Αφηρημένο

Ιστορικό

Συσσωρευμένα στοιχεία υποστηρίζουν ότι η αύξηση του όγκου και υποτροπή του καρκίνου οδηγούνται από καρκινικά βλαστικά κύτταρα. προηγούμενη εργασία μας απέδειξε την ύπαρξη των CD90

+ ηπατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC). Παρ ‘όλα αυτά, τα χαρακτηριστικά αυτών των κυττάρων δεν είναι επαρκώς κατανοητές. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα περισσότερο ευαίσθητο RNA-αλληλούχιση (RNA-Seq) για να συγκριθεί η προφίλ γονιδιακής έκφρασης του CD90

+ κύτταρα ταξινομούνται από τον όγκο (CD90

+ ΚΕΠ) με παράλληλη μη οιδηματώδης ήπαρ ιστούς (CD90

+ NTSCs) και τη διαλεύκανση του ρόλου των υποθετικών γονιδίων-στόχων σε ηπατοκαρκινογένεσης.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

CD90

+ κύτταρα ταξινομήθηκαν αντίστοιχα από τον όγκο και τις παρακείμενες μη νεοπλασματικής ανθρώπινης Οι ιστοί του ήπατος χρησιμοποίηση ενεργοποιημένης με φθορισμό ταξινόμηση κυττάρων. Τα ενισχυμένα RNAs του CD90

+ κύτταρα από 3 ασθενείς HCC υποβλήθηκαν σε ανάλυση RNA-Seq. Ένα προφίλ διαφορική γονιδιακή έκφραση ιδρύθηκε μεταξύ CD90

+ ΚΕΠ και CD90

+ NTSCs, και επικυρώνονται από ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) για το ίδιο σύνολο των ενισχυμένων RNAs, και επιβεβαιώθηκε περαιτέρω σε μια ανεξάρτητη ομάδα των 12 ασθενών HCC. Πεντακόσια γονίδια που εκφράζονται διαφορικά (119 έως ρυθμιζόμενα και 381 κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια) μεταξύ CD90

+ ΚΕΠ και CD90

+ NTSCs. ανάλυση Gene οντολογία έδειξε ότι οι υπερ-εκφρασμένα γονίδια σε CD90

+ ΚΕΠ συνδέθηκαν με φλεγμονή, αντοχή φαρμάκου και του μεταβολισμού των λιπιδίων. Μεταξύ των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, γλυπικάνη-3 (GPC3), ένα μέλος της γλυπικάνης οικογένειας, ήταν σημαντικά αυξημένα σε CD90

+ ΚΕΠ σε σύγκριση με το CD90

+ NTSCs. Ανοσοϊστοχημεία έδειξαν ότι GPC3 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται σε σαράντα δύο ιστούς ανθρώπινου ήπατος όγκου αλλά απουσιάζει σε παρακείμενες μη ογκογόνους ιστούς του ήπατος. Η κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι GPC3 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται σε ήπαρ CD90

+ ΚΕΠ και ώριμα καρκινικών κυττάρων σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του ήπατος και ιστούς όγκου ανθρώπινου ήπατος. Επιπλέον, η έκφραση της GPC3 συσχετίστηκε θετικά με τον αριθμό των CD90

+ ΚΕΠ σε ιστούς του ήπατος όγκου.

Συμπεράσματα /Σημασία

Οι εντοπίστηκαν γονίδια, όπως GPC3 που σαφώς εκφράζονται στο ήπαρ CD90

+ ΚΕΠ, μπορεί να υπόσχεται υποψηφίων γονιδίων για τη θεραπεία HCC χωρίς να προκαλεί βλάβες στο φυσιολογικό ήπαρ βλαστικά κύτταρα

Παράθεση:. Ho DWY, Yang ZF, Yi Κ, Lam CT, Ng MNP, Yu WC, et al. (2012) γονιδιακής έκφρασης του καρκίνου του ήπατος βλαστικά κύτταρα από την RNA-αλληλουχίας. PLoS ONE 7 (5): e37159. doi: 10.1371 /journal.pone.0037159

Συντάκτης: Dean G. Τανγκ, Το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1, Σεπτεμβρίου 2011? Αποδεκτές: 15 Απρ 2012? Δημοσιεύθηκε: May 14, 2012 |

Copyright: © 2012 Ho et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την κα Li Ka Shing Ταμείο του Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ, την Κίνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: Μερικά συντάκτες που απασχολούνται από εμπορικές εταιρείες. Τζεν Fan Yang απασχολείται από την AstraZeneca Παγκόσμια R & amp? D? Kang YI, Zhixiang Yan, Hang Liu και Yong Zhang είναι υπάλληλοι της BGI-Shenzhen. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση συγγραφείς σε όλα τα PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στον κόσμο, με υψηλή θνησιμότητα ποσοστό [1]. Οι περισσότεροι ασθενείς HCC παρόν σε προχωρημένο στάδιο, η οποία είναι ανθεκτική στη χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία [2], [3]. Επιπλέον, το ποσοστό υποτροπής της νόσου είναι πολύ υψηλή μετά από θεραπευτική αγωγή [4]. Η κατανόηση του μηχανισμού της καρκινογένεσης είναι ζωτικής σημασίας για τη διαχείριση της ΕΕΑ [5].

Γραμμές των αποδείξεων έχουν αποκαλύψει την ύπαρξη και τη σημασία των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ) στην καρκινογένεση τις τελευταίες δεκαετίες. ΚΕΠ θεωρούνται η ρίζα των καρκίνων, και είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη του όγκου και τη διαφοροποίηση των κυτταρικών πληθυσμών ετερογενείς εντός όγκους [6]. Επιπροσθέτως, έχει αποδειχθεί ότι είναι στη χημειοθεραπεία [7] και ραδιοανθεκτικά [8]. Σε προηγούμενη μελέτη μας, με τη χρήση του CD90 δείκτη επιφάνειας (Thy-1, που εκφράζεται από την ηπατική στελέχους /προγονικά κύτταρα), ΚΕΠ ήπαρ προσδιορίστηκαν σε κυτταρικές σειρές HCC, τα δείγματα όγκων και δείγματα περιφερικού αίματος των ασθενών HCC και αυτά CD90

+ ΚΕΠ εμφανίζεται ογκογόνο ικανότητα [9].

