Αφηρημένο

Ο καρκίνος του τραχήλου είναι η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις γυναίκες, ιδιαίτερα στις αναπτυσσόμενες χώρες και Λοίμωξη από τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων, σε συνδυασμό με πολλαπλές απορυθμισμένη μονοπατιών σηματοδότησης οδηγεί στην αυχενική καρκινογένεση. ΤΟΡ-β σηματοδότηση σε μεταγενέστερα στάδια του καρκίνου είναι γνωστό ότι επάγει επιθηλιακή προς μεσεγχυματικά μετάβαση προώθηση της ανάπτυξης του όγκου. Φυτοχημικά, κουρκουμίνη και εμοδίνη, είναι αποτελεσματικά ως χημειοαποτρεπτικός και χημειοθεραπευτικών ενώσεων έναντι αρκετών μορφών καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Ο κύριος στόχος αυτής της εργασίας ήταν να μελετήσει την επίδραση της κουρκουμίνης και εμοδίνης σε TGF-β μονοπατιού σηματοδότησης και λειτουργική σημασία της για την ανάπτυξη, τη μετανάστευση και την εισβολή σε δύο καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές, SiHa και HeLa. Δεδομένου ότι ο ΤΟΡ-β και Wnt /β-κατενίνης οδών σηματοδότησης είναι γνωστό ότι cross talk έχουν κοινά κατάντη στόχοι, αναλύσαμε την επίδραση του ΤΟΡ-β επί β-κατενίνης (ένα σημαντικό παίκτη στην σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης) και επίσης μελετήθηκε εάν κουρκουμίνη και εμοδίνης διαμορφώνουν τους. Παρατηρήσαμε ότι η κουρκουμίνη και εμοδίνης αποτελεσματικά ρυθμίζουν προς τα κάτω ΤΟΡ-β οδού σηματοδότησης μειώνοντας την έκφραση του ΤΟΡ-β υποδοχέα II, Ρ-Smad3 και Smad4, και επίσης αντισταθμίζει τις ογκογόνα αποτελέσματα του ΤΟΡ-β με αναστολή της ΤΟΡ-β-επαγόμενη μετανάστευση και την εισβολή. Έκφραση των κατάντη επενεργητές του μονοπατιού σηματοδότησης ΤΟΡ-β, cyclinD1, ρ21 και Pin1, ανεστάλη μαζί με την προς τα κάτω ρύθμιση των βασικών δεικτών μεσεγχυματικών (σαλιγκάρι και Slug) κατά κουρκουμίνη και εμοδίνη θεραπεία. Η κουρκουμίνη και εμοδίνη βρέθηκαν επίσης να αναστέλλουν συνεργικά κυτταρικό πληθυσμό και τη μετανάστευση σε κύτταρα SiHa και HeLa. Επιπλέον, βρήκαμε ότι ο ΤΟΡ-β ενεργοποιεί μονοπάτι σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης σε κύτταρα HeLa, και η κουρκουμίνη και εμοδίνης ρυθμίζουν προς τα κάτω την οδό μέσω της αναστολής β-κατενίνης. Λαμβανόμενα μαζί τα δεδομένα μας παρέχουν μια μηχανιστική βάση για τη χρήση της κουρκουμίνης και εμοδίνης στη θεραπεία του καρκίνου του τραχήλου

Παράθεση:. Thacker PC, Karunagaran D (2015) Η κουρκουμίνη και Emodin μειορυθμίζουν ΤΟΡ-β μονοπάτι σηματοδότησης σε Ανθρώπινα τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 10 (3): e0120045. doi: 10.1371 /journal.pone.0120045

Ακαδημαϊκό Συντάκτης: Eric Asselin, Πανεπιστήμιο του Κεμπέκ στο Trois-Rivieres, Καναδάς

Ελήφθη: 30 Οκτ, 2014? Αποδεκτές: 2 του Φεβρουαρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 18 Μάρτη του 2015

Copyright: © 2015 Thacker, Karunagaran. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του τραχήλου είναι η τέταρτη κύρια αιτία που σχετίζονται με τον καρκίνο θανάτους στις γυναίκες παγκοσμίως και περισσότερο από το 85% του τραχήλου της μήτρας περιπτώσεων και των θανάτων από καρκίνο συμβαίνουν στις αναπτυσσόμενες χώρες, εκ των οποίων, η Ινδία έχει αναφερθεί ότι αντιπροσωπεύουν το 27% του συνόλου του τραχήλου της μήτρας των θανάτων από καρκίνο [1]. Ο υποκείμενος μηχανισμός προώθηση του τραχήλου της μήτρας ογκογένεση είναι σύνθετη και περιλαμβάνει απορρύθμιση των βασικών οδών σηματοδότησης εκτός από τον σημαντικό ρόλο που διαδραματίζουν οι HPV (Human Papilloma Virus) λοίμωξης [2]. μονοπάτι σηματοδότησης ΤΟΡ-β εμπλέκεται σε πολύπλοκες κυτταρικές διεργασίες που ρυθμίζουν την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και την ομοιόσταση [3]. ΤΟΡ-β συνδετήρας συνδέεται προς τον υποδοχέα ΤΟΡ-β II, ενεργοποιώντας ΤΟΡ-β υποδοχέα Ι με διαφωσφορυλίωση, που με τη σειρά ενεργοποιεί R-Smads (Smad2 και Smad3) μέσω φωσφορυλίωσης στο C-τερματικά υπολείμματα τους. Ενεργοποιημένος R-Smads σχηματίζουν ένα heterocomplex με Smad4 και μετατοπίζονται στον πυρήνα όπου ενεργοποιούν γονιδίων που αποκρίνονται ΤΟΡ-β [4]. Στα πρώιμα στάδια της ογκογένεσης, μονοπατιού σηματοδότησης ΤΟΡ-β δρα ως καταστολέας όγκου πρόληψη της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου μέσω της G

1 φάση με την προς τα κάτω ρύθμιση των πρωτεϊνών CyclinD1 και εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση (CDK) και επαγωγή του ρ15

