Αφηρημένο

Το αποτέλεσμα Warburg και η υποξία του όγκου διέπουν μια μοναδική καρκίνο του μεταβολικού φαινοτύπου χαρακτηρίζονται από την εξάρτηση από γλυκόζη και αερόβια ζύμωση. Έχουμε στο παρελθόν έδειξαν ότι δύο μη-τοξικά μεταβολικά θεραπείες – η δίαιτα με ταυτόχρονη υπερβαρικό οξυγόνο (KD + HBOT) και διαιτητικών συμπληρωμάτων κετόνη – θα μπορούσε να αυξήσει τον χρόνο επιβίωσης σε μοντέλο ποντικού VM-Μ3 του μεταστατικού καρκίνου. Υποθέσαμε ότι ο συνδυασμός αυτών θεραπείες θα μπορούσαν να παρέχουν ένα ακόμη μεγαλύτερο θεραπευτικό όφελος σε αυτό το μοντέλο. Οι ποντικοί που έλαβαν τη θεραπεία συνδυασμού έδειξε μια σημαντική μείωση στο ρυθμό ανάπτυξης του όγκου και μεταστάσεις, και έζησε δύο φορές όσο τα ζώα ελέγχου. Για την περαιτέρω κατανόηση των επιπτώσεων αυτών των μεταβολικών θεραπειών, που χαρακτηρίζεται τα αποτελέσματα της υψηλής γλυκόζης (έλεγχος), χαμηλά επίπεδα γλυκόζης (LG), συμπληρώματα κετόνη (βHB), υπερβαρικό οξυγόνο (HBOT), ή θεραπεία συνδυασμού (LG + βHB + HBOT) για κύτταρα VM-Μ3. Μεμονωμένα και συνδυασμένα, αυτές οι μεταβολικές θεραπείες μειώθηκε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό VM-Μ3 κυττάρων και τη βιωσιμότητα. HBOT, μόνος του ή σε συνδυασμό με LG και βHB, αυξημένη παραγωγή ROS στα κύτταρα VM-Μ3. Αυτή η μελέτη υποστηρίζει σθεναρά την περαιτέρω έρευνα σε αυτό το μεταβολικό θεραπεία ως μια πιθανή μη τοξική θεραπεία για τον καρκίνο του μεταστατικού προχωρημένου σταδίου

Παράθεση:. Εντολή poff AM, Ward Ν, Seyfried TN, Arnold P, D’Agostino DP (2015 ) μη Τοξικό διαχείρισης Μεταβολική του μεταστατικού καρκίνου σε VM Ποντίκια: Μυθιστόρημα Συνδυασμός δίαιτα, κετονών συμπλήρωση και θεραπεία υπερβαρικού οξυγόνου. PLoS ONE 10 (6): e0127407. doi: 10.1371 /journal.pone.0127407

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Ντχιάνι Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 4 Ιούνη 2014? Αποδεκτές: 14 του Απριλίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 10 Ιουνίου του 2015

Copyright: © 2015 εντολή poff et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Ευρεσιτεχνίας 12B152PRWO? Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα? DP D’Agostino, A. εντολή poff Π Arnold, «Στόχευση του καρκίνου με μεταβολικές θεραπεία και υπερβαρικό οξυγόνο.» Π Arnold (Savind Inc.) έχει λάβει οικονομική υποστήριξη (Π.Ε.Ο. N000140910244) από την Δ D’Agostino (USF) για να συνθέσει εστέρες κετονών. Οι υπόλοιποι συγγραφείς δεν έχουν σύγκρουση συμφερόντων. η χρηματοδότηση για το έργο αυτό υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια φιλανθρωπική συνεισφορά Scivation, Inc .; ωστόσο, η εταιρεία δεν επηρέασε το σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων, την ανάλυση ή την ερμηνεία των αποτελεσμάτων . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Ευρεσιτεχνίας 12B152PRWO? Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα? DP D’Agostino, A. εντολή poff , Π Arnold, «Στόχευση του καρκίνου με μεταβολικές θεραπεία και υπερβαρικό οξυγόνο.» Π Arnold (Savind Inc.) έχει λάβει οικονομική υποστήριξη (Π.Ε.Ο. N000140910244) από την Δ D’Agostino (USF) για να συνθέσει εστέρες κετονών. Οι υπόλοιποι συγγραφείς δεν έχουν σύγκρουση συμφερόντων. Συγγραφέας (Π Arnold) συνεργασίες με Savind Inc. και χρηματοδοτική στήριξη από Scivation, Inc. δεν μεταβάλλει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνοι παρουσιάζουν μια απορρυθμισμένη μεταβολική φαινότυπο που χαρακτηρίζεται από το γαλακτικό ζύμωση σε παρουσία οξυγόνου, ένα φαινόμενο γνωστό ως αποτέλεσμα Warburg [1]. Το ενδιαφέρον για το μεταβολισμό του καρκίνου έχει αυξηθεί κατά την τελευταία δεκαετία, με ερευνητές προτείνουν πολλές αιτίες και τις συνέπειες του φαινομένου του Warburg, και τη διερεύνηση νέων θεραπευτικών στρατηγικών για την [1-5] εκμεταλλευτούν. Γλυκόζης εξάρτηση και παραγωγή γαλακτικού οξέος, δύο βασικά χαρακτηριστικά του φαινομένου Warburg, συσχετίζονται έντονα με την επιθετική ικανότητα και επεμβατική δυναμικό [3, 4, 6, 7]. Μετάσταση, ή η εξάπλωση κυττάρων όγκου από μία πρωτογενή θέση να άπω ιστούς, είναι υπεύθυνη για πάνω από το 90 τοις εκατό των θανάτων από καρκίνο σχετίζονται. Δεν υπάρχουν θεραπείες του καρκίνου που διατίθενται σήμερα που μπορεί να διαχειριστεί αποτελεσματικά συστηματική μετάσταση. Από το αποτέλεσμα Warburg είναι μια εξέχουσα φαινότυπο σε μεταστατικά κύτταρα, μεταβολικές θεραπείες που εκμεταλλεύονται αυτό το φαινόμενο μπορεί να προσφέρουν νέες θεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς με επιθετική ή τελικού σταδίου καρκίνων.

