Αφηρημένο

Η διαφοροποίηση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ) σε καρκινικά κύτταρα προκαλεί αυξημένη ευαισθησία σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Αν και η αναστολή του στόχου της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) οδηγεί σε CSC επιβίωση, η επίδραση των διακλαδισμένης αλυσίδας αμινοξέων (BCAA), ένα σύμπλοκο mTOR 1 (mTORC1) ενεργοποιητής παραμένει άγνωστη. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τις επιδράσεις των BCAA σε κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC) που εκφράζει ένα ηπατικό δείκτη CSC, EpCAM. Εξετάσαμε τις επιδράσεις του BCAA ή /και 5-φθοριοουρακίλη (FU) επί της εκφράσεως του EpCAM και άλλων CSC που σχετίζονται με δείκτες, όπως επίσης και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα HCC και σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Έχουμε, επίσης, χαρακτηρίζεται CSC σχετίζονται και mTOR σήματος που σχετίζονται με το μόριο έκφρασης και ογκογονικότητα σε κύτταρα HCC με νοκ ντάουν της Rictor ή Raptor, ή υπερέκφραση μόνιμα ενεργών rheb (caRheb). mTOR σήματος που σχετίζονται με το μόριο έκφρασης εξετάστηκε επίσης σε BCAA-επεξεργασμένα κύτταρα HCC.

In-vitro

BCAA μείωσαν την συχνότητα του ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων και βελτιωμένη ευαισθησία στην αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση της 5-FU. Συνδυασμένη 5-FU και BCAA παρέχεται καλύτερη αποτελεσματικότητα κατά του όγκου από 5-FU μόνη της στο μοντέλο ξενομοσχεύματος. Η διέγερση με υψηλές δόσεις BCAA ενεργοποιηθεί mTORC1. Knockdown και υπερέκφραση πειράματα αποκάλυψαν ότι η αναστολή της mTOR συμπλόκου 2 (mTORC2) ή ενεργοποίηση της mTORC1 οδήγησε σε μειωμένη έκφραση EpCAM και λίγο ή καθόλου ογκογονικότητας. BCAA μπορεί να ενισχύσει την ευαισθησία στη χημειοθεραπεία μέσω της μείωσης του πληθυσμού των ΚΕΠ μέσω της οδού mTOR. Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει τη χρησιμότητα των BCAA στη θεραπεία του καρκίνου του ήπατος.

Παράθεση: Nishitani S, M Horie, Ishizaki S, Yano Η (2013) διακλαδισμένη αλυσίδα αμινοξέων Καταστέλλει ηπατοκυτταρικό καρκινικά βλαστικά κύτταρα μέσω της ενεργοποίησης των θηλαστικών στόχος της ραπαμυκίνης. PLoS ONE 8 (11): e82346. doi: 10.1371 /journal.pone.0082346

Επιμέλεια: Ντιέγκο Calvisi, Institut für Pathologie, Greifswald, Γερμανία, Γερμανία

Ελήφθη: 28, Ιουλίου 2013? Αποδεκτές: 31, Οκτώβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 27 Νοεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Nishitani et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία χρηματοδότηση ή υποστήριξη στην έκθεση.

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Αυτή η έρευνα ανήκει στην Ajinomoto Φαρμακευτική Εταιρεία. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι έχουν υποβάλει αίτηση για δίπλωμα ευρεσιτεχνίας που σχετίζονται με BCAA χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη (όνομα ευρεσιτεχνίας: Agent για την ενίσχυση της αντικαρκινική δράση των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων, εφαρμογή ευρεσιτεχνίας αριθ: WO2012 /111790). SN, MH και SI απασχολούνται από Ajinomoto Pharmaceuticals, Co, Ltd Η μελέτη διεξάγεται σε ζωικά μοντέλα και δεν έχει άμεσες επιπτώσεις στον άνθρωπο. Ωστόσο, το έργο της μελέτης αυτής θα μεταφραστεί σε ανθρώπινα υποκείμενα σε μελλοντικές μελέτες και ως εκ τούτου αυτή η δημοσίευση μπορεί να προσθέσει κάποιο όφελος για την Ajinomoto Pharmaceuticals, Co, Ltd. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα στην ανάπτυξη για να κηρύξει. Επιδεινώνοντας αναλογία BCAA χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη είναι η ίδια με αναλογία σύνθεσης των κόκκων BCAA τα οποία πωλούνται από Ajinomoto Pharmaceuticals Co. Ltd. στην Ιαπωνία με το όνομα του LIVACT ® Κόκκοι. Ωστόσο, η εταιρεία δεν σχεδιάσετε ένα άμεσο εμπορικό όφελος από τη μελέτη αυτή, δεδομένου ότι δεν διεξάγεται στον άνθρωπο. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο όρος «καρκίνος βλαστικών κυττάρων» (CSC) αναφέρεται σε ένα καρκινικό κύτταρο με το χαρακτηριστικά ενός βλαστοκυττάρων. Τα βλαστικά κύτταρα φέρουν τη δυνατότητα να αυτο-ανανέωση και διαφοροποιούνται σε άλλους τύπους κυττάρων, και μπορεί ως εκ τούτου να αποκαταστήσει κύτταρα που υφίστανται απόπτωση. Υποτίθεται ότι τα καρκινώματα αναπτύσσονται από βλαστικά κύτταρα υφίστανται μια διαδικασία ασύμμετρης διαίρεσης. ΚΕΠ αρχικά προσδιορίζονται στην οξεία μυελοειδή λευχαιμία [1] και στη συνέχεια έχουν ανακαλυφθεί σε άλλους καρκίνους. Μια πρόκληση προέκυψε όταν θεωρήθηκε ότι τα ΚΕΠ ήταν ανθεκτικά στη θεραπεία. Πολλοί χημειοθεραπευτικοί παράγοντες στοχεύουν ενεργό πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα και μπορεί να μην είναι αποτελεσματικό έναντι των κυττάρων που υποβάλλονται σε περιορισμένη διάδοση. Επιβιώνουν καρκινικά κύτταρα προσδιορίστηκαν να είναι ένας παράγοντας της επανεμφάνισης ή μετάστασης σε άλλους ιστούς [2,3]. Μελέτες έχουν δείξει πολλές δείκτες CSC σε διάφορους καρκίνους. Σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC), CD133 και EpCAM έχουν ταυτοποιηθεί ως δείκτες CSC [4]. Επιπλέον, ΚΕΠ εκφράζουν ABC μεταφορείς όταν εκτίθεται ενεργά σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, που συμβάλλουν στην θεραπευτική αντίσταση [5]. Μια μελέτη συνδυασμού αξιολόγηση αυτών θεραπεία πυρίμαχων ΚΕΠ διαπίστωσε ότι τα υπάρχοντα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να ριζωμένη εντελώς έξω [6]