από τις ικανότητες ογκογένεσης, διαφοροποίηση, αυτο-ανανέωση και χημειοαντίσταση του ήπατος CD90 είναι

+ ΚΕΠ διέπεται από την χαρακτηριστική γενετική σύσταση τους και μια σειρά από αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης σε βιολογικά διεργασίες, διαλεύκανση των μοριακών προφίλ τους είναι σημαντική στην κατανόηση των χαρακτηριστικών αυτών των κυττάρων. Παρ ‘όλα αυτά, ολοκληρωμένο προφίλ της γονιδιακής έκφρασης του ήπατος ΚΕΠ μένει να καθοριστεί.

Στη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, cDNA μικροσυστοιχιών έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς για την αναγνώριση διαφορική προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε πολλούς καρκίνους για τη διαλογή, την πρόγνωση και όγκου ταξινομήσεων [10] – [13]. Ωστόσο, cDNA μικροσυστοιχιών πάσχει από εγγενείς περιορισμούς, όπως η χαμηλή ευαισθησία, χαμηλό δυναμικό εύρος [14], και έργα τέχνης υβριδισμού [15]. Στην πραγματικότητα, η πλειονότητα των γονιδίων σε βιολογικές διεργασίες, όπως αυτές που κωδικοποιούν παράγοντες μεταγραφής και μορφοτροπείς σήματος, συνήθως εκφράζουν σε χαμηλά επίπεδα [16]. Ως εκ τούτου, το cDNA μικροσυστοιχιών μπορεί να μην είναι ένα ιδανικό εργαλείο για να οριοθετηθούν μοριακών οδών. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε αλληλουχίας RNA επόμενης γενιάς (RNA-Seq), αξιοποιώντας την ανώτερη ευαισθησία και την ικανότητά του να ανιχνεύει παραλλαγές συρραφής, για την αποκωδικοποίηση το σύνολο transcriptomes του ήπατος CD90

+ ΚΕΠ και CD90

+ μη -tumorous βλαστικά κύτταρα (NTSCs) από τρεις ασθενείς HCC. Η διαφορική έκφραση των γονιδίων εξετάστηκε μεταξύ αυτών των δύο ομάδων CD90

+ κύτταρα και τα αποτελέσματα επικυρώθηκαν με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεταγραφάσης ανάστροφης (qRT-PCR). Συγκλίνουσες αποτελέσματα υποδεικνύονται μεταξύ των πλατφορμών του RNA-Seq και qRT-PCR, και η πλειοψηφία των μεταγραφημάτων ανιχνεύθηκαν σε χαμηλά επίπεδα έκφρασης από την RNA-Seq. Άλλωστε, πιο διαρθρωτική ισομορφές βρέθηκαν στο ήπαρ CD90

+ ΚΕΠ από CD90

+ NTSCs. Περαιτέρω, Gene Οντολογία (GO) ανάλυση έδειξε ότι τα πάνω ρυθμισμένα γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό του φαρμάκου, το μεταβολισμό των λιπιδίων και τη φλεγμονή που μπορεί να ευθύνεται για αντοχή φαρμάκου, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και την εξέλιξη του όγκου. Μεταξύ των up-ρυθμιζόμενα γονίδια εντοπίστηκαν, γλυπικάνη-3 (GPC3), ένα μέλος της γλυπικάνης οικογένειας πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης, ήταν υπερ-εκφράζεται σε CD90

+ ΚΕΠ. Με ανοσοϊστοχημική χρώση, GPC3 ανιχνεύθηκε στην πλειονότητα των ιστών του ήπατος όγκου, αλλά απουσιάζει σε παρακείμενες μη ογκογόνους ιστούς. Είναι ενδιαφέρον ότι, το επίπεδο έκφρασης του GPC3 συσχετίστηκε θετικά με τον αριθμό των CD90

+ ΚΕΠ σε ιστούς ήπατος όγκου. Περαιτέρω έρευνα με κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι GPC3 ήταν εντυπωσιακά εκφράζεται σε CD90

+ ΚΕΠ σε δείγματα ανθρώπινου ήπατος όγκου. Με βάση τις τρέχουσες ευρήματά μας, ανεξάρτητα από διφορούμενη ρόλους της GPC3 σε καρκίνο του ήπατος βλαστικά κύτταρα, GPC3 μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη γονίδιο στόχος για HCC ανοσοθεραπεία λόγω ειδικότητα της επί των καρκίνο του ήπατος βλαστικά κύτταρα, και η απουσία του σε φυσιολογικό ήπαρ βλαστικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και τη συλλογή δειγμάτων

Όλοι οι ασθενείς υπέγραψαν μια γραπτή συγκατάθεση, και τα δεδομένα και τα δείγματα αναλύθηκαν ανώνυμα. Η παρούσα μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ. Συνολικά 15 ασθενείς είχαν προσληφθεί για RNA-αλληλουχίας και επικύρωση σε αυτή τη μελέτη (Πίνακας 1). Η μέση ηλικία αυτών των ασθενών ήταν 57. Υπήρχαν 14 άνδρες και 1 γυναίκα. Δεκατρείς από τους ασθενείς αυτούς ήταν θετικοί για ηπατίτιδα ορού επιφανειακό αντιγόνο Β και 1 για αντισώματα ηπατίτιδας C. Ογδόντα επτά τοις εκατό των ασθενών αυτών παρουσιάζεται στο όγκο-κόμβο-μετάσταση (TNM) στάδιο III ή IV με ένα μέσο μέγεθος όγκου του 9,3 εκατοστά. Οι τρεις ασθενείς HCC των οποίων τα δείγματα μελετήθηκαν από την RNA-Seq ήταν άνδρες, ηλικίας από 55 έως 61. Όλοι ήταν ηπατίτιδας φορείς του ιού Β. Δύο είχαν το στάδιο TNM καρκίνο ΙΙΙ και ένας είχε ΤΝΜ στάδιο καρκίνου II. Παθολογική διάγνωση έγινε σύμφωνα με την ιστολογία του όγκου δειγμάτων που εξετάστηκαν από έμπειρους παθολόγους.