INK4B, p16

ΙΝΚ4 &, τα οποία αναστέλλουν CDK4 και CDK6? Ομοίως, p21

Cip1or p27

Kip1appears να εκπληρώσει τη λειτουργία του p15

INK4B σε περίπτωση απουσίας του [5, 6]. ΤΟΡ-β-απόπτωση είναι γνωστό ότι αυξάνει την αναλογία της έκφρασης προαποπτωτικών Bax και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 [7]. Ωστόσο, σε προχωρημένα στάδια του καρκίνου, σηματοδότηση ΤΟΡ-β είναι επίσης αποδειχθεί ότι προάγει την διεισδυτικότητα και τη μετάσταση επάγοντας την έκφραση σαλιγκάρι και άλλους παράγοντες μεταγραφής προκαλώντας έτσι τη διαφοροποίηση των επιθηλιακών να μεσεγχυματικών φαινότυπο [8]. Οι Slug και Ν-καδερίνης, γνωστούς παίκτες του ΕΜΤ, που προκαλείται από ΤΟΡ-β που εμπλέκονται στην μετανάστευση και εισβολή [9], και ΤΟΡ-β-διαμεσολαβούμενη επαγωγή της Ν-καντερίνης περιλαμβάνει Pin1 (πεπτιδυλο-προλυλο cis /trans ισομεράσης), γνωστού να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ΤΟΡ-β επαγόμενη μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων [10]. ΤΟΡ-β είναι επίσης αποδειχθεί ότι διεγείρει την έκφραση cyclinD1 τουλάχιστον εν μέρει μέσω της ενεργοποίησης του Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση [11]. Σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης είναι γνωστό ότι ρυθμίζει ευρύ φάσμα κυτταρικών διεργασιών που ρυθμίζουν την ικανότητα του πολυλειτουργικού πρωτεΐνης β-κατενίνης για να ενεργοποιηθεί η μεταγραφή των γονιδίων που εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση, πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, και άλλες οδούς σηματοδότησης [12]. Απορρύθμιση της σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την καρκινογένεση, και οι μεταβολές στην οδό σηματοδότησης /β-κατενίνης Wnt αναφερόμενη στην αυχενική νεοπλασία [13]. Wnt συνδέτης δεσμεύεται με την διαμεμβρανική κατσαρωμένα υποδοχείς, σταθεροποιώντας β-κατενίνης με αναστολή της δραστικότητας της συνθάσης του γλυκογόνου κινάσης 3 β (GSK-3 β), που συνδέεται με ένα πολυμερικό σύμπλοκο θάνατος που αποτελείται από αξίνη, αδενομάτωσης polyposis coli (APC) και κινάση καζεΐνης 1α (CK1α), όπου CK1α και διαδοχικά φωσφορυλίωση της β-κατενίνης GSK-3β, το CE για ουμπικουιτίνωση και την υποβάθμιση του πρωτεασώματος. Σε απόκριση στην ενεργοποιημένη σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης, η GSK-3 β αναστέλλεται από αναμαλλιασμένος πρωτεΐνες, οπότε, β-κατενίνη συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα και μετατοπίζεται εντός του πυρήνα. Στο πυρήνα, β-κατενίνης σε συνδυασμό με τον παράγοντα Τ-κυττάρων παράγοντα /ενισχυτή λεμφοκυττάρων (TCF /Lef) οικογενειακές και άλλες μεταγραφικές συμπαράγοντες, ενεργοποιεί μια ποικιλία γονιδίων στόχων, συμπεριλαμβανομένων c-myc και κυκλίνης D1 [14]. Η σύγκλιση των ΤΟΡ-β και σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης προωθεί επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση επάγοντας την έκφραση σαλιγκάρι και Slug [15]. Υπάρχει μια σημαντική αύξηση στην έκφραση του ΤΟΡ-β mRNA και πρωτεΐνης σε ανθρώπινους καρκίνους και υψηλή έκφραση του ΤΟΡ-β συσχετίζεται με πιο προχωρημένα στάδια της κακοήθειας και μειωμένη επιβίωση [16]. Τα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας είναι γνωστό ότι εκκρίνουν ΤΟΡ-β [17], το οποίο είναι σε θέση αυξάνοντας εντός του όγκου στρώματος και τη μείωση του όγκου διήθηση, ενισχύοντας την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση, ενώ καταστρατήγηση ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή [18]. Ο κεντρικός ρόλος του ΤΟΡ-β για την προώθηση της προόδου των όγκων προτείνει ότι το μονοπάτι σηματοδότησης μπορεί να είναι ένας καλός στόχος για θεραπεία του καρκίνου [16]. Οι τρέχουσες θεραπευτικές επιλογές για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, όπως ακτινοθεραπεία, χειρουργική επέμβαση και χημειοθεραπεία, ειδικά στις αναπτυσσόμενες χώρες, έχουν τους περιορισμούς τους οφείλεται κυρίως στην μη διαθεσιμότητα του τρόπου θεραπείας, το κόστος, τη σοβαρότητα των παρενεργειών, η υψηλή συστημική τοξικότητα και ανθεκτικότητα στα φάρμακα και συχνή ανάπτυξη της υπογονιμότητας μεταθεραπευτική [19]. Επιπλέον, αυξάνοντας την αντίσταση στη χημειοθεραπεία που αναδύεται μέσα από την απορρύθμιση των καταρρακτών σηματοδότησης είναι μια μεγάλη πρόκληση για την αποτελεσματική θεραπεία και σηματοδότηση TGF-β είναι ένα από τα μονοπάτια σηματοδότησης που είναι γνωστό ότι προκαλούν χημειο-αντίσταση μέσω της επαγωγής της EMT [20]. Χημειοπροληπτικές φυτοχημικά στοχεύουν διάφορα καταρράκτες ενδοκυτταρική σηματοδότηση για την αναστολή της προώθησης του όγκου, τον πολλαπλασιασμό και την εξέλιξη [21]. Η κουρκουμίνη, μια πολυφαινόλη που προέρχεται από

Curcuma longa

και εμοδίνης, ένα ανθρακινόνης παρούσα σε ρίζες και φλοιούς των πολλών φαρμακευτικών φυτών πιστεύεται ότι δρουν διαμορφώνοντας απελευθερωμένης μονοπάτια σηματοδότησης σε νεοπλασματικά κύτταρα [22, 23]. Η κουρκουμίνη είναι γνωστό ότι επάγει απόπτωση και να μπλοκάρει την εξέλιξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας [24-26] και εμοδίνη επίσης δειχθεί ότι διεγείρει απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του τραχήλου [27, 28]. Η κουρκουμίνη είναι γνωστό ότι αναστέλλει σηματοδότηση ΤΟΡ-β σε μαστού και παγκρέατος [29, 30] ενώ εμοδίνη είναι γνωστό ότι ρυθμίζει διαφορικά σηματοδότηση ΤΟΡ-β σε ένα πλαίσιο με τρόπο που εξαρτάται [31, 32], ωστόσο, η επίδραση αυτών των φυτοχημικών επί TGF -β σηματοδότηση του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να μελετηθεί.

