Abstract

Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο APC συχνά μεταλλάσσεται σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου, με μεταλλάξεις χωρίς νόημα που αντιπροσωπεύουν το 30% του συνόλου των μεταλλάξεων σε αυτό το γονίδιο. Επαναφορά του γονιδίου WT APC σε καρκινικά κύτταρα γενικά μειώνει ογκογενετικότητας ή επάγει απόπτωση. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τη δυνατότητα χρήσης φαρμάκων για την επαγωγή πρόωρου κωδικόνιο λήξης (PTC) πλήρους ανάγνωσης (αμινογλυκοσίδες, νεγκαμυκίνη), ως μέσο για την επανενεργοποίηση ενδογενούς APC. Με την ποσοτικοποίηση της πλήρους ανάγνωσης των 11 μεταλλάξεων ανοησίες σε APC, ήμασταν σε θέση να εντοπίσει εκείνους αναφέροντας τα υψηλότερα επίπεδα της πλήρους ανάγνωσης μετά τη θεραπεία. Για αυτές τις μεταλλάξεις, αποδείξαμε ότι αμινογλυκοσίδης ή νεγκαμυκίνη θεραπεία οδήγησε σε ανάκτηση της βιολογικής δραστικότητας της APC σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, και έδειξε ότι το επίπεδο της δραστικότητας ΑΡΟ ήταν ανάλογη με το επίπεδο του επαγόμενης πλήρους ανάγνωσης. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η θεραπεία με επαγωγείς πλήρους ανάγνωσης θα πρέπει να θεωρείται ως μια πιθανή στρατηγική για θεραπεία καρκίνων που προκαλούνται από μεταλλάξεις χωρίς νόημα γονίδιο APC. Μπορούν επίσης να παρέχουν μια λογική βάση για τον εντοπισμό των μεταλλάξεων ανταποκρίνεται πλήρους ανάγνωσης επαγωγείς

Παράθεση:. Floquet C, Rousset JP, Μπιντού L (2011) πλήρους ανάγνωσης του Πρόωρη κωδικόνια τερματισμού στο αδενωματώδη πολυποδίαση Coli Gene Επαναφέρει τη βιολογική της δραστηριότητα στον τομέα των ανθρωπίνων καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (8): e24125. doi: 10.1371 /journal.pone.0024125

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Φεβρουαρίου του 2011? Αποδεκτές: 4 Αυγούστου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 31 Αυγούστου, 2011

Copyright: © 2011 Floquet et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα ταμεία της από την Ένωση pour la Recherche sur le Καρκίνο (ARC Νο 5016 για να JPR) και Association Française contre les Μυοπάθειες (σύμβαση 13986). CF χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το γαλλικό Υπουργείο Παιδείας και Έρευνας και εν μέρει από μια υποτροφία από την Ligue Nationale Καρκίνου Contre le. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η APC (αδενωματώδη πολυποδίαση coli) ογκοκατασταλτικό γονίδιο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη πολλών τομέων 311 kDa με θέσεις πρόσδεσης για πολυάριθμους εταίρους, συμπεριλαμβανομένων των μικροσωληνίσκων, αξίνη και βήτα-κατενίνης [1]. Αυτή η πρωτεΐνη λειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστής του μονοπάτι Wnt που εμπλέκεται στην τρανσενεργοποίηση των γονιδίων στόχων, όπως το ογκογονίδιο c-myc και το γονίδιο της κυκλίνης D1 [2]. Το γονίδιο APC μεταλλάσσεται στο 80% των καρκίνων του παχέος εντέρου και μεταλλάξεις συμβαίνουν νωρίς στην ανάπτυξη των περισσότερων καρκίνων του παχέος πολυπλοειδών. Έχει αποδειχθεί ότι η επανεισαγωγή του γονιδίου άγριου τύπου APC σε καρκινικά κύτταρα γενικά μειώνει την ογκογονικότητα ή επάγει την απόπτωση [3], [4]. Συνολικά, το 30% του συνόλου των μεταλλάξεων σε αυτό το γονίδιο είναι ανοησίες μεταλλάξεις [5].

Κατά τα τελευταία λίγα χρόνια, έχουν ορισμένα αντιβιοτικά έχει αποδειχθεί ότι παρεμβαίνει με το ριβόσωμα θηλαστικού, επάγει την πλήρους ανάγνωσης των πρόωρων κωδικόνια τερματισμού (PTCs ). Οι αμινογλυκοσίδες είναι τα αντιβιοτικά πιο συχνά μελετηθεί από την άποψη αυτή, και πολλαπλές μελέτες έχουν προτείνει ότι αυτά τα φάρμακα θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σε καινοτόμες στρατηγικές για τη θεραπεία γενετικών ασθενειών που προκαλούνται από μεταλλάξεις χωρίς νόημα (για ανασκόπηση [6], [7], [8]) . Η νεγκαμυκίνη διπεπτίδιο αντιβιοτικό δεν σχετίζεται δομικά με αμινογλυκοσίδες [9] και έχει βρεθεί να είναι πιο αποτελεσματική από γενταμικίνη για την προώθηση της πλήρους ανάγνωσης κάποιας ανοησία μετάλλαξη [10]. Αυτό το φάρμακο μπορεί έτσι να αποτελέσει μια ελκυστική εναλλακτική θεραπεία για τους ασθενείς που φέρουν μετάλλαξη ανοησίες.