Η

Tumor και παράλληλες μη ογκογόνους ιστούς ήπατος συλλέχθηκαν κατά τη στιγμή της λειτουργίας. Η διαδικασία απομόνωσης των κυττάρων από ιστούς του ήπατος διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως με ορισμένες τροποποιήσεις [9]. Εν συντομία, μετά από πέψη με 100 μονάδες /ml κολλαγενάση τύπου IV (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA) για 30 λεπτά στους 37 ° C, οι ιστοί κιμάς και κυτταρικό εναιώρημα διήλθε διαμέσου ενός νάιλον πλέγματος 100 μm για να απομακρυνθεί συντρίμμια ιστού. Ερυθρά αιμοσφαίρια (RBC) στη συνέχεια λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RBC και το κυτταρικό εναιώρημα πλύθηκε και πάλι, τελικά πέρασε μέσα από ένα νάιλον πλέγμα 40 μm. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα και HetaSep (Stem Technology Cell, Vancouver, BC, Canada) προστέθηκε στη συνέχεια στο κυτταρικό εναιώρημα για την αφαίρεση των εναπομεινάντων θραυσμάτων. Μετά την απομάκρυνση νεκρών κυττάρων, τα κύτταρα τελικά επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό χρώσης (2% BSA, 2 mM EDTA σε PBS), μετρήθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και κυτταρική διαλογή. Τα κύτταρα επίσης ταξινομημένο σε γυάλινο πλακίδιο, αντίθετα με DAPI και εξετάστηκαν κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού.

Οι κυτταρικές σειρές

κυτταρικές σειρές

PLC και MHCC97L [9] διατηρήθηκαν ως μονοστρωματική καλλιέργεια σε υψηλά γλυκόζης ϋΜΕΜ με 10 % εμβρυϊκό ορό βοοειδούς και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 σε αέρα.

ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) για CD90 + κύτταρα

Τα απομονωμένα κύτταρα από καρκινικά και μη καρκινικών ιστών σημάνθηκαν με ΡΕ-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο CD90 και APC-συζευγμένα αντισώματα αντι-ανθρώπινης CD45 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA). Στη συνέχεια, CD45

-CD90

+ κύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα διαχωριστή κυττάρων BD FACSAria II (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA). Ένα κλάσμα του CD90

+ κύτταρα ελέγχθηκαν για καθαρότητα. Τα απομονωμένα κύτταρα περαιτέρω σε επεξεργασία με RNA ™ αντιδραστήριο ασφαλέστερα σταθεροποίηση RNA (SABiosciences, Frederick, MA, USA) και τα σφαιρίδια του κυττάρου φυλάχθηκαν στους -80 ° C για μετέπειτα απομόνωση RNA.

ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων HCC γραμμές και ανθρώπινους ιστούς ήπατος όγκου για GPC3 και CD90

Αρχικά βιώσιμος PLC και MHCC97L κύτταρα και βιώσιμα κύτταρα από ιστούς ανθρώπινου ήπατος όγκου μετά την πέψη διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας Sytox Blue (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, στη συνέχεια τα κύτταρα σταθερές και διαπερατά με το κιτ στερέωσης /διαπερατότητας (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Μετά την πλύση, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ένα ΡΕ-συζευγμένα αντι-CD90 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) και ένα αντι-GPC3 αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) επισημασμένο με Alexa Fluor Zenon® ® 488 ποντικιού IgG 1 Labeling Kit (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Μετά την επώαση και πλύση, τα χρωματισμένα κύτταρα ανιχνεύθηκαν και μετρήθηκαν με ένα BD FACSAria II (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Κατάλληλα ισότυποι χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

απομόνωση του RNA και την ενίσχυση του RNA

Το ολικό κυτταρικό RNA εκχυλίσθηκε από το απομονωμένο CD45

-CD90

σφαιρίδιο κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα RNAqueous-Micro RNA + κιτ απομόνωσης (Ambion, Austin, TX, USA). Τα δείγματα RNA (-50 ng) στη συνέχεια ενισχύθηκαν με ένα κιτ MessageAmp II aRNA Amplification (Ambion) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, ένα δίκλωνο cDNA συντέθηκε με αντίστροφη μεταγραφή από το RNA με έναν εκκινητή Τ7 υποκινητή. Μετά τον καθαρισμό, το δίκλωνο cDNA ενήργησε ως πρόπλασμα για την in vitro μεταγραφή για την παραγωγή πολλαπλών αντιγράφων του ενισχυμένου RNA (aRNA). Μετά την ενίσχυση του RNA, το aRNA υποβλήθηκε σε ένα δεύτερο γύρο ενισχύσεως με την ίδια μεθοδολογία με την πρώτη ενίσχυση εκτός χρησιμοποιώντας ένα διαφορετικό εκκινητή που παρέχονται από τον κατασκευαστή. Ένας έλεγχος Hela RNA επίσης τρέχουν παράλληλα με τα δείγματα RNA κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ενισχύσεως. Μετά την ολοκλήρωση της ενίσχυσης, η συγκέντρωση του aRNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Nanodrop ND-1000 και την ποιότητα του aRNA αναλύθηκε με την Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

