Αφηρημένο

Πράσινο εκχύλισμα κριθαριού (GB) ερευνήθηκε για πιθανές αντικαρκινική δράση με εξέταση αντι-πολλαπλασιαστική και προ-αποπτωτικά ιδιότητες στην ανθρώπινη λευχαιμία λεμφώματος κυττάρου /γραμμές. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ΟΒ επιδεικνύει επιλεκτική αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα σε ένα πάνελ των κυττάρων λευχαιμίας /λεμφώματος σε σύγκριση με μη-καρκινικά κύτταρα. Συγκεκριμένα, GB διαταράσσεται η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσα στα κύτταρα BJAB, όπως εκδηλώνεται από G2 /σύλληψη Μ φάση και κατάτμηση του DNA, και η απόπτωση που επάγεται, όπως αποδεικνύεται από φωσφατιδυλοσερίνη (PS) μετατόπιση προς την εξωτερική κυτταροπλασματική μεμβράνη σε δύο Β-συγγενικής λευχαιμίας /λεμφώματος κυτταρικές γραμμές. Η προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα GB βρέθηκε να είναι ανεξάρτητη των μιτοχονδριακών εκπόλωσης, ενοχοποιώντας έτσι εξωγενών οδών κυτταρικού θανάτου να ασκήσει κυτταροτοξικότητα της. Πράγματι, GB προκάλεσε μια αύξηση της παραγωγής TNF-α, την ενεργοποίηση της κασπάσης-8 και κασπάσης-3, και PARP-1 διάσπασης εντός προ-Β οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας ΝθΙπί-6 κύτταρα. Επιπλέον, κασπάσης-8 και κασπάσης-3 ενεργοποίησης και PARP-1 διάσπασης αναστέλλονται ισχυρά /μπλοκαριστεί από την προσθήκη των ειδικών αναστολέων κασπάσης Ζ-VAD-FMK και Ac-DEVD-CHO. Επιπλέον, ενδοκυτταρική σηματοδότηση αναλύσεις προσδιορίστηκε ότι η θεραπεία GB ενισχυμένη συστατική ενεργοποίηση της Lck και Src κινασών τυροσίνης σε ΝθΙπί-6 κύτταρα. Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι GB επάγεται προτιμησιακή αντι-πολλαπλασιαστική και προ-αποπτωτικά σήματα εντός Β-γράμμωσης κύτταρα λευχαιμίας /λεμφώματος, όπως καθορίζεται από τις ακόλουθες βιοχημικές χαρακτηριστικά της απόπτωσης: PS εξωτερίκευσης, ενισχυμένη απελευθέρωση του ΤΝΡ-α, κασπάσης-8 και κασπάσης-3 ενεργοποίησης, PARP-1 διάσπασης και του κατακερματισμού του DNA Οι παρατηρήσεις μας αποκαλύπτουν ότι GB έχει δυνατότητες ως αντι-λευχαιμίας /λεμφώματος παράγοντα μόνο ή σε συνδυασμό με τυπικές θεραπείες του καρκίνου και έτσι δικαιολογεί περαιτέρω αξιολόγηση

in vivo

να υποστηρίζουν τα ευρήματα αυτά

Παράθεση:. Robles-Escajeda Ε, Lerma D, Nyakeriga AM, Ross JA, Kirken RA, Aguilera RJ, et al. (2013) Αναζήτηση στην Μητέρα Φύση για την Αντικαρκινική Δραστηριότητα: Αντι-πολλαπλασιαστική και Pro-αποπτωτικό αποτέλεσμα που προκλήθηκε από Πράσινο Κριθάρι για λευχαιμίας /λεμφώματος κύτταρα. PLoS ONE 8 (9): e73508. doi: 10.1371 /journal.pone.0073508

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Απρίλη του 2013? Αποδεκτές: 22 Ιουλ 2013? Δημοσιεύθηκε: 9 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Robles-Escajeda et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση το έργο αυτό παρέχεται από NIGMS SCORE Grant 1SC3GM103713-01 να RJA? ο Edward N. και η Margaret Ιδρύματος G. Marsh, Lizanell και Colbert Ίδρυμα Coldwell να RAK? Επιχορηγήσεις 8G12MD007592 στο Συνόρων Ιατροβιολογικών Ερευνών Κέντρο (BBRC) και P20MD002287-06 στο Ισπανικός Υγείας Ανισότητες Research Center (HHDRC) από το Εθνικό Ινστιτούτο για Μειονότητας υγείας και της υγείας Ανισότητες (NIMHD), ένα συστατικό των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (NIH) . ER-Ε και DL υποστηρίχθηκαν από την άνοδο Scholars Program στο UTEP μέσω NIGMS Grant Νο R25GM069621-08 και REU-NSF Grant Νο DBI-0.851.881, αντίστοιχα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Σε παγκόσμιο επίπεδο, το κριθάρι θεωρείται ένα μη τοξικό φυτό [1] που παράγει ένα δημητριακών που χρησιμεύει ως βάση βύνης στη ζυθοποιία. Είναι επίσης ένα υγιές συστατικό των διαφόρων τροφίμων και ποτών (ψωμί, σούπες, βραστά, μπύρα, κ.λ.π.) και ως μείζων κτηνοτροφικά ζώα. Ανεξάρτητα από σιτάρι του, 10- έως 12-ιντσών-μακρά νεαρά φύλλα κριθαριού, που αναφέρεται επίσης ως πράσινο κριθάρι, προσλαμβάνονται ως έγχυση και παρασκευάζονται επίσης για ανθρώπινη κατανάλωση ως ξηρή σκόνη. Τα νεαρά φύλλα κριθαριού συνιστάται ως συμπλήρωμα διατροφής, λόγω των βιταμινών και ανόργανων περιεχόμενό τους [2].

