Αφηρημένο

Ιστορικό

αννεξίνες είναι το ασβέστιο και δεσμευτικές φωσφολιπίδια πρωτεΐνες που σχηματίζουν μια εξελικτική διατηρημένη πολυγονιδιακής οικογένειας. Σημαντική στοιχεία δείχνουν ότι η Α10 αννεξίνη (ANXA10) εμπλέκεται στην καρκινική εξέλιξη, αν και λίγα είναι γνωστά για το ρόλο του στην ανθρώπινη στοματική καρκινογένεση. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η συμμετοχή των ANXA10 σε καρκίνωμα του στόματος πλακωδών κυττάρων (OSCC).

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

ANXA10 mRNA και πρωτεΐνης εκφράσεις αξιολογήθηκαν με ποσοτική αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεταγραφάσης και ανοσοαποτύπωση, και πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού και ανάλυση του κυτταρικού κύκλου σε ANXA10 νοκ ντάουν κύτταρα

in vitro

. Αξιολογήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της κατάστασης έκφρασης ANXA10 σε 100 πρωτοβάθμια OSCCs και τις κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά με ανοσοϊστοχημεία. ANXA10 mRNA και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ήταν πάνω ρυθμισμένα σε όλα τα κυψελοειδή γραμμές εξετάστηκαν (n = 7,

ρ

και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό [12], [13]? και η συνάφεια της κακοήθειας σε οισοφάγο Barrett, γαστρικό καρκίνο, και καρκίνο της ουροδόχου κύστης [14] – [16].

Ο πολλαπλασιασμός των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων ελέγχεται σε μεγάλο βαθμό στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου. Η πρωτεΐνη κινάση που ενεργοποιείται από μιτογόνο (ΜΑΡΚ) καταρρακτών σηματοδότησης έχουν αναδειχθεί ως σημαντικούς παράγοντες στον πολλαπλασιασμό σε διάφορα καρκινικά κύτταρα [17]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι διάφορα αννεξίνες ρυθμίζουν ειδικά την εξωκυτταρική ρυθμιζόμενη κινάσης (ERK) /ΜΑΡΚ καταρράκτη σηματοδότησης ανάντη [18], [19]. ενεργοποίηση ERK παίζει θεμελιώδη ρόλο στην G1 /S μετάβαση [20], [21]. Μέλη της κυκλίνης

–

εξαρτώμενη κινάση (CDK) αλληλεπιδρά πρωτεΐνης /κινάσης ανασταλτική πρωτεΐνη (CIP /Kip) οικογένεια προσδένονται σε σύμπλοκα κυκλίνης-CDK και αναστέλλουν τις δραστηριότητές τους, οδηγώντας σε G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, ρ21

Kip1, και ρ27

Τα επίπεδα Kip1 επηρεαστεί από πολλαπλές οδούς σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του /ΜΑΡΚ μονοπατιού ERK σηματοδότησης [22] – [25]. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους ANXA10 διαμορφώνει αυτές τις κυτταρικές αποκρίσεις δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως στο OSCCs.

Εμείς αναφέρουν τα αποτελέσματα μιας ολοκληρωμένης ανάλυσης της ανώμαλης έκφρασης των ANXA10 σε OSCCs που είναι λειτουργικά και κλινικά συνδέονται με την καρκινική εξέλιξη .

Αποτελέσματα

Αξιολόγηση των ANXA10 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης σε OSCC που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές

Για να διερευνήσουν την κατάσταση έκφρασης του ANXA10 αναγνωριστεί ως ένα γονίδιο του καρκίνου που σχετίζονται με τα προηγούμενα μας δεδομένα μικροσυστοιχιών [11], πραγματοποιήσαμε ποσοτικό αντίστροφη πραγματικό χρόνο μεταγραφή-PCR (qRT-PCR) και ανοσοστύπωση αναλύσεις χρησιμοποιώντας επτά OSCC προερχόμενων κυτταρικών γραμμών και ανθρώπινη φυσιολογική στοματική κερατινοκύτταρα (HNOKs). ANXA10 mRNA και την κατάσταση της έκφρασης της πρωτεΐνης ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε όλες τις κυτταρικές γραμμές OSCC σε σύγκριση με εκείνη των HNOKs (Σχήμα 1Α, Β? *

σ

& lt? 0,05). Ανάλυση της έκφρασης έδειξε ότι και οι δύο μεταγραφή και μετάφραση των προϊόντων αυτού του μορίου ήταν άκρως εκφράζονται σε OSCC που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές.