Η γλυκόλυσης εξάρτηση που συνδέεται με το φαινόμενο Warburg οδήγησε ερευνητές να διερευνήσουν διαιτητικές θεραπείες οι οποίες μειώνουν τη διαθεσιμότητα γλυκόζης στον όγκο. Η δίαιτα (KD) είναι ένα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά, επαρκής πρωτεΐνη, πολύ χαμηλή σε υδατάνθρακες διατροφή η οποία έχει χρησιμοποιηθεί σε προκλινικές και κλινικές μελέτες για να επιβραδύνει την πρόοδο του καρκίνου [8-21]. Η KD αναγκάζει μια φυσιολογική στροφή προς το μεταβολισμό των λιπών, θες γλυκόζης στο αίμα, καταστέλλοντας την ινσουλίνη, και αυξάνοντας τα επίπεδα κετονών στο αίμα, διεγείροντας κετογένεση από διαιτητικές και το αποθηκευμένο λίπος. Αν και οι αντικαρκινικές επιδράσεις του KD αποδοθεί σε μείωση των γλυκολυτικών υποστρώματα και σηματοδότηση της ινσουλίνης που μεταβολισμό καρκίνο καύσιμα, οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι οι κετόνες έχουν ένα θεραπευτικό δυναμικό των δικών τους σε μεγάλο βαθμό [17, 22, 23]. Ενώ τα υγιή κύτταρα εύκολα να προσαρμοστούν στις κετόνες ως ένα αποτελεσματικό ενεργειακό υπόστρωμα, πολλοί καρκίνοι δεν είναι σε θέση να κάνει αυτή την προσαρμογή [24, 25].

Η έκφραση των ενζύμων αξιοποίηση κετόνη είναι συχνά μειωμένη σε κακοήθεις καρκίνους σε σύγκριση με την κανονική τους ομολόγους ιστών [26, 27]. Πράγματι, αντίθετα σε υγιείς νευρώνες, κετόνες αποτυγχάνουν να διασώσει κύτταρα γλοιώματος από τη γλυκόζη στέρηση που προκαλείται θάνατος [28]. Περιγράψαμε πρόσφατα αυτό το φαινόμενο και διερευνήθηκε η πιθανή χρήση των διατροφικών συμπληρωμάτων κετόνης σε ένα μοντέλο ποντικού του μεταστατικού καρκίνου [22]. Η μελέτη μας έδειξε ότι η εξωγενής συμπλήρωση κετόνη εξασκεί ισχυρές αντικαρκινικές επιδράσεις

in vivo

, ακόμη και όταν χορηγείται με δίαιτα υψηλή σε υδατάνθρακες, με παρόμοια αποτελέσματα επί καρκινικών κυττάρων με την παρουσία υψηλών μέσων γλυκόζης

in vitro

[22].

μεταβολισμό κυτταρικής ενέργειας είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με την κατάσταση οξυγόνωσης των ιστών [29, 30]. Όταν το οξυγόνο είναι άμεσα διαθέσιμη, τα φυσιολογικά κύτταρα να παράγουν μέχρι και 90 τοις εκατό του ΑΤΡ τους με μιτοχονδριακή αναπνοή. Όταν η διαθεσιμότητα του οξυγόνου γίνεται περιορισμένη, όπως στην άσκηση των μυών, τα κύτταρα μετατρέπουν τη χρήση της αναερόβιας ζύμωσης για τη διατήρηση της παραγωγής ATP. Αυτή η μεταβολική διακόπτης διατηρεί κυτταρική λειτουργία και προωθεί την επιβίωση εν όψει της παροδικής υποξίας, και ο μηχανισμός του είναι σε μεγάλο βαθμό οδηγείται από τον παράγοντα μεταγραφής HIF-1 [30, 31]. HIF-1 ενισχύει την έκφραση του πάνω από 60 γονίδια, πολλοί εμπλέκονται στη γλυκόλυση και ζύμωση, την αγγειογένεση, την ανάπτυξη και την επιβίωση [30, 32]. Η παρεκκλίνουσα σηματοδότηση που οδηγεί την αγγειογένεση των όγκων δημιουργεί ανώριμα και διαρροή αιμοφόρα αγγεία τα οποία είναι σε θέση να διαχυθεί επαρκώς το σύνολο του όγκου [33]. Αυτό οδηγεί στο σχηματισμό των υποξικών περιοχών στο εσωτερικό του όγκου τα οποία ενισχύουν την επίδραση Warburg και την προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου, εισβολή, και μετάσταση [33-35]. Όγκων υποξία και HIF-1 σηματοδότηση και οι δύο συσχετίζονται έντονα με την επιθετική ικανότητα και φτωχή πρόγνωση [36]. Όγκων υποξία είναι επίσης γνωστό να διαμεσολαβεί κάποια χημείο- και ραδιο-αντίσταση [37-40]. Επειδή αυτές οι θεραπείες λειτουργούν σε μεγάλο βαθμό από την τόνωση της υπερπαραγωγής των αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) εντός του όγκου, περιορισμένη διαθεσιμότητα οξυγόνου μειώνει την αποτελεσματικότητά τους [41, 42].

Η θεραπεία με υπερβαρικό οξυγόνο (HBOT) είναι η χορήγηση 100% οξυγόνο σε υψηλή πίεση.

In vivo

, HBOT διαποτίζει το πλάσμα του αίματος με οξυγόνο, επιτρέποντάς της να διαχέονται περαιτέρω σε ιστούς και οξυγόνωσης περιοχές υποξικών όγκων [43-45]. Ομοίως, HBOT αυξάνει την διάχυση του οξυγόνου στα κύτταρα σε καλλιέργεια και έτσι τα αποτελέσματά της μπορούν να αξιολογηθούν άμεσα στο

in vitro

περιβάλλον. HBOT έχει δειχθεί ότι αναστέλλουν την αγγειογένεση και ανάπτυξη όγκου και την αύξηση του χρόνου επιβίωσης ως ένα αυτόνομο ή συμπληρωματική θεραπεία με το πρότυπο φροντίδας σε μία ποικιλία κυττάρων, των ζώων και του ανθρώπου μελέτες [46-52]. Έχουμε στο παρελθόν έδειξαν ότι η δίαιτα με ταυτόχρονη θεραπεία με υπερβαρικό οξυγόνο ήταν ένας αποτελεσματικός συνδυασμός θεραπεία έναντι μεταστατικού καρκίνου [9].