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι εκχυλίσματα από όλη την πυρήνες κριθάρι εμφανίζουν αντιοξειδωτικές και αντι-πολλαπλασιαστικές επιπτώσεις στην ανθρώπινη καρκίνο του παχέος εντέρου Caco -2 κυττάρων [3]. Παρ ‘όλα αυτά, η αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα εντός πράσινα φύλλα κριθαριού μένει να διευκρινιστεί. Τα πράσινα προϊόντα κριθάρι έχουν αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες και μπορούν να διαμορφώσουν παράγοντα νέκρωσης όγκου-άλφα (TNF-α) παραγωγή /απελευθέρωση στις ΤΗΡ-1 κύτταρα ανθρώπινου μονοκυττάρου [4]. Ομοίως, μια άλλη μελέτη ανέφερε ότι μια ένωση που απομονώνεται από πράσινα φύλλα κριθαριού κατείχε αντι-οξειδωτικές ιδιότητες [5]. Επιπλέον, τα μικρά μόρια (λιγότερο από 1 kDa) καθαρίστηκε από εκχύλισμα πράσινου κριθάρι (GB) ανέστειλε την απελευθέρωση ΤΝΡ-α από μονοπυρηνικά κύτταρα που λαμβάνονται από ρευματοειδή αρθρίτιδα (RA) ασθενείς, υποδηλώνοντας ότι GB θα μπορούσε να είναι ένα φυσικό φάρμακο με αντι-οξειδωτικό και αντι- φλεγμονώδη δραστηριότητα η οποία ανακουφίζει τα συμπτώματα των ασθενών που έχουν προσβληθεί με RA [6]. Μελέτες καθαρισμός διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας προηγμένες μεθόδους για τον χαρακτηρισμό των συγκεκριμένων ενώσεων που είναι υπεύθυνα για τις παρατηρούμενες βιολογικές δράσεις του GB. Markham και Μίτσελ έδειξε ότι η flavone-c-γλυκοζίτες, saponarin και lutonarin, από μικρά πράσινα φύλλα κριθαριού ήταν υπεύθυνη για τις αντι-οξειδωτικές ιδιότητες [7]. Παρομοίως, βιομάζες από πράσινα φυτά κριθαριού κατέχουν σημαντικές ποσότητες του αντι-οξειδωτικού ένζυμα καταλάση και η υπεροξειδική δισμουτάση, καθώς και η μη-ενζυματική αντιοξειδωτικά βιταμίνες C και Ε [8,9]. Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις,

in vivo

μελέτες που περιλαμβάνουν 36 άτομα πρότεινε ότι καθημερινά συμπληρώματα των φύλλων κριθαριού σε συνδυασμό με αντι-οξειδωτικό βιταμίνες (C και Ε) μείωσε τη λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας (LDL)-βιταμίνης Ε και περιεχόμενο ανέστειλε μικρή οξείδωση πυκνά-LDL, κατά συνέπεια, μείωση ορισμένων από τους σημαντικότερους παράγοντες κινδύνου της αθηροσκλήρωσης και την προστασία των ασθενών με διαβήτη τύπου 2 κατά των αγγειακών παθήσεων [10]. Επιπλέον, ένας συνδυασμός saponarin /lutonarin (4.5 /1 αναλογία) που απομονώθηκε από νεαρά φύλλα κριθαριού βρέθηκε να έχει επιπτώσεις αντιοξειδωτικό που ήταν συγκρίσιμες με αυτές που λαμβάνονται από α-τοκοφερόλη και βουτυλιωμένη υδροξυτολουόλη [11].

έχει προταθεί ότι οι αντι-οξειδωτικές και αντικαρκινικές δραστηριότητες στα φρούτα και τα λαχανικά μπορούν να αποδοθούν στη προσθετική ή συνεργιστική συνέπεια πολύπλοκο μείγμα τους φυτοχημικές συστατικά [12]. Επιπλέον, το συνολικό κλάσμα πολυφαινόλης μέσα cranberries παρουσίασαν περισσότερο αποτελεσματική αντι-πολλαπλασιαστική δράση σε σύγκριση με τα επιμέρους συστατικά του, γεγονός που υποδηλώνει μια συνδυασμένη προσθετική ή συνεργιστική επίδραση [13]. Επιπλέον, διάφορες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι τα φυτικά προϊόντα μπορούν να δράσουν ως κυτταρικού κύκλου καταστολή παράγοντες, διακόπτοντας τις φάσεις έναρξη ή την πρόοδο της καρκινογένεσης [14-17]. Επιπλέον, έχει παρατηρηθεί ότι οι ασθενείς με καρκίνο καταπιούν συχνά φυτικά προϊόντα εκτός από συνταγογραφούμενα φάρμακα τους [18] βασίζεται στην υπόθεση ότι τα φυτικά προϊόντα έχουν αβλαβείς παρενέργειες και είναι μια καλά μελετημένη θεραπευτική επιλογή.

παρά τα στοιχεία για το δυναμικό GB ως ένα αντι-φλεγμονώδη μεσολαβητή, υπάρχει πενιχρό ενδείξεις άμεση αντι-πολλαπλασιαστική και /ή κυτταροτοξική δράση του σε φυσιολογικά ή μετασχηματισμένα κύτταρα. Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να εξεταστεί η αντι-πολλαπλασιαστική και κυτταροτοξική δράση του GB σε διάφορες κυτταρικές γραμμές λευχαιμίας /λεμφώματος. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι GB έχει εκλεκτική αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση σε διάφορα κύτταρα λευχαιμίας /λεμφώματος, με ελάχιστη ή και καμία σε μη καρκινικά κύτταρα. Από τέσσερις κυτταρικές σειρές καρκίνου, προ-Β κύτταρα (ΝθΙπί-6) και ώριμα Β-(BJAB) ήταν οι πιο ευαίσθητοι σε αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα της GB. Για πρώτη φορά, η μελέτη μας έδειξε ότι GB οδήγησε σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που επάγεται μέσω της ΤΝΡ-α απελευθέρωσης, κασπάσης-8 και κασπάσης-3 δραστηριότητες, PARP-1 διάσπασης, PS μετατόπιση, κύκλου κυττάρου-σχετίζεται DNA κατακερματισμού. Οι μελέτες αυτές παρέχουν υποστήριξη για την πιθανή χρησιμότητα των GB κατά της λευχαιμίας /λεμφώματος και απαιτούν περαιτέρω έρευνα σε συστήματα ζωικών μοντέλων.

