Αφηρημένο

Ο καρκίνος προέρχεται από κύτταρα που έχουν αποκτήσει οι μεταλλάξεις στα γονίδια κρίσιμη για τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, επιβίωση και διαφοροποίηση. Συχνά, οι όγκοι να συνεχίσουν να εξαρτώνται από αυτές τις λεγόμενες μεταλλάξεις οδηγού, παρέχοντας το σκεπτικό για στοχευμένη αντικαρκινικών θεραπειών. Μέχρι σήμερα, οι αναλύσεις προσδιορισμού σειράς μεγάλης κλίμακας έχουν αποκαλύψει εκατοντάδες μεταλλάξεις σε ανθρώπινους όγκους. Ωστόσο, χωρίς λειτουργική επικύρωση τους παραμένει ασαφές ποια μεταλλάξεις αντιστοιχούν σε οδηγό, ή μάλλον των παρευρισκομένων, μεταλλάξεις και, ως εκ τούτου, αν το μεταλλαγμένο γονίδιο αντιπροσωπεύει ένα στόχο για θεραπευτική παρέμβαση. Στην ανθρώπινη όγκων παχέος εντέρου, η νευροτροφικός TRKB υποδοχέα έχει βρεθεί μεταλλαχθεί σε δύο διαφορετικές τοποθεσίες στον τομέα της κινάσης (TRKB

T695I και TRKB

D751N). Μια άλλη θέση, στο εξωκυτταρικό τμήμα της TRKB, μεταλλάσσεται σε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά πνευμονικού αδενοκαρκινώματος (TRKB

L138F). Τέλος, η δική μας ανάλυση εντόπισε ένα επιπλέον σημείο TRKB εγγύς μετάλλαξη στον τομέα κινάσης (TRKB

P507L) σε μια ανθρώπινη κυτταρική γραμμή μελανώματος. Οι λειτουργικές συνέπειες όλων αυτών των σημειακών μεταλλάξεων, ωστόσο, έχουν μέχρι στιγμής παραμείνει απροσδιόριστη. Προηγουμένως, έχουμε δείξει ότι TRKB είναι ένας ισχυρός καταστολέας της anoikis και ότι τα κύτταρα TRKB εκφράζουν σχηματίσει ιδιαίτερα επεμβατική και μεταστατικών όγκων σε γυμνούς ποντικούς. Για την εκτίμηση των λειτουργικές συνέπειες αυτών των μεταλλάξεων τέσσερα TRKB, προσδιορίσαμε τις δυνατότητές τους να καταστείλουν anoikis και να σχηματίσουν όγκους σε γυμνούς ποντικούς. Απροσδόκητα, αμφότερα με καρκίνο του κόλον που προέρχονται μεταλλάξεις, TRKB

T695I και TRKB

D751N, εμφανίζεται μειωμένη δραστικότητα σε σύγκριση με εκείνη του άγριου τύπου TRKB. Σταθερά, κατά τη διέγερση με το συνδετήρα TRKB BDNF, αυτοί οι μεταλλάκτες είχαν μειωμένη σε ενεργοποίηση TRKB και κατάντη επενεργητές ΑΚΤ και ERK. Οι δύο μεταλλάξεις που προέρχονται από ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές όγκου (TRKB

L138F και TRKB

P507L) ήταν λειτουργικά διακριθεί από άγριου-τύπου TRKB τόσο

in-vitro

και

in-vivo

δοκιμασίες. Εν κατακλείδι, θα αδυνατούν να αντιληφθούν οποιαδήποτε αύξηση του κύκλου λειτουργίας των τεσσάρων σημειακών μεταλλάξεων TRKB καρκίνου που προέρχεται από

Παράθεση:. Geiger TR, Τραγούδι JY, Rosado Α, Peeper DS (2011) Λειτουργική Χαρακτηρισμός των Ανθρωπίνων Καρκίνος προέρχεται Μεταλλάξεις TRKB. PLoS ONE 6 (2): e16871. doi: 10.1371 /journal.pone.0016871

Επιμέλεια: Hang Nguyen, Πανεπιστήμιο Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Ameica

Ελήφθη: 21 Σεπτεμβρίου του 2010? Αποδεκτές: 17 Γενάρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 Φεβ 2011

Copyright: © 2011 Geiger et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την επιχορήγηση της Ευρωπαϊκής Ένωσης FP6 να TRG, AR και D.S.P. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια γενετική ασθένεια, με πολλές σωματικές μεταλλάξεις σε πρωτο-ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια που συμβάλλουν στην κακοήθη φαινότυπο [1]. Τα γονίδια αυτά συνήθως ελέγχει ζωτικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, επιβίωση ή διαφοροποίηση [2]. μετάλλαξη τους προικίζει κύτταρα όγκου με ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα, με αποτέλεσμα κλωνική επέκταση και νεοπλασία. Αν και οι όγκοι φιλοξενούν συνήθως πολλαπλών γενετικών ανωμαλιών [1], η αναστολή της μόνο ένα ή λίγα προϊόντα γονιδίων μπορεί να είναι επαρκή για την καταστολή σε μεγάλο βαθμό τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων ή της βιωσιμότητας [3]. Αυτό έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί υποχώρηση του όγκου σε διάφορα μοντέλα ποντικού καρκίνου του [4] – [6] και οδήγησε στις έννοιες του «ογκογονιδίου εθισμός» και «όγκος υπερευαισθησία γονίδιο καταστολής» [3]. Η εξάρτηση των καρκινικών κυττάρων επί ορισμένων ογκογονιδίων και μονοπάτια σηματοδότησης εκθέτει ένα «αχίλλειο πτέρνα» του καρκίνου, η οποία μπορεί να στοχευθεί για αντικαρκινική θεραπεία [7]. Με βάση αυτή την έννοια, έχουν αρκετές νέα θεραπευτικά έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιούνται στην κλινική [8]. Περιλαμβάνουν μεσυλικό imatinib (ή «Gleevec» /»Glivec») για την αναστολή του BCR-ABL σε χρόνια μυελογενή λευχαιμία (CML) [9] και για την αναστολή ΚΙΤ σε γαστρεντερικούς στρωματικούς όγκους (GIST) [10], αντίστοιχα. Ομοίως, σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού με ERBB2 (επίσης ονομάζεται HER-2 /neu) υπερέκφραση, το μονοκλωνικό αντίσωμα trastuzumab [11] – [13] και το μικρό μόριο αναστολέας lapatinib [14] είναι αποτελεσματικά. Ένα κρίσιμο ρόλο για ογκογόνους μεταλλάξεις αποδεικνύεται από το παράδειγμα του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR /ErbB1) σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), όπου μόνο ένα υποσύνολο των ασθενών ανταποκρίνονται στην gefitinib αναστολέα EGFR. Οι αναλύσεις αλληλουχίας αποκάλυψαν ότι και οι ανταποκρινόμενοι όγκοι φιλοξενούν συγκεκριμένες μεταλλάξεις στο EGFR, αύξηση της ενεργοποίησης του από EGF [15].