Η δίαιτα, συμπληρώματα κετόνη, και στόχος HBOT επικάλυψη μεταβολικές οδούς που είναι ιδιαίτερα εμφανές στην μεταστατικά κύτταρα . Υποθέσαμε ότι ο συνδυασμός αυτών των τριών μεταβολικών θεραπείες θα μπορούσαν να παράσχουν μια ασφαλή, οικονομικά αποδοτική επικουρική θεραπεία για μεταστατικό καρκίνο. Έχουμε δοκιμαστεί αυτή η υπόθεση

in vivo

και

in vitro

χρησιμοποιώντας το μοντέλο ποντικού VM-Μ3 του μεταστατικού καρκίνου [9, 22, 53].

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

VM-Μ3 /διακύμανση των κυττάρων (VM-Μ3) αποκτήθηκαν ως δώρο από Τ Seyfried του Boston College, όπου είχαν ληφθεί από μια αυθόρμητη όγκο στον εγκέφαλο σε ένα VM /Dk καθαρές ποντίκι, προσαρμοσμένο να κυτταρικής καλλιέργειας, και μεταγωγή με ένα φορέα που περιέχει φακοϊό λουσιφεράση πυγολαμπίδας υπό τον έλεγχο του υποκινητή του κυτταρομεγαλοϊού, όπως περιγράφεται προηγουμένως [53]. κύτταρα VM-M3 καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle Medium (Gibco, Life Technologies) με 5 mM L-γλουταμίνη (ATCC), 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Invitrogen), 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Invitrogen), ρυθμιστικό 10mM HEPES (Gibco, Life Technologies), και την υψηλή γλυκόζη (25mM ϋ-γλυκόζη? Fisher Scientific). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ένα υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 ° C σε 95% αέρα και 5% CO

2.

Ποντίκια

ζεύγη αναπαραγωγής του VM /Dk αμιγές στέλεχος ποντικών ελήφθησαν ως δώρο από Τ Seyfried του Boston College, και χρησιμοποιήθηκαν για να καθιερώσει και να διαδώσει μια αποικία του ποντικιού στο Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα Morsani College of Medicine Ιχθυοτροφείο σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο εκτροφής. Αρσενικά ποντίκια (8-20 εβδομάδων) χρησιμοποιήθηκαν στην μελέτη που περιγράφεται. Όλες οι διαδικασίες εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (USF IACUC? Πρωτόκολλο Αριθμός R4137) και πραγματοποιείται υπό την αυστηρή προσήλωση στον Οδηγό ΝΙΗ για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου

VM-. Μ3 κυττάρων Εμφύτευση

Περίπου 1 εκατομμύριο κύτταρα VM-Μ3 σε 300 μι στείρο PBS εμφυτεύθηκαν υποδορίως σε πλευρό της πλευρικής κοιλιακή ποντικών VM /Dk χρησιμοποιώντας μια βελόνα 27g όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. κυττάρων εμβολιασμό VM-Μ3 από αυτό το site έχει ως αποτέλεσμα την ταχεία και συστηματική μετάσταση [9].

Διαιτητικά Διοίκησης

Τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε μια ομάδα μελέτης και άρχισαν να λαμβάνουν τις αντίστοιχες διατροφή τους κατά την ημέρα της τον εμβολιασμό του όγκου, ώστε να μεγιστοποιηθεί το θεραπευτικό παράθυρο στο άκρως επιθετικό μοντέλο VM-Μ3. Πριν από την πρώτη ημέρα της μελέτης, όλοι οι ποντικοί νήστεψαν για μια νύχτα για να ενθαρρύνει την ταχεία συμμόρφωση με τη διαιτητική πρωτόκολλο. Τα ζώα ελέγχου έλαβαν τυπική τροφή τρωκτικών (2018 Teklad Παγκόσμια 18% πρωτεΐνη τρωκτικών Διατροφή, Harlan)

κατά βούληση

για όλη τη διάρκεια της μελέτης. KD + ποντίκια HBOT έλαβαν KD-USF, ένα έθιμο δίαιτα σχεδιάστηκε από τους συγγραφείς και παράγονται από Harlan Laboratories, τρέφονται

κατά βούληση

. KD + KE και KD + KE + ποντικοί έλαβαν HBOT KD-USF αναμιγνύεται με KE στο 10% κατ ‘όγκο με 1% σακχαρίνη για γευστικότητα. KE συντέθηκε σε συνεργασία με τον Patrick Arnold (Savind Inc., Seymour, IL) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [54]. Το προφίλ μακροθρεπτικών και θερμιδική πυκνότητα SD, KD-USF, και ΚΕ παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Όλες οι δίαιτες παρακολουθήθηκαν συνεχώς και αντικαταστάθηκε δύο φορές την εβδομάδα ή όπως απαιτείται για να διατηρηθεί η φρεσκάδα για όλη τη διάρκεια της μελέτης.

Η

υπερβαρικό οξυγόνο Therapy

KD + ΚΕ + ποντίκια HBOT έλαβαν 90 λεπτά συνεδρίες υπερβαρικό οξυγόνο 100% O

2 σε 2,5 ATA (εύρος 1,5 ATM) τρεις φορές την εβδομάδα (Μ, W, F) σε ένα πρότυπο υπερβαρικό θάλαμο (μοντέλο 1300B, Sechrist Industries) για τη διάρκεια της μελέτης. KD + ΚΕ + HBOT έλαβε την πρώτη συνεδρία HBOT τους 24 ώρες μετά από ενοφθαλμισμό των νεοπλασματικών κυττάρων.

Μετρήσεις του αίματος και του βάρους

αίματος (περίπου 10 μl) συλλέχθηκε μία φορά την εβδομάδα από την ουρά χρησιμοποιώντας IACUC εγκεκριμένο μεθόδους. της γλυκόζης του αίματος και β-υδροξυβουτυρικό (βHB) μετρήθηκε με τη χρήση του Precision Xtra γλυκόζης στο αίμα & amp? Σύστημα Παρακολούθησης κετόνη (Abbott Laboratories). Τα ποντίκια ζυγίστηκαν στα μέσα του απογεύματος, δύο φορές την εβδομάδα κατά τη διάρκεια της μελέτης με τη χρήση της AWS-1 KG Portable Digital Κλίμακα (AWS).