Υλικά και Μέθοδοι

εκχυλίσματα πράσινο κριθάρι (GB) προετοιμασία

Πράσινο σκόνη κριθάρι από νεαρά φύλλα του

Hordeum vulgare L.

, πωλείται στο εμπόριο ως φυτικό συμπλήρωμα ως προληπτική πηγή βιταμινών και ανόργανων συστατικών (βιταμίνη World? www.vitaminworld.com), χρησιμοποιήθηκε. Αφυδατωμένα σκόνη GB επανααιωρήθηκε με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS? Ϋίβ Technologies, Grand Island, ΝΥ) σε συγκέντρωση 10% w /v. Οι επανυδατώθηκαν εναιωρήματα σκόνη στη συνέχεια εξετέθησαν σε τρεις διαδοχικούς κύκλους ψύξης /απόψυξης σε θερμοκρασία -80 ° C /δωμάτιο, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, τα δείγματα κατ ‘επανάληψη σε επεξεργασία με υπερήχους (Vibra ΟβΙΙ? Sonics and Materials Inc., Newtown, CT) στους μέγιστο πλάτος 40%, ~ 14 watts, χρησιμοποιώντας ένα ¼ «μικροσκοπική αιχμή, από έναν παλμό κατεργασία υπερήχων 20 sec ακολουθούμενη από διαστήματα ηρεμίας 30 δευτερολέπτων , για επτά διαδοχικούς κύκλους. Σωλήνες που περιέχουν τα μίγματα εναιώρημα κρατήθηκαν προ-ψύξη σε λουτρό πάγου-ύδατος καθ ‘όλη τη διαδικασία για την πρόληψη της θέρμανσης. Μετά από φυγοκέντρηση στα 15.000 χ

g

για 30 λεπτά, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και ασηπτικά διηθείται, αρχικά μέσα από τους πόρους της μεμβράνης 0.45-μm, που ακολουθείται από μια δεύτερη διήθηση μέσα από τους πόρους της μεμβράνης 0.22 μπι (Cole-Parmer, Chicago, IL). Δείγματα του στείρου PBS χωρίς GB χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι. Επιπροσθέτως, το ξηρό βάρος του GB διαλυτό υλικό μετρήθηκε για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση του φυτού ξηρού βάρους, σε mg /ml, που χρησιμοποιείται σε κάθε θεραπεία. Τρία δείγματα του 1 ml και από τα δύο δείγματα που GB παρασκευάστηκαν σε PBS λυοφιλοποιήθηκαν (Labconco 4,5 L πάγωμα στεγνωτήριο, Stanford, CA) όλη τη νύχτα. Επιπλέον, δείγματα του 1 ml PBS μόνο χρησιμοποιήθηκαν για να αφαιρέσουμε τη συνεισφορά PBS διαλύτη, και το ξηρό βάρος υπολογίζεται. Οι συνήθεις όγκοι χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη και ξηρό βάρος ισοδυνάμων τους GB απεικονίζονται στον Πίνακα S1

Κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

Τέσσερις ανθρώπινη λευχαιμία /κυτταρικές σειρές λεμφώματος χρησιμοποιήθηκαν:. YT Φυσικό Killer- όπως [19], ώριμη-T οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία Jurkat [20], προ-Β οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας ΝθΙπί-6 [21], και το λέμφωμα ώριμων-B του Burkitt BJAB [22]. Για συγκριτικούς σκοπούς, μία κυτταρική σειρά από καρκίνο μη προέλευσης, ανθρώπινα δερματικά νεογνική ακροποσθία Hs27 ινοβλάστες (Hs27? ATCC, Manassas, VA), συμπεριλήφθηκε επίσης. Τα μέσα καλλιέργειας για λευχαιμία /λέμφωμα (ΥΤ, Jurkat, ΝθΙπί-6 και BJAB) και κύτταρα ινοβλαστών (Hs27) ήταν RPMI και DMEM (HyClone, Logan UT), αντίστοιχα. Και τα δύο από αυτά τα μέσα καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone), 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 0,25 μg /ml αμφοτερικίνη Β (Lonza, Walkersville, MD). Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα, σε περίπου 60-75% συρροή, μετρήθηκαν και σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Οι συνθήκες επωάσεως των κυττάρων ήταν 37

° C σε

2 ατμόσφαιρα υγροποιημένη 5% CO. Για να διασφαλιστεί η υψηλή βιωσιμότητα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23].

Αντι-πολλαπλασιαστική

δοκιμασία

λευχαιμίας /λεμφώματος και μη καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν σε μια μορφή πλάκας 24-φρεατίων σε 1×10

5 κύτταρα /φρεάτιο και 1.25×10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε 1 ml μέσου, αντίστοιχα. Αφού τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 50 μl /ml του GB για 96 ώρες, ο αριθμός των κυττάρων απόλυτος ανά χιλιοστόλιτρο προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο και ένα θάλαμο Neubauer (αιμοκυτόμετρο), για την εκτίμηση αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα σε σύγκριση με μη αρνητικούς μάρτυρες. Τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε εναιώρημα ήταν άμεσα ομογενοποιείται, και ένα δείγμα φορτώθηκε σε αιματοκυτταρόμετρο και μετρήθηκαν. Για προσκολλημένα κύτταρα Hs27, το υπερκείμενο που περιέχει τα επιπλέοντα κύτταρα (κυρίως νεκρά) από κάθε φρέαρ συνελέγησαν σε ένα σωλήνα, ενώ τα προσκολλημένα κύτταρα αποκολλήθηκαν με τρυψινοποίηση όπως προηγουμένως λεπτομερώς [24]. Πλωτή και προσκολλημένα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν και μετρήθηκε, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ο μέσος όρος των καλλιεργειών εις τετραπλούν. Οι PBS-αγωγή μάρτυρες, αραιωτικό της GB, ομαλοποιήθηκαν στο 100% και χρησιμοποιείται ως αναφορά για τον υπολογισμό του ποσοστού των ΟΒ-κατεργασμένου κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

