Abstract

Μία νέα λειτουργία για το συνδετικό υλικό του Arl δύο (Bart) μόριο σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα έχει αναφερθεί. BART αναστέλλει τη διεισδυτικότητα του παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μέσω δέσμευσης σε ένα Ca

2 + -εξαρτώμενη, φωσφορυλιωμένα, γουανοσίνη τριφωσφατάσης (GTPase) πρωτεΐνη σύντηξης μεμβράνης, annexin7 (ANX7). Μια λειτουργία καταστολής όγκου για ANX7 είχε προηγουμένως αναφερθεί με βάση την προγνωστική ρόλο της σε ανθρώπινους καρκίνους και καρκίνο επιρρεπείς φαινότυπο ποντίκι

ANX7

(+/-). Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι το σύμπλοκο BART-ANX7 μεταφέρεται προς κύτταρο προεξοχές σε μεταναστευτικά κύτταρα όταν BART υποστηρίζει την πρόσδεση του ANX7 στην ισομορφή της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC) ΡΚΟα. Πρόσφατα στοιχεία έχουν δείξει ότι η φωσφορυλίωση της ANX7 από PKC ενισχύει σημαντικά ANX7 που προκαλείται σύντηξη των κυστιδίων φωσφολιπιδίων? Ωστόσο, τα τρέχοντα δεδομένα δείχνουν ότι η σύνθετη BART-ANX7 μειώνει την δραστηριότητα ΡΚΟα. Να χτυπήσει κάτω ενδογενή BART και ANX7 αυξάνει τη δραστηριότητα των ΡΚΟα και ειδικούς αναστολείς της ΡΚΟα καταργήσει σημαντικά τη διεισδυτικότητα που προκαλείται από BART και ANX7 νοκ ντάουν. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι BART συμβάλλει στη ρύθμιση της δραστηριότητας ΡΚΟα μέσω της σύνδεσης με ANX7, επηρεάζοντας έτσι την ικανότητα εισβολής των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος. Έτσι, είναι πιθανό ότι BART και ANX7 μπορεί να ρυθμίσει σαφώς την κατάντη σηματοδότησης του ΡΚΟα που είναι δυνητικά σχετική με κύτταρο εισβολή δρώντας ως αντι-επεμβατική μόρια

Παράθεση:. Taniuchi K, K Yokotani, Saibara Τ (2012 ) BART Αναστέλλει καρκίνο του παγκρέατος κυττάρων εισβολή από ΡΚΟα αδρανοποίηση μέσω σύνδεσης προς ANX7. PLoS ONE 7 (4): e35674. doi: 10.1371 /journal.pone.0035674

Επιμέλεια: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Ιανουαρίου του 2012? Αποδεκτές: 19 Μαρτίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 19 Απρίλη 2012

Copyright: © 2012 Taniuchi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια Grant-in-Aid από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας της Ιαπωνίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το συνδετικό υλικό του Arl δύο (Bart) μόριο είναι μια διαλυτή πρωτεΐνη 19-kDa που αρχικά καθαρίζεται από βόειο εγκέφαλο και ταυτοποιήθηκε σαν ένα συνεταίρο δέσμευσης του ADP-ριβοσυλίωση του παράγοντα-σαν 2 (ARL2) [1]. Η σύνδεση του BART να ARL2 είναι υψηλής συγγένειας και εξαρτάται από την σύνδεση της GTP προς ARL2 [1]. έχουν διακριτές λειτουργίες έχουν συναχθεί από ευρήματα που ARLs στερούνται των βιοχημικών ή γενετικό χαρακτηριστικό δραστηριότητες παραγόντων ADP ριβοζυλίωσης (ARFs), παρά την ταυτότητα αλληλουχίας αμινοξέων 40% έως 60% μεταξύ ARFs και ARLs [2]. ARL2 έχει ενοχοποιηθεί ως ένας ρυθμιστής της δυναμικής μικροσωληνίσκων και δίπλωση [3], αλλά η λειτουργία του παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Αναφέραμε προηγουμένως ότι η ρύθμιση του BART μετα-μεταγραφική τροποποίηση

μέσω

ενδοκυτταρικής σύνδεσης προς G3BP σε κόκκους στρες CD24 συμβάλλει στην αναστολή της εισβολής και της μετάστασης των κυττάρων του παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) [4]. Ν-τερματικό G3BP συμβάλλει στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση BART [5]. Περαιτέρω μελέτη έδειξε ότι μειώνει BART διηθητικότητα των κυττάρων PDAC αναστέλλοντας την ARL2 μεσολάβηση μείωση στην δραστηριότητα της πρωτεΐνης Rho ΟΤΡάσης RhoA [6]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι BART παίζει ένα ρόλο στην αναστολή της ικανότητας εισβολής PDAC.

ANX7 είναι ένα μέλος της οικογένειας των πρωτεϊνών αννεξίνης και κώδικες δεσμευτικούς φωσφολιπιδίου εξαρτώμενο από ασβέστιο για ένα Ca

2 + -ενεργοποιημένου ΟΤΡάσης.

ANX7

(+/-) knockout ποντίκια έχουν Ca

2 + εξαρτώμενη ενδοκρινικό εκκριτική ελαττώματα [7]. ANX7 φωσφορυλιώνεται από PKC, η οποία ενισχύει σημαντικά πρόσδεση του ANX7 να συντήκονται κυστίδια φωσφολιπιδίων σε χρωμιόφιλα κύτταρα [8]. Ενεργοποιημένος PKCs επάγουν την έκκριση των ΜΜΡ-9, οδηγούν σε ενεργοποίηση των ΜΜΡ-2, ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκκριση ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2, και την αύξηση της ΜΤ1-ΜΜΡ στην κυτταρική επιφάνεια [9]. Έτσι, ANX7 μπορεί να είναι ένας από τους παράγοντες που συνδέονται με την PKC-εξαρτώμενη έκκριση καταρράκτη. Επιπλέον, ANX7 είναι ένα πρόσφατα περιγράφεται ογκοκατασταλτικό γονίδιο για τον καρκίνο του προστάτη, όπως αποδεικνύεται από την απώλεια της ετεροζυγωτίας και μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης ANX7 σε ένα μεγάλο κλάσμα των αρχειοθετημένων μεταστατικών όγκων [10]. ANX7 παρουσιάζει πολλές βιολογικές και γενετικές ιδιότητες ενός γονιδίου καταστολής όγκων και επίσης εμπλέκεται στην καρκινογένεση μέσω μονοπατιών σηματοδότησης διακριτών συμμετοχή άλλων καταστολείς όγκων, επιδιόρθωσης DNA και τα γονίδια που σχετίζονται με την απόπτωση [10], [11]. Αυτές οι αναφορές έχουν προτείνει ότι ANX7 παίζει πολλούς διαφορετικούς ρόλους που εμπλέκονται στην εξωκυττάρωση, η καταστολή του όγκου και την καρκινογένεση.