παρασκευή βιβλιοθήκης RNA και αλληλουχίας

RNA-βιβλιοθήκη προετοιμασία πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Εν συντομία, η πολυ-Α που περιέχει Arnas καθαρίστηκαν, που ακολουθείται από τον κατακερματισμό του RNA σε μικρά κομμάτια. Διασπασμένων θραυσμάτων RNA συντέθηκαν σε μονόκλωνης cDNA χρησιμοποιώντας Superscript II αντίστροφη μεταγραφάση (Invitrogen) και τυχαία εξα-εκκινητές (IDT, Coralville, Iowa, USA), που ακολουθείται από δεύτερη σύνθεση κλώνου με DNA πολυμεράση Ι (Invitrogen) και E. coli RNase Η (Invitrogen). Μετά τη δεύτερη σύνθεση κλώνου, με άκρο επισκευή και Α-ουράς, οι συντίθεται δίκλωνο cDNA θραύσματα υποβλήθηκαν σε καθαρισμό, στη συνέχεια συνδέθηκε προς προσαρμογείς Illumina χρησιμοποιώντας κιτ Quick TM απολίνωση (ΝΕΒ) και DNA λιγάση. Οι βιβλιοθήκες cDNA προσαρμογέας τροποποιημένου προκύπτον cDNA κλασματοποιήθηκαν επί γέλης αγαρόζης, 200-bp θραύσματα αποκόπηκαν και ενισχύθηκαν με 15 κύκλους της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Μετά τον καθαρισμό, η ποιότητα των βιβλιοθηκών cDNA ελέγχθηκε με Bioanalyzer 2100 (Agilent). Η συγκέντρωση των βιβλιοθηκών cDNA μετρήθηκε και αραιώθηκε στα 10 ηΜ σε ρυθμιστικό Tris-HCl πριν να συγκεντρώνονται γενιά. Cluster σχηματισμός, ο υβριδισμός εκκινητή και αντιδράσεις αλληλουχίας διεξήχθησαν διαδοχικά σύμφωνα με το συνιστώμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ζεύγος τέλος αλληλουχίας από Illumina Genome Analyzer II (Illumina, San Diego, CA, USA) με 76 κύκλους. Μία λωρίδα κελί ροής χρησιμοποιήθηκε για κάθε δείγμα. Πρώτες σύντομο θραύσματα ακολουθίας έγιναν δεκτές εφόσον περάσει τις παραμέτρους φιλτραρίσματος ποιότητας που χρησιμοποιούνται στο στάδιο της Illumina GA Pipeline GERALD.

Διαβάστε έκφραση χαρτογράφηση και τη γονιδιακή

Υψηλής ποιότητας διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν με το γονιδίωμα αναφοράς του ανθρώπου (NCBI Build 36.1) χρησιμοποιώντας το λογισμικό NextGENe® (Softgenetics, State College, PA, USA). Η αντιστοίχιση διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν με το mRNA του Ανθρώπου REFSEQ (NCBI). Διαβάζει μικρότερη από 20 bps και εκείνοι με την ποιότητα σκοράρει λιγότερο από 14 εξαιρέθηκαν. Οι αλληλουχίες ευθυγραμμίζονται με την ατομική μεταγραφής μετρήθηκαν ψηφιακά. Τα επίπεδα έκφρασης για κάθε γονίδιο κανονικοποιήθηκαν σε διαβάζει ανά kilobase μοντέλου εξονίου ανά εκατομμύριο χαρτογραφηθεί διαβάζει (RPKM) για να διευκολυνθεί η σύγκριση των μεταγραφών μεταξύ δειγμάτων. ΤΟΡΗΑΤ C λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό παραλλαγών ματίσματος του κάθε δείγματος [17].

RNA-Seq εξόρυξης δεδομένων και τον καθορισμό των γονιδίων mis-ρυθμίζονται σε όλη τους ασθενείς

Μια μεγάλη βάση δεδομένων που περιέχει όλες τις μεταγραφές γονίδιο που προσδιορίζονται από RNA-Seq για τα δείγματα του CD90

+ κυττάρων από ζεύγη όγκου και μη ογκογόνους ιστούς του 3 ασθενείς είχαν συναρμολογηθεί. Μια μέση λογαριθμική

2 φορές αλλαγή [RPKM του CD90

+ ΚΕΠ /RPKM του CD90

+ NTSCs] του κάθε γονιδίου υπολογίστηκε σε όλες τις 3 ασθενείς. Το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR, δηλαδή μία πιθανότητα κακώς αποδοχή διαφορά μεταξύ αυτών των δύο δοκιμαστεί CD90

+ κυττάρων ομάδες) του κάθε γονιδίου προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο Storey του [18]. Τα γονίδια θεωρήθηκαν ως εκφράζονται διαφορικά όταν FDRs τους ήταν μικρότερη από 0,05. Περαιτέρω, τα γονίδια είχαν ταξινομηθεί ως up-ρυθμίζεται κατά μέσο καταγραφής τους

2 αναλογία αλλαγή φορές ήταν μεγαλύτερο από 1 ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται όταν καταγραφής τους

2 αναλογία αλλαγή φορές ήταν λιγότερο από -1.

Fluidigm microfluidic τσιπ για qRT-PCR

για να επικυρώσετε την αξιοπιστία του RNA-Seq δεδομένων, αρχικά πραγματοποιήσαμε qRT-PCR χρησιμοποιώντας τα ίδια υλικά ενισχυμένα RNA ως εσωτερική επικύρωση, ακολουθούμενη από την αρχική, μη ενισχυμένο RNA από ένα ανεξάρτητη ομάδα ασθενών HCC ως υποψήφιο επικύρωσης. BioMark® Real-Time PCR System 48,48 Δυναμική Array (Fluidigm, South San Francisco, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση της qRT-PCR σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή.