Αυτά και άλλα παραδείγματα απεικονίζουν ότι ο προσδιορισμός των ογκογονιδίων κριτικά απαιτούνται για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση μπορεί να οδηγήσει σε αποτελεσματικές αντικαρκινικές θεραπευτική. Ως εκ τούτου, αρκετές ερευνητικές ομάδες έχουν διενέργεια συστηματικών αλληλούχιση μεγάλης κλίμακας αναλύσεις για τη διαλογή γονίδια που είναι μεταλλαγμένα σε καρκίνο. Αυτή η στρατηγική οδήγησε πρώτα στην ταυτοποίηση της κινάσης BRAF ως ένα κρίσιμο ογκογονιδίου σε ένα μεγάλο ποσοστό των μελανωμάτων και πολλών άλλων μορφών καρκίνου [16]. Το 2003, η ομάδα των Vogelstein, ΚίηζΙβΓ και Velculescu αλληλουχία συστηματικά τις περιοχές κινάσης όλων των κινασών τυροσίνης σε μια συλλογή του ανθρώπινου παχέος εντέρου. Βρήκαν 7 από 138 γονίδια αναλύονται για να μεταλλαχθεί σε περισσότερες από μία όγκου [17]. Η ίδια ομάδα στη συνέχεια αναλύθηκαν πάνω από 1000 διαφορετικά γονίδια σε καρκίνο του μαστού και του παχέος εντέρου [18], προσδιορίζοντας έως 189 νέα και γνωστά γονίδια υποψήφια καρκίνου. Ομοίως, Stratton, Futreal και οι συνεργάτες του στο Ινστιτούτο Sanger προσδιορισμό αλληλουχίας πρώτα 518 κινάσες πλήρους μήκους σε όγκους πνεύμονα και κυτταρικών γραμμών όγκου [19] και στη συνέχεια το πλήρες kinome σε δέκα διαφορετικούς τύπους καρκίνου [20]. Αυτές και άλλες αναλύσεις έχουν εντοπίσει εκατοντάδες νέων σωματικών μεταλλάξεων σε διάφορες ανθρώπινες κακοήθειες [21]. Ωστόσο, λίγες εξαιρέσεις στην άκρη, οι λειτουργικές συνέπειες αυτών των μεταλλάξεων έχουν παραμείνει σε μεγάλο βαθμό απατηλό. Για να επιλέξετε τις κατάλληλες στόχους για το μέλλον αντικαρκινικών θεραπειών, θα είναι απαραίτητο να δοκιμαστεί πειραματικά ποια από αυτές τις μεταλλάξεις είναι ογκογόνο και για τις οποίες μεταλλαγμένα γονίδια όγκων εξαρτάται.

Εμείς επιλέξαμε να ερευνήσει την TRKB νευροτροφικού υποδοχέα (NTRK2), για οι οποίες έχουν τρία σωματικά, μη συνώνυμες μεταλλάξεις σημείου έχουν αναφερθεί σε μελέτες που αναφέρθηκαν παραπάνω [17], [19], ενώ η δική μας ανάλυση αποκάλυψε ένα άλλο σημείο TRKB μετάλλαξη σε ένα ανθρώπινο κυτταρική γραμμή μελανώματος. TRKB είναι ένα από τα τρία μέλη της οικογένειας υποδοχέων TRK, η οποία περιλαμβάνει επίσης TrkA και TrkC. TRKB προτίμηση δεσμεύει την νευροτροφίνη προερχόμενο από τον εγκέφαλο νευροτροφικός παράγοντας (BDNF) και NT4 /5, ενώ TrkA και TrkC έχουν υψηλές συγγένειες προς παράγοντα ανάπτυξης νεύρου (NGF) και ΝΤ3, αντίστοιχα [22]. Το παν-TRK υποδοχέων p75NTR διαμορφώνει περαιτέρω την ανταπόκριση των υποδοχέων TRK να νευροτροφίνες [22]. TRKB έχει βρεθεί υπερεκφράζεται σε έναν αριθμό των επιθετικών ανθρώπινων τύπων καρκίνου (για επισκόπηση βλέπε [23]). Προηγουμένως, έχουμε δείξει ότι TRKB είναι ένας ισχυρός καταστολέας της anoikis (απόπτωση που επάγεται από ακατάλληλη ή απούσα κυτταρικής προσκόλλησης) σε επιθηλιακά κύτταρα αρουραίου, και ότι τα κύτταρα που υπερεκφράζουν TRKB-σχηματίσει ιδιαίτερα επεμβατική και μεταστατικών όγκων σε γυμνούς ποντικούς [24]. Επιπλέον, έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ανάλυση δομής-λειτουργίας μας έδειξαν ότι όλες αυτές οι λειτουργίες εξαρτώνται από την δραστικότητα TRKB κινάσης σε αυτό το πειραματικό σύστημα [25]. Πιο πρόσφατα, έχουμε αποδείξει για επιθηλιακά κύτταρα αρουραίου TRKB μετασχηματισμένα ότι η αυξημένη δραστηριότητα σήματα ΜΑΡΚ μέσω συστροφή και σαλιγκάρι να επάγουν μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) -όπως μετασχηματισμό, anoikis καταστολή και μετάσταση [26]. Ως δύο από τις εντοπίστηκαν μεταλλάξεις του καρκίνου που προέρχεται από το σημείο TRKB χάρτη εντός του τομέα κινάσης, ενδεχομένως επηρεάζουν την ενζυμική της δράση, είναι κατανοητό ότι δρουν ογκογονικώς και αντιστοιχούν σε μεταλλάξεις του οδηγού. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν, ως εκ τούτου, να εκτιμήσει τις λειτουργικές συνέπειες των τεσσάρων ανεξάρτητων μεταλλάξεων σημείου TRKB ανθρώπινου καρκίνου που προέρχεται.