απεικόνιση βιοφωταύγειας και ανάπτυξη όγκου Ανάλυση

βιοφωταύγεια του λουσιφεράσης-tagged κύτταρα VM-M3

in vivo

αποκτήθηκε χρησιμοποιώντας το IVIS Lumina ψύχεται σύστημα κάμερας CCD και Ζώντας λογισμικό εικόνας (δαγκάνα LS). Δεκαπέντε λεπτά πριν από την απεικόνιση, τα ποντίκια έλαβαν ί.ρ. ένεση 50 mg /kg D-λουσιφερίνης (δαγκάνα LS). Ολόκληρο το σήμα bioluminescent ζώο (φωτόνια /sec) μετρήθηκε μία φορά την εβδομάδα ως δείκτης του μεταστατικού μεγέθους του όγκου και την εξάπλωση. Όγκου πάρει και μεταστατική εξάπλωση επιβεβαιώθηκε σε όλα τα ζώα μέσα σε 14 ημέρες μετά τον εμβολιασμό κυττάρων VM-Μ3 από bioluminescent απεικόνισης.

In vivo

bioluminescent σήματος (φωτόνια /sec) του κλειδιού μεταστατικών περιοχών (του εγκεφάλου, των πνευμόνων, και του ήπατος) μετρήθηκε ως ένας δείκτης του μεταστατικού φορτίου όγκου και να διαδοθούν σε 21 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των ζώων μελέτη επιβίωσης [43 , 55]. Έκταση της μεταστατικής εξάπλωσης αναλύθηκε περαιτέρω σε μια ξεχωριστή ομάδα ζώων θεραπείας αντιμετωπίζονται ελέγχου και συνδυασμό με

ex vivo

όργανο bioluminescent απεικόνισης. Τα ζώα εμβολιάστηκαν με κύτταρα VM-M3, θεραπεία για 21 ημέρες και με ευθανασία. Οι ιστοί συλλέχθηκαν και τοποθετήθηκαν σε ένα τρυβλίο Petri που περιέχει 300 μg /mL λουσιφερίνης σε αποστειρωμένο PBS για 5 λεπτά πριν από την απόκτηση της βιοφωταυγούς σήματος.

Ανάλυση Επιβίωσης

Φυσικές και συμπεριφορικές υγεία των ποντικών ήταν αξιολογείται καθημερινά σε όλη τη μελέτη. Τα ποντίκια ευθανασία από CO

2 ασφυξία σύμφωνα με εγκεκριμένες κατευθυντήριες γραμμές IACUC με την προσκόμιση των καθορισμένων κριτηρίων που σχετίζονται με την εξέλιξη της νόσου (μη φυσιολογική διατροφική συμπεριφορά, σχετίζονται με τον όγκο ασκίτη, μειωμένη ανταπόκριση σε ερεθίσματα, αποτυχία να ευδοκιμούν).

ανοσοϊστοχημική ανάλυση του όγκου αγγείωση

Μετά από 21 ημέρες θεραπείας, τα ζώα στην προαναφερθείσα μελέτη θεραπείας 3 εβδομάδων ήταν ευθανασία και τα ήπατα συλλέχθηκαν και διατηρήθηκαν σε 10% ουδέτερη, ρυθμισμένο με φωσφορικό φορμαλίνη. Το ήπαρ ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη, κόβονται σε 5 micron τμήματα, και τοποθετούνται πάνω σε πλάκες μικροσκοπίου στο USF Morsani College of Medicine Ιστολογίας Core. Μία σειρά διαφανειών χρωματίστηκε με αιματοξυλίνη και ηωσίνη και τοποθετείται με καλυπτρίδες για μορφολογική ανάλυση. Μια άλλη σειρά διαφανειών ανιχνεύθηκε για το CD31 ενδοθηλιακών κυττάρων δείκτη για να απεικονίσει τα αιμοφόρα αγγεία. Τα πλακίδια επανυδατώθηκαν μέσω σειράς ξυλόλιο και αιθανόλη πλύσεις, και το αντιγόνο ανακτήθηκε με μία τυποποιημένη μέθοδο κιτρικού ρυθμιστικού θερμότητα μεσολάβηση. Διαφάνειες επωάστηκαν σε 0,3% H

2O

2 dH

2O να αναστέλλει την ενδογενή δραστηριότητα του υπεροξειδίου. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των διαφανειών εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Vectastain Elite ABC. Τα πλακίδια αποκλείστηκαν για 30 λεπτά σε φυσιολογικό ορό και το κλείδωμα, και στη συνέχεια επωάζονται σε αντίσωμα αντι-CD31 (1:25? Ab28364, Abcam) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια στη συνέχεια επωάστηκαν σε βιοτινυλιωμένο δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού σε φυσιολογικό ορό αποκλεισμού για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από αντιδραστήριο Vectastain ABC περιέχει αβιδίνη και βιοτινυλιωμένη ραφανιδική διάλυμα υπεροξειδάσης για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα σλάϊντς αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το διάνυσμα NovaRED υπεροξειδάση (HRP) Kit υποστρώματος. Τα πλακίδια με αιματοξυλίνη, πλύθηκαν, τοποθετείται με καλυπτρίδες, και οπτικοποιήθηκαν με μικροσκοπία φωτός. Τουλάχιστον 3 πλαίσια που περιέχουν ιστό του όγκου ανά δείγμα αναλύθηκαν. Ο αριθμός των CD31

+ αιμοφόρων αγγείων που σχετίζονται με όγκους σε κάθε πλαίσιο μετρήθηκε και συγκρίθηκε μεταξύ των ομάδων ελέγχου και θεραπείας ως μέτρο της αγγείωσης του όγκου.