Η κυτταροτοξικότητα παρακολουθήθηκε με ζωτικής χρωστικής προπίδιο

δοκιμασία ιωδιούχο αποκλεισμού

Για την ποσοτικοποίηση της κυτταροτοξικότητας, συλλέχθηκαν δείγματα κυττάρων, χρωματίζονται με την μεμβράνη διαπερνά ιωδιούχο βαφή προπιδίου (PI) και παρακολουθείται σε λειτουργία ζωντανής-κυττάρων

μέσω

κυτταρομετρία ροής (Cytomics FC500? Beckman Coulter, Miami , FL). Αυτή η δοκιμασία προσδιορίζει μεμονωμένα κύτταρα ΡΙ-θετικής με διαταράσσεται μεμβράνες του πλάσματος που θεωρούνται νεκρά κύτταρα. Περίπου 10.000 γεγονότα συλλέχθηκαν για κάθε δείγμα, και τα δεδομένα αναλύθηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [25]. Ως θετικός αντι-πολλαπλασιαστική /κυτταροτοξικά μάρτυρες, τα κύτταρα εξετέθησαν σε 1 mg /ml G418, έναν αναστολέα της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Επιπλέον, ως αρνητικοί έλεγχοι, κύτταρα κατεργασμένα με ισοδύναμους όγκους GB μόνο διαλύτη, PBS, και μη-κατεργασμένα κύτταρα συμπεριλήφθηκαν σε παράλληλες καλλιέργειες. Η απόκτηση και ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού CXP (Beckman Coulter). Ανάλυση

κυτταρικού κύκλου με τη μέτρηση του περιεχομένου κυτταρικού DNA

Ανάλυση του κυτταρικού περιεχομένου DNA και του κυτταρικού κύκλου διανομής διεξήχθη με PI χρώση και την παρακολούθηση του φθορισμού του

μέσω

κυτταρομετρία ροής. Η επιρροή του GB ως μια πιθανή διαταράκτης κυτταρικού κύκλου διερευνήθηκε σε ασύγχρονη κυτταρική γραμμή BJAB μετά από 96 ώρες επώασης. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα πιάτο με 24 φρεάτια, καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και συλλέχθηκαν όπως περιγράφεται λεπτομερώς προηγουμένως [24]. Οι πυρήνες των κυττάρων παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ DNA-Prep Coulter αντιδραστήρια (Beckman Coulter) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα 262xg για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και στη συνέχεια τα σφαιρίδια του κυττάρου επαναιωρήθηκαν απαλά με στροβιλισμό χαμηλής ταχύτητας χρησιμοποιώντας 100 μΙ λύσης DNA-Prep και ένα αντιδραστήριο διαπερατοποίηση (απορρυπαντικό), ακολουθούμενη από την προσθήκη 400 μΙ αντιδραστηρίου χρώσης DNA Prep (50 μg /mL PI και 4 kU /mL RNAse). Ακολούθως, τα δείγματα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι για 60 λεπτά, ακολουθούμενη από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (LSRII? BD Biosciences, San Jose, CA). Ως θετικός έλεγχος για διακοπή του κυτταρικού κύκλου, δύο ανεξάρτητα πειράματα στα οποία τα κύτταρα εξετέθησαν σε 1 mg /ml G418 και 80 ηΜ ετοποσίδη (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ) για 96 ώρες. Ως έλεγχος για μη-ειδικές επιδράσεις, το αραιωτικό της GB, PBS (10 και 50 μλ), όπως περιέχονται στις πειραματικά δείγματα, περιελήφθη. Μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Τα ποσοστά των κυττάρων με διαφορετικές κατανομές περιεχόμενο DNA προσδιορίστηκαν από ιστόγραμμα με πύλες για την υπο-G0 /G1, υποδιπλοειδή? G0 /G1, διπλοειδή? S, hyperdiploid? και G2 /M, τετραπλοειδούς. Gating εφαρμόστηκε για τον αποκλεισμό δυάδων. Ο πληθυσμός S-φάση ορίζεται ως το ποσοστό των κυττάρων με ένα περιεχόμενο DNA μεταξύ G0 /G1 (διπλοειδή) και G2 /M (τετραπλοειδούς). Επιπλέον, αυτό το είδος της ανάλυσης χρησιμοποιήθηκε για την ικανότητά της να ανιχνεύει μια απόπτωση που σχετίζεται με πρότυπο κατακερματισμού του DNA στο επίπεδο του ενός κυττάρου, όπως εκδηλώνεται με την αύξηση του υποπληθυσμού κυττάρων υπο-G0 /G1 [26]. Για να deconvolute τα ιστογράμματα περιεχόμενο του DNA, FACS Diva (BD Biosciences) ή FlowJo (Tree Star, Ashland, OR), το λογισμικό χρησιμοποιήθηκε.

Ανάλυση της φωσφατιδυλοσερίνης (PS) τη διανομή σε κυτταρικές μεμβράνες

Για να διερευνήσει αν διατάραξη της κυτταρικής μεμβράνης ασυμμετρίας PS εμπλέκεται ως ένας μηχανισμός κυτταρικού θανάτου που επάγεται από GB, τα κύτταρα παρακολουθούνται

μέσω

κυτταρομετρία ροής μετά διπλή χρώση με Annexin V-FITC και ΡΙ. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων t σε πυκνότητα 100.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 1 ml μέσου καλλιέργειας. Μετά από ολονύκτια επώαση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΙ GB ή ελέγχου PBS για επιπλέον 48 ώρες και 96 ώρες, για ΝθΙπί-6 και BJAB κύτταρα, αντίστοιχα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με ψυχρό PBS και υφίστανται επεξεργασία σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Beckman Coulter). Εν συντομία, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ένα διάλυμα που περιέχει ένα μίγμα από αννεξίνης V-FITC και ΡΙ σε 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης, επωάζονται επί πάγου στο σκοτάδι για 15 λεπτά, ακολουθούμενο από την προσθήκη 400 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος σύνδεσης παγωμένου και αμέσως αναλύθηκαν