Αποτελέσματα

Ταυτοποίηση των μεταλλάξεων σημείου TRKB ανθρώπινου καρκίνου που προέρχεται και δημιουργία συστήματα κυψελών

Δύο μη συνώνυμες μεταλλάξεις σημείου εντός της περιοχής της κινάσης του

TRKB

γονιδίου έχουν ανακαλυφθεί σε όγκους παχέος εντέρου: TRKB

T695I και TRKB

D751N [17] ( η αρίθμηση όλων των αλληλουχιών αμινοξέων, αναφέρεται στο πλήρους μήκους ανθρώπινη πρωτεΐνη TRKB, αριθμός πρόσβασης NP_006171.2). Μια άλλη μετάλλαξη σημείο TRKB, TRKB

L138F, εντοπίστηκε στην κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα NCI-Η2009 [19]. Αυτή η μετάλλαξη βρίσκεται εντός του πλούσιες σε λευκίνη περιοχή του εξωκυτταρικού τμήματος του υποδοχέα, η οποία έχει αποδειχθεί ότι απαιτείται για σύνδεση του συνδετήρα TRKB νευροτροφικός παράγοντας προερχόμενος από τον εγκέφαλο (BDNF) και την ενεργοποίηση του υποδοχέα TRKB [25], [27 ], [28]. Επιβεβαιώσαμε την παρουσία αυτής της μετάλλαξης με αλληλούχιση γονιδιωματικού DNA (gDNA) που απομονώνεται από κύτταρα NCI-Η2009 (Σχήμα 1Α, αριστερό πάνελ). Η παρουσία ενός διπλού κορυφής (θυμιδίνης και κυτοσίνη) υποδεικνύει ότι η μετάλλαξη είναι ετερόζυγο, σύμφωνα με την αρχική έκθεση [19]. Έχει ως αποτέλεσμα την αντικατάσταση της λευκίνης με φαινυλαλανίνη. Για αναζήτηση περισσότερα

μεταλλάξεις σχετίζονται με τον καρκίνο TRKB

σημείο, η αλληλουχία των εξωνίων που περιλαμβάνει την

TRKB

τομέα κινάσης από γονιδιακό DNA από 28 ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές όγκου, από πολλές προελεύσεις ιστού (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα ). Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε έναν επιπλέον

TRKB

σημείο μετάλλαξης, στην κυτταρική σειρά μελανώματος MDA-MB-435. (Η κυτταρική σειρά MDA-MB-435 φαίνεται να έχουν ταξινομηθεί εσφαλμένα στο παρελθόν [29]. Ότι αρχικά απομονώθηκε από έναν ασθενή με καρκίνο του μαστού [30], [31], πρόσφατη ανάλυση έδειξε ότι επί του παρόντος διαθέσιμων κυτταρική σειρά είναι μελανώματος προέλευσης [32], [33]). Η

TRKB

μετάλλαξη που προσδιορίζονται στο MDA-MB-435 κυττάρων είναι C1520T, με αποτέλεσμα μια υποκατάσταση της προλίνης 507 με λευκίνη (TRKB

P507L). Σε αυτήν την περίπτωση, ο προσδιορισμός της αλληλουχίας του gDNA αποκάλυψε μια μονή κορυφή μόνο (Σχήμα 1Α δεξιό πλαίσιο), υποδηλώνοντας ότι η μετάλλαξη είναι ομόζυγο. Το υπόλειμμα P507 βρίσκεται πλησίον της περιοχής κινάσης στην ενδοκυττάριο τμήμα του υποδοχέα. Το σχήμα 1Β δείχνει μία σχηματική επισκόπηση των θέσεων όλων των σημειακών μεταλλάξεων ανθρώπινου καρκίνου που προέρχεται TRKB αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη.

(Α) ανάλυση αλληλουχίας των gDNA από κύτταρα ΝΟΙ-Η2009 που φέρει το TRKB

L138F μετάλλαξη ( αριστερό πάνελ) και από MDA-MB-435 κύτταρα που έφεραν το TRKB

P507L μετάλλαξη (δεξί πάνελ). Οι αστερίσκοι (*) υποδεικνύουν τις αντίστοιχες μεταλλαγμένες βάσεις. Μαύρα γράμματα υποδηλώνουν υπολείμματα άγριου τύπου, κόκκινα γράμματα υποδηλώνουν μεταλλαγμένα υπολείμματα. (Β) Σχηματική επισκόπηση επί όλων των σημειακών μεταλλάξεων TRKB λαμβάνεται από καρκίνο αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη. LRM: πλούσιες σε λευκίνη Motif, Ig: παρόμοια με ανοσοσφαιρίνη περιοχή, ΤΜ: διαμεμβρανικό τομέα. Οι αριθμοί δείχνουν τις θέσεις των υπολειμμάτων αμινοξέων. (Γ) Τα επίπεδα έκφρασης του μεταλλαγμένου ή άγριου τύπου σε κύτταρα TRKB RIE-1, αναλύθηκε σε ανοσοκηλίδα (ΙΒ). Τουμπουλίνης χρησιμεύει ως έλεγχος φόρτωσης. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν ποσοτικοποίηση του σήματος TRKB, κανονικοποιημένη προς αλφα-τουμπουλίνης, και σε σχέση με φορέα αναφοράς. δοκιμασία (D) στην κυτταρική επιφάνεια βιοτινυλίωση δείχνουν ότι τουλάχιστον ένα σημαντικό κλάσμα του συνόλου μεταλλαγμάτων TRKB εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη. Συνολική κυτταρική επιφάνεια πρωτεΐνες βιοτινυλιώθηκαν με σουλφο-ΝΗδ-LC-Βιοτίνη, λύθηκαν και TRKB ανοσοκατακρημνίστηκε (ΙΡ) με TRK αντίσωμα (C-14, C-13 για τον έλεγχο). Μετά την ηλεκτροφόρηση γέλης, βιοτινυλιωμένο TRKB οπτικοποιήθηκε με στρεπταβιδίνη-ΗΚΡ και συνολική TRKB με TRK αντίσωμα (C-14). Όλα άγριου τύπου και μεταλλαγμένες πρωτεΐνες TRKB έγινε βιοτινυλιώθηκαν (άνω αριστερό πλαίσιο). Στη δεξιά πλευρά η ειδικότητα της δοκιμασίας καταδεικνύεται: βιοτίνη ανιχνεύθηκε σήμα μόνο για πλήρους μήκους TRKB (άνω δεξιά πάνελ, δεύτερη λωρίδα), αλλά όχι για κυτοσολικό, κολοβωμένη TPR-TRKB [25] (τρίτη λωρίδα, αναμένεται σε ~ 50 kD), και όχι κατά την ΠΕ ελέγχου (λωρίδα 4) ή απουσία Σουλφο-ΝΗδ-ΕΟ-βιοτίνη (λωρίδα 5). IP του συνολικού πλήρους μήκους και αποκομμένες TRKB δείχνεται στο πάνελ πυθμένα. Αιχμές βελών δείχνουν πλήρους μήκους TRKB, βέλος δείχνει ακρωτηριασμένη TPR-TRKB (ακριβώς κάτω από βαριές αλυσίδες Ig).