PKC είναι μια οικογένεια κινασών σερίνης /θρεονίνης εμπλέκονται στη μεταγωγή σημάτων, συμπεριλαμβανομένου του σήματος Ras, για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και διαφοροποίηση [12], [13]. Η οικογένεια PKC αποτελείται από τουλάχιστον 12 ισομορφές με διαφορετικά πρότυπα έκφρασης ιστού, εξειδικεύσεις υποστρώματος, και υποκυτταρικά τοπικές προσαρμογές που σχετίζονται με εξειδικευμένες λειτουργίες των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση [14]. Τα «κλασικά» PKCs (α, β1, β2, και γ) εστέρες δεσμεύουν φορβόλης και Ca

2+ εξαρτάται. Οι «νέες» PKCs (δ, ε, η και θ) δεν εξαρτώνται από Ca

2+, αλλά δεσμεύουν εστέρες φορβόλης. Η τρίτη υποοικογένεια περιλαμβάνει τα «άτυπα» PKCs (ξ, ι, λ και μ), το οποίο δεν δεσμεύει είτε Ca

2+ ή φορβολεστέρα [14], [15]. Ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένους υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας, όπως ο υποδοχέας EGF ή PDGF υποδοχέα [16], ή Ras [17], αιτία υπερενεργοποίηση της PKC, καθώς και της αλληλουχίας που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ). Η υπερέκφραση του ΡΚΟδ επάγει μια πιο κακοήθη φαινότυπο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές

in vivo

, μέσω της διαφοροποίησης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης [18]. Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι η ενεργοποιημένη PKC προκαλεί σχηματισμό ελασματοπόδια και η συνεπαγόμενη αύξηση μεταναστευτική δραστηριότητα του επιπεφυκότα ινοβλάστες [19]. Έτσι, έχει προταθεί ότι PKCs επάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων /επιβίωσης, εισβολή και μετάσταση.

Σε αυτή τη μελέτη, ANX7 ταυτοποιήθηκε ως εταίρος δέσμευσης νέα του BART, και Bart βρέθηκε να σχετίζεται με ANX7-PKC σχηματισμού συμπλέγματος στα κύτταρα PDAC. Επιπλέον, τα τρέχοντα αποτελέσματα έδειξαν ότι χτυπούν κάτω BART επάγει κυτταρική εισβολή από αυξανόμενη δραστηριότητα ΡΚΟα με την απώλεια του σχηματισμού συμπλέγματος ANX7-ΡΚΟα. Έτσι, μειώθηκε ενεργό ΡΚΟα

μέσω

τόσο BART και ANX7 συμβάλλει στην αναστολή της PDAC εισβολής.

Αποτελέσματα

BART συνδέεται με ANX7 στα κύτταρα PDAC

BART knockdown αυξήσεις οπισθοπεριτοναϊκή εισβολή και μετάσταση κυττάρων PDAC του ήπατος σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος, όπως περιγράφεται σε προηγούμενη έκθεση [4]. Για να διερευνηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο BART καταστέλλει διεισδυτικότητα και μετάσταση, ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) πειράματα πραγματοποιήθηκαν στην ανθρώπινη κυτταρική γραμμή PDAC S2-013 χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα για να BART, για την ανίχνευση των συμπλοκών BART με άλλες πρωτεΐνες. S2-013 είναι κλωνοποιημένο υποσειρά ενός PDAC κυτταρικής γραμμής (SUIT-2) που προέρχεται από ένα μετάσταση στο ήπαρ [20], και λήφθηκε από Dr. Τ Iwamura (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japan). Silver-βάφονται ανοσοκαταβυθίστηκαν κλάσματα διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα SDS-PAGE απεκάλυψε μία ζώνη 50 kDa που δεν παρατηρήθηκε σε ανοσοκαθιζήματα ελέγχου ισοτύπου (βέλος στην Εικ. 1Α). Η ζώνη αποκόπηκε και αναλύθηκε με Q-TOF-MS μετά από πέψη με θρυψίνη στο πήκτωμα, και ταυτοποιήθηκε ως ANX7. Η κάλυψη πεπτιδική αλληλουχία ήταν 15% (Σχ. 1Β). Αυτή η ειδική σύνδεση του ANX7 να BART αποδείχθηκε με συν-IP από S2-013 κύτταρα (Σχ. 1C) και υποκυτταρικά colocalization αναλύθηκε με ανοσοχρώση S2-013 κύτταρα (Σχ. 1D). BART και ANX7 συγκατακρημνίστηκαν και ήταν colocalized στο κυτταρόπλασμα. Αξίζει να σημειωθεί είναι ότι BART και ANX7 συσσωρεύεται στο lamellipodial-όπως προεξοχές που είναι απαραίτητα για τη μετανάστευση των κυττάρων (βέλη στο Σχ. 1Ε).