VM-M3 κυτταρικού πολλαπλασιασμού

50.000 κύτταρα VM-M3 απλώθηκαν σε πλάκες 35 ra 6 φρεάτιο σε 1 κ.εκ. υψηλή γλυκόζη μέσο (έλεγχος? 25mM) ή χαμηλή γλυκόζη μέσο (LG? 3 mM), με ή χωρίς την καθημερινή HBO θεραπείες (HBOT? 100% O

2 , 90 λεπτά, 2,5 ΑΤΑ). Μια ομάδα θεραπείας συνδυασμού έλαβε χαμηλά επίπεδα γλυκόζης, συμπληρώματα κετόνη (5mM βHB), και καθημερινή θεραπείες HBO (LG + βHB + HBOT). Αυτές οι μελέτες διεξήχθησαν σε συνδυασμό με την εργασία ερευνά την επίδραση των συμπληρωμάτων κετόνης επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού VM-Μ3? Ως εκ τούτου, οι καμπύλες πολλαπλασιασμού γλυκόζη 25mM και 3mM παρουσιάζονται είναι τα ίδια όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [22]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 24, 48, 72, και 96 ώρες για να καθορίσουν μια καμπύλη ανάπτυξης. Το μέσο αντικαταστάθηκε σε όλες τις θεραπείες στις 48 ώρες, και κάθε ομάδα χρονικό σημείο και θεραπεία εκτελέστηκε εις τριπλούν. Τα κύτταρα αποξέστηκαν και μετρήθηκαν με τη χρήση τυποποιημένων trypan blue αιμοκυτταρομετρία. Πλάκες επιθεωρούνται οπτικά για να εξασφαλίσει όλα τα κύτταρα συλλέχθηκαν πριν την απαρίθμηση.

VM-M3 κυττάρων Βιωσιμότητας

Η βιωσιμότητα εκτιμήθηκε με το Live /DEAD Βιωσιμότητας /κυτταροτοξικότητα Kit (Invitrogen). 50.000 κύτταρα VM-M3 απλώθηκαν σε τρυβλία 22 12 mm που περιέχει πολυ-D-λυσίνη γυάλινες καλυπτρίδες (BrainBits) σε μέσα ελέγχου 1mL και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 24 ώρες. Σε 24 ώρες, τα κύτταρα χορηγήθηκαν θεραπεία: υψηλή media γλυκόζης (έλεγχος? 25mM), χαμηλή γλυκόζη μέσο (LG? 3 mm), τα μέσα ενημέρωσης ελέγχου (25mM γλυκόζης) με μία μόνο συνεδρία του υπερβαρικού οξυγόνου (HBOT? 100% O

2 , 90 λεπτά, 2,5 ΑΤΑ), ή η θεραπεία συνδυασμού χαμηλής γλυκόζης, συμπληρώματα κετόνη (5mM βHB), και μια ενιαία συνεδρία του υπερβαρικού οξυγόνου (LG + βHB + HBOT). Αυτές οι μελέτες διεξήχθησαν σε συνδυασμό με την εργασία ερευνά την επίδραση των συμπληρωμάτων κετόνης στη βιωσιμότητα των κυττάρων VM-Μ3? Ως εκ τούτου, τα δεδομένα βιωσιμότητας 25mM και βHB είναι τα ίδια όπως αναφέρθηκε προηγουμένως και παρουσιάζονται εδώ για την αναφορά [22]. Στις 48 ώρες, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με D-PBS και επωάστηκαν σε 2 μΜ calcein ΑΜ (Εχ /Em: 495/515) και 4μΜ EthD-1 (Ex /Em: 525/590) σε D-PBS για 30 λεπτά στους 37 ° ΝΤΟ. Οι καλυπτρίδες αναστράφηκαν, συναρμολογημένα, και σφραγίζεται σε μία πλάκα μικροσκοπίου, και τα κύτταρα έγιναν ορατά με ένα Nikon TE200E χρησιμοποιώντας ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού με FIT-C και τα φίλτρα TRIT-C για να διαπιστώσετε ζωντανά και νεκρά κύτταρα, αντίστοιχα. Θεραπείες διεξήχθησαν εις τριπλούν. Οι αριθμοί των ζωντανών και νεκρών κυττάρων μετρήθηκαν στα 10 καρέ ανά καλυπτρίδα χρησιμοποιώντας ένα 10x στόχο να προσδιοριστεί το ποσοστό βιωσιμότητας.

VM-M3 κυττάρων ROS Ανίχνευση

50.000 κύτταρα VM-Μ3 απλώθηκαν σε 35 mm Poly-D-Lysine επικαλυμμένο γυαλί FluoroDish πιάτα καλλιέργειας ιστού (World Precision Instruments) σε 1 media έλεγχο mL και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 24 ώρες. Σε 24 ώρες, οι κυτταρικές χορηγήθηκαν θεραπεία: μέσο αντικαταστάθηκε με υψηλή γλυκόζη μέσο (έλεγχος? 25mM), χαμηλή γλυκόζη μέσο (LG? 3mM), μέσων ελέγχου με συμπλήρωση κετόνη (βHB? 5mM βHB), μέσα ενημέρωσης ελέγχου με μία μόνο συνεδρία του υπερβαρικό οξυγόνο (HBOT? 100% O2, 90 λεπτά, 2,5 ΑΤΑ), ή θεραπεία συνδυασμού (LG + βHB + HBOT). Στις 48 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν σε 10 μΜ διυδροεργοταμίνης (Εχ /Em:. Σε CSF για 30 λεπτά στους 37 ° C, και η παραγωγή υπεροξειδίου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού με ένα φίλτρο TRIT-C όπως περιγράφηκε προηγουμένως [56] Οι θεραπείες διεξήχθησαν στην επανάληψη. υπεροξειδική παραγωγής μετρήθηκε με τον υπολογισμό του μέσου όρου των μονάδων ένταση φθορισμού (ΜΧΠ) ανά κύτταρο σε 10 καρέ ανά δείγμα χρησιμοποιώντας ένα 10x στόχο.

Στατιστικά

η επιβίωση αναλύθηκε με την Kaplan -Meier και log-rank τεστ Mantel-Cox για διανομή επιβίωση. κυτταρική βιωσιμότητα και όγκου αγγείωση αναλύθηκαν με ζευγαρωμένο t τεστ. βιο-φωσφορισμού σήμα αναλύθηκε με Mann-Whitney U test. η βιωσιμότητα των κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, η μέση επιβίωση, γλυκόζη του αίματος και βHB , και η αλλαγή τοις εκατό κατά βάρος του σώματος αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA με δοκιμή πολλαπλής συγκρίσεως του Tukey post hoc Όλα στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση GraphPad Prism 6 λογισμικό αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικά όταν ρ & lt?… 0.05 Τα δεδομένα για την παρούσα μελέτη είναι διαθέσιμη ως συμπληρωματικές πληροφορίες (S3 File).