Η

αξιολογηθεί κατά πόσον αυτές οι τέσσερις μεταλλάξεις σημείου TRKB καρκίνο προέρχεται αντιστοιχούν σε κερδίσει-του-λειτουργία μεταλλάξεων που σχετίζονται με αυξημένη ογκογόνο δυναμικό. Πραγματοποιήσαμε αυτή την ανάλυση σε αρουραίους επιθηλιακά κύτταρα πρώτα, επειδή είναι πολύ ευαίσθητα σε TRKB μεσολάβηση ογκογόνο μετασχηματισμό, όπως σημειώνεται από ένα μορφολογικό μετασχηματισμό ΕΜΤ-όπως, anoikis αντίσταση και ο σχηματισμός μεταστατικού όγκου σε γυμνούς ποντικούς [24] – [26]. Για το σκοπό αυτό, κλωνοποιήσαμε άγριου τύπου και μεταλλαγμένων TRKB στον φορέα έκφρασης ρετροϊικού pBabe-puro και μετάγονται εντερικά επιθηλιακά αρουραίου (RIE-1) κύτταρα καθώς και κύτταρα Ε1Α-αθανατοποιημένη νεφρό αρουραίου επιθηλιακά (RK3E). Και οι δύο κυτταρικές σειρές αθανατοποιημένα, ακόμη μη ογκογόνους σε αθυμικούς ποντικούς. Ως αρνητικός έλεγχος, εκφράσαμε μια κινάση ανενεργό μετάλλαγμα του TRKB, TRKB

K588M [34], το οποίο προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι ανίκανο ογκογονικώς μετασχηματισμού κυττάρων [25], [26] RIE-1. Εμείς επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδος Western ότι όλες οι μεταλλάξεις TRKB εκφράστηκαν σε παρόμοια επίπεδα με άγριου τύπου TRKB (Σχήμα 1C για κύτταρα RIE-1, Εικόνα S1A για κύτταρα RK3E). Σε συμφωνία με τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας [25], ανιχνεύσαμε TRKB ως πολλαπλά είδη σε SDS-πολυακρυλαμιδίου, πιθανότατα αντικατοπτρίζει διαφορικώς γλυκοζυλιωμένη είδη [35]. Επιπλέον, με την εκτέλεση ενός προσδιορισμού βιοτινυλιώσεως της κυτταρικής επιφανείας εξασφαλίσαμε ότι τουλάχιστον ένα ανιχνεύσιμο κλάσμα όλων των μεταλλακτών TRKB σωστά εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη [36] (Εικόνα 1D). Εμείς που παράγεται έτσι ένα σύστημα κυττάρων που μας επιτρέπει να συγκρίνουμε τις δραστηριότητες και τις λειτουργίες των διαφόρων μεταλλάξεων TRKB πλάι-πλάι.

Μετασχηματισμός δυναμικό των σημειακών μεταλλάξεων TRKB ανθρώπινου καρκίνου που προέρχονται από in vitro

Όπως και οι περισσότερες κινάσες , TRKB χρειάζεται ένα ελάχιστο επίπεδο ενεργοποίησης για το μετασχηματισμό επιθηλιακών κυττάρων. Υποθέσαμε ότι, εάν τα καρκινικά προερχόμενα μεταλλάξεις TRKB παρέχουν κέρδος της λειτουργίας, μπορούν να μετατρέψουν τα επιθηλιακά κύτταρα ακόμη και απουσία (ή με μειωμένα επίπεδα) του BDNF. Ωστόσο, όταν εξετάσαμε τα διάφορα μεταλλάγματα TRKB απουσία συν-εκφράζονται συνδετήρα, καμία από αυτές δεν προκάλεσε μία ατρακτοειδή μορφολογία κυττάρων (Σχήμα 2Α για RIE 1-κύτταρα, Σχήμα S1B για RK3E κύτταρα) ή καταστέλλεται anoikis (Σχήμα 2Β, Σχήμα S1c) απουσία του BDNF. Αυτό ήταν σε αντίθεση με ό, τι παρατηρήθηκε για την ιδιοσυστατικώς δραστική και ανεξάρτητη συνδεσμικού μεταλλαγμένο TPR-TRKB, η οποία έκανε το μετασχηματισμό RIE-1 και τα κύτταρα RK3E και κατέστειλε anoikis απουσία εξωγενούς BDNF, συνεπές με προηγούμενη αναφορά μας [25].

(Α) Μορφολογία των κυττάρων RIE-1 που εκφράζουν μεταλλαγμένη ή άγριου τύπου TRKB, φωτογραφήθηκε στο 50x μεγέθυνση. (Β) δοκιμασία Anoikis, στην οποία τα κύτταρα που περιγράφονται στο (Α) σπάρθηκαν σε τρυβλία ULC και σαρώνονται με 1x μεγέθυνση 9 ημέρες αργότερα (7 ημέρες για TPR-TRKB).

Η

Στη συνέχεια, ενεργοποιείται ο άγριου τύπου και μεταλλαγμένους υποδοχείς με σταθερώς συν-εκφράζουν ανθρώπινο BDNF, τόσο σε RIE-1 (Σχήμα 3Α) και κύτταρα RK3E (Σχήμα S1D). Σε συμφωνία με τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας [24] – [26], για κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου TRKB + BDNF αυτό οδήγησε σε ΕΜΤ-όπως μετασχηματισμός μορφολογικές (Σχήμα 3Β, Σχήμα S1E), προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης (Εικόνα 3C και Σχήμα S1F) και καταστολή anoikis (Σχήμα 3D, Εικόνα S1G). Το ίδιο παρατηρήθηκε για τα κύτταρα που εκφράζουν TRKB

L138F + BDNF και TRKB

P507L + BDNF. Αντίθετα, TRKB

T695I- και TRKB

κύτταρα D751N εκφράζουν ήταν μειωμένη σε απάντησή τους σε BDNF (Σχήμα 3Β, C, D, Εικόνα S1E, F, G). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι, αναπάντεχα, TRKB

T695I και TRKB

D751N είναι μειωμένη ως προς την ικανότητά τους να μετατρέπουν τα επιθηλιακά κύτταρα αρουραίου

in vitro

. Επιπλέον, TRKB

L138F και TRKB

P507L είναι δυσδιάκριτες από άγριου τύπου TRKB σε αυτή τη ρύθμιση.