(Α) Ποσοτικοποίηση των

ANXA10

επίπεδα mRNA σε OSCC που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές από qRT -PCR ανάλυση. Σημαντικές πάνω ρύθμιση του

ANXA10

mRNA φαίνεται στα επτά OSCC προερχόμενων κυτταρικών γραμμών σε σύγκριση με εκείνη στα HNOKs. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SEM τιμών από τρεις δοκιμασίες (*

ρ

& lt? 0,05? Mann-Whitney U test). (Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των ANXA10 πρωτεΐνης στα OSCC προερχόμενων κυτταρικών γραμμών και HNOKs. έκφραση ANXA10 πρωτεΐνης (μοριακό βάρος, 37 kDa) είναι επάνω-ρυθμίζονται στα OSCC προερχόμενων κυτταρικών γραμμών σε σύγκριση με εκείνη στα HNOKs. δεδομένα πρωτεΐνη πυκνομετρική ANXA10 κανονικοποιούνται προς α-τουμπουλίνης επίπεδα πρωτεΐνης. Οι τιμές εκφράζονται ως ποσοστό των HNOKs.

Η

Δημιουργία κυττάρων νοκ ντάουν ANXA10

Επειδή η έκφραση ANXA10 ήταν ρυθμισμένη στα κυτταρικά γραμμές OSCC, υποθέσαμε ότι θα μπορούσε να διαδραματίσει ANXA10 ένα σημαντικό ρόλο στην OSCCs. Για να εκτιμηθεί η ANXA10 λειτουργίες

in vitro

, ένα πείραμα shRNA διεξήχθη με τη χρήση των κυττάρων SA3 και ΗΟ-1-υ-1. Εκδήλωση ANXA10 mRNA και πρωτεΐνης στα shANXA10-επιμολυσμένα κύτταρα ήταν σημαντικά χαμηλότερα από ό, τι στα κύτταρα shMock-επιμολυσμένα (SA3 και ΗΟ-1-υ-1-προερχόμενα μορφομετατροπέα κύτταρα, Σχήμα 2Α, Β? *

p

& lt?. 0.05)

(Α) qRT-PCR δείχνει ότι η έκφραση ANXA10 mRNA στα shANXA10-επιμολυσμένα κύτταρα (Sa3- και Ho-1-u-1 που προέρχεται από επιμολύνσεις? 2 κλώνους το καθένα) είναι σημαντικά χαμηλότερες ό, τι στις shMock-επιμολυσμένα κύτταρα (*

ρ

& lt? 0,05? Mann-Whitney U test). (Β) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης, δείχνει ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης σε ANXA10 shANXA10-επιμολυσμένα κύτταρα (Sa3- και ΗΟ-1-υ-1 που προέρχεται από επιμολύνσεις? 2 κλώνοι έκαστο) επίσης έχει μειωθεί σημαντικά σε σύγκριση με ότι στα shMock-επιμολυσμένα κύτταρα

Λειτουργική ανάλυση της ANXA10 νοκ ντάουν κυττάρων

για να αξιολογηθεί η επίδραση των ANXA10 νοκ ντάουν στην κυτταρική ανάπτυξη, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Τα διαμολυνθέντα με το ANXA10 shRNA (shANXA10) – και τον έλεγχο shRNA (shMock) επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 βιώσιμα κύτταρα /φρεάτιο μετρήθηκαν σε 7 συνεχόμενες ημέρες. Υπήρξε μια σημαντική μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη των shANXA10-επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα shMock-επιμολυσμένα (Sa3 ή ΗΟ-1-υ-1-προερχόμενα κύτταρα μορφομετατροπέα, Σχήμα 3? *

ρ

& lt? 0,05 ).

για να προσδιοριστεί η επίδραση της shANXA10 επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, shANXA10- και shMock επιμολυσμένα κύτταρα εμβολιάζονται σε πλάκες των 6 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 βιώσιμα κύτταρα /φρεάτιο. Αμφότερα τα προϊόντα επιμόλυνσης μετρήθηκαν επί 7 συνεχείς ημέρες. Η κυτταρική ανάπτυξη του shANXA10-επιμολυσμένα κύτταρα (Sa3- και ΗΟ-1-υ-1 που προέρχεται από επιμολύνσεις? 2 κλώνοι έκαστο) αναστέλλεται σημαντικά σε σύγκριση με shMock επιμολυσμένα κύτταρα μετά από 7 ημέρες (168 ώρες). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως το μέσο ± SEM τιμών από τρεις δοκιμασίες. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των shANXA10- και shMock-επιμολυσμένα κύτταρα (*

σ

& lt? 0,05? Mann-Whitney U test).

Η

Για να διερευνήσει μια πιθανή υποκείμενη μηχανισμό που θα μπορούσε να εξηγήσει μειωμένη κυτταρικού πολλαπλασιασμού στα shANXA10-επιμολυσμένα κύτταρα, αξιολογήσαμε τα μονοπάτια ERK, τα οποία είναι συχνά πάνω ρυθμισμένα σε ενδομητρίου και άλλων καρκίνων [26] – [29]. Η φωσφορυλιωμένη ERK πρωτεΐνη (pERK) μειώθηκε σημαντικά σε shANXA10-επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με shMock-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 4). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η οδός σηματοδότησης ERK συχνά εξασθενημένος σε shANXA10-επιμολυσμένα κύτταρα.