Έτσι, ο κύριος στόχος αυτής της εργασίας ήταν να μελετήσει την επίδραση της κουρκουμίνης και της οδού εμοδίνης σε TGF-β σηματοδότηση και λειτουργική σημασία της για την ανάπτυξη και τη μετανάστευση στην δύο τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές, SiHa και HeLa. Περαιτέρω, ήταν ενδιαφέρον να μελετηθεί εάν το συνδυασμένο αποτέλεσμα των ενώσεων αυτών είχε οποιαδήποτε συνεργιστική ή προσθετικά αποτελέσματα. Παρατηρήσαμε ότι η κουρκουμίνη και εμοδίνης ρυθμίζουν προς τα κάτω ΤΟΡ-β οδό σηματοδότησης σε κύτταρα SiHa και HeLa, και επίσης αντισταθμίζει τις ογκογενητικών αποτελεσμάτων του ΤΟΡ-β με αναστολή ΤΘΡ-β-επαγόμενη μετανάστευση και εισβολή αυτών των κυττάρων. Επίσης, ο συνδυασμός της κουρκουμίνης και εμοδίνης συνεργιστικά ανέστειλε την κυτταρική βιωσιμότητα σε κύτταρα SiHa και HeLa.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Η κουρκουμίνη, εμοδίνη, 5, 5′, 6 , 6′-τετραχλωρο-1, 1′, 3, ιωδιούχο 3′-tetraethylbenzimidazol-καρβοκυανίνη (JC-1) αγοράστηκαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ? USA). Ένα 10 mM διάλυμα της κάθε ένωσης (κουρκουμίνη ή εμοδίνη) παρασκευάστηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), αποθηκεύονται ως μικρά δείγματα στους -20 ° C, και στη συνέχεια αραιώνεται περαιτέρω σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας, όπως απαιτείται. DMSO (0.4%) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος όχημα για όλα τα πειράματα. Ανθρώπινη ΤΟΡ-β1was αγοράστηκε από την Peprotech (USA). Geltrex, ιωδιούχο προπίδιο, Lipofectamine 2000, κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS Νοτιοαφρικάνικη προέλευσης) αγοράσθηκαν από την GIBCO (Invitrogen, Carlsbad, CA? USA). Πολυαιθυλενοϊμίνης (ΡΕΙ) αγοράστηκε από την Polysciences (Warrington, ΡΑ, USA). μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου και Ενισχυμένη κιτ χημειοφωταύγειας ελήφθησαν από BIORAD (Hercules, CA? USA). Πρωτεάσης και του αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ αγοράστηκε από την Sigma (St. Louis, ΜΟ? USA). β-ακτίνης αντίσωμα αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ? USA) και αντισώματα προς ΤΟΡ-β υποδοχέα Ι, ΤΟΡ-β υποδοχέα II, Smad4, Ν-cadherin, Pin1, β-κατενίνης, ΟδΚ3β και P- ΟδΚ3β (Ser9) ελήφθησαν από την Santa Cruz (CA? USA). Αντισώματα προς Ρ-Smad2, Smad2, Ρ-Smad3, Smad3, σαλιγκάρι, CyclinD1, Slug, Bax, Bcl-2 και ρ15, ρ16, ρ21, ρ27 ήταν από τη Cell Signaling (Danvers, ΜΑ? USA) και υπεροξειδάση κρένου δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο λήφθηκε από Jackson ImmunoResearch Inc. (USA).

Κυτταροκαλλιέργεια

Ανθρώπινο τραχηλικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές, HeLa και SiHa, ελήφθησαν από το Εθνικό Κέντρο Επιστημών κυττάρων (NCCS) Pune της Ινδίας . Ήταν καλλιεργήθηκαν σε πλήρες του Dulbecco Modified Eagle Medium (cDMEM) αποτελούμενο από DMEM συμπληρωμένο με στρεπτομυκίνη (100 μg /ml), πενικιλλίνη (100 U /ml) και 10% FBS. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37

0C με 5% CO

2.

Η ρεσαζουρίνη δοκιμασία μείωσης

Ανάλυση κυτταροτοξικότητας καθορίστηκε από ρεσαζουρίνη δοκιμασία μείωσης [33]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια 96 φρεατίων πλάκα σε μια πυκνότητα 5.000 ανά φρεάτιο και αναπτύχθηκαν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης και εμοδίνης με ή χωρίς 5ng /ml του ΤΟΡ-β σε cDMEM για 48 ώρες. Η ρεσαζουρίνη βαφή προστέθηκε στο μέσο σε τελική συγκέντρωση 0,1 mg /ml, επωάστηκαν για 3 ώρες για τη μείωση του μπλε χρωστική ρεζαζουρίνης σε ροζ ρεζορουφίνη και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 και 595 nm. Τα δεδομένα αναλύθηκαν ως ποσοστό ελέγχου, όπου τα φρεάτια ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ισοδύναμες ποσότητες μόνο DMSO. Τα ανέλυσαν δεδομένα που αντιπροσωπεύουν ποσοστό πληθυσμού κυττάρων, χαράσσονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (S.E.M.). IC

50 λήφθηκε με προσδιορισμό της συγκέντρωσης των ενώσεων που προκύπτουν σε 50% αναστολή του κυτταρικού πληθυσμού μετά 48 ώρες θεραπείας με τη χρήση του λογισμικού GraphPad PRISM (GraphPad Software, Inc.).