Σε μια πρόσφατη μελέτη, δείξαμε ότι ακόμα και μια μέτρια επίπεδο πλήρους ανάγνωσης αμινογλυκοσιδών που προκαλείται (6%) προκάλεσε την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων που φιλοξενούν μια ανοησία -mutated γονίδιο p53 [11]. Αυτά τα αποτελέσματα έδωσαν την απόδειξη της ιδέας που πλήρους ανάγνωσης επαγωγείς μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη θεραπεία των καρκίνων που συνδέονται με την παρουσία μιας μετάλλαξης σε μια ανοησία ογκοκατασταλτικό γονίδιο. Στην παρούσα μελέτη, διερευνούμε τη δυνατότητα επέκτασης της προσέγγισης αυτής με τον καρκίνο που συνδέεται με μια μετάλλαξη ανοησίες στο γονίδιο APC. Πρόσφατα, Zilberberg κ.ά. έδειξαν ότι πλήρους ανάγνωσης επαγωγείς βελτίωσε τα κλινικά συμπτώματα της ογκογένεσης σε ένα μοντέλο ποντικού που φέρει μία μετάλλαξη ανοησίες στο γονίδιο APC. Ωστόσο, η σχέση μεταξύ του χαμηλότερου επιπέδου ανάπτυξης των όγκων και PTC πλήρους ανάγνωσης δεν είχε αποδειχθεί [12]. Γίνεται όλο και περισσότερο προφανές ότι μόνο ένα υποσύνολο των μεταλλάξεων ανοησίες θα επωφεληθούν από γενταμικίνη θεραπεία, ανάλογα με το πλαίσιο νουκλεοτιδίων τους [13], [14], [15], [16].

Εμείς αξιολογούνται απόδοση πλήρους ανάγνωσης για 11 μεταλλάξεις ανοησίες που εμπλέκονται σε καρκίνο του παχέος εντέρου, με σκοπό τον εντοπισμό των μεταλλάξεων ανοησίες στο γονίδιο APC πιο δεκτικά σε θεραπείες πλήρους ανάγνωσης επαγωγής. Για τις μεταλλάξεις με τα υψηλότερα επίπεδα πλήρους ανάγνωσης, συμπεριλαμβανομένου ενός ενδογενούς μετάλλαξη, αντιβιοτική θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα την ανάκτηση της βιολογικής δραστικότητας του APC.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Προσδιορισμός των APC μεταλλάξεις χωρίς νόημα αποκρίνεται σε αμινογλυκοζίτη θεραπεία

Μελετήσαμε 11 μεταλλάξεις ανοησίες που βρέθηκαν στο 23% των καρκινικών κυττάρων που φέρουν μια μετάλλαξη ανοησίες στο γονίδιο APC (Τ Σούση, προσωπική επικοινωνία). Πλήρους ανάγνωσης απόδοσης έχει αποδειχθεί ότι εξαρτάται από τη φύση των αλληλουχιών που περιβάλλουν το κωδικόνιο τερματισμού [13], [17], [18], [19]. Έτσι, για κάθε μετάλλαξη, εισαγάγαμε μια περιοχή που περιλαμβάνει τις περιβάλλουν το πλαίσιο (27 νουκλεοτίδια) στο φορέα pAC99 διπλής αναφοράς (Πίνακας 1). Πλήρους ανάγνωσης ποσοτικοποιήθηκε σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 παροδικά επιμολυσμένα με τον φορέα ρεπόρτερ διπλή, με την παρουσία ή απουσία του γενταμυκίνη (Σχήμα 1). Πλήρους ανάγνωσης ποσοστά κυμαίνονταν από 0,01% (Q1131X) έως 0,2% (L360X) για τη βασική πλήρους ανάγνωσης, και από 0,09% (APC Q789X) έως 1,6% (L360X) παρουσία 800 μg /ml γενταμυκίνη. Παρόμοιες παραλλαγές στην βασική πλήρους ανάγνωσης επίπεδα και ανταπόκρισης στις αμινογλυκοσίδες έχουν αναφερθεί σε αρκετές προηγούμενες μελέτες [13], [18]. Δοκιμάσαμε επίσης άλλο αντιβιοτικό αμικασίνη, η οποία έδωσε πλήρους ανάγνωσης επίπεδα παρόμοια ή χαμηλότερα από εκείνα που λαμβάνονται με γενταμυκίνη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με μία προηγούμενη μελέτη από Howard et al που έχουν σχέση πλήρους ανάγνωσης δραστηριότητα αρκετών αμινογλυκοσίδες [20].