μέσω

κυτταρομετρία ροής (Cytomics FC 500? Beckman Coulter). Το συνολικό ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων ορίστηκε ως το άθροισμα των δύο πρώιμη και την όψιμη φάση της απόπτωσης (ανεξίνη V-FITC θετικά), πάνω και κάτω δεξιά τεταρτημόρια σε κυτταρομετρίας ροής διαγράμματα σημείων, αντίστοιχα. Για κάθε δείγμα, 10.000 γεγονότα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CXP (Beckman Coulter). Κάθε πειραματικό σημείο και οι έλεγχοι αξιολογήθηκαν εις τετραπλούν.

ανίχνευσης Ζωντανή-κυττάρων των ενδοκυττάριων κασπάσης-3

ενεργοποίηση

κυστεΐνη-ασπαρτικό πρωτεάσες (κασπάσης) -3 ενεργοποίηση ΝθΙπί 6-κύτταρα GB-θεραπεία μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φθορογόνο NucView 488 Caspase-3 σετ για ζωντανά κύτταρα (Biotium, Hayward, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα που εμφανίζουν ένα πράσινο σήμα φθορισμού παρακολουθήθηκαν

μέσω

κυτταρομετρία ροής (Cytomics FC500). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μορφή πλάκας 24-φρεατίων, όπως περιγράφεται παραπάνω και εκτέθηκαν για 6 ώρες και 8 ώρες σε 50 μΙ εκχυλίσματος GB. Αρκετοί μάρτυρες συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη σειρά πειραμάτων: κύτταρα που κατεργάζονται για 8 ώρες με εκχύλισμα GB εκτέθηκαν σε 10 μΜ Ac-DEVD-CHO (DEVD? Ν-ακετυλο-Asp-Glu-Val-Asp-αλδεϋδης), ένας ισχυρός, ειδικός και μη-αναστρέψιμος αναστολέας της κασπάσης-3 [27], πριν από την προσθήκη του υποστρώματος NucView? κύτταρα κατεργασμένα για 8 ώρες με 2 μg /ml καμπτοθεκίνη, ένα γνωστό επαγωγέα απόπτωσης

μέσω

κασπάσης-3 ενεργοποίησης [26], ως θετικός έλεγχος? και μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Συλλογή δεδομένων και ανάλυση των κασπάσης-3-θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού CXP.

ανάλυση Western blot της PARP 1-διάσπασης

Η διάσπαση πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης-1 (PARP-1) εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western όπως περιγράφεται λεπτομερώς προηγουμένως [28]. Εν συντομία, 50 μΙ ή 100 μΙ GB προστέθηκε σε 1×10

5 ΝθΙπί-6 κύτταρα σε 1 ml μέσου και επωάστηκαν για 24 ώρες. Ως ένας θετικός έλεγχος της επαγωγής διάσπασης PARP-1, χρησιμοποιήθηκε 2 μg /ml καμπτοθεκίνης. Ένας ισχυρός αναστολέας της κασπάσης-3, Ac-DEVD-CHO (20 μΜ), προστέθηκε στα κύτταρα ταυτόχρονα με GB για να προσδιοριστεί η συμβολή της κασπάσης-3 σε ΡΑΚΡ-1 διάσπασης. Ίσες ποσότητες των κυτταρικών εκχυλισμάτων, 100 μg πρωτεΐνης ανά λωρίδα σε Laemmli-αναγωγικό ρυθμιστικό, διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα 10% mini-gel (Bio-Rad, Hercules, CA) για SDS-PAGE. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των κυτταρικών εκχυλισμάτων ποσοτικοποιήθηκαν με το κιτ δικιγχονινικού οξέος προσδιορισμού πρωτεϊνών (Pierce, Rockford, IL). Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν από το πήκτωμα σε μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Στη συνέχεια, οι κηλίδες μεμβράνη PVDF φράχθηκαν με 5% (w /v) σκόνη αποβουτυρωμένου γάλακτος σε TBST για 1 ώρα. Τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: κουνελιού αντι-ΡΑΚΡ-1 (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ) και αντι-β-ακτίνης κουνελιού (Sigma, St. Louis, ΜΟ), αραιωμένο 1: 1000 και 1: 3000 με διάλυμα αποκλεισμού. Αντι-ΡΑΚΡ-1 αντιδραστήριο ανιχνεύει πλήρους μήκους PARP-1 (116 kDa), καθώς και μεγάλο θραύσμα του (89 kDa). Στη συνέχεια, ανοσοστυπώθηκαν πρωτεΐνες επισημάνθηκαν με πρωτογενές αντίσωμα υβριδοποιήθηκαν με HRP-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (αραίωση 1: 3000? Sigma). Η κινητικότητα των δεικτών μοριακού βάρους προσδιορίζεται. Οι κηλίδες σε επεξεργασία με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια αντιδραστήριο (Millipore, Billerica, ΜΑ) και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ (Phenix, Candler, NC) για οπτικοποίηση ζώνη πρωτεΐνης. Φωτογραφίες από τις ανεπτυγμένες ταινίες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα τεκμηρίωσης τζελ (η Alpha Innotech, San Leandro, CA).