χρώση JC-1

JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine ιωδίδιο) είναι μια λιπόφιλη φθορίζουσα κατιονική χρωστική που χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΔΨ) σε κύτταρα [34]. Ακέραια ΔΨπι εμφανίζει αρνητικό φορτίο, επιτρέποντας η χρωστική JC-1 για να εισέλθουν στην μιτοχονδριακή μήτρα όπου συσσωρεύεται σχηματίζοντας συσσωματώματα που φθορίζουν κόκκινο ενώ η μιτοχονδριακή μεμβράνη καταρρέει στα αποπτωτικά κύτταρα, και έτσι JC-1 δεν μπορεί να συσσωρευτεί στα μιτοχόνδρια των κυττάρων αυτών, όπου το παραμένει στο κυτταρόπλασμα σε μονομερή μορφή που φθορίζουν πράσινο. Η μείωση της αναλογίας του κόκκινο σε πράσινο φθορισμού της χρωστικής είναι μια ένδειξη της μειωμένης ΔΨ των κυττάρων. Μετά την επεξεργασία της κουρκουμίνης και εμοδίνης σε παρουσία ή απουσία του ΤΟΡ-β για 48 ώρες, το μέσο που περιέχει JC-1 (τελική JC-1 συγκέντρωση -5 μg /mL) προστέθηκε στα κύτταρα, που ακολουθείται από επώαση για 20 λεπτά στους 37 ° ΝΤΟ. Ακολούθως τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS και ο φθορισμός μετρήθηκε σε διέγερση: 485? εκπομπής: 535 για μονομερή μορφή (πράσινο φθορισμό) και διέγερση 550? εκπομπή 600 για τα αδρανή υλικά (ερυθρός φθορισμός), χρησιμοποιώντας Perkin Elmer Enspire αναγνώστη πολλαπλών δίσκων. Αναλογία κόκκινο σε πράσινο φθορισμό αναλύθηκε και καταγράφεται σε κατάλληλες συνθήκες θεραπείας.

πληγή επούλωση δοκιμασία

Οι αλλαγές στη μετανάστευση των κυττάρων κατά την αγωγή μελετήθηκαν με τη χρήση επούλωση των πληγών δοκιμασία. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν ως μονοστιβάδα σε μία πλάκα 48 φρεατίων και σε 100% συρροή? μια γρατσουνιά έγινε με μονοστιβάδας. Τα κύτταρα πλένονται απαλά και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κουρκουμίνη και εμοδίνης σε παρουσία ή απουσία του ΤΟΡ-β και διατηρήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό. μετανάστευση των κυττάρων στην επιφάνεια του τραύματος παρακολουθήθηκε με μικροσκοπία. Εικόνες του μηδέν ελήφθησαν σε μεγέθυνση 4χ αμέσως μετά την προσθήκη του εμοδίνης και μετά 48 ώρες. Η έκταση της μετανάστευσης σε κάθε δείγμα μετρήθηκε ως η περιοχή που καλύπτεται από τα κύτταρα στις 48 ώρες με τη χρήση λογισμικού ανάλυσης Tscratch [35] και εκφράζεται ως ποσοστό του ελέγχου.

Matrigel εισβολής δοκιμασία

Ο καρκίνος του τραχήλου κυττάρων εισβολή εκτιμήθηκε με δοκιμασία Boyden χρησιμοποιώντας Transwell θαλάμους (8 μm μέγεθος πόρου? Costar, ΜΑ, USA). Chambers επικαλύφθηκαν με 100 μΙ Matrigel και επωάστηκαν όλη τη νύκτα. Στερούνται ορού SiHa (25.000) και HeLa (50000) κύτταρα σπάρθηκαν σε άνω θαλάμους των Matrigel επικαλυμμένα φρεάτια (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) που περιέχει 100 μλ DMEM συν την επιθυμητή θεραπεία. Η κουρκουμίνη ή εμοδίνη που περιέχουν ϋΜΕΜ με ή χωρίς ΤΟΡ-β, συμπληρωμένο με 10% FBS τοποθετήθηκε στους κατώτερους θαλάμους, και τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν μέσα από το φίλτρο για 48 ώρες. Κύτταρα τα οποία απέτυχαν να μεταναστεύσουν απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια των θαλάμων με απόξεση με ένα βαμβάκι. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν με επιτυχία μέσα από την Matrigel και το φράγμα μεμβράνης προς το κατώτερο μεμβράνη μονιμοποιήθηκαν σε 100% μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 2% κρυσταλλικό ιώδες. Εικόνες των χρωματισμένων κυττάρων συλλήφθηκαν σε 10Χ μεγέθυνση. Η έκταση της εισβολής εκφράστηκε ως ποσοστό ελέγχου που συνάγεται από την απορρόφηση του κρυσταλλικού ιώδους απελευθερώνονται με λύση των κυττάρων με 10% οξικό οξύ σε 595 nm.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

προπιδίου χρώση ιωδιούχου και της ροής κυτταρομετρία χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί το προφίλ κατανομής του κυτταρικού κύκλου. Τα επεξεργασμένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS EDTA και στη συνέχεια συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 0.25% θρυψίνη EDTA και αιωρούνται σε cDMEM. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και φυγοκεντρήθηκαν στις 1200 rpm στους 4 ° C για 5 λεπτά και επαναιωρήθηκαν σε 300 μL PBS, μονιμοποιήθηκαν με 0,7 ml αιθανόλης 70% για όλη τη νύχτα. Σταθερή κύτταρα περιδινίστηκαν, πλύθηκε με 0.1% FBS που περιείχε PBS και στη συνέχεια εναιωρήθηκαν σε 300 μL ιωδιούχο προπίδιο (2 μg /mL) διάλυμα χρώσης με RNase Α (200 μg /mL) στο σκοτάδι, επωάζεται στους 37 ° C για 1 ώρα. Τα δεδομένα από 10.000 κύτταρα συλλέχθηκαν για κάθε δείγμα. Η απόκτηση δεδομένων και ανάλυση διεξήχθησαν σε ένα κυτταρόμετρο ροής (Beckman Coulter κύτταρο εργαστήριο Quanta).

