT030 νευροσφαίρες

Αν και έχουν miRNAs ήταν γνωστό μόνο για λίγα χρόνια, έχουν βρεθεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην διεργασίες μεσολαβώντας ογκογένεση, αγγειογένεση, κυτταρική εισβολή και την απόπτωση σε μια ποικιλία τύπων όγκου. Ως εκ τούτου, εξετάστηκε αν η θεραπεία BBMD3 θα μπορούσε να αλλάξει το προφίλ έκφρασης των miRNAs στην GBM βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν. Νευρόσφαιρες, που προέρχεται από PBT003, PBT008, PBT022 και οι ασθενείς PBT030 GBM, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ BBMD3 για 16 ώρες, ενώ τα κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο με φορέα (DMSO). Σύνολο miRNA απομονώθηκε από αυτές τις καλλιέργειες νευροσφαιρών, και η έκφραση του κάθε miRNA ποσοτικοποιήθηκε. Σε σύγκριση με τους μάρτυρες, η αγωγή BBMD3 επάνω ρυθμισμένη έκφραση κάποιων miRNAs, και ρυθμισμένα προς τα κάτω την έκφραση των άλλων miRNAs. Ο Πίνακας 1 δείχνει το μέσο προφίλ έκφρασης miRNA, σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα GBM ελέγχου βλαστικά κύτταρα όμοια, για κάθε μία από τις τέσσερις ασθενείς μετά τη θεραπεία GBM BBMD3. miR-7 είναι το πιο κάτω-ρυθμίζονται miRNA, με μια μείωση στην έκφραση του 1,06 φορές. Αντίθετα, οι δύο πιο πάνω ρυθμισμένα miRNAs είναι miR-4284 και miR-27a? αύξηση 4,48 και 2,25 φορές αντίστοιχα. Έχει αναφερθεί ότι πάνω ρύθμιση του miR-23a, 27a, και 24-2 διεγείρει τόσο κασπάσης-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από την απόπτωση σε ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα [31]. Μέχρι σήμερα, δεν έχουμε καταφέρει να βρει οποιαδήποτε δημοσίευση που περιγράφει τη ρυθμιστική λειτουργία (-ες) του miR-4284.

Η

miR-4284 Αναστολέας Μπλοκάρει τις επιπτώσεις της BBMD3 για τη βιωσιμότητα του GBM Νευροσφαίρες

Για να επιβεβαιώσετε κατά πόσον η αυξημένη έκφραση του miR-27a και miR-4284 που προκαλείται από τη θεραπεία BBMD3 συσχετίζεται με τη μείωση της GBM νευρόσφαιρα βιωσιμότητας, εξετάσαμε αν miR-27a και miR-4284 αλληλουχιών αντι-νόημα θα μπορούσε να αναστείλει την κυτταροτοξική δράση του BBMD3. Το πρώτο μας βήμα ήταν να εξεταστεί κατά πόσον αυτοί οι αναστολείς ανέστειλε μόνη βιωσιμότητα των κυττάρων. 60 ηΜ ανθρώπινης αναστολέων αντι-νόημα miRNA (δηλαδή, συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια) έναντι HSA-miRNA-4284 και HSA-miRNA-27α διαμολύνθηκαν σε κύτταρα που προέρχονται από PBT008 και PBT030 νευροσφαιρών. Μη συνδεδεμένοι αναστολέα μικρο-RNA αντι-νόημα χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος, και 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με αυτούς τους αναστολείς miRNA, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχ. 5Α κατέδειξαν ότι οι αναστολείς miR-27a και miR-4284 μόνο του δεν μειώνουν αποτελεσματικά κυτταρικής βιωσιμότητας σε σχέση με εκείνη των μη επιμολυσμένα κύτταρα (untran). Στη συνέχεια εξετάσαμε το αποτέλεσμα των αναστολέων miR-27a και miR-4284 σχετικά με την κυτταροτοξική δραστικότητα του BBMD3 χρησιμοποιώντας PBT008 και PBT030 νευροσφαιρών.