Πολυχρωμικό ανάλυση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (

Δ

Ψm)

ΝθΙπί-6 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΙ GB και επωάστηκαν για 4 ώρες όπως περιγράφεται παραπάνω. Στη συνέχεια, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 2 μΜ του 5,5 φθοροφόρου ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine ιωδίδιο (JC-1) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (Life Technologies, Grand Island , ΝΥ). Η διατάραξη του μιτοχονδριακού

ΔΨπι

αποδεικνύεται από αισθητή μετατόπιση του σήματος fl uorescence από κόκκινο σε πράσινο. JC-1 συσσωματώματα ή μονομερή, που εκπέμπουν κόκκινο ή πράσινο σήμα, εντοπίστηκαν

μέσω

fl ow κυτταρομετρία (Cytomics FC500) χρησιμοποιώντας FL2 ή FL1 ανιχνευτές, αντίστοιχα. Ως θετικός έλεγχος ένα ιονοφόρο πρωτόνιο που διαχέει το μιτοχονδριακό

ΔΨm

, καρβονύλιο κυανιούχο 3-χλωροφαινυλυδραζόνη (CCCP, 50 μΜ), χρησιμοποιήθηκε. Κύτταρα κατεργασμένα με το αραιωτικό GB (PBS) και μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Η συλλογή και η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού CXP.

Luminex multiplex ανάλυση

κύτταρα εμβολιάζονται σε ένα πολυ-φρεατίων εκτέθηκαν σε 25 και 50 μl /ml του GB για 3

6 ΝθΙπί- h πριν από τα κυτταρικά ιζήματα και τα υπερκείμενα μέσα καλλιέργειας συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση. υπερκείμενα καλλιέργειας κυττάρων από κάθε δείγμα στη συνέχεια αναλύθηκαν για την ποσοτικοποίηση του παράγοντα άλφα νέκρωσης όγκου (TNF-α) και διαλυτό συνδέτη Fas (sFas-L) κυτοκινών επίπεδα, σύμφωνα με τη σύσταση του κατασκευαστή (Millipore, Billerica, ΜΑ). Επιπλέον, τα σφαιρίδια κυττάρου πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν με Milliplex κύτταρο ΜΑΡ σηματοδότησης ρυθμιστικό λύσης που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (Millipore, Billerica, ΜΑ). ποσοτικοποιήσεις πρωτεΐνης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας BCA αντιδραστήριο (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL). Το κιτ MILLIPLEX ΜΑΡ Ανθρώπινα Src οικογένειας κινάσης (Millipore, Billerica, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση φωσφορυλιωμένης Lck (Tyr394), Src (Tyr419), Fyn (Tyr420), Blk (Tyr389) και Fgr (Tyr412), σε 25 μg του συνολικού κυτταρικό λύμα σύμφωνα με το προτεινόμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. πρωτεΐνες-στόχοι αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας xMAP βάση σφαιρίδια (multianalyte profiling) τεχνολογία στην πλατφόρμα Luminex 200 (σύστημα FlexMAP 3D? Millipore, Billerica, ΜΑ) σε συνδυασμό με xPONENT 3,1 λογισμικό (Luminex, Austin, ΤΧ) σύμφωνα με το προτεινόμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Millipore ). Κάθε πειραματικό σημείο και οι έλεγχοι διεξήχθησαν εις τριπλούν.

σε πραγματικό χρόνο ανίχνευση ενδοκυτταρικών κασπάσης-8 ενεργοποίηση

Η ενεργοποίηση της κασπάσης-8 στο ΝθΙπί-6 κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την κυτταρική διαπερατό και μη αναστρέψιμα δέσμευσης κασπάσης-8 αναστολέα επισημασμένο με φλουορεσκεΐνη, FITC-IETD-FMK, και παρακολουθήθηκε

μέσω

κυτταρομετρία ροής [30]. Κύτταρα σε μορφή πλάκας 24-φρεατίων, σπάρθηκαν σε πυκνότητα 100.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 1 ml μέσου καλλιέργειας ανάπτυξης, εκτέθηκαν σε 10 και 50 μl /ml του GB για 4 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντιδραστήριο FITC-IETD-FMK , για τους σκοπούς χρώση, ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Abcam, Cambridge, ΜΑ). Οι ακόλουθοι έλεγχοι χρησιμοποιήθηκαν: 50 μl GB εκχύλισμα ταυτόχρονα προστίθεται με τον αναστολέα κασπάσης παν-Z-VAD-FMK (Abcam) στα 20 μΜ, το οποίο αναστέλλει τη σύνδεση του FITC-IETD-FMK? 2 mM του H

2O

2, ως θετικός μάρτυρας για κασπάσης-8 ενεργοποίησης? 50 μΙ PBS ως έλεγχος διαλύτη? και μη επεξεργασμένα κύτταρα ως αρνητικός έλεγχος. Οι κυτταρικές κατανομές με πράσινο σήμα φθορισμού αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τον ανιχνευτή FL-1. απόκτηση δεδομένων και ανάλυση των κασπάσης-8-θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού CXP (Beckman Coulter).

Η στατιστική ανάλυση

Κάθε σημείο δεδομένων έγινε ένα τουλάχιστον τρεις φορές. Για να δείξει πειραματικά μεταβλητότητα, τα δεδομένα εκφράστηκαν ως ο μέσος όρος με αντίστοιχη τυπική απόκλιση. Δίπλευρη ζεύγη Φοιτητών

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ έγιναν για να καθοριστεί η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των πειραματικών δειγμάτων και των αντίστοιχων ελέγχων τους. Για να υποδηλώσει αν οι συγκρίσεις των δύο θεραπείες έχουν στατιστική σημασία, μια τιμή των

P

& lt? 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

GB μείωσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων λευχαιμίας /λεμφώματος

Αρχικά, εξετάσαμε τη δυνατότητα αντι-πολλαπλασιαστική δράση του GB για τον καρκίνο και μη καρκίνος προέλευση κύτταρα με ποσοτικοποίηση του συνολικού αριθμού των κυττάρων μετά από 96 ώρες. GB-επεξεργασμένα κύτταρα /λεμφώματος λευχαιμίας έδειξαν μια στατιστικά σημαντική μείωση της συνολικής τους αριθμούς τους (