EvaGreen και αναλύσεις TaqMan έγιναν σύμφωνα με το τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Οι εκκινητές των επιλεγμένων γονιδίων σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer 3 λογισμικό (Πίνακας S1). TaqMan Οικουμενική Master Mix, TaqMan προενισχυτή Master Mix και ανιχνευτές αγοράστηκαν από την Applied Biosystems (ΑΒΙ, Foster City, CA, USA). Τα δείγματα έτρεξαν τουλάχιστον εις διπλούν. Το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου ομαλοποιήθηκε με αφαίρεση του κατωφλίου κύκλου (Ct) ενός αφθόνως εκφρασμένο γονίδιο ελέγχου από την Ct για κάθε επιλεγμένο γονίδιο ενδιαφέροντος. Σχετική τιμές γονιδιακής έκφρασης εκφράζονται ως φορές μεταβολής ήταν στη συνέχεια προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας την 2

-ΔΔCT μέθοδο. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο ελέγχου αναφοράς και του CD90

+ NTSCs ελήφθησαν ως δείγματα αναφοράς. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την έκδοση BioMark Real-Time PCR Λογισμικό Ανάλυσης 2 (Fluidigm).

Η ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης του GPC3 πραγματοποιήθηκε με Fluidigm Digital Array. Η δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού BioMark Digital PCR ανάλυση (Fluidigm).

Ποσοτικοποίηση των CD90

+ κύτταρα σε δείγματα ανθρώπινου όγκου ήπατος με κυτταρομετρία ροής

Tumor και παράλληλες μη ογκογόνους ιστούς ήπατος λήφθηκαν από άλλα σαράντα δύο ασθενείς HCC κατά τη στιγμή της ηπατεκτομή. Ένα τμήμα του κάθε εκτομή ιστών μονιμοποιήθηκε σε 10% φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Το υπόλοιπο τμήμα υπέστη τις ίδιες διαδικασίες του FACS για

+ κύτταρα CD90 όπως περιγράφεται ανωτέρω και ο αριθμός των CD90

+ κύτταρα αναλύθηκαν και ποσοτικά με BD κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems).

Η ανοσοϊστοχημική χρώση της GPC3 σε δείγματα όγκων ανθρώπινου ήπατος

Τα ενσωματωμένα ιστοί κόπηκαν σε 5-μm πάχους τομές για ανοσοϊστοχημική χρώση της GPC3. Οι τομές αρχικά αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν μέσω αιθανόλης σε νερό. Οι τομές στη συνέχεια σε επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% σε μεθανόλη για 20 λεπτά για την κατάργηση ενδογενής δράση υπεροξειδάσης. Για ανάκτηση αντιγόνου, οι τομές θερμάνθηκαν σε 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6,0) με χύτρα ταχύτητας για 5 λεπτά στους 120 ° C. Οι τομές στη συνέχεια καλύπτεται με μία αραίωση 1:1000 του μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού αντι-GPC3 σε PBS (Santa Cruz Biotechnology, California, USA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με TBS-Tween 20, οι τομές επωάστηκαν με Envision υπεροξειδάσης Polymer-horseradish (DakoCytomation, Carpenteria, CA, USA), το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύον αντίσωμα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το σήμα χρώμα για GPC3 κάθε τμήματος αναπτύχθηκε με την προσθήκη 3, 3 τετραϋδροχλωρική διαμινοβενζιδένιο (DakoCytomation), ακολουθούμενο από λεπτά επώαση 2. Τέλος, οι τομές πλύθηκαν με απεσταγμένο νερό και επιχρωματίστηκαν για πυρήνες με 10% αιματοξυλίνη και αφυδατωμένα. Η ανάλυση της ανοσοϊστοχημείας πραγματοποιήθηκε από ανεξάρτητους ερευνητές. Η έκφραση της GPC3 εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα «βαθμολογία H», το οποίο ελήφθη από τον ακόλουθο τύπο:.

3X ποσοστό ισχυρή χρώση + 2Χ ποσοστό μέτρια χρώση + ποσοστό του ασθενή χρώση [19]

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) επιμόλυνση in vitro

ένα ειδικό GPC3-siRNA και μια ομελέτα ελέγχου siRNA (ΕΣΕ) αγοράστηκαν από την Ambion (Austin, TX). CD90

+ + κύτταρα GPC3

είχαν ταξινομηθεί από τα κύτταρα PLC για τα επόμενα λειτουργικές δοκιμασίες, όπως τα κύτταρα PLC εκφράζουν σχετικά υψηλά CD90 και GPC3. GPC3 knockdown επιτεύχθηκε με επιμόλυνση siRNA ολίγο στα ταξινομημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας την αντίστροφη επιμόλυνση με αντιδραστήριο Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σε μια τελική συγκέντρωση 20 ηΜ siRNA. Αυτά τα επιμολυσμένα κύτταρα πλέον περιγράφονται ως PLC CD90

+ GPC3

+ (GPC3-). Παράλληλα, PLC CD90

+ GPC3

+ κύτταρα επιμολυσμένα με το ανακατωμένο έλεγχο siRNA σε τελική συγκέντρωση των 20 nm, η οποία είναι πλέον περιγράφονται ως PLC CD90