(Α) RIE-1 κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένα ή άγριου τύπου TRKB μετήχθησαν με BDNF και αναλύονται για ανοσοστύπωμα (ΙΒ). Arrowhead δείχνει τη θέση του BDNF. Τουμπουλίνης χρησιμεύει ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Η μορφολογική μετατροπή των κυττάρων RIE-1 συν-εκφράζουν μεταλλαγμένο ή άγριου τύπου TRKB και BDNF, φωτογραφήθηκε στο 50x μεγέθυνση. (Γ) Η επιθηλιακά δείκτη Ε-καδερίνης ρυθμίζεται μειωτικά σε TRKB επαγόμενη, μορφολογικά μετασχηματισμένα κύτταρα, όπως εκτιμήθηκε με ανοσοστύπωση ανάλυση (ΙΒ). β-ακτίνη χρησιμεύει ως έλεγχος φόρτωσης. καταστολή (D) Anoikis από μεταλλαγμένα ή άγριου τύπου TRKB + BDNF στα κύτταρα που περιγράφονται στο (Α). Τα κύτταρα σαρώθηκαν σε μεγέθυνση 1x 9 ημέρες μετά την σπορά πάνω σε πλάκες ULC.

Η

Ανταπόκριση του ανθρώπινου καρκίνου που προέρχεται από μεταλλάξεις TRKB να BDNF

Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι TRKB μεσολάβηση ογκογόνο μετασχηματισμό του κύτταρα RIE-1 εξαρτάται καθοριστικά από την δραστηριότητα TRKB κινάσης [25], [26]. Σε αναζήτηση ενός βιοχημικού εξήγηση για τα απρόβλεπτα αποτελέσματα που περιγράφονται παραπάνω, προσδιορίσαμε αν τα καρκινικά προερχόμενα μεταλλάκτες TRKB διαφέρουν από άγριου τύπου TRKB στην απόκριση τους σε BDNF. Για τη μέτρηση της ενεργοποίησης TRKB, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα RIE-1 που εκφράζουν άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο TRKB αλλά όχι συνδέτη, και διεγείρονται τα κύτταρα με ένα φυσιολογικώς σχετικό εύρος του ανασυνδυασμένου BDNF. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες μας [25], [26], αυτή η επαγόμενη από αυτοφωσφορυλίωση του άγριου τύπου TRKB (Σχήμα 4Α και 4Β), και οδήγησαν στην ενεργοποίηση των δύο μεγάλων οδών κατάντη σηματοδότησης [22]: της οδού ΡΙ3Κ (με αποτέλεσμα φωσφορυλίωση της ΑΚΤ /ΡΚΒ? Σχήμα 4C) και η οδός ΜΑΡΚ (με αποτέλεσμα φωσφορυλίωση της ΜΑΡΚ /ΕΚΚ? Εικόνα 4D). Η έκθεση σε 1 ng /ml BDNF ήταν αρκετή για να προκαλέσει αυτοφωσφορυλίωση TRKB άγριου τύπου και ενεργοποιούν το μονοπάτι ΜΑΡΚ, ενώ υψηλότερες συγκεντρώσεις του BDNF απαιτήθηκαν για την ενεργοποίηση ΑΚΤ (Σχήμα 4Β, C, D και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). TRKB

L138F και TRKB

P507L ανταποκρίθηκαν στο BDNF παρόμοια με άγριου τύπου TRKB. Συνεπής με την ανικανότητά τους να καταστέλλουν anoikis, TRKB

T695I ήταν μόνο εν μέρει ενεργοποιούνται από BDNF, ενώ TRKB

D751N ήταν εντελώς αδιάφορη για BDNF, όμοια με κινάση ανενεργού TRKB

K588M (Σχήμα 4). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι TRKB

T695I και TRKB

οθόνη D751N μειωμένη ανταπόκριση σε BDNF διέγερση σε επιθηλιακά κύτταρα αρουραίου, ενώ TRKB

L138F και TRKB

P507L συμπεριφέρονται αδιακρίτως από άγριου τύπου TRKB.

(Α) κύτταρα RIE-1 που εκφράζουν άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο TRKB διεγέρθηκαν με 10 ng /ml ανασυνδυασμένης BDNF και αναλύθηκε για φωσφο-τυροσίνης (ρΥ) και το συνολικό περιεχόμενο TRK με ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) και επακόλουθη immunoblot ανάλυση (ΙΒ) . (Β) κύτταρα RIE-1 που εκφράζουν άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο TRKB διεγέρθηκαν με 1 ng /ml ανασυνδυασμένης BDNF και αναλύθηκαν για φωσφο (ρ) και το συνολικό TRK. (C) RIE-1 κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο TRKB διεγέρθηκαν με 10 ng /ml ανασυνδυασμένης BDNF και αναλύθηκαν για φωσφο- (p) ΑΚΤ και συνολική ΑΚΤ. αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 εφαρμόστηκε για την επιβεβαίωση της ταυτότητας του σήματος ρΑΚΤ υποδεικνύεται από το βέλος. Ο αστερίσκος (*) υποδεικνύει μία μη-ειδική ζώνη. Τα δείγματα φορτώθηκαν στις λωρίδες δύο και τρία χρησιμεύουν ως έλεγχοι και προήλθαν από ένα πείραμα επαναληπτικές εκτελείται υπό τις ίδιες συνθήκες. (D) κύτταρα RIE-1 που εκφράζουν άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο TRKB διεγέρθηκαν με 1 ng /ml ανασυνδυασμένης BDNF και αναλύθηκαν για φωσφο- (p) ERK και ολική ΕΚΚ. Για όλα τα πάνελ, οι αριθμοί υποδεικνύουν κάτω ποσοτικοποίηση των σημάτων φωσφο-ειδικό, κανονικοποιημένη με τις συνολικές σήματα και σε σχέση με εκείνα του φυσικού τύπου TRKB.