P

& lt? 0,05? Σχήμα 1). Μετά την κανονικοποίηση των PBS αγωγή ελέγχους στο 100%, το ποσοστό του πολλαπλασιασμού των ΟΒ-κατεργασμένων κυττάρων υπολογίστηκε. GB ασκείται μία διαβάθμιση αναστολή του πολλαπλασιασμού σε κύτταρα λευχαιμίας /λεμφώματος, προκαλώντας μειώσεις κυτταρικό πολλαπλασιασμό των 73% επί ΝθΙπί-6, 40% επί BJAB, 34,5% επί YT και 24.7% σε κύτταρα Jurkat (Σχήμα 1Α-D). Είναι ενδιαφέρον, αυτό αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα δεν επηρέασε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των μη καρκινικά κύτταρα Hs27 (Σχήμα 1 Ε). Επιπλέον, το Β-γράμμωσης ΝθΙπί-6 και BJAB ήταν οι επηρεάζονται περισσότερο κύτταρα (Σχήμα 1Α-Β). Έτσι, αυτές οι κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν σε περαιτέρω πειράματα για να διερευνήσει τον μηχανισμό υποκείμενων GB κυτταρική τοξικότητα. Μέχρι στιγμής, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η GB διαθέτει μια προνομιακή καταστολή δραστηριότητα του πολλαπλασιασμού λευχαιμίας /λεμφώματος κυττάρων.

Ο συνολικός αριθμός των κυττάρων ανά χιλιοστόλιτρο (

y

-άξονα) μετρήθηκαν με ένα αιμοκυτταρόμετρο μετά 96 h θεραπείας: (Α) ΝθΙπί-6, (Β) BJAB, (Γ) ΥΤ ΝΚ-όπως, (D) κύτταρα Jurkat και (Ε) Hs27. Ως ένας θετικός έλεγχος ενός αντι-πολλαπλασιαστική δράση, /ml G418 συμπεριλήφθηκε 1 mg. Μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως ένας δείκτης της κυτταρικής βιωσιμότητας κατά τη διάρκεια όλων των χρονικών περιόδων επώασης. Πρόσθετοι έλεγχοι του αραιωτικού των εκχυλισμάτων, PBS, εξετάστηκαν επίσης. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο όρο των τεσσάρων επαναλήψεων και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, σχολιασμένη από την κορυφή του 50 μΙ GB επεξεργασμένα κύτταρα, εμφανίζεται ως ένα ποσοστό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού του PBS κατεργασμένα κύτταρα, η οποία θεωρείται το 100% της αύξησης. Πενήντα μλ GB σε PBS είναι ισοδύναμη με 1,5 ± 0,048 mg /ml αποξηραμένη σκόνη.

Η

GB προκαλεί κυτταροτοξικότητα σε προ-Β οξείας λευχαιμίας /λεμφώματος ΝθΙπί-6 κύτταρα

Η ταυτόχρονη με το ποσοτικοποίηση του συνολικού αριθμού των κυττάρων, προσδιορίσαμε αν GB επαγόμενη κυτταροτοξικότητα. Παραδόξως, η κυτταροτοξικότητα παρατηρήθηκε μόνο σε ΝθΙπί-6 κύτταρα, αλλά όχι σε BJAB, ΥΤ, ή κύτταρα Jurkat (Σχήμα 2Α-D), υπονοώντας ότι η παρατηρούμενη αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα δεν σχετίζονται απαραίτητα με την κυτταροτοξικότητα. Με την εξαίρεση των ΝθΙπί-6, η βιωσιμότητα των κυτταρικών γραμμών λευχαιμίας /λεμφώματος έμοιαζε με συνέπεια τις αξίες της με αγωγή με PBS ή μη επεξεργασμένους μάρτυρες (Σχήμα 2). Ομοίως, η έλλειψη κυτταροτοξικότητας παρατηρήθηκε επίσης σε φυσιολογικά μη καρκινικά κύτταρα προερχόμενα από (Σχήμα 2Ε)

Μετά από 96 ώρες επώασης, παρατηρήθηκε τοξικότητα στο (Α) ΝθΙπί-6 κύτταρα.? ενώ (Β) BJAB, (Γ) ΥΤ, (D) Jurkat και (Ε) κύτταρα Hs27 μη καρκινικά ήταν ανθεκτικά σε αυτό το τοξικό αποτέλεσμα. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙ και το ποσοστό της κυτταροτοξικότητας (

y

-άξονα) παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας μια μέθοδο κυτταρομετρίας ροής. Ως ένας θετικός έλεγχος της κυτταροτοξικής δραστικότητας, 1 mg /ml G418 χρησιμοποιήθηκε. Μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως ένας δείκτης της κυτταρικής βιωσιμότητας καθ ‘όλη τη διάρκεια της περιόδου επώασης. Το αραιωτικό του εκχυλίσματος GB, PBS, αναλύθηκε επίσης. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο όρο των τεσσάρων επαναλήψεων και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. 1 x 10

4 εκδηλώσεις ανά δείγμα αποκτήθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CXP (Beckman Coulter). Πενήντα μλ GB σε PBS είναι ισοδύναμη με 1,5 ± 0,048 mg /ml αποξηραμένη σκόνη.

Η

GB προκαλεί κατακερματισμό του DNA και G2 /M σύλληψης σε κύτταρα BJAB

αναλύσεις κατανομή κυτταρικού κύκλου πραγματοποιήθηκαν να αποκρυπτογραφήσει με περισσότερες λεπτομέρειες ο μηχανισμός που χρησιμοποιεί GB να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα BJAB εκτέθηκαν σε 10 και 50 μl GB για 96 ώρες και στη συνέχεια παρασκευάστηκαν για ανάλυση του περιεχομένου κυτταρικού DNA