ANXA10 knockdown αιτίες μειωμένα επίπεδα φωσφορυλιωμένης ERK (pERK) σε σύγκριση με τα κύτταρα shMock-επιμολυσμένα (Sa3- και ΗΟ-1-υ -1-προέρχεται επιμολύνσεις? 2 κλώνους το καθένα)? το επίπεδο ERK είναι αμετάβλητη. δεδομένα πρωτεΐνη πυκνομετρική pERK /ERK κανονικοποιούνται προς α-τουμπουλίνης επίπεδα πρωτεΐνης.

Η

Για να διερευνηθεί ο μηχανισμός της προόδου του κυτταρικού κύκλου σε shANXA10-επιμολυσμένα κύτταρα, εκτελέσαμε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του shANXA10-επιμολυσμένα κύτταρα. Το ποσοστό της G1 φάσης σε shANXA10-επιμολυσμένα κύτταρα ήταν σημαντικά (

ρ

& lt? 0,05) υψηλότερη από ότι σε ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα (Σχήμα 5Α, Β). Εκτιμήσαμε επίσης το επίπεδο έκφρασης της εξαρτώμενης από κυκλίνη αναστολείς κινάσης (CDKIs: p21

Cip1 και p27

Kip1), κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, CDK2, CDK4 και CDK6. Όπως αναμενόταν, ενώ οι CDKIs ρυθμίστηκαν προς τα πάνω, μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω της κυκλίνης D1, κυκλίνη Ε, CDK2, CDK4, CDK6 και ανιχνεύθηκαν σε shANXA10-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 5C). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κάτω ρύθμιση ANXA10 ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό κατά συλλαμβάνοντας τη φάση G1.

Για να διερευνηθεί εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, αναλύσαμε προσδιορισμός με κυτταρομετρία ροής του περιεχομένου DNA από FACScalibur στην G0-G1, S, και, G2-M φάσεις. Προσδιορίσαμε το επίπεδο έκφρασης του CDKIs (ρ21

Cip1and ρ27

Kip1), κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, CDK2, CDK4, CDK6 και για την αναγνώριση του μηχανισμού με τον οποίο ANXA10 αναστέλλει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου στην φάση G1. (Α) Μετά το συγχρονισμό στο G0 /G1 φάση με στερούνται ορού, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής διεξήχθη για να διερευνηθεί η κυτταρικού κύκλου στα shANXA10- και shMock-επιμολυσμένα κύτταρα. Το ποσοστό της φάσης G1 στις shANXA10-επιμολυσμένα κύτταρα (Sa3- και ΗΟ-1-υ-1 που προέρχεται από επιμολύνσεις? 2 κλώνοι έκαστο) έχει αυξηθεί σημαντικά σε σύγκριση με τα ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα (

ρ

& lt ? 0,05,

U

Mann-Whitney test του). (Β) Μετά το συγχρονισμό στο G2 /M φάση σε κατεργασμένα με nocodazol, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής διεξήχθη για να διερευνηθεί η κυτταρικού κύκλου στα shANXA10- και shMock-επιμολυσμένα κύτταρα. Το ποσοστό της φάσης G1 στις shANXA10-επιμολυσμένα κύτταρα (Sa3- και ΗΟ-1-υ-1 που προέρχεται από επιμολύνσεις? 2 κλώνοι έκαστο) έχει επίσης αυξηθεί σημαντικά σε σύγκριση με τα ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα (

p

& lt? 0,05,

U

Mann-Whitney test του). ανάλυση (C) Ανοσοκηλίδωση δείχνει προς τα πάνω ρύθμιση του p21

Cip1and ρ27

Kip1 και ρύθμιση προς τα κάτω της κυκλίνης D1, κυκλίνη Ε, CDK2, CDK4, CDK6 και στις shANXA10-επιμολυσμένα κύτταρα (Sa3- και ΗΟ-1 -u-1 που προέρχονται από επιμολύνσεις?. 2 κλώνους το καθένα) σε σύγκριση με τις shMock-επιμολυσμένα κύτταρα

Η

Η αξιολόγηση της έκφρασης ANXA10 στην πρωτοβάθμια OSCCs

Εκπρόσωπος ανοσοϊστοχημεία (IHC) αποτελέσματα για ANXA10 πρωτεΐνης σε φυσιολογικό ιστό και από του στόματος πρωτογενούς OSCC φαίνονται στο Σχήμα 6Α-D. Οι ANXA10 IHC βαθμολογίες του κυτταροπλάσματος των πρωτογενών OSCCs ήταν σημαντικά (Σχήμα 6Ε? *