Αποτελέσματα

θεραπεία Μεταβολικό επιβραδύνει την ανάπτυξη του όγκου, αναστέλλει την μεταστατική διασπορά και αγγείωση του όγκου, και εκτείνεται χρόνο επιβίωσης σε ποντίκια με μεταστατικό καρκίνο

απεικόνιση βιοφωταύγειας έδειξε μια τάση μειωμένου συντελεστή ανάπτυξης του όγκου και μεταστατική εξάπλωση σε ζώα που υπέστησαν αγωγή σε σύγκριση με ελέγχους κατά τη διάρκεια της μελέτης (Σχήματα 1 και 2). Tumor βιοφωταύγεια ήταν κάτω από τα ανιχνεύσιμα κατώφλι σε αρκετές ποντικούς HBOT KD + KE + σε 3 εβδομάδες (Σχήμα 1). Tumor λαμβάνει και την εξάπλωση από την θέση του εμβολιασμού παρατηρήθηκε με απεικόνιση βιοφωταύγειας σε όλους τους ποντικούς κατά την ημέρα 14, δείχνοντας ότι αυτές οι μεταβολικές θεραπείες δεν παρέτεινε την επιβίωση απλά με την πρόληψη του σχηματισμού όγκων. Ωστόσο, βιοφωτισμός όγκος μειώθηκε στα ποντίκια τριπλή θεραπεία σε σύγκριση με τον έλεγχο στις εβδομάδες 1 και 2, γεγονός που υποδηλώνει ότι η φυσιολογική περιβάλλοντος που προκαλείται από μεταβολική θεραπεία μας ήταν λιγότερο ευνοϊκό για την ανάπτυξη του όγκου και μπορεί να έχουν επιβραδύνει την ανάπτυξη του πρωτογενούς όγκου καθώς και μεταστατικό διάδοση. KD + KE + ποντικούς που υπέστησαν αγωγή παρουσίασαν HBOT λιγότερο συνολικό φορτίο όγκου, όπως μετράται με συνολικό bioluminescent σήματος από ελέγχους σε όλα τα ισχύοντα χρονικά σημεία (εβδομάδα 1, 2, και 3? Σχήμα 1). KD + KE + ποντικούς που υπέστησαν αγωγή παρουσίασαν HBOT επίσης λιγότερο συνολικό φορτίο του όγκου από ό, τι τα ποντίκια στην KD εβδομάδα 3 και 5 και KD + KE ποντικών την εβδομάδα 1, 2, 3, και 5 (Σχήμα 1). Σε 3 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό των κυττάρων VM-M3, KD + ΚΕ + ποντικούς που υπέστησαν αγωγή HBOT είχαν σημαντικά μικρότερο συνολικό φορτίο όγκου και λιγότερο μεταστατική εξάπλωση στον εγκέφαλο, τους πνεύμονες, το συκώτι, τα νεφρά, τη σπλήνα, και στο λιπώδη ιστό σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου (** * ρ & lt? 0.001, μονόδρομη ANOVA? Σχήμα 1). KD, KD + KE, και KD + KE + ποντίκια HBOT έδειξαν σημαντικά παρατεταμένη καμπύλες επιβίωσης σε σύγκριση με τα ζώα ελέγχου (ρ = 0.03, ρ = 0.009 και ρ & lt? 0,0001, log-rank Mantel-Cox test για διανομή επιβίωση? Σχήμα 3Α) . επεξεργασία KD αυξημένο μέσο χρόνο επιβίωσης κατά περίπου 14 ημερών (44,6%), η θεραπεία KD + ΚΕ από περίπου 20 ημέρες (65,4%), και τη θεραπεία HBOT KD + ΚΕ + περίπου κατά 32 ημέρες (103,2%) σε σύγκριση με τους ελέγχους (* ρ & lt? 0,05? μονόδρομη ANOVA? Σχήμα 3Β). Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην επιβίωση μεταξύ των τριών ομάδων θεραπείας. Μορφολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση των συκωτιών από KD + ΚΕ + ποντικούς που υπέστησαν αγωγή HBOT αποκάλυψαν μόνο μικρομεταστατικών αλλοιώσεις με μικρή αξιοσημείωτη αγγείωση σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Σχήμα 4). Η γλυκόζη του αίματος και το σωματικό βάρος μειώθηκε και το αίμα βHB αυξάνεται σε ποντικούς που λαμβάνουν θεραπεία KD + KE από 7 ημέρες, πριν από την έναρξη της σημαντικής προόδου της νόσου (Σχήμα 5).

(Α)

In vivo

βιοφωτισμός απεικόνιση αντιπροσωπευτικά ζώα από κάθε ομάδα αγωγής 3 εβδομάδες μετά τον ενοφθαλμισμό των νεοπλασματικών κυττάρων. Αντιμετωπίζονται ποντίκια παρουσίασαν μειωμένη επιβάρυνση του όγκου και τη μεταστατική εξάπλωση. (B) Σύνολο βιοφωταύγεια ζώων (φωτόνια /sec) εντοπίστηκε σε βάθος χρόνου ως ένα μέτρο του ρυθμού ανάπτυξης του όγκου. Για να αποφευχθεί η παραπλανητική αναπαράσταση του φορτίου του όγκου, τα δεδομένα για τις ομάδες θεραπείας, όπου ≥50% των ζώων που είχαν υποκύψει στην εξέλιξη της νόσου δεν είναι πλέον εμφανίζεται. Tumor βιοφωταύγεια ήταν εξαιρετικά μεταβλητή, αλλά αγωγή ζώα έδειξαν μια αξιοσημείωτη τάση επιβράδυνσης της ανάπτυξης του όγκου σε σύγκριση με τους μάρτυρες διάρκεια της μελέτης. KD αγωγή ποντίκια είχαν λιγότερο βιοφωταύγεια από τους ελέγχους κατά την εβδομάδα 2, ενώ KD + ΚΕ + ποντίκια είχαν λιγότερο HBOT βιοφωταύγεια από ζώα ελέγχου στις εβδομάδες 1, 2, και 3. KD + ΚΕ + ποντίκια HBOT είχαν επίσης λιγότερα βιοφωταύγεια από KD + KE ποντικούς σε εβδομάδες 1, 2, 3, και 5, και είχαν λιγότερο βιοφωταύγεια όγκου από ποντικούς σε KD εβδομάδα 3 και 5. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικά όταν ρ & lt?. 0.05