μέσω

κυτταρομετρίας ροής. Αυτή η μέθοδος βασίζεται στην φθορίζοντες ανιχνευτές που δεσμεύονται DNA, επιτρέποντας έτσι ολόκληρο το περιεχόμενο DNA ανά πυρήνα να παρακολουθείται με ακρίβεια [31]. Σχετικές διαφορές στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου παρατηρήθηκαν σε κύτταρα που υπέστησαν κατεργασία με 50 μλ GB, ενώ 10 μΐ κύτταρα GB-αγωγή δεν παρουσίασαν σημαντική μεταβολή στη συχνότητα των κυττάρων όλων των φάσεων του κυτταρικού κύκλου (σχήμα 3Α-D). Τα κύτταρα με αποπτωτική κατακερματισμένο DNA μπορούν να διακριθούν από υποδιπλοειδή περιεχόμενο DNA τους (υπο-G0 /G1peak) κατά τη διάρκεια μονοπαραγοντική ανάλυση κυτταρικό περιεχόμενο DNA. Οι υποδιπλοειδή τιμές αυξήθηκαν σε 11.8% σε κύτταρα κατεργασμένα με 50 μλ GB, ενώ σε δείγματα εκτίθενται σε 10 μΐ GB, PBS ή χωρίς θεραπεία ελέγχους, τα υποδιπλοειδή τιμές ήταν λιγότερο από 1% (

P

= 0,01173? Εικόνα 3). Η τιμή G0 /G1 25,4% στις ΟΒ-επεξεργασμένα κύτταρα ήταν σημαντικά μειωμένη (

P

& lt? 0,04) σε σύγκριση με 40,1% και 39% για τα PBS κατεργασμένα και ακατέργαστα κύτταρα, αντίστοιχα. Οι διαφορές στη συχνότητα των κυττάρων στη φάση S ήταν ανεπαίσθητη. Το ποσοστό των κυττάρων σε φάση G2 /M για ΟΒ-επεξεργασμένα κύτταρα ήταν 43.7%, η οποία ήταν υψηλότερη σε σύγκριση με είτε τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS, 37.5%, ή τα δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής, 37,1% (

P

= 0,01945 και

P

= 0,02426, αντίστοιχα).

Μετά από 96 ώρες GB που προκαλείται αποπτωτικών κατακερματισμό του DNA και G2 /M σύλληψη φάση σε μια δοσοεξαρτώμενη τροπικότητα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, κατέστησαν διαπερατά και χρωματίστηκαν και αναλύθηκαν

μέσω

κυτταρομετρίας ροής. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων επαναλήψεων, και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την αντίστοιχη τυπική απόκλιση. (Α-Δ) Το ποσοστό της συχνότητας των κυττάρων γράφημα κατά μήκος του

y

-άξονα, και οι διαφορετικές θεραπείες χαράσσονται κατά μήκος του

x

-άξονα. (Ε-Ι) Αντιπροσωπευτικά ενιαίο ιστογράμματα παραμέτρων όπου τέσσερις πύλες σχολιάζονται εμφανίζουν το ποσοστό των συχνοτήτων των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου. Πύλες από αριστερά προς τα δεξιά: sub-G0 /G1 (υποδιπλοειδή? Υπολογίζονται ως αποπτωτικά υποπληθυσμό), G0 /G1 (διπλοειδή), S (hyperdiploid) και G2 /M (τετραπλοειδούς). Αυτή η σειρά πειραμάτων περιλαμβάνονται διάφορα στοιχεία ελέγχου: οι δύο ενώσεις προκαλούν αλλοίωση του κυτταρικού κύκλου, (G) 80 ηΜ ετοποσίδη (ΕΤΟ) και (Η) 1 mg /ml G418? (F) το αραιωτικό GB, PBS, όπως περιέχονται στις πειραματικά δείγματα? και (Ι) μη επεξεργασμένα κύτταρα (Unt), ως αρνητικός έλεγχος. Η σημασία των διαφορών μεταξύ των 50 μΙ κυττάρων GB-αγωγή, σε σύγκριση με 50 μΙ PBS-επεξεργασμένα κύτταρα, και επίσης, με μη επεξεργασμένα κύτταρα, είναι

P

& lt? 0,03 (*) και

P

& lt? 0.04 (‡), αντίστοιχα. GB 10 μl = 0,3 ± 0,009 mg /ml, και GB 50 μl = 1,5 ± 0,048 mg /ml αποξηραμένη σκόνη.

Η

GB προκαλεί φωσφατιδυλοσερίνη εξωτερίκευσης σε κυτταρικές σειρές Β-γενεαλογία

δύο κυτταρικές σειρές Β-γενεαλογία εκτέθηκαν σε GB να διακρίνει το δυναμικό επαγωγής της φωσφατιδυλοσερίνης (PS) εξωτερίκευσης. Αυτό παρακολουθήθηκε

μέσω

V FITC-δοκιμασία ανεξίνη /ΡΙ και κυτταρομετρία ροής. Για να καθοριστεί εάν GB κυτταροτοξικότητα που ασκείται σε ΝθΙπί-6 κύτταρα περιλαμβάνονται επίσης μετατόπιση PS, τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν μετά από 48 ώρες επώαση με 50 μΙ GB. Σε αυτό το χρονικό σημείο, το 37,2% των κυττάρων ήταν αποπτωτικά και 24,9% και τα κύτταρα ήταν νεκρωτικά (Εικόνα 4Α). Κύτταρα κατεργασμένα με 50 μΙ PBS και τα μη επεξεργασμένα κύτταρα δεν παρουσιάζουν σημαντική αύξηση είτε αποπτωτικών ή νεκρωτικών τιμές (Σχήμα 4C-D). Επιπλέον, η αύξηση των αποπτωτικών κατακερματισμού του DNA που παρατηρήθηκε στην GB-επεξεργασμένα κύτταρα BJAB ερευνήθηκε περαιτέρω υπό τις ίδιες συνθήκες που εφαρμόστηκαν για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. GB-επεξεργασμένα κύτταρα ήταν 26.3% αννεξίνη V-FITC θετικά, σε αντίθεση με 15,1 και 3,4% για αγωγή με PBS ή μη επεξεργασμένα κύτταρα, αντίστοιχα? τόσο οι τιμές ήταν σημαντικά με

P

& lt? 0.05 (Εικόνα 4A’-Ε ‘). Οι διαφορές στους αριθμούς των νεκρωτικών κυττάρων ήταν ουσιαστικά δεν ανιχνεύθηκαν.