ρ

& lt? 0.001) υψηλότερο από φυσιολογικούς ιστούς, όπου οι βαθμολογίες των IHC κανονικής στοματικών ιστών και OSCCs κυμαίνονταν από 27,5 να 132,4 (διάμεσος, 93,5) και 60,5 να 230.4 (διάμεσος, 150.6), αντίστοιχα. Ο Πίνακας 1 δείχνει τις συσχετίσεις μεταξύ των κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά των ασθενών με OSCC και την κατάσταση της πρωτεϊνικής έκφρασης ANXA10 χρησιμοποιώντας το σύστημα βαθμολόγησης IHC. Μεταξύ των κλινικών ταξινομήσεις, ANXA10 θετικά OSCCs συσχετίστηκαν με καρκινική μεγέθους (

σ

= 0,027) και το στάδιο TNM των OSCCs (

σ

= 0,041).

αποτελέσματα Αντιπροσωπευτικά IHC για ANXA10 πρωτεΐνης σε κανονικά από το στόμα ιστού (Α, Β) και πρωτογενείς OSCC (C, D) (A, C) Αρχική μεγέθυνση, × 100. Ράβδοι κλίμακας, 50 μm. (Β, D) Πρωτότυπο μεγέθυνσης, × 400. Ράβδοι κλίμακας, 10 μm). Ισχυρή ανοσοαντιδραστικότητα ANXA10 ανιχνεύεται στην πρωτοβάθμια OSCCs? κανονική ιστών του στόματος δείχνουν σχεδόν αρνητική ανοσοχρώση. (Ε) Η κατάσταση της πρωτεϊνικής έκφρασης ANXA10 στην πρωτοβάθμια OSCCs (n = 100) και των κανονικών ομολόγων. Οι βαθμολογίες ANXA10 IHC υπολογίζεται ως εξής: σκορ IHC = 1 × (αριθμός των ασθενώς χρωσμένων κυττάρων στο πεδίο) + 2 × (αριθμός των μετρίως χρώση κυττάρων στο πεδίο) + 3 × (αριθμός έντονα χρωματισμένο κυττάρων στο πεδίο) . Οι βαθμολογίες ANXA10 IHC για την κανονική στοματική ιστούς και OSCCs κυμαίνονταν από 27,5 να 132,4 (διάμεσος, 93,5) και 60,5 να 230.4 (διάμεσος, 150.6), αντίστοιχα. τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ANXA10 στην OSCCs είναι σημαντικά (*

σ

& lt? 0,001, Mann-Whitney για

U

δοκιμή). υψηλότερο από το κανονικό προφορική ιστούς

Η

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, ANXA10 ήταν συχνά υπερεκφράζεται σε OSCC που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές, και προς τα κάτω ρύθμιση οδήγησε σε μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού με αδρανοποίηση του ΕΚΚ. Η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου έδειξε επίσης ότι G1 σύλληψη έλαβε χώρα στο ANXA10 νοκ ντάουν κύτταρα μέσω μειώθηκαν CDKI (p21

Cip1 και p27

Kip1) έκφρασης. Επιπλέον, ANXA10 ήταν συχνά πάνω ρυθμισμένα σε πρωτογενείς OSCCs και υψηλότερη έκφραση ANXA10 συσχετίστηκε με καρκινική μεγέθους (

σ

= 0,027). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ANXA10 συνδέεται με ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου στην φάση G1 και παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινική εξέλιξη σε OSCCs.

Από του στόματος καρκινογένεση και άλλους τύπους καρκίνου πιστεύεται ότι είναι πολλών σταδίων διεργασίες που περιλαμβάνουν προοδευτική διαταραχή του πολλαπλασιασμού των επιθηλιακών κυττάρων, οι μηχανισμοί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε κύτταρα όγκου είναι ένα σημαντικό πεδίο μελέτης για ογκική θεραπεία και μοριακή βιολογία του καρκίνου [30], [31]. Αννεξίνες, συμπεριλαμβανομένων ANXA10, έχουν παίξει σημαντικό ρόλο στην καρκινική ανάπτυξη και την εξέλιξη [14] – [16], [18], [19]. Ωστόσο, καμία άμεση απόδειξη έχει δείξει ότι ANXA10 απαιτείται για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Για να καθοριστεί εάν η λειτουργία ANXA10 είναι σχετική με την πρόοδο OSCC, εκτελέσαμε λειτουργικές μελέτες χρησιμοποιώντας shRNA και διαπίστωσε ότι η καταστολή της ANXA10 μειώθηκε σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ως αποτέλεσμα της ανέστειλε ΜΑΡΚ μονοπάτι με ρύθμιση προς τα κάτω του pERK σηματοδότησης. Το μονοπάτι σηματοδότησης ERK /ΜΑΡΚ έχει σχέση με πολλές κυτταρικές διεργασίες, όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, ομοιόσταση, και η κυτταρική επιβίωση [17], [32]. Η ενεργοποίηση της ERK /ΜΑΡΚ σηματοδοτική οδό προωθεί ανώμαλη κυτταρική ανάπτυξη και ογκογένεση σε πολλούς τύπους όγκων. Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι η έκφραση ANXA10 ήταν σχετική με φωσφορυλίωση της ERK και ενεργοποίηση της /ΜΑΡΚ οδού σηματοδότησης ERK. Η οδός ΕΚΚ /ΜΑΡΚ ελέγχεται αυστηρά από μηχανισμούς εξωκυτταρικών σημάτων. Αυτό περιλαμβάνει τον έλεγχο των ενδοκυτταρικών Ca