SBE και TOPFlash αναφοράς λουσιφεράσης δοκιμασία

Cells (30.000 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες και συν 96 -επιμολυσμένα με κατασκεύασμα αναφοράς SBE4-Luc, που περιείχε τέσσερα αντίγραφα της θέσης δέσμευσης Smad (GTCTAGAC) κλωνοποιήθηκε σε ρΒν-Luc ενδεικτική της κατάντη μεταγραφική ενεργοποίηση του ΤΟΡ-β οδού σηματοδότησης (Addgene πλασμίδιο 16495) [36] ή TOPFlash, μια λουσιφεράση ρεπόρτερ του β-κατενίνης μεσολαβεί μεταγραφική ενεργοποίηση, με 7 TCF /LEF θέσεις ανάντη λουσιφεράσης σύνδεσης (Addgene πλασμίδιο 12456) [37] και ρΡΙ_-ΤΚ (λουσιφεράση της Renilla) πλασμίδιο χρησιμοποιώντας ΡΕΙ (για κατασκεύασμα SBE λουσιφεράσης) και Lipofectamine 2000 (για κατασκεύασμα λουσιφεράσης TOPFlash) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, σε ορό και αντιβιοτικό ελεύθερο DMEM. Έξι ώρες μετά την επιμόλυνση, το μέσο άλλαξε και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κουρκουμίνη και εμοδίνης σε παρουσία ή απουσία του ΤΟΡ-β σε cDMEM. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα λύθηκαν και πυγολαμπίδας και αναλύθηκαν δραστηριότητες λουσιφεράσης Renilla [38].

απομόνωσης πρωτεϊνών και κηλίδωση Western

Τα κύτταρα πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) 48 ώρες μετά την αγωγή , και η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται μετά απόξεση και τη συλλογή των κυττάρων σε δοκιμασία ράδιο κατακρήμνιση ανοσο (RIPA) ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [20 mM Tris (ρΗ 7.5), 150 mM χλωριούχο νάτριο, 1 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξικό οξύ, 1 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 1% Triton Χ 100 , πυροφωσφορικό νάτριο 2.5mM, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 1 mM φαινυλ μεθάνιο σουλφονυλ φθορίδιο, 20 mM φθοριούχο νάτριο, αναστολέας πρωτεάσης 1%], επωάστηκε για 1 ώρα, και φυγοκεντρήθηκε. Ολικής κυτταρικής πρωτεΐνης στο υπερκείμενο υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία Bradford, και 30 μικρογραμμάρια πρωτεΐνης υποβλήθηκε σε διαχωρισμό SDS-PAGE ακολουθούμενη από μεταφορά σε μεμβράνη polyvinylidenedifluoride. Η μεμβράνη επωάστηκε με πρωτεύοντα αντισώματα έναντι του υποδοχέα του ΤΟΡ-β Ι, υποδοχέα ΤΟΡ-β II, Ρ-Smad2, Smad2, Ρ-Smad3, Smad3, Smad4, β-κατενίνης, της ΟδΚ3β, Ρ-ΟδΚ3β (Ser9), Ν-cadherin , Pin1, σαλιγκάρι, CyclinD1, Slug, Bax, Bcl-2, ρ15, ρ16, ρ21, ρ27, CDK6 (αραίωση 1: 1000), ή β-ακτίνης (αραίωση 1: 10.000) όλη τη νύκτα, που ακολουθείται από επώαση με ένα ΗΡνΡ- συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα. Οι ζώνες της πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με χρήση ενισχυμένης κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας και οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας το σύστημα ανάλυσης εικόνας Versa Doc (Bio-Rad).

Στατιστική ανάλυση

Δύο T-test ή δύο μη ζευγαρωμένα ουρά σπουδαστή ανάλυση διακύμανσης χρησιμοποιήθηκε για την στατιστική ανάλυση των μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων δειγμάτων ή όπως υποδεικνύεται. τιμές P & lt? 0.05, 0.01and 0.001 υποδεικνύονται με ‘*’ ‘** »και« *** », αντίστοιχα.

Αποτελέσματα

Η κουρκουμίνη και εμοδίνης επάγουν κυτταροτοξικότητα παρουσία ή απουσία ΤΟΡ β σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας

Έχουμε δοκιμάσει τις επιδράσεις διαφόρων συγκεντρώσεων της κουρκουμίνης και εμοδίνης στις βιωσιμότητες των ανθρώπινου τραχηλικού καρκινικά κύτταρα και το IC

50 τιμές που υπολογίζονται από τα δεδομένα αυτά παρατίθενται στον πίνακα 1. η κουρκουμίνη ήταν σχετικά περισσότερο κυτταροτοξική σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του τραχήλου της μήτρας που αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη (Πίνακας 1) και χρησιμοποιήθηκε σε 15μΜ σε SiHa και 25μΜ σε κύτταρα HeLa, ενώ εμοδίνη χρησιμοποιήθηκε σε 40 μΜ σε SiHa και HeLa κύτταρα για περαιτέρω πειράματα. Δεδομένου ότι η έκκριση του ΤΟΡ-β στο στρώμα παρατηρείται συχνά κατά την διάρκεια των προχωρημένα στάδια του καρκίνου του τραχήλου [18], θέλαμε να μελετήσουμε την επίδραση αυτών των ενώσεων με την παρουσία του ΤΟΡ-β. Σύμφωνα με προηγούμενη αναφορά μας, 5ng /ml ΤΟΡ-β μείωσε τον κυτταρικό πληθυσμό [39] και ανέστειλαν δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης σε κύτταρα SiHa (Εικ. 1Α και C), ενώ τα κύτταρα HeLa παρέμεινε ανεπηρέαστη (Σχ. 1 Β και D). Η κουρκουμίνη και εμοδίνη βρέθηκαν να αναστέλλουν σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων (Σχ. 1Α και Β) όπως παρατηρείται από ρεσαζουρίνη δοκιμασία αναγωγής παρουσία όσο και απουσία του ΤΟΡ-β στα κύτταρα αυτά. Η μείωση του μιτοχονδριακού δυναμικού μεμβράνης (Σχ. 1C και D) που έφερε ο κουρκουμίνη ή εμοδίνη όπως αναλύεται με JC-1 βαφή φθορισμομετρία ήταν σημαντική σε κύτταρα SiHa και HeLa. Ωστόσο, αυτή η επίδραση ήταν ανεξάρτητη του ΤΟΡ-β σε HeLa αλλά δεν ήταν σημαντική σε παρουσία του ΤΟΡ-β σε κύτταρα SiHa (Εικ. 1 C και D). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι αν και ο ΤΟΡ-β μείωσε την ανάπτυξη των κυττάρων και το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης σε SiHa αλλά όχι σε κύτταρα HeLa, αυτό δεν επηρέασε την κουρκουμίνη ή εμοδίνης μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης και το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης σε αυτά τα κύτταρα.