Α. Οι ανοσοκαθιζήσεις από S2-013 κύτταρα χρησιμοποιώντας κανονική IgG κουνελιού (έλεγχος) και αντίσωμα αντι-BART εξετάστηκαν με ανάλυση χρώσεως με άργυρο. Q-TOF-MS ανάλυση διερευνήθηκε εξέχουσα συγκρότημα στο BART ανοσοϊζήματα (βέλος). B. Ποσοστό κάλυψης για ANX7 αντιπροσωπεύεται από τις προσδιοριζόμενες πεπτίδια στο συνολικό αλληλουχία πρωτεΐνης (αριθμός προσβάσεως NM_004034). Γ ανοσοκατακρημνίστηκαν ενδογενή BART ή ANX7 από S2-013 εξετάστηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-BART και αντισώματα αντι-ANX7. Κανονική κουνέλι ή ποντικός IgG χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος ισοτύπου για BART και ANX7, αντίστοιχα. Δ ανοσοκυτταροχημική χρώση των S2-013 κυττάρων χρησιμοποιώντας αντι-BART (πράσινο) και αντι-ANX7 (κόκκινο) αντισώματα. Μπλε, DAPI χρώση. Bar, 10 μm. Ε βέλη δείχνουν ότι BART (πράσινο) και ANX7 (κόκκινο) αποικίζει τις lamellipodial-όπως προεξοχές του S2-013 κυττάρων. Μπλε, DAPI χρώση. Μπαρ, 10 μm.

Η

ANX7 αναστέλλει PDAC εισβολή των κυττάρων

Προηγουμένως, κυτταρικοί κλώνοι παρήχθησαν στην οποία BART ήταν σταθερά καταστέλλεται από φορέα με βάση το συγκεκριμένο σύντομη φουρκέτα μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) σε S2-013 κύτταρα που προηγουμένως εξέφρασαν υψηλά επίπεδα BART [4]. Για να προσδιοριστεί η λειτουργία των συμπλοκών BART-ANX7, ένας επούλωση πληγών δοκιμασία ανοσοχρώση χρησιμοποιήθηκε για να παρατηρήσει τον εντοπισμό BART και ANX7 σε πολωμένα κύτταρα που μεταναστεύουν (Εικ. 2Α). Τόσο BART και ANX7 προσλήφθηκαν στις κορυφαίες άκρες κατά την επούλωση του ελέγχου S2-013 κύτταρα (βέλη στο Σχ. 2Α) του τραύματος. Εξάντληση των BART ανέστειλε τη συσσώρευση ANX7 στα χείλη προσβολής (κάτω πάνελ στο Σχ. 2Α). Σε συνδυασμό με το αποτέλεσμα του Σχ. 1Ε, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι BART και ANX7 αλληλένδετα εντοπίζεται στις κορυφαίες άκρες και στις lamellipodial-όπως προεξοχές που σχετίζονται με τη μετανάστευση των κυττάρων.

Α. Αρνητική ομελέτα ελέγχου (SCR-1) και BART RNAi (siBART-1) S2-013 κύτταρα σε καλλιέργειες συρροής τραυματίστηκαν. Μετά από 4 ώρες, τα κύτταρα ανοσοχρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας αντι-BART (πράσινο) και αντι-ANX7 (κόκκινο) αντισώματα. Μπλε, DAPI χρώση. Βέλη, colocalized BART και ANX7 βρίσκονται στην αιχμή των κυττάρων ελέγχου. Μπαρ, 10 μm. B. siRNA ολιγονουκλεοτίδια στόχευσης ANX7 (siANX7) και αρνητικό κωδικοποιημένα ελέγχου επιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα S2-013 και PANC-1. Western blotting επικυρωθεί ANX7 knockdown στις δύο κυτταρικές σειρές. Γ Transwell δοκιμασία κινητικότητος των κυττάρων σε επεξεργασία όπως στο (Β). Μετανάστευσαν κύτταρα σε τέσσερις τομείς ανά ομάδα μετρήθηκαν. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD. *

σ

& lt? 0.005 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. D. Η ποσοτικοποίηση της δοκιμασίας εισβολή δύο θαλάμων από κύτταρα που κατεργάζονται όπως στο (Β). Εισβολή κύτταρα σε τέσσερα πεδία ανά ομάδα μετρήθηκαν. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD. *

σ

& lt?. 0.001 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

In vitro

αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν για να εξετάσει τα αποτελέσματα των ANX7 στην κυτταρική κινητικότητα και την εισβολή. Όπως φαίνεται με ανάλυση κηλίδος Western, η έκφραση ANX7 ήταν σημαντικά μειωμένη σε S2-013 και μια κυτταρική σειρά PDAC, PANC-1, 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με τις ANX7 στόχευσης siRNA ολιγονουκλεοτίδια, σε αντίθεση με τα κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο siRNA-ολιγονουκλεοτίδια (Σχ . 2Β). Καταστολή της ANX7 ενισχυμένης κινητικότητας σε επικοινωνούντα δοκιμασίες κινητικότητα του S2-013 και PANC-1 σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Σχ. 2C). Σε αναλύσεις εισβολή δύο θαλάμων, τα κύτταρα ANX7 RNAi ήταν σημαντικά πιο επεμβατική από το S2-013 ελέγχου και κύτταρα PANC-1 (Σχ. 2D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ένα σημαντικό ρόλο για τη δέσμευση του BART και ANX7 σε αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης.

Η δέσμευση του ANX7 και φωσφορυλιωμένων PKC σχετίζεται με την αναστολή της ικανότητας εισβολής κυττάρων PDAC