2+ συγκεντρώσεις, επιτρέποντας έτσι Ca

2+ για να χρησιμεύσει ως ένας δεύτερος αγγελιαφόρος [33]. Ca

2 + -effector πρωτεΐνες μπορούν να μεσολαβήσουν κυτταρικές αποκρίσεις σε αλλαγές στην ενδοκυτταρική Ca

2+ επίπεδα. Αννεξίνες, μια οικογένεια τέτοιων εντόνως διατηρημένη Ca

2 + -regulated πρωτεΐνες, χαρακτηρίζονται από την ικανότητά τους να συνδέονται με φωσφολιπίδια σε Ca

2 + -εξαρτώμενη τρόπο και τις περισσότερες λειτουργίες αννεξίνης συνδέονται με την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με κυτταρικές μεμβράνες σε ρυθμιζόμενη τρόπο [12], [13]. Με βάση αυτές τις αποδείξεις σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα μας, υποδεικνύουν ότι μπορεί να επηρεάσει ANXA10 ενδοκυτταρικού Ca

2+ ομοιόσταση και άμεσα ή έμμεσα αλληλεπιδρά με την ενεργοποίηση των οδών σηματοδότησης ERK /ΜΑΡΚ.

Εκτός από τη σηματοδότηση ΜΑΡΚ μονοπάτι, κύτταρα OSCC με shANXA10 αποκάλυψε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 φάση με up-ρύθμιση του p21

Cip1 και p27

Kip1 και προς τα κάτω ρύθμιση της κυκλίνης D1 και κυκλίνης Ε Οι δύο τελευταίοι είναι επίσης κρίσιμη ρυθμιστές της G1 εξέλιξη και τη μετάβαση G1-S. Η αναστολή μπλοκ έκφραση G1-S μετάβασή τους στον κυτταρικό κύκλο. Οι δραστηριότητες των συμπλοκών κυκλίνης-CDK διαμορφώνεται από δύο τύπους CDKIs, CIP /Kip (p21

Cip1and p27

Kip1), η οποία ρυθμίζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Μέλη της οικογένειας bind CIP /Kip σε σύμπλοκα κυκλίνης-CDK και αναστέλλουν τις δραστηριότητές τους, η οποία οδηγεί σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου G1. Κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, ρ21

Kip1, και ρ27

Τα επίπεδα Kip1 επηρεαστεί από πολλαπλές οδούς σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του /ΜΑΡΚ σηματοδότηση μονοπατιού ERK [25], [34]. Κυκλίνη D1 και η κυκλίνη Ε είναι συχνά πάνω ρυθμισμένα σε ανθρώπινους καρκίνους [35], [36]. Ο μηχανισμός της ενεργοποίησης ERK σε μη προσκολλημένα ινοβλάστες έχει αναφερθεί ότι επηρεάζουν κυκλίνης D1 [37]. Σε άλλες αναφορές, η ενεργοποίηση της ERK οδηγεί σε αυξητική ρύθμιση της κυκλίνης D1 [38]. Η CDKIs, p21

Kip1 και p27

Kip1, είναι συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε καρκίνους του ανθρώπου [39], [40]. Ο μηχανισμός ρύθμισης ΕΚΚ της p21

Kip1 και p27

Kip1 παραμένει ασαφής. ΕΚΚ μπορεί να φωσφορυλιώνει άμεσα p21

Kip1 και p27

Kip1 [41] – [43]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ANXA10 ενεργοποιεί την ΜΑΡΚ μονοπατιού σηματοδότησης μέσω φωσφορυλίωσης της ERK και προωθεί την G1 του κυτταρικού κύκλου από CDKIs κάτω ρύθμιση σε εξέλιξη OSCC.