+ GPC3

+

( SSC).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων Δοκιμασία

PLC CD90

+ GPC3

+ (GPC3-) και CD90

+ GPC3

+

(ΕΣΕ) κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα 96-φρεατίων σε πυκνότητα 4000 κυττάρων /φρεάτιο σε ϋΜΕΜ /10% FBS. Στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία, 10 ul του WST-1 αντιδραστηρίου (Roche Applied Science, Madison, WI, USA) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο που περιέχει 100 μΐ μέσου. Η πλάκα επωάστηκε για 2 ώρες, ακολουθούμενο με 1 λεπτά με τα πόδια ανακίνηση. Η ανάπτυξη των κυττάρων εκτιμήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm χρησιμοποιώντας ένα αναγνώστη μικροπλάκας (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) την ημέρα 1, 2, 3 και 4. Κάθε δείγμα εις τριπλούν και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Stem αποικίας κυττάρου δοκιμασία σχηματισμού

Κλωνογόνος ικανότητα των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου εκτιμήθηκε με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας βλαστικών κυττάρων. Το CD90

+ + κύτταρα GPC3

απομονώθηκαν από κύτταρα PLC, που ακολουθείται από επιμόλυνση με GPC3 siRNA και κωδικοποιημένα ελέγχου siRNA, αντιστοίχως. Το CD90

+ GPC3

+ (GPC3-) και CD90

+ GPC3

+

(ΕΣΕ) σπάρθηκαν σε μέσα άγαρ ημιστερεά χρησιμοποιώντας StemTAG TM 96 και βλαστικών κυττάρων αποικία κιτ δοκιμασίας σχηματισμού (Cell Biolabs, Inc. San Diego, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 50 μΐ βάση άγαρ Matrix Layer διανεμήθηκε σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων και στερεοποιήθηκε στους 4 ° C. Εβδομήντα-πέντε μΐ του κυτταρικού εναιωρήματος αναστολή /άγαρ μήτρα που περιέχει 5000 κύτταρα διανεμήθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά τη στερεοποίηση, 50 μΐ μέσου καλλιέργειας με αυξητικούς παράγοντες προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν για 8 μέρα στο υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 ° C με 5% CO

2. Η ικανότητα σχηματισμού αποικιών εξετάστηκε κάτω από μικροσκόπιο, και τα αποτελέσματα στη συνέχεια προσδιορίστηκε με ποσοτικό προσδιορισμό δραστικότητας της αλκαλικής φωσφατάσης μετά την λύση των κυττάρων.

Στατιστική ανάλυση

Οι συνεχείς μεταβλητές εκφράσθηκαν ως μέση τιμή ± SD ή διάμεση . Συγκρίσεις της πτυχής αλλαγή των γονιδίων και παραλλαγών ματίσματος μεταξύ των δύο ομάδων έγιναν με t-test του Student. Συσχέτιση μεταξύ μετριέται γονιδίων μεταξύ RNA-Seq και qRT-PCR μετρήθηκε με Spearman συντελεστής συσχέτισης βαθμού. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Ένα

P

τιμή μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Απομόνωση του CD90

+ κυττάρων από δείγματα όγκου και μη όγκου

Τόσο αντι-ανθρώπινα CD90 και αντισώματα αντι-ανθρώπινο CD45 χρησιμοποιήθηκαν στις διαδικασίες απομόνωσης. Όπως CD90 έχει επίσης εκφραστεί από ορισμένους λεμφοκύτταρα, σε συνδυασμό CD45

-CD90

+ χρησιμοποιήθηκε για να καθορίσει nonlymphatic CD90

+ κύτταρα στο ήπαρ ιστούς του ασθενούς (Εικόνα S1). Το BD διαλογέα κυττάρων ταξινομημένο CD90

+ κυττάρων με μέση καθαρότητα 86,6%. Ένας μέσος αριθμός των 3.4 × 10

4 CD90

+ ΚΕΠ από ιστούς όγκων και 8,9 × 10

3 κύτταρα CD90

+ NTSCs από μη ογκογόνους ιστούς ελήφθησαν. Ο αριθμός των CD90

+ ΚΕΠ ήταν σημαντικά υψηλότερο από εκείνο των CD90

+ NTSCs (

P

= 0,0008). Τα ταξινομημένα + κύτταρα CD90

επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με χρώση ανοσοφθορισμού πριν την εκχύλιση RNA.

εκχύλιση RNA και ενίσχυση

Η απόδοση του RNA από το ταξινομημένο CD90

+ κυττάρων κυμαίνονταν από 12 ng έως 200 ng (από 10

3 έως 10

4 κύτταρα). Λόγω της ανεπαρκούς ποσότητας του RNA για RNA-Seq, δύο γύροι ενισχύσεως RNA πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις διαδικασίες του κατασκευαστή. Μετά την ενίσχυση, ελήφθη ένας μέσος όρος 114 μg του ενισχυμένου RNA (aRNA). Τα μεγέθη ήταν της τάξεως των 200-2000 νουκλεοτίδια, με την πλειοψηφία να είναι περίπου 500, η ​​οποία είναι σε συμφωνία με τις προδιαγραφές των μεγεθών του aRNA δηλώνεται από τον κατασκευαστή, υποδεικνύοντας ότι τα δείγματα aRNA ήταν σε καλή ποιότητα.

Όσον αφορά την προκατάληψη ενισχύσεως RNA στο RNA-Seq τεχνολογία, δεν υπάρχουν στοιχεία σύγκρισης έχει βρεθεί ποτέ στη βιβλιογραφία ακόμη. Παρ ‘όλα αυτά, έχει αποδειχθεί ότι ένα ή δύο γύρους ενισχύσεως RNA που παράγεται αναπαραγώγιμα δεδομένα μικροσυστοιχιών χωρίς σημαντική απώλεια της ανίχνευσης γονιδίου [20]. Επιπλέον, μια μελέτη έδειξε ότι το 75% περισσότερα γονίδια ανιχνεύτηκαν με αλληλούχηση mRNA σε σύγκριση με μικροσυστοιχιών μετά την ενίσχυση του cDNA σε ένα μόνο κύτταρο [21]. Ως εκ τούτου, πιστεύαμε ότι η παραγόμενη Arnas θα μπορούσε επίσης να χρησιμοποιηθεί για την RNA-Seq.