Co-IP του ANX7 και πολύπλοκες PKC διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι-ANX7 ή αντι-PKC αντίσωμα (10800) αντιδρά με το ΡΚΟα, β1, β2, δ, ε και η ισομορφών σε S2-013 κύτταρα. Ανοσοκηλίδωση των ανοσοκαταβύθισης αποκάλυψε ότι ANX7 συν-ανοσοκαταβυθίζεται με PKC (Εικ. 3Α). έκφραση της PKC δεν ήταν ιδιαίτερα υψηλή, αλλά υπήρχαν σημαντικές ποσότητες σε συγκροτήματα ANX7-ανοσοκαταβυθίστηκε χωρίς PKC εκκριταγωγά. Τα αποτελέσματα του να χτυπήσει κάτω ANX7 για τη ρύθμιση της δραστικότητας της PKC διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-φωσφο-PKC (9379), η οποία ανιχνεύει τις κλασσικές PKCs (α, β1, β2 και γ) και τα νέα PKCs (δ, ε, η και θ) όταν φωσφορυλιώνεται σε ομόλογο κατάλοιπο να Thr514 του ΡΚΟγ (Σχ. 3Β). ANX7 knockdown επαγόμενη φωσφορυλίωση του PKC σε S2-013 κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι ANX7 παίζει ρόλο στη μείωση φωσφορυλιωμένο PKC. Για να διερευνηθεί η υποκυτταρική συνεντόπισης του ANX7 και φωσφορυλιωμένων PKC, S2-013 κύτταρα ανοσοχρώθηκαν. ANX7 και φωσφορυλιωμένη PKC ήταν colocalized σε lamellipodial-όπως προεξοχές (βέλη στο Σχ. 3C). Είναι ενδιαφέρον, ANX7 και φωσφορυλιωμένη PKC προσλήφθηκαν και colocalized στα χείλη προσβολής κατά την επούλωση του S2-013 κύτταρα (βέλη στο Σχ. 3D) τραυμάτων, υποδεικνύοντας ότι φωσφορυλιωμένη PKC συνδέεται με την αντι-επεμβατική λειτουργία του ANX7. Από ANX7 θα μπορούσε να λειτουργήσει σε φθίνουσα δραστικότητα PKC (Σχ. 3Β), ANX7-εξαρτώμενη αναστολή του κυτταρικού εισβολή είναι πιθανό να σχετίζεται με μειωμένη δραστικότητα των συγκεκριμένων κλασικής ή νέα ισόμορφα PKC. Έτσι, περαιτέρω πειράματα για την ανάλυση του BART-ANX7 που σχετίζεται με την αναστολή της κυτταρικής εισβολής επικεντρώθηκαν στις κλασικές και νέες ισομορφές της PKC με την οποία αντέδρασε η αντι-φωσφο-PKC αντίσωμα (9379).

Α. Ανοσοκαταβύθιση ενδογενούς ANX7 ή PKC από S2-013 κύτταρα. Ανοσοκαταβύθισης εξετάστηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-ANX7 και αντι-PKC αντισώματα. Κανονική IgG ποντικού ή κουνελιού χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος ισοτύπου για ANX7 ή PKC, αντιστοίχως. Β Western blot με αντι-PKC και αντι-φωσφο-PKC αντισώματα που δείχνει S2-013 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με siRNA για ANX7 σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο έλεγχο. χρώση Γ Ανοσοκυτοχημική σε S2-013 κύτταρα, όπως προσδιορίζεται με αντι-ANX7 (πράσινο) και (κόκκινο) αντισωμάτων-PKC αντι-φωσφο. Μπλε, DAPI χρώση. Βέλη, colocalized ANX7 και φωσφορυλιωμένη PKC σε lamellipodial-όπως προεξοχές. Bar, 10 μm. κύτταρα Δ Συρρέοντα S2-013 τραυματίστηκαν. Μετά από 4 ώρες, τα κύτταρα ανοσοχρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας αντι-ANX7 (πράσινο) και (κόκκινο) αντισωμάτων-PKC αντι-φωσφο. Μπλε, DAPI χρώση. Βέλη, colocalized ANX7 και φωσφορυλιωμένη PKC βρίσκονται στην αιχμή. Bar, 10 μm.

Η

φωσφορυλιωμένη PKC διεγείρει κυτταρική εισβολή των κυττάρων PDAC

Ένας διεγέρτης PKC, φορβόλη 12-μυριστικό 13-οξικό άλας (ΡΜΑ) είναι ένας προαγωγός ισχυρός όγκου [21] ότι επάγει μετανάστευση επιπεφυκότα ινοβλάστες [19] και γλοιοβλαστώματος κύτταρα [9]. PMA αλληλεπιδρά με και ενεργοποιεί τόσο την κλασική και τα νέα ισόμορφα PKC [21]. Ως εκ τούτου, η επίδραση της ΡΜΑ σε κυτταρικές εισβολή του S2-013 και PANC-1 διερευνήθηκε. Ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-PKC αντίσωμα (9379) αποκάλυψε ότι η θεραπεία με ΡΜΑ αυξημένη ενεργό PKCs (Σχ. 4Α). PMA διεγερμένα σημαντικά κύτταρο εισβολή του S2-013 και PANC-1 σε

in vitro δοκιμασίες

εισβολή (Εικ. 4Β), υποδεικνύοντας ότι PMA-ευαίσθητο ισόμορφα PKC συμβάλλουν στην διηθητικότητα των κυττάρων PDAC. Για να επιβεβαιωθεί ότι προκαλείται από ΡΜΑ εισβολή εξαρτιόταν από ενεργό PKCs, τα κύτταρα αρχικά σε επεξεργασία με έναν αναστολέα PKC (calphostin C, ένας αναστολέας τόσο των κλασικών και νέων PKCs) και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΡΜΑ. Η αρχική θεραπεία με τον αναστολέα PKC εμπόδισε την προκαλούμενη από ΡΜΑ αύξηση στη δραστικότητα PKC (Σχ. 4Α) και ανέστειλαν PMA-διαμεσολαβούμενη κυτταρική εισβολή του S2-013 και PANC-1 (Σχ. 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι συγκεκριμένες ισομορφές της κλασικής και νέα PKCs θα μπορούσε να επάγει PDAC κύτταρο εισβολή.

A. S2-013 και τα κύτταρα PANC-1 σε προεπεξεργασία με ή χωρίς calphostin Ο υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΡΜΑ και δραστικότητα PKC αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western με ένα αντίσωμα αντι-φωσφο-PKC. Β S2-013 και PANC-1 κύτταρα που κατεργάζονται όπως στο (Α) απλώθηκαν σε θαλάμους εισβολή Matrigel. Εισβολή κύτταρα σε τέσσερα πεδία ανά ομάδα μετρήθηκαν. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD. *

σ

& lt? 0.001? **

ρ

& lt? 0.003 σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. κύτταρα C. S2-013 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς ΡΜΑ και ανοσοκυτταροχημική χρώση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντι-Ε-καδερίνης και αντισώματα αντι-β-κατενίνης (πράσινο). Μπλε, χρώση DAPI? μπαρ, 10 μm.