πλήρους ανάγνωσης αποδόσεις για 11 μεταλλάξεις χωρίς νόημα στο γονίδιο APC εκτιμήθηκαν σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 με και χωρίς γενταμυκίνη ( /ml) θεραπεία 800 μg για 24 ώρες. Δύο μεταλλάξεις χωρίς νόημα (L360X και R1114X) εμφανίζονται επίπεδα γενταμυκίνη επαγόμενης πλήρους ανάγνωσης πάνω από 0,5%. Σημαίνει ότι οι τιμές που παρουσιάζονται, μαζί με το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) (n = 5).

Η

αξιολογηθεί κατά πόσο πλήρους ανάγνωσης επίπεδα ήταν παρόμοια στα κύτταρα της προέλευσης του παχέος εντέρου, με επίσης την αξιολόγηση η πλήρους ανάγνωσης κατευθύνεται από κάθε μετάλλαξη ανοησίες στον καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά DLD-1. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν ήταν παρόμοια με εκείνα για τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Για περαιτέρω χαρακτηρισμό, εστιάσαμε στις μεταλλάξεις χωρίς νόημα L360X και R1114X, η οποία έδειξε τα υψηλότερα επίπεδα του πλήρους ανάγνωσης με την παρουσία της γενταμικίνης αμινογλυκοσίδης (1,6% και 0,7%, αντίστοιχα). Για τις δύο επιλεγμένες μεταλλάξεις χωρίς νόημα, εμείς ποσοτικά τις πλήρους ανάγνωσης επίπεδα που λαμβάνονται υπό την παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων G418 (γενετικίνη), επειδή αυτό το αντιβιοτικό είναι το πιο ισχυρό πλήρους ανάγνωσης επαγωγέας των αμινογλυκοσιδών [11], [21], [22]. Και οι δύο μεταλλάξεις χωρίς νόημα που εμφανίζεται μια δοσοεξαρτώμενη απόκριση σε G418, με αποτέλεσμα πλήρους ανάγνωσης επίπεδα μεγαλύτερα από εκείνα που παρατηρούνται για γενταμυκίνη, φθάνοντας το 2,3% για L360X και 1,8% για R1114X (Σχήμα 2 Α και 2Β, αντίστοιχα). Τα πλήρους ανάγνωσης επίπεδα που λαμβάνονται με την παρουσία του διπεπτιδίου νεγκαμυκίνη ήταν χαμηλότερες από (L360X) ή παρόμοια (R1114X) με εκείνα που λαμβάνονται με γενταμυκίνη (Σχήμα 2 Α και 2Β, αντίστοιχα).

(Α) πλήρους ανάγνωσης αποδόσεις για APC L360X μεταλλάξεις χωρίς νόημα προσδιορίστηκαν σε DLD-1 κύτταρα παρουσία του G418 (10, 25, 50, 100 και 200 ​​μg /ml), νεγκαμυκίνη (1 mg /ml), αμικακίνη (2 mg /ml) ή γενταμυκίνη (800 μg /ml). (Β) πλήρους ανάγνωσης αποδόσεις για APC R1114X μεταλλάξεις χωρίς νόημα προσδιορίστηκαν σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 με την παρουσία του G418 (50, 100 και 200 ​​μg /ml) ή νεγκαμυκίνη (1 mg /ml). Οι πλήρους ανάγνωσης αποδόσεις σε κύτταρα DLD-1 ήταν σύμφωνα με εκείνα σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). (Γ) Αμινογλυκοσίδη θεραπεία αποκαθίσταται δραστικότητα APC. APC σύνδεση σε βήτα-κατενίνης (reppression του ανταποκριτή pTOPGlow) αποκαθίσταται με τη θεραπεία της DLD-1 κύτταρα παροδικώς επιμολυσμένα με cDNA APC L360X με G418 (10, 25, 50, 100 και 200 ​​μg /ml), νεγκαμυκίνη (1 mg /ml), αμικακίνη (2 mg /ml) ή γενταμυκίνη (800 μg /ml). (D) APC σύνδεση σε βήτα-κατενίνης (καταστολή του pTOPGlow ανταποκριτή) αποκαθίσταται με τη θεραπεία των κυττάρων LoVo μεταφέρουν APC R1114X με G418 (50, 100 και 200 ​​μg /ml) ή νεγκαμυκίνη (1 mg /ml). Ως έλεγχος, τα κύτταρα LoVo συνεπιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο αναφοράς pTOPGlow και είτε το siRNA APC-στόχευσης (siRNA APC) ή ένα μη-στόχευσης siRNA (siRNA ΝΤ) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με G418 (200 μg /ml). (Ε) Επίδραση του siRNA που στοχεύει APC mRNA. Εμείς παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα LoVo με ένα siRNA που στοχεύει (siRNA APC) ή όχι στόχευση (siRNA ΝΤ) APC mRNA. Ποσοτική PCR χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων mRNA. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε σχέση με την ποσότητα του mRNA σε παρουσία siRNA NT. Οι μέσες τιμές παρουσιάζονται, μαζί με το SEM (n = 3).