κύτταρα SiHa (Α) και HeLa (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 15 και 25 μΜ κουρκουμίνη, αντίστοιχα ή 40 μΜ εμοδίνης με την παρουσία (ΤΟΡ-β) ή απουσία (UT) του 5 ng /ml ΤΟΡ-β για 48 ώρες και προσδιορίστηκαν για τη βιωσιμότητα των κυττάρων από ρεσαζουρίνη μέθοδο μείωσης. βιωσιμότητα Ποσοστό κύτταρο υπολογίστηκε με κανονικοποίηση της απορρόφησης των δειγμάτων σε επεξεργασία κατά τον έλεγχο DMSO (η = 3, μέσος όρος ± S.E.M.). Η κουρκουμίνη ή εμοδίνης επεξεργασμένα κύτταρα SiHa (C) και HeLa (D) υπό την παρουσία (ΤΟΡ-β) και απουσία (UT) του ΤΟΡ-β προσδιορίστηκαν για δραστικότητα JC-1 χρησιμοποιώντας μια φθορομετρική μέθοδο όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται ως φορές μεταβολής της μέσης έντασης φθορισμού (MFI) σε σχέση με τον έλεγχο DMSO (n = 3, μέση τιμή ± SEM).

Η

Από 5 ng /ml ΤΟΡ-β δεν έχουν εξετάστηκε οποιαδήποτε σημαντική επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων ή δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης σε κύτταρα HeLa, αν μια διαφορετική συγκέντρωση του ΤΟΡ-β θα έχουν παρόμοια ή διαφορετική απάντηση. Από αυτή την άποψη, τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του ΤΟΡ-β και η επίδρασή της επί της σηματοδότησης του αξιολογήθηκε αναλύοντας τη δραστικότητα του κατασκευάσματος ανταποκριτή SBE-Luc ΤΟΡ-β-απόκρισης, σε μία δοκιμασία αναγνώσεως. Παρατηρήθηκε ότι 2,5 ng /ml ΤΟΡ-β επαγόμενη σημαντικά τη δραστικότητα της λουσιφεράσης SBE αλλά δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην έκταση της επαγωγής με αύξηση της συγκέντρωσης του (Εικ. 2Α). Περαιτέρω, τα κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του ΤΟΡ-β σε παρουσία ή απουσία της κουρκουμίνης ή εμοδίνης αξιολογήθηκαν για μεταβολές βιωσιμότητα των κυττάρων και το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης. Διαφορετικές συγκεντρώσεις του ΤΟΡ-β δεν είχε σημαντική επίδραση επί της κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχ. 2Β) ή δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (Σχ. 2C), και δεν επηρέασε την αναστολή της κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχ. 2Β) ή δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (Σχ. 2C) από κουρκουμίνη και εμοδίνης σε αυτά τα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έλλειψη ανταπόκρισης των κυττάρων HeLa σε ΤΟΡ-β προς τη βιωσιμότητα των κυττάρων και το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης ήταν ανεξάρτητη από τη συγκέντρωση, και επίσης ΤΟΡ-β δεν επηρέασε την δραστικότητα αναστολής της ανάπτυξης της κουρκουμίνης ή εμοδίνης.

Κύτταρα

HeLa (Α) επιμολυσμένα με SBE λουσιφεράση πυγολαμπίδας και Renilla ΤΚ-λουσιφεράσης κατασκευάσματα υποβλήθηκαν σε αγωγή (6 ώρες μετά την επιμόλυνση) με 2,5, 5, 10 και 20 ng /ml του ΤΟΡ-β και προσδιορίστηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης 24 ώρες μετά τη θεραπεία. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης ομαλοποιήθηκε με υπολογισμό της σχετικής αναλογίας των πυγολαμπίδας να λουσιφεράση της Renilla δραστηριότητες και τα αποτελέσματα χαράσσονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τον μη επεξεργασμένο έλεγχο. κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του ΤΟΡ-β παρουσία και απουσία της κουρκουμίνης ή εμοδίνης και αναλύθηκαν για την βιωσιμότητα των κυττάρων με ρεσαζουρίνη μέθοδο αναγωγής (Β), και το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης με την ανάλυση δραστικότητας JC-1 (C) χρησιμοποιώντας ένα φθορισμομετρική μέθοδο, μετά 48h όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι (n = 3, μέσος όρος ± SEM).