Sequencing μέσω σύνθεσης των ενισχυμένων RNA που απομονώθηκε από CD90

+ ΚΕΠ και CD90

+ NTSCs επί Illumina Genome Analyzer II

Τα ενισχυμένα RNAs μετά την κατασκευή μίας βιβλιοθήκης cDNA υποβλήθηκαν σε RNA-Seq επί Illumina Genome Analyzer II (ζεύγος-end αλληλούχιση). Με την ολοκλήρωση, 14.900.000 – 20.500.000 75-bp μακρά ακολουθία διαβάζει ανά δείγμα παρήχθησαν, και αντιστοιχεί σε ένα μέσο όρο 1,30 δεδομένων πρώτων ακολουθία Gb. Ευθυγράμμιση με mRNA αλληλουχία αναφοράς (NCBI) ήταν 39,4 ± 7% με μεγαλύτερη μερίδα αναγνώσεις ευθυγραμμισμένες με την ανθρώπινη αναφοράς γονιδιώματος (70.3 ± 8%) (Πίνακας 2), υποδηλώνοντας ότι οι μη ευθυγραμμισμένων αλληλουχιών προς REFSEQ ήταν πιθανώς λόγω ατελούς σχολιασμό του ισομορφές mRNA σε Homo sapiens [22], [23]. Άλλες αιτίες μπορεί να αποδοθεί στην προέλευσή τους έξω από το ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς ή χαμηλής ποιότητας ακολουθία [24]. Παρ ‘όλα αυτά, ο μέσος αριθμός των αντιγράφων ανιχνεύονται σε CD90

+ ΚΕΠ και CD90

+ NTSCs ήταν 31.407 ± 2.202 και 31.444 ± 479, αντίστοιχα, τα οποία αντιστοιχούσαν σε περίπου 74% των REFSEQ μεταγραφές καταχωρήσεις του Ανθρώπου. Επειδή δεν υπάρχει σημαντική διαφορά στον αριθμό των μεταγραφών βρέθηκε μεταξύ των δύο τύπων CD90

+ κύτταρα, η σύγκριση γονίδιο θεωρήθηκε να είναι έγκυρη (

P

= 0,7).

Η

Εναλλακτικός πρόδρομο RNA (pre-mRNA) μάτισμα παίζει σημαντικούς ρόλους στην δημιουργία λειτουργικής ποικιλομορφίας του γονιδιώματος. Συσσωρευμένα στοιχεία έχουν αποκαλύψει ότι έκτροπου ματίσματος συμβάλλει στην νεοπλασία, την εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση [25] – [27]. γεγονότα ματίσματος συμπεριλαμβανομένων των εναλλακτικών ‘ή 5’ θέση ματίσματος 3, εναλλακτικές πρώτο εξόνιο, εναλλακτική τελευταίο εξόνιο, κατακράτηση ιντρονίου και εξονίου παρακάμπτοντας συγκρίθηκαν μεταξύ CD90

+ ΚΕΠ και CD90

+ NTSCs (Πίνακας 3). Οι μέσες αριθμούς εναλλακτικό μάτισμα του CD90

+ ΚΕΠ βρέθηκαν να είναι 383, ενώ εκείνες των CD90

+ NTSCs ήταν 245 (

P

& lt? 0,05). Περισσότερα δομικές παραλλαγές βρέθηκαν σε CD90

+ ΚΕΠ σε σύγκριση με CD90

+ NTSCs, υποδεικνύοντας ότι περισσότερο ρυθμιστικό και λειτουργική ποικιλομορφία των transcriptomes συνέβη στο ΚΕΠ του ήπατος.

Η

Η κατανομή των αντιγράφων σε CD90

+ ΚΕΠ και CD90

+ NTSCs εμφάνισαν παρόμοια μοτίβα (Σχήμα 1). Παρατηρήσαμε ότι το 80% των μεταγραφών είχαν λιγότερο από 10 RPKM στο CD90

+ ΚΕΠ ή CD90

+ NTSCs, αλλά μόνο περίπου 0,1% των εκφρασμένων μεταγραφές είχαν περισσότερες από 1000 RPKM. Αυτό συνεπάγεται ότι η πλειοψηφία των μεταγραφών εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα και δεν θα μπορούσε να προσδιοριστεί εύκολα από τον μικροσυστοιχιών cDNA. Ένα παρόμοιο πρότυπο κατανομής μεταγραφής βρέθηκε στη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης σε γλοιοβλάστωμα χρησιμοποιώντας την τεχνολογία αλληλούχισης επόμενης γενιάς [28]. Αυτό αποδεικνύει και πάλι υψηλή ευαισθησία του ΚΝΑ-Seq στην ανίχνευση ταπεινός εκφράζονται μεταγραφές σε καρκινικά κύτταρα [29]

άξονας Υ, ο αριθμός των διαβάζει.? Χ-άξονα, κάδους των επιπέδων έκφρασης (κάδοι σε & lt? 5 RPKM, 5-10 RPKM, 11-100 RPKM, 100-1000 RPKM και & gt? 1000 RPKM). Η πλειονότητα των μεταγραφών εκφράστηκαν σε χαμηλά επίπεδα (& lt? 5 RPKM). RPKM, διαβάζει ανά kilobase ανά εκατομμύριο διαβάζει.

Η

Ανάλυση του προφίλ γονιδιακής έκφρασης του CD90

+ ΚΕΠ και CD90

+ NTSCs

Μετά την αφαίρεση των διπλών γονιδίων μετά ευθυγραμμίζοντας μεταγραφές για το Ανθρώπινο RNA αλληλουχία αναφοράς, αναλύθηκαν τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης του 24609 γονίδια. Πεντακόσια γονίδια εκφράζονται διαφορικά, μεταξύ των οποίων ήταν επάνω ρυθμισμένα 119 γονίδια, και 381 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω.