Η

πλήρους ανάγνωσης επίπεδο εξαρτάται από τη φύση του το κωδικόνιο λήξης και τη γύρω νουκλεοτιδίων πλαισίου, αλλά οι κανόνες που διέπουν πλήρους ανάγνωσης επίπεδο είναι πολύπλοκες και παραμένουν να προσδιορίζεται για τα κύτταρα των θηλαστικών. Η παρουσία ενός υπολείμματος C αμέσως μετά το κωδικόνιο στοπ (4) συσχετίζεται με ένα υψηλό επίπεδο πλήρους ανάγνωσης, αν και αυτό δεν φαίνεται να είναι ο μοναδικός προσδιοριστής του επιπέδου πλήρους ανάγνωσης. Αρκετές μελέτες έχουν επίσης καταδείξει ότι μόνο λίγες μεταλλάξεις χωρίς νόημα δώσει «σημαντική» πλήρους ανάγνωσης παρουσία γενταμυκίνης. Σε αυτή τη μελέτη, μόνο δύο από τις έντεκα μεταλλάξεις χωρίς νόημα που δοκιμάστηκαν, L360X και R1114X, εμφανίζεται γενταμυκίνη επαγόμενη πλήρους ανάγνωσης επίπεδα μεγαλύτερα από 0.5%, αλλά μόνο L360X είχε ένα κατάλοιπο C στη θέση 4. Η μετάλλαξη R1114X ήταν επομένως έχουν απορριφθεί, αν αυτό ήταν το μοναδικό κριτήριο που χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό μεταλλάξεων ανταποκρίνεται πολύ καλά στην πλήρους ανάγνωσης επαγωγείς. Η προσέγγισή μας παρέχει έτσι μια ορθολογική στρατηγική για τον εντοπισμό των ασθενών που είναι πιθανό να ωφεληθούν από τη θεραπεία με επαγωγείς πλήρους ανάγνωσης.

Ανάκτηση της APC βιολογική δραστηριότητα από την L360X cDNA APC μετά τη θεραπεία αμινογλυκοσιδών

Στη συνέχεια, διερευνάται εάν η θεραπεία αμινογλυκοσιδών επαγόμενη ανιχνεύσιμα επίπεδα της βιολογικής δραστικότητας για ένα APC πρωτεΐνης που παράγεται από ένα cDNA που φέρει την μετάλλαξη L360X. Ενεργά APC μεσολαβεί στην παγίδευση των β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα, εμποδίζοντας έτσι την αλληλεπίδραση αυτού του μορίου με το TCF παράγοντα διενεργοποίησης που απαιτούνται για την έκφραση των γονιδίων στόχων. δραστικότητα APC πρωτεΐνης εκτιμήθηκε με προσδιορισμό της ικανότητας αυτής της πρωτεΐνης να δεσμεύει βήτα-κατενίνης, χρησιμοποιώντας ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή που περιέχει TCF /sites εισάγεται ανοδικά από το γονίδιο λουσιφεράσης πυγολαμπίδας (pTopGlow) [23] δέσμευσης βήτα-κατενίνης. Σε αυτό το σύστημα αναφοράς, η αλληλεπίδραση μεταξύ των ενεργών APC και βήτα-κατενίνης ως αποτέλεσμα την αναστολή της έκφρασης λουσιφεράσης πυγολαμπίδας.