Η

ογκογόνο δυναμικό του ανθρώπινου καρκίνου που προέρχεται από μεταλλάξεις TRKB εκφράζονται σε αρουραίο επιθηλιακά κύτταρα

στη συνέχεια, ελέγξαμε την ογκογόνο δυναμικό του TRKB μεταλλακτών

in vivo

, σε πειράματα ξενομοσχεύματος ποντικού. Εμείς εμβολιάστηκαν υποδορίως Balb /c γυμνά ποντίκια με άγριου τύπου ή μεταλλαγμένα κύτταρα που εκφράζουν TRKB. Σε περίπτωση απουσίας του BDNF, μόνο άγριου τύπου TRKB-, TRKB

L138F- και TRKB

P507L κύτταρα που εκφράζουν RIE-1 (Σχήμα 5Α, Β, Εικόνα S2A, Β) και κύτταρα RK3E (Σχήμα S2E, F ) που σχηματίζεται μεγάλους όγκους με μικρή λανθάνουσες, αλλά κανένα από τα TRKB

T695I- ή TRKB

κύτταρα D751N εκφράζουν έκανε. Παρόμοια με αυτό, επίσης με την παρουσία του συν-εκφράζονται BDNF, TRKB

L138F και TRKB

P507L προκάλεσε όγκους παρομοίως με το αγρίου τύπου TRKB σε RIE-1 και κύτταρα RK3E (Σχήμα 5C, D, Εικόνα S2C, D και το Σχήμα S2G, Η). Σε αυτή τη ρύθμιση, RIE-1 TRKB

T695I + BDNF που εκφράζουν κύτταρα σχηματίζονται επίσης όγκους, αλλά με μια στατιστικά σημαντική καθυστέρηση, σε σύγκριση με RIE-1 TRKB

wt + BDNF που εκφράζουν κύτταρα (Σχήμα 5C, S2C). Αξίζει να σημειωθεί ότι, όταν 1 * 10

5 κύτταρα εμβολιάστηκαν, επίσης RIE-1 TRKB

D751N + BDNF-κύτταρα που εκφράζουν σχηματίζονται όγκοι, αλλά με μια σημαντική μεγαλύτερη καθυστέρηση από ό, τι εκείνες που προκαλούνται από RIE-1 TRKB

κ.β. + κύτταρα BDNF που εκφράζουν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε κύτταρα RK3E, η έκφραση του TRKB

D751N δεν οδήγησε σε σχηματισμό όγκου, ακόμη και με υψηλό αριθμό κυττάρων και με την παρουσία του BDNF, ενώ RK3E TRKB

T695I + BDNF κύτταρα που εκφράζουν σχημάτισαν όγκους με σημαντική μεγαλύτερη λανθάνουσα κατάσταση σε σύγκριση να RK3E TRKB

κβ + BDNF-κύτταρα που εκφράζουν (Σχήμα S2G). Κατά παρέκκλιση από ορισμένες διαφορές μεταξύ των δύο κυτταρικές σειρές, συνολικά, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι TRKB

T695I και TRKB

D751N έχουν απομειωθεί σε μετασχηματισμό επιθηλιακά κύτταρα αρουραίου και

in vivo

. Επιπλέον, ούτε TRKB

L138F ούτε TRKB

P507L εμφανίζει αυξημένη ογκογόνο δραστηριότητα σε σύγκριση με το αγρίου τύπου TRKB.

(Α) 1 * 10

6 RIE-1 κύτταρα που εκφράζουν TRKB (άγριας τύπου ή μεταλλαγμένο) εγχύθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές γυμνών ποντικών. n = 5 για wt και P507L, η = 4 για T695I και D751N. (Β) 1 * 10

6 RIE-1 κύτταρα που εκφράζουν TRKB (άγριου τύπου ή μεταλλαγμένη) εγχύθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές γυμνών ποντικών. n = 4 και για τις δύο κυτταρικές σειρές. (Γ) 1 * 10

4 RIE-1 κύτταρα συν-εκφράζουν BDNF και TRKB (άγριου τύπου ή μεταλλαγμένη) εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς. n = 6 για wt και P507L, η = 3 για T695I και D751N. (D) 1 * 10

5 RIE-1 κύτταρα συν-εκφράζουν BDNF και TRKB (άγριου τύπου ή μεταλλαγμένη) εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς. n = 4 και για τις δύο κυτταρικές σειρές. Σε όλα τα πειράματα, τα ποντίκια θυσιάστηκαν όταν το φορτίο του όγκου έφθασε 2 cm

2 και καμπύλη επιβίωσης Kaplan-Meier δείχνεται. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με μια δοκιμασία log-rank.

Η

BDNF ανταπόκριση του ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου προέρχονται από TRKB

T695I και TRKB

D751N εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

μια πιθανή εξήγηση για την διαταραγμένη δραστηριότητα του TRKB

T695I και TRKB

D751N στις δοκιμασίες που περιγράφονται παραπάνω είναι ότι τους πραγματοποιείται σε ένα aphysiological κυτταρικό περιβάλλον. Πράγματι, η καλωδίωση των ενδοκυτταρικών δικτύων σηματοδότησης και το πρότυπο έκφρασης του TRKB ρυθμιστικών παραγόντων μπορεί να μην είναι ταυτόσημες κατά μήκος των κυτταρικών τύπων. Στην ιδανική περίπτωση, πρέπει κανείς να εκτιμήσει την λειτουργία των μεταλλακτών TRKB στην αρχική τους πλαίσιο, δηλαδή, στα κύτταρα του όγκου στα οποία είχαν αρχικά ταυτοποιηθεί. Ωστόσο, δεν υπάρχουν κυτταρικές σειρές διαθέσιμες που εκφράζουν TRKB

T695I ή TRKB

D751N ενδογενώς. Επιπλέον, με τις γνώσεις μας, δεν υπάρχει πρωτογενές ανθρώπινη κυτταρική σειρά επιθηλιακών κόλον διαθέσιμα. Στοχεύοντας να χρησιμοποιήσετε ένα φυσιολογικά σχετικό κυτταρικό σύστημα, εμείς μετάγονται COLO 205 και Caco-2 κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος του παχέος εντέρου με TRKB