Η

(Α)

In vivo

βιοφωτισμός των βασικών μεταστατικών περιοχών 21 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων έδειξαν μια σημαντική μείωση στο μεταστατικό φορτίο του όγκου και την εξάπλωση για θεραπεία ζώα. KD + KE + ποντίκια HBOT είχαν σημαντικά λιγότερη μεταστατική εξάπλωση στον εγκέφαλο, πνεύμονα, ήπαρ και σε σύγκριση με ελέγχους σε 3 εβδομάδες. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στη μεταστατική εξάπλωση μεταξύ των τριών ομάδων θεραπείας. (Β-Γ) Να παρέχει μια πιο ευαίσθητη μέτρο της μεταστατικής εξάπλωσης σε multi-θεραπεία συνδυασμού μας, μια ξεχωριστή ομάδα ελέγχου και KD + ΚΕ + ζώα που έλαβαν θεραπεία HBOT υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 21 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων και την ευθανασία.

Ex vivo

bioluminescent απεικόνισης της συγκομίζονται οργάνων επιβεβαίωσε μια σημαντική μείωση στο μεταστατικό φορτίο όγκου και να εξαπλωθεί στα ζώα που έλαβαν συνδυασμό σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Όλα τα εξετασθέντα όργανα-εγκεφάλου, των νεφρών, σπλήνα, πνεύμονες, λιπώδη, και το ήπαρ-εμφάνισαν σημαντικά μειωμένη βιοφωταύγειας σήμα σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικά όταν ρ & lt?. 0.05

Η

(Α) Καμπύλη επιβίωσης Kaplan-Meier των ομάδων μελέτης. KD, KD + ΚΕ, και KD + ΚΕ + ποντίκια που έλαβαν θεραπεία HBOT αποδειχθεί παρατεταμένη επιβίωση σε σύγκριση με τους μάρτυρες (p = 0,03, p = 0,009 και p & lt? 0,0001, αντίστοιχα? Log-rank Mantel-Cox test για διανομή επιβίωσης). Υπήρχε μια ισχυρή τάση των πιο παρατεταμένη επιβίωση στους ποντικούς θεραπείας συνδυασμού σε σύγκριση με KD ή KD + KE, αλλά αυτές οι καμπύλες δεν ήταν σημαντικά διαφορετικό από κάθε άλλο (KD έναντι KD + ΚΕ + HBOT p = 0,0622? KD + KE vs. KD + ΚΕ + HBOT p = 0,1924? δοκιμασία log-rank Mantel-Cox). (Β) το μέγεθος κοόρτης (n), η μέση επιβίωση (ημέρες), και επί τοις εκατό αύξηση στο μέσο χρόνο επιβίωσης από τον έλεγχο. KD, KD + KE, και KD + KE + ποντικούς που υπέστησαν αγωγή HBOT παρουσίασαν 44,6%, 65,4%, και η αύξηση 103,2% σε μέσο χρόνο επιβίωσης σε σύγκριση με τους μάρτυρες, αντίστοιχα (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** p & lt? 0,001? One-Way ANOVA). Παρόμοια με την ανάλυση της καμπύλης επιβίωσης, υπήρχε μια τάση αυξημένης μέσος χρόνος επιβίωσης σε ποντίκια που έλαβαν συνδυασμό σε σύγκριση με KD και KD + KE, αλλά αυτές οι διαφορές δεν ήταν σημαντικές (KD έναντι KD + ΚΕ + HBOT p = 0,1062? KD + KE εναντίον KD + ΚΕ + HBOT p = 0,2763). Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικά όταν ρ & lt?. 0.05

Η

Μορφολογία και αγγείωση της KD + ΚΕ + HBOT αγωγή όγκων του ήπατος του ποντικιού αναλύθηκαν από την H & amp? E χρώση και CD31 ανοσοϊστοχημεία. Όγκοι από KD + ΚΕ + ποντικό HBOT αγωγή ήταν μικρότερα με περισσότερο καλά καθορισμένων ορίων (A, C) και επέδειξε μία σημαντική μείωση στην αγγείωση (B, D, E) από τους ελέγχους (* ρ & lt? 0,05? Unpaired t-test) . Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM.

Η

(AC) KD + KE ποντίκια με αγωγή είχαν μειωθεί σημαντικά γλυκόζης στο αίμα και του σωματικού βάρους και αυξημένη βHB αίματος σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου από την ημέρα 7. Η γλυκόζη του αίματος ήταν σημαντικά μειωμένη μόνο σε KD + KE ποντίκια με αγωγή την ημέρα 7. Τόσο KD + KE και KD + KE + ποντικούς που υπέστησαν αγωγή παρουσίασαν αυξημένη HBOT βHB αίματος σε σύγκριση με τον έλεγχο και KD ποντίκια με αγωγή την ημέρα 7. Μόνο KD + KE ποντίκια είχαν σημαντική μείωση του σωματικού βάρους κατά την ημέρα 7. (D) Μόνο οι ποντικοί KD + KE έδειξαν σημαντική και συνεπή μείωση του σωματικού βάρους κατά τη διάρκεια της μελέτης. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικά όταν ρ & lt? 0,05. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM.