Η

Η προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου μπορούν επίσης να επηρεάσουν την κινητικότητα [22]. Κατά το σχηματισμό των επαφών κυττάρου-κυττάρου, τα κύτταρα να μειώσουν το ρυθμό μετανάστευσης και της κυτταρικής επιφάνειας προεξοχή δραστηριότητά τους, και να μειώσουν μικροσωληνίσκων και ακτίνη νήματος δυναμική τους [23]. Για να προσδιοριστεί η επίδραση των κλασικών και νέων PKCs σε επαφή κυττάρου-κυττάρου, S2-013 κύτταρα επωάστηκαν με ΡΜΑ και ανοσοφθορισμό διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι-Ε-καδερίνης και αντισώματα αντι-β-κατενίνης (Εικ. 4C). PMA μείωσε σημαντικά τις πρωτεΐνες διασταύρωση κατά περιοχές επαφής κυττάρου-κυττάρου, δεικνύοντας μειωμένη περιφερική εντοπισμό των πρωτεϊνών διασταύρωση, με αποτέλεσμα σε διασταυρώσεις προσκόλληση με μειωμένη σταθερότητα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι PMA-ευαίσθητη PKCs παίζουν ένα ρόλο στη μείωση της σταθερότητας των επαφών κυττάρου-κυττάρου και, με τη σειρά της, επάγει κυτταρική εισβολή.

BART υποστηρίζει την πρόσδεση του ANX7 στην ενεργό PKC και λειτουργεί σε φθίνουσα ενεργό PKC

για να προσδιοριστεί η επίδραση των συμπλοκών BART-ANX7 επί ρυθμίζουν τη δραστηριότητα του PKC, διερευνήθηκαν οι επιδράσεις της BART knockdown σε συγγένεια ANX7 για ιδιοσυστατικώς ενεργοποιημένα PKCs με κατεργασία με ΡΜΑ (Εικ. 5Α). PMA διέγερση προκάλεσε σημαντικές αυξήσεις στην ποσότητα των συγκροτημάτων ANX7-PKC σε κύτταρα ελέγχου, ενώ δεν υπήρχαν διαφορές στα κύτταρα BART RNAi S2-013. Επιπλέον, αν η σύνδεση θα μπορούσε να ανασταλεί από τους αναστολείς PKC πριν τη διέγερση των κυττάρων ελέγχου με ΡΜΑ αξιολογήθηκε. Calphostin Ο και χλωριούχο χηλερυθρίνη (ένας αναστολέας του ΡΚΟα, β, γ και δ) αξιοσημείωτα μειωμένη αλληλεπίδραση ANX7-PKC σε ΡΜΑ-διεγερμένα κύτταρα ελέγχου (Εικ. 5Α). Επιπλέον, BART ανοσοκαταβυθίστηκαν με αυξημένες ποσότητες ANX7 όταν S2-013 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΡΜΑ και προεπώαση με calphostin Ο ανέστειλε την αύξηση της δέσμευσης (Σχ. 5Β). Η ανοσοκυτταροχημική ανάλυση πραγματοποιήθηκε για να εξεταστεί η ενδοκυτταρική εντόπιση του ΡΜΑ επαγόμενης σύμπλοκα ANX7-PKC σε έλεγχο και κύτταρα BART RNAi S2-013 (Εικ. 5C). ANX7 colocalized με ΡΜΑ-διεγερμένα PKCs σε κύτταρα ελέγχου (βέλη στο Σχ 5C.)? Ωστόσο, BART εμπόδισε knockdown δέσμευση του ANX7 και ΡΜΑ-διεγερμένα PKCs (κεφαλές βέλους στο Σχ. 5C). Επιπλέον, τα πειράματα IP χρησιμοποιώντας αντι-φωσφορυλιωμένη αντισώματος PKC (9379) επιβεβαίωσε ότι χτυπούν κάτω BART ανέστειλε την πρόσδεση του ANX7 και φωσφορυλιωμένη PKC (Εικ. 5D, E).

Α. Ανοσοκαταβύθιση της PKC από τον έλεγχο και τα κύτταρα BART RNAi S2-013 διεγείρεται από ΡΜΑ με ή χωρίς προεπεξεργασία του calphostin C ή χηλερυθρίνη χλωριούχο εξετάστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-ANX7 και αντι-PKC αντισώματα. *, Συν-ανοσοκαταβυθίστηκε ANX7 με PKC σε κύτταρα BART RNAi S2-013. B. Ανοσοκαταβύθιση του BART από S2-013 κύτταρα που κατεργάζονται όπως στο (Α) εξετάστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-ANX7 και αντισώματα αντι-BART. Γ ανοσοκυτταροχημική χρώση του ελέγχου (άνω πάνελ) και Bart RNAi (κατώτερο πάνελ) S2-013 κύτταρα διεγερμένα από ΡΜΑ χρησιμοποιώντας αντι-ΡΚΟ (πράσινο) και αντι-ANX7 (κόκκινο) αντισώματα. Μπλε, DAPI χρώση. Βέλη, ANX7 colocalized με PMA-ευαίσθητα PKCs στα κύτταρα ελέγχου? αιχμές βελών, PMA-ευαίσθητα PKCs δεν colocalized με ANX7 στα κύτταρα BART RNAi. Μπαρ, 10 μm. Δ Ανοσοκαταβύθιση φωσφορυλιωμένου PKC από τον έλεγχο και τα κύτταρα BART RNAi S2-013 εξετάστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-ANX7 και αντι-φωσφο-PKC αντισώματα. Ε πυκνομετρική ανάλυση των αποτελεσμάτων του Σχήματος 5ϋ. Το επίπεδο των ANX7 στα ιζήματα εκτιμήθηκε μετά την ομαλοποίηση σήματα ANX7 να φωσφο-PKC σήματα των προϊόντων λύσης κυττάρου. ΣΤ Western blot με αντι-BART και αντι-φωσφο-PKC αντισώματα που δείχνει δύο S2-013 κλώνοι επιμολύνθηκαν με siRNA για BART (siBART-1 και 2) σε σύγκριση με ψευδο (Neo-1) και κωδικοποιημένα ελέγχου (SCR-1) κλώνους.