T695I ή TRKB

D751N και λαμβάνονται πολυκλωνικά πληθυσμούς που εκφράζουν σταθερά είτε υποδοχέα. Εμείς διεγείρονται αυτά τα κύτταρα με ανασυνδυασμένο BDNF και μεταγενέστερα αποτιμώνται TRKB αυτοφωσφορυλίωση και την ενεργοποίηση των μεταγενέστερων τελεστών. Παρόμοια με αυτό που παρατηρήθηκε σε κύτταρα RIE-1, και στα δύο κύτταρα COLO 205 και Caco-2, TRKB

T695I και TRKB

D751N ήταν λιγότερο άφθονα φωσφορυλιωμένη από άγριου τύπου TRKB κατά τη διέγερση με BDNF (Σχήμα 6). ERK φωσφορυλιώθηκε κατά τη διέγερση TRKB μόνο σε κύτταρα Caco-2, αλλά όχι σε κύτταρα COLO 205 (Σχήμα 6C, D). Αυτό είναι πιθανώς επειδή COLO 205 κύτταρα φιλοξενούν ένα BRAF

V600E μετάλλαξη (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic), το οποίο είναι ουσιαστικά δραστική και διεγείρει την ΜΑΡΚ σηματοδότηση [16]. Κατά την διέγερση των κυττάρων Caco-2 με BDNF, ούτε TRKB

T695I ούτε TRKB

επαγόμενη φωσφορυλίωση ERK D751N (Σχήμα 6D). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η TRKB

T695I και TRKB

μεταλλάκτες D751N είναι λιγότερο δραστικές όχι μόνο στα επιθηλιακά κύτταρα αρουραίου, αλλά και σε δύο κυτταρικές γραμμές καρκινώματος ανθρώπινου κόλον.

205 κύτταρα (Α) COLO και (Β) κύτταρα Caco-2 που εκφράζουν άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο TRKB διεγέρθηκαν με 10 ng /ml ανασυνδυασμένης BDNF και αναλύθηκε για φωσφο-τυροσίνη περιεχόμενο (Ργ) με ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) και ανάλυση ανοσοστυπώματος μετέπειτα (ΙΒ). λύματα (C) Cell του COLO 205 κύτταρα από το (Α) και (D) προϊόντα λύσης κυττάρων Caco-2 από (Β) αναλύθηκαν για φωσφο (ρ) και τη συνολική TRK και (ιστ) ERK. Ο αναστολέας U0126 ΜΕΚ εφαρμόστηκε για την επιβεβαίωση της ταυτότητας των pERK σημάτων. β-ακτίνης χρησιμεύει ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Νοκ ντάουν της ενδογενούς TRKB

L138F και TRKB

P507L σε ανθρώπινα καρκινικά κυτταρικές σειρές

Το γεγονός ότι TRKB

L138F και TRKB

P507L είναι ενδογενώς εκφράζονται σε κυτταρικές σειρές όγκων, μας έδωσε τη δυνατότητα να διερευνήσει κατά πόσον απαιτούνται για ογκογόνο φαινότυπο τους. Έχουμε εξαντληθεί TRKB

L138F και TRKB

P507L από NCI-Η2009 και MDA-MB-435 κύτταρα, αντιστοίχως, από την RNA παρεμβολής με δύο ανεξάρτητες, μη-επικαλυπτόμενα μικρή φουρκέτα (sh) RNA κατασκευάσματα. Πετύχαμε -75% προς τα κάτω ρύθμιση των TRKB σε κύτταρα ΝΟΙ-Η2009 (Σχήμα 7Α). Ωστόσο, αυτό δεν επηρέασε ούτε η μορφολογία των κυττάρων (Σχήμα 7Β πάνω πίνακα), ούτε αντίσταση anoikis (Σχήμα 7Β κάτω πίνακα). Ομοίως, -80% ρύθμιση προς τα κάτω του TRKB σε MDA-MB-435 κύτταρα (Σχήμα 7C) δεν είχε καμία επίδραση στην κυτταρική μορφολογία (Σχήμα 7D άνω πάνελ) και αντίσταση anoikis (Σχήμα 7D κάτω πίνακας). Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, τα επίπεδα Ε-καδερίνη δεν άλλαξαν κατά TRKB knockdown είτε κυτταρική γραμμή (Σχήμα 7Ε). Επιπλέον, κανένα αποτέλεσμα επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού παρατηρήθηκε (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Παρά το γεγονός ότι TRKB δεν εξαντληθεί πλήρως είτε σε κυτταρική γραμμή, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι (μεταλλαγμένο) TRKB σε NCI-Η2009 και MDA-MB-435 κυττάρων δεν είναι μια σημαντική κινητήρια δύναμη της μετασχηματισμένο φαινότυπο τους.

(Α) qRT-PCR αποδεικνύει νοκ ντάουν των επιπέδων TRKB mRNA με δύο μη επικαλυπτόμενα σύντομο φουρκέτες (sh). Μέσες τιμές τριών ανεξάρτητων μετρήσεων δείχνονται, ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. (Β) Νοκ ντάουν της TRKB ούτε επηρεάζει τη μορφολογία του μεγαλώνουν προσκολλημένα κύτταρα NCI-Η2009, φωτογραφήθηκε στο 50x μεγέθυνση (πάνω πίνακα), ούτε αντίσταση anoikis των κυττάρων NCI-Η2009 σε αιώρηση (κάτω πίνακας). πλάκες ULC σαρώθηκαν σε μεγέθυνση 1x 6 ημέρες μετά τη σπορά. (C) qRT-PCR αποδεικνύει νοκ ντάουν των επιπέδων TRKB mRNA με δύο μη επικαλυπτόμενα σύντομο φουρκέτες. Μέσες τιμές τριών ανεξάρτητων μετρήσεων δείχνονται, ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. (D) εξόντωση TRKB ούτε επηρεάζει μορφολογία των κυττάρων που μεγαλώνουν προσκολλημένα MDA-MB-435, φωτογραφήθηκαν σε μεγέθυνση 50χ, ούτε αντίσταση anoikis του MDA-MB-435 κύτταρα σε εναιώρημα (κάτω πίνακας). πλάκες ULC σαρώθηκαν σε μεγέθυνση 1x 6 ημέρες μετά τη σπορά. (Ε) εξόντωση TRKB σε ΝΟΙ-Η2009 και MDA-MB-435 κύτταρα δεν επηρεάζει Ε-καδερίνης επίπεδα πρωτεΐνης, όπως αξιολογείται με ανοσοκηλίδα ανάλυση (ΙΒ). Οι θετικές και αρνητικές εκθέσεις της ίδιας κηλίδα εμφανίζεται. β-ακτίνης χρησιμεύει ως έλεγχος φόρτωσης