η

η κουρκουμίνη και εμοδίνη αναστέλλουν την κυτταρική ανάπτυξη, τη μετανάστευση και εισβολή σε παρουσία ή απουσία του ΤΟΡ-β σε κύτταρα SiHa και HeLa

TGF-β είναι γνωστό ότι επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης [40]. Βρήκαμε ότι ο ΤΟΡ-β επαγόμενη G

0 /G

1 συλλήψεως SiHa, αλλά όχι σε κύτταρα HeLa (Εικ. 3Α) και την επίδραση της κουρκουμίνης και εμοδίνης στο προφίλ κυτταρικού κύκλου κάτω από αυτές τις συνθήκες αναλύθηκε περαιτέρω. Η κουρκουμίνη που προκαλείται G

2 /M σύλληψης σε κύτταρα SiHa σημαντικά, ενώ επίδραση εμοδίνη σχετικά G

2 /M φάση δεν ήταν στατιστικά σημαντική, αν και η σύλληψη ήταν ορατό (Ρ-0.08). Η παρουσία του ΤΟΡ-β δεν επηρέασε σημαντικά επίδραση κουρκουμίνη είναι? ενώ εμοδίνης μεσολάβηση μερική G

2 /M σύλληψη βρέθηκε να αναιρείται από τον TGF-β. Ωστόσο, τόσο η κουρκουμίνη και εμοδίνη αύξησε την υπο G

0 /G

1 πληθυσμός (ενδεικτική της απόπτωσης), με την παρουσία όσο και απουσία του ΤΟΡ-β σημαντικά σε κύτταρα HeLa (Σχ. 3Α). Περαιτέρω, όπως παρατηρείται από επούλωσης πληγών δοκιμασία, ΤΟΡ-β επαγόμενη μετανάστευση και στα δύο κύτταρα SiHa και HeLa και η κουρκουμίνη και εμοδίνη βρέθηκαν να αναστέλλουν την μετανάστευση, ακόμη και με την παρουσία του ΤΟΡ-β (Σχ. 3Β και C). Επιπλέον, προσδιορισμός εισβολή χρησιμοποιώντας Matrigel επικαλυμμένα ενθέματα transwell έδειξαν ότι ο ΤΟΡ-β επαγόμενη εισβολή στα δύο κύτταρα SiHa και HeLa, και η κουρκουμίνη και εμοδίνη ανέστειλε τόσο το βασικό όσο και του ΤΟΡ-β επαγόμενη εισβολή σε αυτά τα κύτταρα (Εικ. 4). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η κουρκουμίνη και εμοδίνης προκαλέσουν G

2 /M σύλληψη στην SiHa και την απόπτωση σε κύτταρα HeLa, αντίστοιχα. Αυτοί αναστέλλουν σημαντικά τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων SiHa και HeLa και είναι επίσης σε θέση να αντισταθμίσουν ΤΟΡ-β επαγόμενη μετανάστευση και εισβολή σε αυτά τα κύτταρα.

SiHa και HeLa κύτταρα (Α) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κουρκουμίνη ή εμοδίνης με την παρουσία ή απουσία ΤΟΡ-β για 48 ώρες και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Ποσοστιαία κατανομή των διαφόρων φάσεων του κυτταρικού κύκλου παραστάθηκε γραφικώς επί του Υ-άξονα έναντι των υποδεικνυόμενες συνθήκες θεραπείας επί του Χ-άξονα. SiHa (Β) και HeLa (C) κύτταρα σπάρθηκαν σε μια συρρέουσα μονοστιβάδα. 16h μετά την σπορά, μια γρατσουνιά έγινε από ένα μικρο άκρη, και η κατάλληλη θεραπεία δόθηκε σε μέσο ελεύθερο ορού. Γδαρμένο επιφάνεια απεικονίζεται στο 0h και 48 ώρες μετά τη θεραπεία. Η έκταση της μετανάστευσης σε κάθε δείγμα μετρήθηκε ως η περιοχή που καλύπτεται από τα κύτταρα στις 48 ώρες με τη χρήση του λογισμικού TScratch και εκπροσωπήθηκαν ως ποσοστιαία μεταβολή σε σχέση με τον έλεγχο DMSO (Β) (n = 3, μέση τιμή ± SEM).

Η

SiHa (25.000) και HeLa (50000) κύτταρα εμβολιάζονται πάνω σε θάλαμο Boyden επικαλυμμένα με Matrigel, υποβλήθηκαν σε θεραπεία με κουρκουμίνη, εμοδίνη και /ή ΤΟΡ-β για 48 ώρες. Δημοσίευση θεραπεία, τα κύτταρα χρωματίστηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι, και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο (Α). Ποσοτικοποίηση της εισέβαλαν κυττάρων (Β και Γ) έγινε με ανάγνωση της απορρόφησης του κρυσταλλικού ιώδους σε 595 nm. Ποσοστό εισβολή υπολογίστηκε ως φορές μεταβολής σε σχέση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα (n = 3, μέση τιμή ± SEM)

Η

Η κουρκουμίνη και εμοδίνης αναστέλλουν μονοπάτι TGF-β σηματοδότηση σε κύτταρα SiHa και HeLa