Μέχρι σήμερα, η έκφραση της ANXA10 στους ιστούς OSCC και ο συσχετισμός της με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά δεν έχουν διευκρινισθεί. Στη μελέτη μας, αν και τα θετικά ποσοστά ANXA10 σε όγκους πρώιμου σταδίου ήταν σημαντικά χαμηλή, οι θετικούς ρυθμούς στις προηγμένες-όγκοι αυξήθηκαν σημαντικά? αυτό σημαίνει έντονα ότι ANXA10 μπορεί να παίξει ένα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου. Δεδομένου ότι ANXA10 υπερέκφραση μπορεί να προβλέψει κακοήθεια, διαστρωμάτωση των ασθενών με ANXA10 κατάσταση μπορεί να παρέχει μια πιο εξατομικευμένη προσέγγιση για τη θεραπεία της ανθρώπινης τον καρκίνο του στόματος.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ANXA10 υπερεκφράζεται συχνά σε OSCCs και ότι αυτή η υπερέκφραση μπορεί να είναι που συνδέονται με την καρκινική εξέλιξη προωθώντας την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου στην φάση G1 μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού σηματοδότησης ERK /ΜΑΡΚ, που οδηγεί σε μειωμένη έκφραση του CDKIs. Ενώ απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να μελετηθεί η αλληλεπίδραση της ANXA10 και μονοπατιού ERK /ΜΑΡΚ σηματοδότησης, τα στοιχεία αυτά δηλούν ότι ANXA10 παίζει σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την έκφραση είναι πιθανό να είναι ένας βιοδείκτης της εξέλιξης και ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων στην πρωτοβάθμια OSCCs.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Graduate School of Medicine, University Chiba (ο αριθμός έγκρισης, 236) και έγινε σύμφωνα με τα δεοντολογικά πρότυπα που ορίζονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς.

OSCC κυτταρικές γραμμές και δείγματα ιστών

Οι ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές OSCC (HSC-2, HSC-3, HSC-4, ΚΩΝ, Ho-1 -u-1, και Ca9-22) αγοράστηκαν από το Science Research Resources Bank Ανθρώπου, Osaka, Japan. SA3 παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. S. Fujita σε Wakayama Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Wakayama, Ιαπωνία [44]. Πρωτογενή καλλιεργημένα HNOKs υπηρέτησε ως φυσιολογικοί μάρτυρες [45] – [49]. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle /F-12 ΗΑΜ (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Sigma) και 50 μονάδες /ml πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (Sigma) σε υγροποιημένη 5 % CO

2 /ατμόσφαιρα αέρα στους 37 ° C.

εκατό ζεύγη των πρωτογενών δειγμάτων OSCC και τα αντίστοιχα κανονικά από το στόμα επιθηλιακών ιστών ελήφθησαν κατά τη διάρκεια χειρουργικών επεμβάσεων στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Chiba, Chiba, Ιαπωνία. Όλοι οι ασθενείς παρείχαν ενημερωμένη συγκατάθεση για τη χρήση του πρωτοκόλλου, το οποίο μελέτησε και ενέκρινε η επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Chiba. Οι εκτομή ιστοί χωρίζεται σε δύο μέρη? ένας καταψύχθηκε αμέσως και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι την απομόνωση RNA, και το δεύτερο ήταν σταθερό σε διάλυμα ρυθμιστικού διαλύματος φορμαλδεΰδης 20% για παθολογική διάγνωση και IHC. Ιστοπαθολογική διάγνωση του κάθε ιστού έγινε σύμφωνα με τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας από το Τμήμα Παθολογίας, Chiba University Hospital. Κλινικοπαθολογοανατομικές στάσης προσδιορίστηκε σύμφωνα με τον όγκο-κόμβο-μεταστάσεις κατάταξη της Διεθνούς Ένωσης κατά του Καρκίνου. Όλα τα δείγματα OSCC επιβεβαιώθηκαν ιστολογικά και ελέγχονται για να διασφαλιστεί η παρουσία των καρκινικών σε περισσότερες από 80% των δειγμάτων.

Ποσοτική πραγματικό χρόνο αντίστροφη μεταγραφή-PCR

Το συνολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ ( Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA παρήχθη από 5 μg ολικού RNA με τη χρήση Ready-To-Go You-Prime First-Strand Χάντρες (GE Healthcare, Buckinghamshire, Ηνωμένο Βασίλειο) και ολιγο (dT) εκκινητή (Hokkaido System Science, Σαπόρο, Ιαπωνία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . qRT-PCR διεξήχθη για να αξιολογηθεί το επίπεδο έκφρασης του

ANXA10

mRNA στα OSCC προερχόμενων κυτταρικών γραμμών και HNOKs. Τα επίπεδα έκφρασης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας εκκινητές και ανιχνευτές που έχουν σχεδιαστεί με τη χρήση του Probe Βιβλιοθήκη Καθολική (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για qRT-PCR ήταν:

ANXA10

, μπροστά 5′-GCATCCATTATGGGATTGAAA-3 ‘, 5′-αντίστροφη CAAAATGTTTTGTGGAGACTATGTG-3’, και καθολική καθετήρα # 24. Όλα qRT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα LightCycler® 480 PCR (Roche). Ενισχύσεις ξεκίνησαν με ένα 10-λεπτά προ-επώασης στους 95 ° C, που ακολουθείται από 45 κύκλους των 10 δευτερολέπτων στους 95 ° C για μετουσίωση προτύπου, 30 δευτερόλεπτα στους 55 ° C για εκκινητή ανασύνδεσης /επέκτασης και ψύξη για 30 δευτερόλεπτα στους 40 ° ΝΤΟ. Το ποσό μεταγραφή για το

ANXA10

εκτιμήθηκε από τις αντίστοιχες τυπικές καμπύλες και ομαλοποιούνται στη

αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης

(

GAPDH

) (προς τα εμπρός 5-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA -3’cell, αντίστροφη 5′-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 ‘, και καθολική καθετήρα # ποσό 60) απομαγνητοφώνηση προσδιορίζεται σε αντίστοιχα δείγματα.

ανοσοαποτύπωσης ανάλυση

Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό φωσφορικά άλατα ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και φυγοκεντρήθηκε για λίγο. Τα κυτταρικά σφαιρίδια επωάστηκαν στους 4 ° C για 30 λεπτά σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 4% β /ο CHAPS, και 10 mM Tris [ρΗ 7.4]) με το κοκτέιλ αναστολέα πρωτεϊνάσης (Roche). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με μια πρωτεΐνη Bio-Rad Δοκιμασία (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Εκχυλίσματα πρωτεΐνης (20 μg) διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου δωδεκυλ θειικού νατρίου σε 4-12% γέλη, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, και αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε Ανασταλτικό One (Nacalai Tesque, Tokyo, Japan). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντι-ANXA10 πολυκλωνικό αντίσωμα (Abnova, Taipei, Ταϊβάν), ποντίκι αντι-

α-τουμπουλίνης

μονοκλωνικό αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. USA), ποντικού αντι-ΕΚΚ 1/2 μονοκλωνικό αντίσωμα (Κ &? D Systems, Abingdon, UK), κουνελιού αντι-φωσφορυλιωμένης ERK 1/2 μονοκλωνικό αντίσωμα (pERK, R &? συστήματα D), ποντικού αντι-ρ21

Cip1 μονοκλωνικό αντίσωμα, αντι-ρ27

Kip1 πολυκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-κυκλίνη D1 μονοκλωνικό αντίσωμα (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), αντί-Κυκλίνη Ε μονοκλωνικό αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology), αντι-CDK2 μονοκλωνικό αντίσωμα, αντι-CDK4 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού κουνελιού ποντικού , ή αντι-CDK6 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Cell Signaling Technology) για 4 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Η μεμβράνη πλύθηκε με 0.1% Tween-20 σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα, επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα και συζευγμένο με ραφανιδική υπεροξειδάση-συζευγμένο αντι-κουνελιού ή αντι-ποντικού IgG (Promega, Madison, WI, USA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου . Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με SuperSignal χημειοφωταυγές υπόστρωμα (Thermo, Waltham, ΜΑ, USA). Τέλος, τα αποτελέσματα της ανάλυσης ανοσοστύπωσης έγιναν ορατές με έκθεση της μεμβράνης σε ένα ψυχόμενο σύστημα κάμερας CCD (ΑΤΤΟ, Tokyo, Japan). εντάσεις σήματος ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την έκδοση CS Analyzer 3.0 (ΑΤΤΟ).

Η επιμόλυνση με το πλασμίδιο shRNA

Τα κυτταρικά γραμμές OSCC, SA3 και ΗΟ-1-υ-1, στα οποία η έκφραση της πρωτεΐνης ANXA10 ήταν υψηλότερη από ό, τι στις άλλες κυτταρικές γραμμές, επιμολύνθηκαν σταθερά με το ANXA10 shRNA (shANXA10) ή τον έλεγχο shRNA (shMock) (Santa Cruz Biotechnology) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη LTX και Plus Αντιδραστήρια (Invitrogen). Οι σταθερές επιμολύνσεις απομονώθηκαν από το μέσο καλλιέργειας που περιείχε 2 mg /ml πουρομυκίνη (Invitrogen). Δύο έως 3 εβδομάδες μετά την επιμόλυνση, βιώσιμες αποικίες συνελήφθησαν και μεταφέρθηκαν σε νέα πιάτα. shANXA10- και shMock-επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα.