Η

κύτταρα BART RNAi S2-013 είχαν αυξημένα επίπεδα ενεργού PKC και αμετάβλητα επίπεδα σταθερής κατάστασης του PKCs (Εικ. 5F). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι BART μπορεί να σχετίζεται με μειωμένα επίπεδα του δραστικού PKC. Υποθέτουμε ότι BART ρυθμίζει αλληλεπιδράσεις μεταξύ ANX7 και δραστικές μορφές του PKCs στόχου ως μόριο ικρίωμα ή /και μια πρωτεΐνη φορτίο ANX7, επιτρέπει ANX7 να μειώσει την δραστικότητα PKC-στόχο, και με τη σειρά του, αναστέλλει την κυτταρική εισβολή.

PKC δραστηριότητα δεν ρυθμίζεται άμεσα από ANX7

Για να διερευνήσουν το ρόλο της PKC στη ρύθμιση φωσφορυλίωση ANX7, όπως έχει ήδη αναφερθεί σε χρωμιόφιλα κύτταρα [8], S2-013 και PANC-1 κύτταρα σημάνθηκαν μεταβολικά με [

32Ρ] -orthophosphoric οξύ, και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με ΡΜΑ. Το ραδιενεργά σημασμένο-ANX7 ανοσοκαταβυθίστηκε με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ANX7 και αναλύθηκε με φώσφορο απεικόνισης (Σχ. 6Α). Εάν ANX7 είναι ένα υπόστρωμα των ειδικών PKCs, το επίπεδο της φωσφορυλίωσης ANX7 πρέπει να οδηγήσει σε σημαντικά αυξημένη αλλαγές στην απόκριση στο ΡΜΑ. Ωστόσο, ΡΜΑ διέγερση δεν αύξησε τα επίπεδα της φωσφορυλίωσης ANX7 σε οποιαδήποτε κυτταρική γραμμή. Στη συνέχεια,

in vitro δοκιμασίες φωσφορυλίωσης

χρησιμοποιήθηκαν για να καθοριστεί εάν δραστικότητα PKC άμεσα ρυθμίζεται από ANX7 (Εικ. 6Β). Καθαρισμένη εγκέφαλο αρουραίου, με καθαρότητα & gt? 95% και που περιέχει την κλασική και τα νέα ισόμορφα PKC, επωάστηκε με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη ANX7 με ή χωρίς ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη BART. ANX7 δεν άλλαξε τη δραστηριότητα των PKCs και προσθέτοντας BART πρωτεΐνη δεν συνδέθηκε με τη ρύθμιση της δραστικότητας της PKC. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ANX7 δεν είναι υπόστρωμα της PKC, και ότι ANX7 δεν αλλάζει τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των στόχων PKCs άμεσα.

A. S2-013 και PANC-1 κύτταρα προεπισημαίνονται με [

32Ρ] -orthophosphoric οξύ και διεγείρονται ή όχι με PMA. ANX7 ανοσοκαταβυθίστηκε, διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και αναλύθηκαν με αυτοραδιογραφία. Ένα ανοσοστύπωμα πραγματοποιήθηκε στο κυτταρικό λύμα ως μάρτυρας φόρτωσης. Β

In vitro

προσδιορισμούς φωσφορυλίωσης να διερευνήσει την επίδραση της BART και ANX7 για PKC-φωσφορυλίωση. Καθαρισμένη εγκέφαλο αρουραίου επωάστηκε με ανασυνδυασμένο ANX7 με ή χωρίς ανασυνδυασμένη BART. Τα προϊόντα της αντίδρασης αναλύθηκαν με μία δοκιμασία ELISA. ABS στο

Υ-άξονα

σημαίνει απορρόφηση στα 492 nm ως αναφορά μετρήθηκαν με έναν αναγνώστη μικροπλάκας.

Η

ΡΚΟα σχετίζεται με συμπλέγματα BART-ANX7

Για τον προσδιορισμό συγκεκριμένων ισομορφές της PKC που δεσμεύονται με ANX7 σε αυτό το σύστημα, ένας ακριβής προφίλ έκφρασης της κλασικής και τα νέα PKCs δημιουργήθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ξεχωριστά αντισώματα αντι-φωσφο-PKC σε κύτταρα BART RNAi που προέρχονται από S2-013 (Εικ. 7Α). Επειδή τα επίπεδα φωσφορυλίωσης PKCs στόχου αυξήθηκαν σε κύτταρα ΨΑΡΟΝΕΤΟΣ RNAi (Εικ. 5F), ρυθμίζεται προς τα πάνω φωσφο-PKCs σε κύτταρα BART RNAi επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Μεταξύ αυτών, ΡΚΟα ενεργοποιήθηκε σημαντικά από BART νοκ ντάουν στο S2-013. Επιπλέον, ΡΚΟα ήταν άφθονα φωσφορυλιωμένη σε κύτταρα ANX7 RNAi του S2-013 και PANC-1 (Σχ. 7Β). Στη συνέχεια, η σύνδεση του ANX7 με φωσφορυλιωμένη ΡΚΟα αποδείχθηκε με ανοσοκαθίζηση και ανάλυση στυπώματος Western σε S2-013 κύτταρα (Σχ. 8Α). Φωσφο-ΡΚΟη δεν ανοσοκαταβυθίστηκε με ANX7. Για να διερευνηθεί η υποκυτταρική συνεντόπισης φωσφορυλιωμένης ΡΚΟα, S2-013 κύτταρα ανοσοχρώθηκαν. Η φωσφορυλιωμένη ΡΚΟα ήταν εντοπισμένη σε lamellipodial-όπως προεξοχές (βέλη στο Σχ. 8Β). Επιπλέον, ANX7 και φωσφορυλιωμένη ΡΚΟα προσλήφθηκαν στις κορυφαίες άκρες κατά την επούλωση των πληγών του ελέγχου S2-013 κυττάρων (άνω πάνελ στην Εικ. 8C). Εξάντληση των BART δεν προκάλεσε συσσώρευση ANX7 στις κορυφαίες άκρες και μετέπειτα colocalization με φωσφορυλιωμένη ΡΚΟα (κάτω πάνελ στο Σχ. 8C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ΡΚΟα είναι αλληλένδετα σχετίζεται με BART και ANX7 στη ρύθμιση της μετανάστευσης PDAC κυττάρων.