DLD-1 κύτταρα στερούνται λειτουργικής πρωτεΐνης APC (APC del 1 bp 1406) επιμολύνθηκαν με το pCMV φορέας έκφρασης που περιέχει είτε WT ή μεταλλαγμένης APC L360X cDNA, μαζί με pTopGlow (Σχήμα 2C). Η επιμόλυνση με τον φορέα WT APC κατέληξε σε επίπεδα πυγολαμπίδας έκφρασης ενός δεκάτου εκείνα που λαμβάνονται μετά από επιμόλυνση με ένα άδειο φορέα. Χωρίς θεραπεία, L360X εμφανίζεται υπολειμματική επίπεδα δραστηριότητας, πιθανώς λόγω της ατελούς απώλειας λειτουργία αυτού του αλληλόμορφου, όπως υπολειμματική δραστικότητα έχει επίσης καταδειχθεί για μεταλλάξεις σε κοντινές θέσεις [23]. Η υψηλότερη δόση του G418 μειωμένης δραστηριότητας της λουσιφεράσης κατά ένα συντελεστή 2,5, καταδεικνύοντας την παραγωγή μιας λειτουργικής πρωτεΐνης APC για την επεξεργασία των αμινογλυκοσιδών. G418 κατασταλεί δραστικότητα λουσιφεράσης με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο συσχετίζεται με τις πλήρους ανάγνωσης μετρούμενα επίπεδα σε DLD-1 κύτταρα (Σχήμα 2Α). Η θεραπεία με το αμινογλυκοσίδες γενταμυκίνη ή αμικασίνη, ή με νεγκαμυκίνη προκάλεσε επίσης την καταστολή της δραστηριότητας της λουσιφεράσης, υποδεικνύοντας την σύνθεση ενός δραστικού APC πρωτεΐνης (Σχήμα 2C). Για κάθε αγωγή, η δραστικότητα της πρωτεΐνης συσχετίστηκε με το επίπεδο του επιπέδου πλήρους ανάγνωσης που μετράται στο διττό σύστημα ανταποκριτή (Σχήμα 2Α και 2C). Χρησιμοποιήσαμε μη παραμετρική δοκιμασία συσχέτισης Spearman του (two-tailed) για να αξιολογήσει τη σημασία της συσχέτισης αυτής. Βρήκαμε ότι υπήρχε μια ισχυρή, πολύ σημαντική συσχέτιση (rs = -0,95, p & lt? 0,0001) μεταξύ του επιπέδου πλήρους ανάγνωσης και τη μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης. Έτσι, και οι δύο αμινογλυκοσίδης και το διπεπτίδιο νεγκαμυκίνη μπορεί να επάγει APC βιολογική δραστικότητα από ένα μεταλλαγμένο cDNA, και το επίπεδο της δραστηριότητας είναι ανάλογη του επιπέδου πλήρους ανάγνωσης. Ως μάρτυρας, χρησιμοποιήθηκε το διάνυσμα pFopGlow περιέχει θέσεις δέσμευσης μεταλλαγμένης TCF /βήτα-κατενίνης. Με αυτό τον φορέα, καμία σημαντική αλλαγή δεν παρατηρήθηκε μετά από αμινογλυκοσίδης ή νεγκαμυκίνη θεραπεία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η ανάκτηση της APC βιολογική δραστικότητα από το ενδογενές γονίδιο APC R1114X μετά τη θεραπεία αμινογλυκοσίδης

τότε διερευνηθεί κατά πόσον η θεραπεία αμινογλυκοσιδών της ενδογενούς μεταλλάξεις ανοησίες θα δώσει παρόμοια αποτελέσματα. κύτταρα LoVo (APC R1114X) επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο αναφοράς pTopGlow και αφεθεί χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με G418 ή νεγκαμυκίνη. Η δραστικότητα του γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης πυγολαμπίδας ήταν μέγιστη με την απουσία της αγωγής και ορίστηκε σε 100%, αντανακλώντας την έλλειψη δραστηριότητας της APC πρωτεΐνης. Η θεραπεία με νεγκαμυκίνη και G418 μειωμένη pTopGlow δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας σε 50% και 18% της τιμής αναφοράς, αντίστοιχα (Σχήμα 2D). επίπεδο δραστηριότητας συσχετίστηκε με πλήρους ανάγνωσης απόδοσης (Εικόνα 2Β). Παραδόξως, γενταμικίνη θεραπεία, παρά την προώθηση επίπεδα πλήρους ανάγνωσης παρόμοια με εκείνα που λαμβάνονται με νεγκαμυκίνη, δεν μειώθηκε pTopGlow δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, πλήρους ανάγνωσης αποδοτικότητα δεν είναι το μόνο καθοριστικό παράγοντα για την ανάκτηση της δραστικότητας της πρωτεΐνης πλήρους μήκους. Πράγματι, PTC πλήρους ανάγνωσης αντιστοιχεί στην ενσωμάτωση ενός σχεδόν συγγενές αμινοακυλο tRNA [24], [25], [26], [27] (συμπληρωματικό προς δύο από τα τρία νουκλεοτίδια από ένα κωδικόνιο στοπ), με πιθανό αποτέλεσμα την αντικατάσταση του η κανονική υπολείμματος με ένα αμινοξύ ασυμβίβαστη με την σταθερότητα ή δραστικότητα της πρωτεΐνης πλήρους μήκους [10]. Είναι πιθανό ότι οι διαφορετικά αμινοξέα που ενσωματώνονται στην θέση του κωδικονίου λήξης στην παρουσία αυτών των δύο φαρμάκων, με μόνο νεγκαμυκίνη θεραπεία που οδηγεί στην ενσωμάτωση του (-η) αμινοξύ (-α) συμβατή με την βιολογική δραστικότητα της πρωτεΐνης. Αυτή η κατάσταση μπορεί να προκύψει λόγω των διαφορετικών τρόπων δράσης αυτών των φαρμάκων: αμινογλυκοσίδες φαίνεται να συνδέονται αποκλειστικά με το κέντρο της αποκωδικοποίησης [28], ενώ νεγκαμυκίνη έχει δειχθεί ότι συνδέεται όχι μόνο με την θέση Α της μικρής υπομονάδας του ριβοσώματος [9], αλλά και για το τοίχωμα της εν τω γεννάσθαι σήραγγας εξόδου αλυσίδα της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος [29]. Ως εκ τούτου, μπορούμε να αναμένουμε το υποσύνολο των φυσικών αποκαταστατικών tRNA επιλέγεται να είναι διαφορετική μετά αμινογλυκοσιδών και νεγκαμυκίνη θεραπείες.