Η

θεραπεία Μεταβολικό μειώνει τον πολλαπλασιασμό και τη βιωσιμότητα και την αύξηση της παραγωγής ROS στα κύτταρα VM-M3

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων VM-M3 ανεστάλη σημαντικά με μείωση της συγκέντρωσης γλυκόζης του μέσου καλλιέργειας και με χορήγηση HBOT (Σχήμα 6Α). Αναφέραμε προηγουμένως μία παρόμοια απόκριση στα κύτταρα VM-Μ3 με βHB συμπλήρωση να ποικίλη συγκέντρωση γλυκόζης [22]. Συνδυάζοντας LG, βHB, και HBOT προκάλεσε ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα

in vitro

(Σχήμα 6Β). Τα κύτταρα που λαμβάνουν αυτή την θεραπεία συνδυασμού διαιρείται πολύ αργά, με σήμανση σημαντική μείωση στην πυκνότητα κυττάρου σε σύγκριση με ελέγχους σε όλα τα χρονικά σημεία που δοκιμάστηκαν (* ρ & lt? 0,05, μονόδρομη ANOVA? Σχήμα 6Β). Στις 24 και 48 ώρες, ρυθμός ανάπτυξης ήταν σημαντικά βραδύτερη στα κύτταρα LG + HBOT σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. ρυθμός ανάπτυξης ήταν επίσης σημαντικά βραδύτερη στα κύτταρα LG + βHB + HBOT από ό, τι στα κύτταρα LG. Οι διαφορές στο ρυθμό πολλαπλασιασμού μεταξύ των ομάδων έγιναν πιο διακριτές με το χρόνο, έτσι ώστε με 72 ώρες, το ρυθμό πολλαπλασιασμού των όλες τις ομάδες θεραπείας διέφεραν σημαντικά το ένα από το άλλο με την εξαίρεση της LG έναντι LG + HBOT, και στις 96 ώρες, όλες οι ομάδες διέφεραν με την εξαίρεση του LG έναντι LG + HBOT. Υπήρχε ένα παρόμοιο αποτέλεσμα της μεταβολικής θεραπείας στην βιωσιμότητα των κυττάρων VM-Μ3. Η βιωσιμότητα ήταν 19% λιγότερο στην ομάδα LG σε σχέση με την ομάδα ελέγχου σε αγωγή 24 ωρών (* ρ & lt? 0,05, μονόδρομη ANOVA? Σχήμα 7). Αναφέραμε προηγουμένως ένα παρόμοιο αποτέλεσμα σε κύτταρα VM-M3 αγωγή με συμπληρώματα βHB [22]. Παρά το γεγονός ότι HBOT δεν μειώνουν τη βιωσιμότητά από μόνη της, όταν χορηγείται με την LG και βHB, αυτή η συνδυασμένη θεραπεία μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα κατά περίπου 38%. (*** Ρ & lt? 0.001, μονόδρομη ANOVA? Σχήμα 7). VM-M3 παραγωγή κυττάρων υπεροξειδίου αυξήθηκε σημαντικά με HBOT, μεμονωμένα και σε συνδυασμό με LG + βHB (*** ρ & lt? 0.001, μονόδρομη ANOVA? Σχήμα 8).

κύτταρα VM-M3 ήταν καλλιεργούνται σε συνθήκες που μιμούνται μεταβολική θεραπεία, συμπεριλαμβανομένων των συνδυασμών ποικίλες συγκέντρωσης γλυκόζης (25mM, 15mM, ή 3 mm) μέσα μαζικής ενημέρωσης, τα συμπληρώματα κετόνη (5mM βHB), και καθημερινές συνεδρίες HBOT (100% O

2, 2.5 ΑΤΑ, 90 λεπτά). Η κυτταρική πυκνότητα μετρήθηκε με trypan blue αιμοκυτταρομετρία για να παραχθεί μια καμπύλη ανάπτυξης πάνω από 96 ώρες. (Α) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων VM-M3 ανεστάλη με μειούμενη συγκέντρωση γλυκόζης και η προσθήκη HBOT. Στις 24 ώρες, η πυκνότητα κυττάρου των κυττάρων που HBOT 3mM Glu και 3mM glu ​​+ ήταν σημαντικά μικρότερη από τον έλεγχο κύτταρα κατεργασμένα (25mM) γλυκόζη. Στις 48, 72, και 96 ώρες, η κυτταρική πυκνότητα όλες τις ομάδες θεραπείας ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με το μάρτυρα (* ρ & lt? 0,05? Αμφίδρομη ANOVA). (Β) το συνδυασμό χαμηλής γλυκόζης, συμπλήρωση κετόνη, και HBOT οδήγησε σε αξιοσημείωτη μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων η οποία ήταν σημαντική από τον έλεγχο σε όλα τα χρονικά σημεία που εξετάστηκαν. (Ρ & lt? 0,05? Μονόδρομη ANOVA). Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία συνδυασμού είχαν μια σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με την LG μόνο σε 24, 48, και 72 ώρες, και σε σύγκριση με βHB μόνο στο 48, 72, και 96 ώρες, και εμφάνισε μη σημαντική τάση μειωμένο πολλαπλασιασμό σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα LG + HBOT για τη διάρκεια της καμπύλης ανάπτυξης. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικά όταν ρ & lt? 0,05. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM

Η

κύτταρα VM-M3 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με υψηλές (έλεγχος? 25mM). ή χαμηλή (LG? 3 mm) γλυκόζης για 24 ώρες, με ή χωρίς 5mM βHB ή μία σύνοδο της HBOT . Η βιωσιμότητα μετρήθηκε με καλσεϊνη ΑΜ και Ethd-1 μικροσκοπία φθορισμού. (Α-Β) βHB, LG, και η LG θεραπεία + βHB + HBOT μειωμένη βιωσιμότητα σε σύγκριση με τον έλεγχο και κύτταρα επεξεργασμένα HBOT. βιωσιμότητα + βHB + HBOT κυττάρων LG ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με βHB αλλά όχι κύτταρα επεξεργασμένα LG. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικά όταν ρ & lt? 0,05. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM

Η

(Α-Β) κύτταρα VM-M3 έλαβαν θεραπεία για 24 ώρες με μεμονωμένες ή συνδυασμένες θεραπείες μεταβολισμού:. LG, βHB, HBOT ή LG + βHB + HBOT. Η παραγωγή υπεροξειδίου μετρήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού DHE και ήταν σημαντικά αυξημένη με μόνη ή σε συνδυασμό με LG + βHB HBOT. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικά όταν ρ & lt? 0,05. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM.

Η

Συζήτηση

Μετάσταση παραμένει ο μεγαλύτερος εμπόδιο στον εντοπισμό αποτελεσματικές θεραπείες για τη μακροπρόθεσμη αντιμετώπιση του καρκίνου. Η έλλειψη ζωικά μοντέλα που αντικατοπτρίζουν το μεταστατικό φαινότυπο αποτρέπει σημαντικές βελτιώσεις στη φροντίδα των ασθενών.