για να διερευνηθεί εάν αυτές οι ενώσεις θα αναστέλλουν τη δράση της λουσιφεράσης σηματοδότησης ΤΟΡ-β, ΤΟΡ-β επαγόμενη SBE σε κύτταρα SiHa και HeLa αναλύθηκε και βρέθηκε να αναστέλλεται τόσο από την κουρκουμίνη και εμοδίνη (Σχ. 5Α και Β). Για να κατανοήσουμε εάν σηματοδότησης ΤΟΡ-β αναστέλλεται από επηρεάζει την έκφραση των υποδοχέων του, μελετήσαμε την επίδραση αυτών των ενώσεων επί της εκφράσεως των πρωτεϊνών υποδοχέα ΤΟΡ-β. Όπως παρατηρήθηκε με κηλίδωση Western, τόσο SiHa και HeLa κύτταρα, η κουρκουμίνη και εμοδίνη σημαντικά κάτω ρυθμίζεται η έκφραση του υποδοχέα ΤΟΡ-β II, ενώ ΤΟΡ-β υποδοχέα Ι ήταν κάτω ρυθμίζεται μόνο σε κύτταρα HeLa, και σε μικρότερο βαθμό (Σχ. 5C και D). Αν και οι δύο κύτταρα SiHa και HeLa συμπεριφέρθηκαν παρομοίως, τα αποτελέσματα ήταν πιο βαθιά σε κύτταρα HeLa και έτσι επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτες. Από την άποψη αυτή, η έκφραση των πρωτεϊνών Smad κατά την κατεργασία με τις ενώσεις αυτές με την παρουσία και απουσία του ΤΟΡ-β αναλύθηκε με κηλίδωση Western. ΤΟΡ-β είναι γνωστό ότι επάγει σημαντικά τη φωσφορυλίωση της Smad2 και Smad3 από 15 λεπτά έως μία ώρα της θεραπευτικής αγωγής [41, 42], και έτσι η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Smad2 και Smad3 αναλύθηκε σε κύτταρα HeLa προεπεξεργασία με κουρκουμίνη και εμοδίνης για 48 ώρες, και στη συνέχεια κατεργάζεται με ΤΟΡ-β για 30 λεπτά. ΤΟΡ-β επαγόμενη την φωσφορυλίωση Smad2 και Smad3 σημαντικά (Σχ. 6Α). Η κουρκουμίνη και εμοδίνη ανέστειλε σημαντικά την επαγωγή της φωσφορυλίωσης της Smad2 και Smad3 σε κύτταρα HeLa (Σχ. 6Α). Περαιτέρω, δεδομένου ότι οι αλλαγές στην έκφραση των κατάντη στόχοι του ΤΟΡ-β και τελεστές που σχετίζονται με την EMT γενικά παρατηρήθηκε από 24 έως 72 ώρες [42], ήταν ενδιαφέρον να μελετηθεί η επίδραση της συν θεραπεία της κουρκουμίνης ή εμοδίνης με ΤΟΡ-β μετά 48η του TGF-β μεταχείριση βασικούς παίκτες, τους μεταγενέστερους στόχους και τελεστές της οδού σηματοδότησης TGF-β. Σε 48 ώρες επώασης, επίσης, ΤΟΡ-β βρέθηκε να επάγει την φωσφορυλίωση της Smad2 /Smad3, και την έκφραση της Smad4 πρωτεΐνης και της βασικής τους, καθώς και ο ΤΟΡ-β-επαγόμενη έκφραση κάτω ρυθμίζονται από κουρκουμίνη και εμοδίνη, ενώ οι συνολικές Smad2 και Smad3 έκφραση παρέμεινε ανεπηρέαστη (εικ. 6Β). Ετσι διαπιστώθηκε ότι η κουρκουμίνη και εμοδίνης ρυθμίζουν προς τα κάτω ΤΟΡ-β οδού σηματοδότησης από κάτω ρύθμιση ΤΟΡ-β υποδοχέα II, Ρ-Smad2, Ρ-Smad3 και Smad4

SiHa (Α) και HeLa κύτταρα. (Β) επιμολυσμένα με SBE λουσιφεράση πυγολαμπίδας και Renilla ΤΚ-λουσιφεράσης κατασκευάσματα και κατεργάζεται με κουρκουμίνη και εμοδίνης σε παρουσία ή απουσία TGF-β, προσδιορίστηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης ομαλοποιήθηκε με υπολογισμό της σχετικής αναλογίας των πυγολαμπίδας να λουσιφεράση της Renilla δραστηριότητες και τα αποτελέσματα χαράσσονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα. Αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται, ένα άλλο ανεξάρτητο πείραμα απέδωσε παρόμοια αποτελέσματα. Σύνολο κυτταρολύματα του SiHa (C) και HeLa (D) κύτταρα κατεργασμένα με κουρκουμίνη ή εμοδίνης σε παρουσία ή απουσία του ΤΟΡ-β για 48 ώρες και υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με ΤΟΡ-β υποδοχέα Ι (TGFRI), ΤΟΡ-β υποδοχέα II ( TGFRII) ή β-ακτίνης (έλεγχος φόρτωσης) αντισώματα. Ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδα εμφανίζεται και οι τιμές που εμφανίζονται αντιπροσωπεύουν πυκνομετρική ανάλυση της πρωτεϊνικής ταινίας σε σχέση με το β-ακτίνης και παρόμοια αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε ένα άλλο ανεξάρτητο πείραμα.

Η

Σύνολο κυτταρολύματα κυττάρων HeLa σε προεπεξεργασία με κουρκουμίνη και εμοδίνης για 48 ώρες, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΤΟΡ-β για 30 λεπτά υποβλήθηκε σε ανοσοστύπωμα με Ρ-Smad2 και πρωτεϊνών Ρ-Smad3 (Α). Σύνολο κυτταρικό λύμα των κυττάρων HeLa σε επεξεργασία με κουρκουμίνη ή εμοδίνης, με την παρουσία ή απουσία του ΤΟΡ-β για 48 ώρες υποβλήθηκε σε ανοσοκηλίδωση με Ρ-Smad2, Ρ-Smad3, Smad2, Smad3, Smad4 και αντισώματα β-ακτίνης (loading ελέγχου) ( ΣΙ). Ένας εκπρόσωπος κηλίδα εμφανίζεται και οι τιμές που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν πυκνομετρική ανάλυση της πρωτεϊνικής ταινίας σε σχέση με το β-ακτίνης και παρόμοια αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε άλλο ανεξάρτητο πείραμα.

Η

Η κουρκουμίνη και εμοδίνης επηρεάζουν τα κατάντη παίκτες και τελεστές του TGF-β μονοπάτι σηματοδότησης

τα συμπλέγματα παράγοντα Smad-μεταγραφής που είναι γνωστό ότι ρυθμίζει αναστολέα της CDK6 p21 [5]. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση του ρ21 και CyclinD1 βρέθηκε να επάγεται από ΤΟΡ-β, αλλά ήταν κάτω ρυθμίζεται κατόπιν κουρκουμίνη και εμοδίνη θεραπεία (Εικ. 7Α). ΤΟΡ-β-επαγόμενη μετανάστευση προάγεται από Pin1 [10] και όπως αναμένεται, η κουρκουμίνη και εμοδίνη κάτω ρυθμιζόμενη Pin1 σημαντικά (Σχ. 7Α). Βρήκαμε ότι η κουρκουμίνη και εμοδίνη σημαντικά κάτω ρυθμίζεται η έκφραση του Ρ15, ρ16, CDK6, ρ27 αν και η κουρκουμίνη δεν θα μπορούσε να αναστείλει ρ16 παρουσία ΤΟΡ-β (Σχ. 7Β). Bax αναλογία Bcl-2 για να υποδηλώνει την ευαισθησία των κυττάρων στον κυτταρικό θάνατο [43] και είναι στο χέρι ρυθμιζόμενη κατά κουρκουμίνη και εμοδίνη θεραπεία (Εικ. 7C).