Όσο για την άλλη μετάλλαξη που δοκιμάστηκαν, η έκφραση της λουσιφεράσης από pFopGlow υπόθαλψη μεταλλαγμένες θέσεις πρόσδεσης /β-κατενίνης TCF δεν επηρεάστηκε σημαντικά

με αντιβιοτική θεραπεία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ελέγξαμε ότι η ενεργός πρωτεΐνη APC ήταν πραγματικά υπεύθυνη για την παρατηρούμενη μείωση στην έκφραση της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας, χρησιμοποιώντας ένα siRNA που στοχεύουν ειδικά το mRNA APC. Εμείς χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά RT-PCR για να ελέγξετε ότι το siRNA μείωσε αποτελεσματικά τα επίπεδα της APC mRNA (σχήμα 2Ε). κύτταρα LoVo συνεπιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο αναφοράς pTOPGlow και στόχευση siRNA ή όχι στόχευση APC.

Μετά την κατεργασία G418 (200 μg /ml), το siRNA APC στόχευση έδωσε μια μείωση στη δραστηριότητα λουσιφεράσης δύο φορές χαμηλότερη από αυτήν που παρατηρείται σε περίπτωση απουσίας του siRNA, ενώ το μη ειδικό siRNA δεν είχε επίδραση επί της λουσιφεράσης αναστολής (Σχήμα 2D). Έτσι, η επίδραση στο σύστημα ανταποκριτή ανιχνεύθηκε ειδικώς σε παρουσία APC mRNA που δείχνει ότι διαμεσολαβείται από μια ενεργό πρωτεΐνη APC.

Για αυτές τις δύο μεταλλάξεις, ερευνήσαμε την ικανότητα της θεραπείας αμινογλυκοσίδης για την αποκατάσταση της παραγωγής του πλήρους μήκους APC πρωτεΐνης. Είχαμε τη δυνατότητα να ανιχνεύσει την πρωτεΐνη APC πλήρους μήκους σε κύτταρα HeLa (APC WT), αλλά αυτή η πρωτεΐνη δεν ήταν ανιχνεύσιμη μετά από τη θεραπεία του φαρμάκου είτε σε κύτταρα LoVo (R1114X) ή DLD-1 κύτταρα επιμολυσμένα με το cDNA L360X (Σχήμα 3). Αυτή η έλλειψη ανίχνευσης ήταν πιθανώς λόγω των περιορισμών της τεχνικής για την ανίχνευση μικρών ποσοτήτων ενός μεγάλης πρωτεΐνης (311 kDa). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι τα χαμηλά επίπεδα της APC πρωτεΐνης μπορεί να είναι επαρκής για να ρυθμίζουν τη δραστηριότητα του μεταγραφικού συμπλόκου TCF /βήτα-κατενίνης.

LoVo κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με G418 (200 μg /ml) για 72 ώρες. Western στυπώματα ανιχνεύθηκαν με το αντίσωμα FE-9 που κατευθύνονται έναντι του Ν-άκρου της APC. Οι συντετμημένες μορφές που αντιστοιχούν στα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα που υπάρχει στα κύτταρα LoVo υποδεικνύονται με βέλη. Ένα εκχύλισμα από κύτταρα HeLa (APC WT) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας? μια ζώνη εντοπίστηκε σε 311 kDa.

Η

Συμπέρασμα

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την ικανότητα των μορίων πλήρους ανάγνωσης-προκαλώντας να επάγει την παραγωγή ενός λειτουργικού APC πρωτεΐνης σε κύτταρα που φέρουν διάφορες μεταλλάξεις χωρίς νόημα στο γονίδιο APC. Βιολογική δραστικότητα ανιχνεύθηκε για τις δύο μεταλλάξεις χωρίς νόημα πιο δεκτικά σε θεραπεία αμινογλυκοσίδη (R1114X και L360X) και αυτή η δραστηριότητα ήταν ευθέως ανάλογο με τα πλήρους ανάγνωσης επίπεδα μετρήθηκαν με ένα διπλό σύστημα αναφοράς. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι πλήρους ανάγνωσης επαγωγείς, όπως αμινογλυκοσιδών και νεγκαμυκίνη, μπορεί να επανενεργοποιήσει το ογκοκατασταλτικό γονίδιο APC στα καρκινικά κύτταρα. Παρέχει μια ορθολογική στρατηγική για τον εντοπισμό των ασθενών που είναι πιθανό να ανταποκριθεί και συνεπώς πιο πιθανό να ωφεληθούν από τη θεραπεία με επαγωγείς πλήρους ανάγνωσης. Μια πρόσφατη μελέτη προσέφερε την απόδειξη της αρχής ότι η εκ νέου έκφραση μιας πρωτεΐνης APC πλήρους μήκους μετά από θεραπεία με επαγωγείς πλήρους ανάγνωσης μειώνει το μέγεθος του όγκου σε ένα ποντίκι ξενομόσχευμα [12]. Επιπλέον, έχουμε δείξει πρόσφατα ότι η θεραπεία των κυττάρων που φέρουν μία μετάλλαξη ανοησίες στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο ρ53 οδηγεί στην εκ νέου έκφραση μίας πρωτεΐνης πλήρους μήκους σε θέση να προκαλέσει απόπτωση σε κύτταρα όγκου σε καλλιέργεια [11]. Όλα αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα μόρια που επάγουν stop-κωδικονίου πλήρους ανάγνωσης θα μπορούσε δυνητικά να χρησιμοποιηθεί όχι μόνο για τη θεραπεία γενετικών ασθενειών, αλλά και για να διαφοροποιήσει το υφιστάμενο οπλοστάσιο των θεραπειών για τον καρκίνο και ως μια ορθολογική βάση για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών εξατομικευμένη θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές γραμμές και κυτταροκαλλιέργεια

Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM συν GlutaMAX (Invitrogen), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS, Invitrogen) και 100 U /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5.5% CO

2, στους 37 ° C. ΝΙΗ3Τ3 (ευγενική προσφορά από τον Marc Sitbon) κύτταρα είναι εμβρυϊκά ινοβλάστες ποντικού. LoVo (APC R1114X και del 1 bp 1430, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Françoise Praz, [30]) και DLD-1 (APC del 1 bp 1406, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Françoise Praz, [31]) κύτταρα είναι επιθηλιακά κύτταρα που προέρχονται από έναν άνθρωπο του παχέος εντέρου αδενοκαρκίνωμα. HeLa κύτταρα (APC WT) είναι επιθηλιακά κύτταρα που προέρχονται από ένα ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα τραχήλου (ευγενώς από Fabrice Lejeune).

πλήρους ανάγνωσης ποσοτικό προσδιορισμό σε κυτταρική καλλιέργεια

Συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια που αντιστοιχούν σε μεταλλάξεις χωρίς νόημα ενσωματωμένα στο φυσικό τους πλαίσιο (αλληλουχίες στον πίνακα 1) ανοπτήθηκαν και συνδέθηκαν εντός του πλασμιδίου διπλής ρεπόρτερ pAC99, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Αυτή η διπλή ρεπόρτερ επιτρέπει την ποσοτικοποίηση του stop-κωδικονίου πλήρους ανάγνωσης, μέσω της μέτρησης των δραστηριοτήτων λουσιφεράσης και β-γαλακτοσιδάσης (εσωτερική βαθμονόμηση), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Τα πλήρους ανάγνωσης επίπεδα μεταλλάξεις χωρίς νόημα αναλύθηκαν με την παρουσία ή απουσία γενταμυκίνη. ΝΙΗ3Τ3 κύτταρα ηλεκτροδιατρήθηκαν με 20 μg του πλασμιδίου ανταποκριτή και, την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα ξεπλένονται και φρέσκο ​​μέσο, ​​με ή χωρίς γενταμυκίνη, αμικασίνη, νεγκαμυκίνη ή συμπλήρωση G418, προστέθηκε. Σε αυτά τα πειράματα, δεν κυτταρική τοξικότητα παρατηρήθηκε για τις δόσεις των αντιβιοτικών που χρησιμοποιούνται. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν με θρυψίνη-ΕϋΤΑ (Invitrogen). Βήτα-γαλακτοσιδάση και λουσιφεράση δραστηριότητες προσδιορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Πλήρους ανάγνωσης αποτελεσματικότητα εκτιμήθηκε με υπολογισμό της αναλογίας της λουσιφεράσης με τη δραστηριότητα της β-γαλακτοσιδάσης που ελήφθη με το κατασκεύασμα δοκιμή και την ομαλοποίηση αυτό σε σχέση με την αναλογία που λαμβάνεται με ένα κατασκεύασμα ελέγχου εντός πλαισίου. Για κάθε κατασκεύασμα, διεξήχθησαν τουλάχιστον πέντε ανεξάρτητα πειράματα μορφομετατροπής. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό σε πλήρους ανάγνωσης DLD-1, το ίδιο πρωτόκολλο χρησιμοποιήθηκε, εκτός από το ότι η μέθοδος φωσφορικού ασβεστίου χρησιμοποιήθηκε για επιμόλυνση. Για κάθε κατασκευή, εκτελέστηκαν τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα επιμόλυνσης.

πλασμίδιο έκφρασης κατασκευάσματα

pCMV APC WT παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Bert Vogelstein (Ογκολογικό Κέντρο Johns Hopkins, Βαλτιμόρη). Κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση διεξήχθη σε ένα θραύσμα του γονιδίου APC για τη δημιουργία του APC L360X ανοησία μετάλλαξη (pCMV APC L360X). Η αλληλουχία του νέου εισηγμένου τμήματος ελέγχθηκε.