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού

Για να διερευνηθεί η επίδραση της ANXA10 knockdown επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, shANXA10- και shMock-επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε έξι- φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 βιώσιμα κύτταρα /φρεάτιο. Στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία, τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Προκειμένου να συγχρονίσει τα κύτταρα κατά τη G0 /G1 ή G2 /M μετάπτωσης, τα κύτταρα στερήθηκαν ορού για 48 ώρες ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με 200 ng /ml nocodazole (Sigma) για 20 ώρες [50], [51]. Για τον προσδιορισμό της κατανομής του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, και ανιχνεύθηκαν με κιτ αντιδραστηρίου DNA CycleTEST Plus (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα συμπυκνώθηκαν σε 5 × 10

5 κύτταρα /ml υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 400 χ g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Προσθέσαμε 250 ml διαλύματος Α (ρυθμιστικό θρυψίνη) και επωάστηκαν το μείγμα για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια προστίθενται 200 ​​ml διαλύματος Β (αναστολέα της θρυψίνης και RNase σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα), και επωάζεται το μείγμα για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, προστίθενται 200 ​​ml διαλύματος C (προπίδιο διάλυμα χρώσης ιωδιούχο), και επωάστηκαν το μείγμα για 10 λεπτά στο σκοτάδι επί πάγου. Προσδιορισμός με κυτταρομετρία ροής του περιεχομένου DNA αναλύθηκε με FACScalibur (Becton-Dickinson). Τα κλάσματα των κυττάρων στην G0-G1, S, G2 και Μ-φάσεις αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA).

Ανοσοϊστοχημεία

IHC διεξήχθη στις 4-μm τμήματα εγκλεισμένων σε παραφίνη δειγμάτων χρησιμοποιώντας αντι-ANXA10 πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Abnova). Εν συντομία, μετά αποπαραφινώσεως και ενυδάτωση, η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποσβέστηκε με επώαση 30 λεπτών σε ένα μίγμα 0,3% διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου σε 100% μεθανόλη. Οι τομές αποκλείσθηκαν επί 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με 1,5% ορό αποκλεισμού (Santa Cruz Biotechnology) σε PBS πριν την αντίδραση με το αντίσωμα αντι-ANXA10 (1:1000 αραίωση) στους 4 ° C σε ένα υγρό θάλαμο όλη τη νύκτα. Κατά την επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα, τα δείγματα πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Histofine Simplestain Max-ΡΟ (G) (Nichirei, Tokyo, Japan) που ακολουθείται από ανάπτυξη χρώματος σε 3,3′-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική (DAKO, Carpinteria, CA, USA). Τέλος, τα πλακίδια επιχρωματίστηκαν ελαφρώς με αιματοξυλίνη, αφυδατώθηκαν με αιθανόλη, καθαρίζονται με ξυλόλιο, και τοποθετημένα. Η μη ειδική δέσμευση του αντισώματος με τις πρωτεΐνες, εκτός από μερικές φορές συνέβη το αντιγόνο. Ως αρνητικός έλεγχος, τριπλούν τομές ανοσοχρωματίστηκαν χωρίς έκθεση σε πρωτογενές αντίσωμα, η οποία επιβεβαίωσε την ειδικότητα χρώσης. Για να ποσοτικοποιηθεί η κατάσταση της πρωτεϊνικής έκφρασης ANXA10 σε αυτά τα συστατικά, που χρησιμοποιούνται συστήματα βαθμολόγησης IHC περιγράφηκε προηγουμένως [48], [52] – [55]. Η ένταση του ανοσοαντίδρασης ANXA10 βαθμολογήθηκε ως εξής: 1+, αδύναμη? 2+, μέτρια? και 3+, έντονη. Οι κυτταρικές αριθμοί και η ένταση χρώσης στη συνέχεια πολλαπλασιάστηκαν για να παράγουν το σκορ ANXA10 IHC. Θήκες με βαθμολογία ANXA10 IHC υπερβαίνει τα 132,0 (+3 τυπική απόκλιση (SD) βαθμολογία για φυσιολογικό ιστό) ορίστηκαν ως ANXA10 θετικά. Ο ± 3 αποκοπής SD, που στατιστικά είναι μόλις 0,2% της μέτρησης και αναμένεται να πέσει έξω από αυτό το εύρος, χρησιμοποιήθηκε γιατί ήταν απίθανο να επηρεαστεί από ένα τυχαίο πειραματικό σφάλμα που παράγεται από το χειρισμό του δείγματος [56]. Δύο ανεξάρτητοι παθολόγους, κανείς από τους οποίους είχαν γνώση της κλινικής κατάστασης των ασθενών, κάνει αυτές τις αποφάσεις.

Η στατιστική ανάλυση

Η σημασία των επιπέδων έκφρασης ANXA10 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher ή το Mann -Whitney τεστ U.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM).

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε κα Lynda Γ Charters για την επεξεργασία αυτού του χειρογράφου.