Α. κηλίδα Western με αντισώματα έναντι των κλασικών και νέων ισομορφών της PKC που δείχνει δύο S2-013 κλώνοι επιμολυσμένων με siRNA για BART σε σύγκριση με κοροϊδεύει και κωδικοποιημένα κλώνους ελέγχου. B. siRNA ολιγονουκλεοτίδια στόχευσης ANX7 και αρνητικός έλεγχος κωδικοποιημένα επιμολύνθηκαν παροδικά σε S2-013 και τα κύτταρα PANC-1. κηλίδα Western με αντισώματα έναντι των κλασικών και νέων ισομορφών της PKC εκτελέστηκε.

Η

Α. Ανοσοκαταβύθιση ANX7 (αριστερά πάνελ) ή φωσφο-ΡΚΟα (δεξιά πάνελ) από S2-013 κύτταρα εξετάστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι ANX7, φωσφο-ΡΚΟα και φωσφο-ΡΚΟη. B. ανοσοκυτταροχημική χρώση σε S2-013 κύτταρα, όπως προσδιορίζεται με αντίσωμα αντι-φωσφο-PKC (πράσινο). Μπλε, DAPI χρώση. Βέλη, φωσφορυλιωμένη PKC σε lamellipodial-όπως προεξοχές. Bar, 10 μm. Γ Συρρέουσες καλλιέργειες ελέγχου και κυττάρων BART RNAi S2-013 τραυματίστηκαν. Μετά από 4 ώρες, τα κύτταρα ανοσοχρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας αντι-ANX7 (πράσινο) και (κόκκινο) αντισωμάτων-ΡΚΟα αντι-φωσφο. Μπλε, DAPI χρώση. Μπαρ, 10 μm.

Η

Ειδικοί αναστολείς της ΡΚΟα αναστέλλουν αυξημένη κυτταρική μετανάστευση από νοκ ντάουν του BART και ANX7

Για να εξεταστεί κατά πόσον ΡΚΟα σηματοδότηση εμπλέκεται στην αυξημένη μετανάστευση από BART ή ANX7 νοκ ντάουν S2-013, ένας αναστολέας /β1 ΡΚΟα Ro-32-0432 και ένας ειδικός αναστολέας σαφιγγόλης ΡΚΟα εφαρμόστηκαν σε

in vitro δοκιμασίες

εισβολή. Όπως φαίνεται στο Σχ. 9Α και 9Β, φωσφορυλιωμένη ΡΚΟα μειώθηκε ειδικά από Ro-32-0432 και σαφιγγόλη θεραπεία, αλλά εκφράσεις της φωσφο-ΡΚΟη δεν άλλαξε. Η μεγαλύτερη μετανάστευση των κυττάρων S2-013 συνέβησαν μετά να χτυπήσει κάτω BART ή ANX7? Ωστόσο, η αυξημένη μετανάστευση αναστάλθηκε με προεπώαση με Ro-32-0432 (Σχ. 9C) και σαφιγγόλης (Εικ. 9D). Αυξημένη διεισδυτικότητα του Bart ή ANX7 knockdown δεν εμποδίστηκε με προεπώαση με ένα μυριστοϋλιωμένης αναστολέα ψευδοϋπόστρωμα ΡΚΟη (Σχήμα 9Ε.) Και ενός αναστολέα ΡΚΟδ (rottlerin? Δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενεργοποίηση των ΡΚΟα απαιτείται για τη μετανάστευση PDAC κυττάρων που προκαλείται από BART ή ANX7 νοκ ντάουν.

Α. κύτταρα BART RNAi S2-013 και S2-013 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με ANX7-siRNA υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ή χωρίς Ro-32-0432. Η δραστηριότητα των ΡΚΟα και η εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western. Β κύτταρα φαίνονται στο (Α) υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ή χωρίς σαφιγγόλης. Η δραστηριότητα των ΡΚΟα και ΡΚΟη εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western. C. Η επίδραση του Ro-32 – 0432 στην κυτταρική εισβολή ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία transwell εισβολή. Μετανάστευσαν κύτταρα σε τέσσερις τομείς ανά ομάδα μετρήθηκαν. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD. *

σ

& lt? 0.001 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. D. Η επίδραση της σαφιγγόλης στην κυτταρική εισβολή ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία transwell εισβολή. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD. *

σ

& lt? 0.001? **

σ

& lt? 0.003 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Ε Η επίδραση της rottlerin και ψευδοϋπόστρωμα ΡΚΟη αναστολέα στην κυτταρική εισβολή ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία transwell εισβολή. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD.

Η

Συζήτηση

PDAC είναι μία από τις πλέον θανατηφόρες των καρκίνων οφείλεται στην ικανότητά του να εισβάλει σε μεγάλο βαθμό γύρω ιστούς και μεταστάσεις σε πρώιμο στάδιο [24 ]. Εκτεταμένες τοπική διήθηση και μετάσταση είναι οι κύριες αιτίες θανάτου στην PDAC [25]. Υπό το πρίσμα του ρόλου της στην αναστολή BART εισβολή κυττάρων PDAC, η μελέτη αυτή σχεδιάστηκε για να προσδιορίσει την πρωτεϊνών που σχετίζονται με PDAC κύτταρο διεισδυτικότητα δεσμευτικός BART. Τα βασικά χαρακτηριστικά αυτής της έκθεσης έχουν ως εξής:.

BART και ANX7 μπορούν να λειτουργούν μαζί σε συγκρότημα να αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων

BART και ANX7 μπορεί να αναστέλλουν την κυτταρική διείσδυση με τη μείωση της ενεργού PKC σε κορυφαίες άκρες.