Η

Συζήτηση

Τρεις σωματικά, μη συνώνυμες μεταλλάξεις σημείου TRKB έχουν αναφερθεί στις μελέτες αλληλουχίας νωρίς μεγάλης κλίμακας σε ανθρώπινους καρκίνους:. δύο σε όγκους παχέος εντέρου, TRKB

T695I και TRKB

D751N [17], και ένα σε μια κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, TRKB

L138F [19]. Εντοπίσαμε ένα επιπλέον σημείο TRKB μετάλλαξη, TRKB

P507L, στην κυτταρική σειρά ανθρώπινου μελανώματος MDA-MB-435. Αν και ορισμένες από αυτές τις μεταλλάξεις έχουν προταθεί ως υποψήφια γονίδια του καρκίνου οδήγησης [17], αναπάντεχα, η ανάλυσή μας σε επιθηλιακά κύτταρα αρουραίου και σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές απέτυχε να παράσχει υποστήριξη για μια επίδραση κέρδος-of-λειτουργίας για οποιοδήποτε από τα τέσσερα TRKB σημειακές μεταλλάξεις. Στην πραγματικότητα, οι δύο παχέος μεταλλάξεις που προέρχονται από όγκους σημείο TRKB συσχετίστηκαν με ακόμη μειωμένη δραστικότητα κινάσης και ογκογόνο δυναμικό, σε σύγκριση με άγριου τύπου TRKB. Σαν προειδοποιητική σημείωση, πρέπει να έχουμε κατά νου ότι δεν δοκιμάσει τις παχέος όγκους που προέρχονται από μεταλλαγμένα TRKB στην αρχική τους πλαίσιο, δηλαδή τους όγκους που εκφράζουν ενδογενώς TRKB

T695I ή TRKB

D751N, ενώ κυτταρικές σειρές που προέρχονται αυτών δεν είναι διαθέσιμες. Παρ ‘όλα αυτά, η έκθεση σε BDNF των δύο επιθηλιακών αρουραίου και ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κόλου που εκφράζουν αυτά τα μεταλλάγματα είχαν ως αποτέλεσμα τη μειωμένη ενεργοποίηση του υποδοχέα του TRKB

T695I και σχεδόν καθόλου ενεργοποίηση TRKB

D751N. Αυτό υποδηλώνει έντονα ότι αυτές οι μεταλλάξεις έχουν μειωμένη ενζυματική δραστηριότητα στο πλαίσιο του BDNF διέγερσης. Θέτει ακόμη το ενδεχόμενο ότι TRKB

T695I και TRKB

D751N μπορεί να δράσει σε ένα κυρίαρχο αρνητικό τρόπο, και ότι αγρίου τύπου TRKB μπορεί επίσης να έχει καταστολής όγκων δραστηριότητα (ή μια διπλή λειτουργία) στον καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά περαιτέρω μελέτες θα πρέπει να αντιμετωπιστούν αυτά τα σημαντικά ζητήματα. Δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι η απόκριση του TRKB

T695I και TRKB

D751N σε άλλους συνδετήρες TRKB μπορεί να είναι διαφορετικό από αυτό στο BDNF. Μπορούμε επίσης δεν αποκλείει επίσημα το ενδεχόμενο ότι TRKB

T695I και TRKB

D751N μπορεί να έχουν επιλεγεί από τις αρχικές όγκους, συμβάλλει στο σχηματισμό του όγκου με λειτουργίες που είναι διαφορετικές από εκείνες που δοκιμάσαμε

in vitro

. Τα θέματα αυτά δεν αντέχουν, πιστεύουμε ότι είναι δίκαιο να πούμε ότι αυτές οι μεταλλάξεις δεν πληρούν τα συμβατικά κριτήρια για μετάλλαξης ενεργοποίηση των κινασών υποδοχέα.

Θεωρητικά, όλες οι μεταλλάξεις που κατοικούν στην κυτταροπλασματική πλευρά του υποδοχέα θα μπορούσε να επηρεάσει τη δέσμευση της πρωτεΐνες προσαρμογέα ή υποστρώματα του TRKB, ανεξάρτητα από την επίδραση στην δραστικότητα της κινάσης. Η παρουσία και η λειτουργία αυτών των εταίρων δέσμευσης θα εξαρτηθεί από κυτταρικό περιβάλλον και μπορεί να είναι διαφορετική σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Αν και ο πρωτότυπος μηχανισμός για ογκογόνο λειτουργία των κινασών τυροσίνης είναι συστατική ή ενισχυμένη δραστικότητα κινάσης με αλλοιωμένη κατάντη σηματοδότησης [37], οι κινάσες τυροσίνης υποδοχέα μπορεί να έχει επίσης την κινάση-ανεξάρτητες λειτουργίες που συμβάλλουν στον καρκίνο. Αυτό έχει δειχθεί για άγριου-τύπου EGFR, η οποία, ανεξάρτητα από τη δράση κινάσης της, αλληλεπιδρά με τον τρόπο αυτό και σταθεροποιεί νάτριο /συμμεταφορέα γλυκόζη 1 (SLGT1) [38]. Ρύθμιση προς τα κάτω, αλλά δεν ενζυμική αναστολή, του EGFR οδηγεί σε μειωμένα επίπεδα SLGT1, μειωμένη πρόσληψη γλυκόζης και αυτοφαγία των κυττάρων του όγκου [38]. Το κατά πόσον ένα παρόμοια λειτουργία συνδέεται επίσης με TRKB δεν είναι γνωστή. Μια πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι η παραλλαγή ματίσματος TRKB-T1 κινάση ανεπάρκεια, μετά από τεχνητή υπερέκφραση, μπορεί να τονώσει τη μετάσταση των παγκρεατικών κυττάρων αδενοκαρκινώματος [39]. Απαιτείται περισσότερη έρευνα για να διαλευκανθεί κινάση-ανεξάρτητες λειτουργίες της TRKB και τη συμβολή τους σε κακοήθη νόσο, ιδίως για την αντιμετώπιση τυχόν ρόλος της ενδογενούς πρωτεΐνης στα καρκινικά κύτταρα.

Έχουμε εντοπίσει και χαρακτηρίζεται, επίσης, ένα νέο σημείο μετάλλαξης TRKB , TRKB

P507L, το οποίο απομονώθηκε από την κυτταρική γραμμή όγκου MDA-MB-435.