Στις προηγούμενες και παρούσες μελέτες, χρησιμοποιήσαμε αντι-ανθρώπινο αντίσωμα CD90 για την απομόνωση CD90

+ ΚΕΠ και CD90

+ NTSCs από ιστούς όγκων του ασθενούς, διότι CD90 είναι ένας δείκτης επιφάνεια για ηπατική βλαστικά κύτταρα (ωοειδή κύτταρα) [30]. Αυτές οι δύο ομάδες κυττάρων παρουσίασαν παρόμοιες ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων, όπως αντανακλάται από τα γονίδια που εμπλέκονται στην pluripotency και διαφοροποίηση (Πίνακας 4) εκφράζει σε παρόμοια επίπεδα, γεγονός που υποδηλώνει την καταγωγή τους από τα ηπατικά βλαστοκύτταρα.

Η

γονίδια καθαριότητας εκφράστηκαν σε συγκρίσιμα επίπεδα CD90

+ ΚΕΠ και CD90

+ NTSCs, υποδεικνύοντας ότι οι αλλαγές έκφραση άλλων γονιδίων θα μπορούσε λογικά να συγκριθούν μεταξύ αυτών των δύο ομάδων (Πίνακας 4).

Εκπρόσωπος χαρακτηριστικά διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε CD90

+ ΚΕΠ και CD90

+ NTSCs συνοψίστηκαν (Πίνακας 5, up-ρυθμίζονται και στον πίνακα 6, κάτω-ρύθμιση). Τα ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια που σχετίζονται με βιολογικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της μεταφοράς των ναρκωτικών (ABCC5), του μεταβολισμού των λιπιδίων (APOE, APOC1), την αγγειογένεση (COL15A1, Plau, PLVAP), τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (ESM-1, FGL1, GPC3, ΙΟΡΒΡ5), των μεταφορών ( AMBP), οξεία φλεγμονώδη απόκριση (ΑΡΟΑ2, ORM1), η παραγωγή κυτοκίνης (FABP4), κυτταρικού κύκλου (PLK2), μεταγωγή σήματος (RAP2A), και η ενεργοποίηση του ΜΑΡΚ /ΕΚΚ μονοπάτι (CXCR4). Down-ρυθμιζόμενων γονιδίων που εμπλέκονται σε διάφορες βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης οργάνων (ADAMTS1, ALDH1A2), απάντηση στην υποξία (ANGPTL4, EDN1, SOCS3, VEGFA), νουκλεοτίδιο δεσμευτική (ATP2A3, RAN, RPLP2), η δραστηριότητα επιμήκυνσης μετάφρασης (EEF1D), και χημειοταξία (IL8, CXCL1).

η

Επικύρωση της RNA-Seq δεδομένων από qRT-PCR

Για να επαληθεύσετε τα στοιχεία του RNA-Seq, τα αρχικά έξι ενισχυμένα δείγματα RNA που χρησιμοποιείται για RNA-Seq ελέγχθηκαν και πάλι με qRT-PCR σε ένα πάνελ από 47 απόκλιση εκφρασμένων γονιδίων. Επιλεγμένα γονίδια περιλαμβάνονται 28 up-ρυθμιζόμενα γονίδια και 19 κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια. Log αλλαγή

2 φορές γονιδίων qRT-PCR συγκρίθηκε με εκείνη του RNA-Seq. Αυτές οι δύο πλατφόρμες ανάλυση γονιδιακής έκφρασης αποδεικνύεται σύμφωνη αποτελέσματα (Spearman Rank Correlation = 0,88,

P

& lt? 0,001? Σχήμα 2). Επιπλέον, η κλίση της γραμμής παλινδρόμησης ήταν 0,73, γεγονός που υποδηλώνει ότι το RNA-Seq είχε μια παρόμοια δυναμική περιοχή ανίχνευσης με εκείνη του qRT-PCR, και ως εκ τούτου η μέθοδος RNA-Seq μας θα μπορούσε αξιόπιστα μετρήσει τις διαφορές έκφρασης γονιδίου, ιδιαίτερα για εκείνα τα ταπεινούς εκφράζονται γονίδια στο CD90

+ ΚΕΠ και CD90

+ NTSCs

η συσχέτιση μεταξύ qRT-PCR και RNA-Seq δεδομένων των 47 επιλεγμένων γονιδίων:. 28 έως ρυθμιζόμενα γονίδια και 19 κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια σε 3 ζεύγη ενισχυμένα δείγματα RNA. Spearman Συντελεστές συσχέτισης = 0.88 (

P

& lt? 0.001). Και η κλίση = 0,73

Η

Η επιβεβαίωση της RNA-Seq δεδομένων από qRT-PCR χρησιμοποιώντας δείγματα από μια ανεξάρτητη ομάδα ασθενών

για να εξαλειφθεί η πιθανή προκατάληψη ως αποτέλεσμα της προ-ενίσχυσης και για την περαιτέρω επικύρωση των RNA-Seq αποτελέσματα, qRT-PCR του 27 up-ρυθμιζόμενα γονίδια και 15 κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια διεξήχθη σε 12 ζεύγη δειγμάτων RNA που παρασκευάστηκε από CD90

+ ΚΕΠ και CD90

+ NTSCs προέρχεται από ένα ανεξάρτητο παρτίδα όγκου και παράλληλων μη καρκινικούς ιστούς, αντίστοιχα. Κανένα από αυτά τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ενίσχυση RNA ούτε προσδιορίστηκαν για ανάλυση RNA-Seq.