Western κηλίδας ανάλυση

κύτταρα LoVo υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με G418 (200 μg /ml) για 72 ώρες. Το μέσο αντικαταστάθηκε και φρέσκο ​​αντιβιοτικά προστέθηκαν κάθε μέρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με το αντιδραστήριο Bradford (Biorad) και τα εκχυλίσματα μετουσιώθηκαν με επώαση σε ρυθμιστικό Laemmli για 5 λεπτά στους 90 ° C. Υποβάλλαμε 100 μα συνολικής πρωτεΐνης σε SDS-PAGE σε NuPAGE Novex 3/8% Τπδ /οξικό πηκτώματα προ-cast (Invitrogen). Οι πρωτείνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης όλη τη νύχτα, όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. Οι μεμβράνες κορεσμένες με επώαση επί 1 ώρα σε TBS συμπληρωμένο με 5% μη λιπαρά γάλα σε σκόνη, και επωάστηκαν με το πρωτογενές μονοκλωνικό αντίσωμα, FE-9 (Ν-τερματικό χαρτογράφηση επιτόπου μεταξύ των καταλοίπων αμινοξέων 1 και 35 της APC? Calbiochem, 1 /100). Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές σε TBS συμπληρωμένο με 1% μη λιπαρά γάλα σε σκόνη και επωάστηκαν με το δευτερογενές αντίσωμα (horseradish υπεροξειδάση-συζευγμένο αντι-ποντικού IgG (1/2500) ή αλκαλική φωσφατάση-συζευγμένη αντι-ποντικού IgG (1/7000) Promega ) για 45 λεπτά. Αυτά πλύθηκαν έξι φορές και χημειοφωταύγεια ανιχνεύθηκε με τη δυτική αντιδραστήρια blotting ανίχνευσης ECL (Amersham, GE Healthcare).

δοκιμασίες δραστικότητας Πρωτεΐνης

Η βιολογική δραστικότητα του APC εκτιμήθηκε με τον φορέα pTOPGlow (ευγενώς που παρέχονται από τον Δρ Marc Van de Wetering, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Ουτρέχτης, Ολλανδία).

DLD-1 κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με pCMV L360X (4 μg), pTOPGlow ή pFOPGlow (10 μg) και pCMVLacZ (2 μg) , με τη μέθοδο φωσφορικού ασβεστίου. Κάθε ίζημα DNA χωρίστηκε ανάμεσα σε δύο φρεάτια μιας πλάκας έξι φρεατίων. Αντιβιοτικά (10 μg /ml έως 200 μg /ml G418? 800 μg /ml γενταμικίνης? 2 mg /ml αμικακίνη? 1 mg /ml νεγκαμυκίνη) προστέθηκαν αμέσως μετά την επιμόλυνση, εκτός από το G418, η οποία προστέθηκε στην επόμενη μέρα. Το μέσο αντικαταστάθηκε καθημερινά και προστέθηκαν φρέσκο ​​αντιβιοτικά. Παρασκευάσαμε εκχυλίσματα πρωτεΐνης 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, και μετρήθηκαν ενζυματικές δραστηριότητες

Για τα κύτταρα LoVo, τα αντιβιοτικά. (G418 σε συγκεντρώσεις 50, 100 και 200 ​​μg /ml? /Ml νεγκαμυκίνη 1 mg) προστέθηκαν την ημέρα πριν επιμόλυνση και σε κάθε επόμενη ημέρα. κύτταρα LoVo συν-επιμολύνθηκαν με τη μέθοδο φωσφορικού ασβεστίου, με TOPGlow ή FOPGlow (10 μg) και pCMVLacZ (2,8 μg) για την κανονικοποίηση για αποδοτικότητα διαμόλυνσης, η βιωσιμότητα των κυττάρων και τη μεταβλητότητα εκχύλιση πρωτεϊνών. Κάθε ίζημα DNA χωρίστηκε ανάμεσα σε δύο φρεάτια μιας πλάκας έξι φρεατίων. Τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν και μετρήθηκαν ενζυματικές δραστηριότητες.

Για κάθε κυτταρική σειρά, τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα επιμόλυνσης εκτελέστηκαν.

siRNA επιμολύνσεις

κύτταρα LoVo, δραστικότητα της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA που στοχεύει mRNA APC (Dharmacon ON-TARGET συν J-003869-12) ή NS, nontargeting (Dharmacon ON-TARGET καθώς και τον έλεγχο των siRNA # 1), με την παρουσία του DharmaFECT Duo (Thermo Scientific? 1.3 μg του siRNA ανά φρεάτιο ενός έξι-φρεατίων), 24 ώρες μετά την αρχική τους διαμόλυνση όπως περιγράφηκε ανωτέρω. Τα επιμολυσμένα κύτταρα αμέσως επωάστηκαν σε μέσο με ή χωρίς G418 (200 μg /ml) συμπληρώματα. Τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λουσιφεράσης και β-γαλακτοσιδάσης δραστηριότητες προσδιορίστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα επιμόλυνσης εκτελέστηκαν.

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε όλα τα μέλη του εργαστηρίου και Mounira Amor-Guéret (Institut Curie, CNRS, Orsay) για τις χρήσιμες συζητήσεις. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω Julie Frugier για τεχνική βοήθεια.