η φωσφορυλιωμένη ΡΚΟα είναι υπεύθυνη για την αύξηση της εισβολής των κυττάρων PDAC δει με BART ή ANX7 νοκ ντάουν. ΡΚΟα είναι interdependently σχετίζεται με BART και ANX7 στη ρύθμιση διηθητικότητας των κυττάρων PDAC.

Η

Η συχνή απώλεια της έκφρασης ANX7 παρατηρήθηκε σε καρκίνο του προστάτη, ιδιαίτερα στην μετάσταση και την τοπική υποτροπή της νόσου ορμονοάντοχο [7]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η μηδενική

ANX7

– /- ποντίκια πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, ANX7 ετερόζυγα ποντίκια (

ANX7

+/-) την ανάπτυξη, ώριμη, και την ηλικία κατά κανόνα, και πιο ενδιαφέροντα, έχουν ένα καρκίνο επιρρεπείς φαινότυπο [10]. Ένα ευρύ φάσμα αυθόρμητων όγκων έχουν ανιχνευθεί σε

ANX7

+/- ποντίκια, συμπεριλαμβανομένων του ήπατος, του προστάτη, ενδομητρίου, σιελογόνων αδένων, και του θύμου αδένα [11]. Στον ποντικό, απλοανεπάρκεια έκφρασης ANX7 φαίνεται να οδηγεί την εξέλιξη σε καρκίνο λόγω της γονιδιωματικής αστάθειας μέσω ενός διακριτού μονοπάτι σηματοδότησης συμμετοχή άλλων ογκοκατασταλτικών γονιδίων, γονιδίων επιδιόρθωσης DNA, και τα γονίδια που σχετίζονται με απόπτωση. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι BART και ANX7 παίζουν ρόλο στη μείωση του επιπέδου φωσφορυλίωσης των ΡΚΟα σε PDAC κύτταρα.

In vitro

πειράματα απέτυχαν να αποδείξουν ότι ANX7 μειωμένη άμεσα δράση της PKC (Σχήμα 6Β.)? Ωστόσο, το Σχ. 6Α δείχνει οριστικά ότι ANX7 δεν ήταν ένα υπόστρωμα για PKC σε PDAC κύτταρα. Αν και ο μηχανισμός με τον οποίο ANX7 ρυθμίζει δραστικότητα PKC παραμένει άγνωστη, είναι αξιοσημείωτο ότι BART και ANX7 θα μπορούσαν να λειτουργήσουν μαζί για να μειώσει τη δραστικότητα της ισομορφής ΡΚΟα και, με τη σειρά του, καταστέλλουν διηθητικότητα των κυττάρων PDAC. Αυτό επέτρεψε μελέτη αξιολόγησης ενός κυτταρικό μονοπάτι σηματοδότησης ρυθμίζεται από το

ANX7

ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε PDAC. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να καθοριστεί ποια μόρια που άμεσα καταστέλλει ΡΚΟα, και να προσδιορίσει ακριβή υποστρώματα ΡΚΟα, προκειμένου να κατανοηθούν οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην BART-ANX7 μεσολάβηση αναστολή της κυτταρικής εισβολής.

Ο ρόλος των ΡΚΟα σε PDAC μετανάστευση κυττάρων δεν έχει μελετηθεί εκτεταμένα. Πολλές γραμμές αποδείξεως δεικνύουν ότι ΡΚΟα παίζει κρίσιμο ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων /μετανάστευση /την εισβολή, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπινων πτωχά διαφοροποιημένο καρκίνο του ήπατος [26], καρκίνος του ενδομητρίου [27] και γαστρικού καρκίνου [28]. Κυττάρων οδούς που περιλαμβάνουν την οικογένεια PKC σηματοδότησης ξεκινούν με την πρόσδεση ενός συνδέτη, όπως ένας αυξητικός παράγοντας, με τις αντίστοιχες υποδοχέα κυτταρικής επιφάνειας, το οποίο ενεργοποιεί την κατανομή των φωσφολιπιδίων με φωσφολιπασών C και D, και την παραγωγή του διακυλογλυκερόλη (DAG). DAG δεσμεύει και ενεργοποιεί τα περισσότερα ισόμορφα PKC, η οποία στη συνέχεια μετατοπίζονται έναντι υποκυτταρικών διαμερισμάτων που ποικίλουν ανάλογα με την PKC ισομορφή και κυτταρικό τύπο. Τελικά, MAPKs, συμπεριλαμβανομένου του εξωκυτταρικού σήματος ρυθμιζόμενη πρωτεΐνη κινάση (ΕΚΚ), η c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK), και p38MAPK, παίζουν κρίσιμο ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση που διαμεσολαβείται από ΡΜΑ-ενεργοποιημένα PKCs [19], [29 ]. Αυτό BART και ANX7 καταργεί φωσφορυλίωση του ERK σε κύτταρα PDAC έχει αποδειχθεί (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι ΡΚΟα μπορεί να σχετίζεται με τη ρύθμιση της δραστικότητας ERK πιθανώς σχετίζεται με BART-ANX7 σχετίζονται αναστολή της ικανότητας εισβολής. Επιπλέον, είναι πιθανό ότι ΡΚΟα επαγόμενη εξωκύττωση ρυθμίζει τη μετανάστευση των κυττάρων. Έτσι, οι μελλοντικές μελέτες ΡΚΟα δικαιολογείται να χαρακτηριστούν περαιτέρω exocitic τη λειτουργία του και τη διαλεύκανση δυνητική συμβολή της στην κυτταρική μετανάστευση.

Εν ολίγοις, τα ευρήματα που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη είναι υποστηρικτική των καίριο ρόλο της BART στη συντονισμένη ρύθμιση δραστηριότητας ΡΚΟα

μέσω

δέσμευση με ANX7. Η λειτουργική σημασία της σύνδεσης των BART, ANX7 και ΡΚΟα στη διαμόρφωση της εισβολής των κυττάρων PDAC ιδρύθηκε. Είναι πιθανό ότι BART και ANX7 μπορεί να ρυθμίσει σαφώς την κατάντη σηματοδότησης του ΡΚΟα που είναι δυνητικά σχετική με κύτταρο εισβολή δρώντας ως αντι-επεμβατική μόρια.