Δύο προσεγγίσεις στη θεραπεία του καρκίνου έχουν προταθεί:. Θεραπεία Ξυπνήστε και θεραπεία ύπνου. θεραπείας Ξυπνήστε ενισχύει την ευαισθησία σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες από επαγωγή διαφοροποίησης από ΚΕΠ σε καρκινικά κύτταρα. Ογκοστατίνη Μ, μία κυτοκίνη IL-6 οικογένειας, είναι ένα πολύ γνωστό επαγωγέα διαφοροποίησης. Συνδυασμός αυτής της κυτοκίνης με χημειοθεραπευτικό παράγοντα βελτιωμένη αποτελεσματικότητα κατά του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος HCC [7]. Ωστόσο, ογκοστατίνη Μ δεν έχει δοκιμαστεί κλινικά. θεραπεία Sleep διατηρεί φέρεται χαμηλό πολλαπλασιασμό των ΚΕΠ, αλλά η παθοφυσιολογία αυτού του φαινομένου παραμένει ασαφής. Μελέτες έχουν εστιάσει κυρίως σε αιμοποιητικά κύτταρα με στόχο της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) τα σήματα που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση [8,9]. Είναι καλά γνωστό ότι διακλαδισμένης αλυσίδας αμινοξέα (BCAAs), ιδιαίτερα λευκίνη, ενεργοποιούν mTORC1 [10,11]. BCAAs είναι απαραίτητα για το μεταβολισμό του αμμωνίου στους μυς, όταν το ήπαρ δεν είναι σε θέση να εκτελέσει αυτή τη λειτουργία. Πρόσφατες εκθέσεις έδειξαν ότι BCAA ενεργοποιεί σύνθεση αλβουμίνης σε αρουραίο πρωτογενή ηπατοκύτταρα [12] και με κίρρωση ήπατος αρουραίου [13] μέσω σηματοδότησης mTOR, μια κεντρική ρυθμιστής της πρωτεϊνοσύνθεσης, ανιχνεύοντας θρεπτική συνθήκες [14]. Στην Ιαπωνία, η φαρμακολογική συμπλήρωση με κόκκους BCAA χρησιμοποιείται για τη θεραπεία υπολευκωματαιμία σε ασθενείς με μη αντιρροπούμενη κίρρωση του ήπατος (LC) [15]. BCAA κόκκοι, προδιαγράφεται τρεις φορές την ημέρα μετά τα γεύματα για να δώσει μία συνολική ημερήσια δόση 12 g του BCAA, έχουν μια αναλογία 2: 1,2 κατά βάρος λευκίνης σε ισολευκίνη σε βαλίνη: 1. BCAA καταστέλλει την εμφάνιση HCC σε ζωικά μοντέλα [16,17] και οι ασθενείς LC [18]. Εστιάσαμε στην επαγωγή CSC διαφοροποίηση, κυρίως την ενίσχυση των χημειοθεραπευτικών ευαισθησίας. CSC διαφοροποίηση αξιολογήθηκε με ενεργοποίηση mTORC1 με BCAA, και η αντικαρκινική δράση του συνδυασμού BCAA και χημειοθεραπευτικού παράγοντα μελετήθηκε

in vitro

και

vivo

. Τα αποτελέσματά μας θα είναι σημαντικής αξίας για την κατανόηση της κλινικής αποτελεσματικότητας της θεραπείας του ήπατος καρκινώματος σε ασθενείς με LC.

Υλικά και Μέθοδοι

Όλες οι εργασίες των ζώων έγινε σύμφωνα με τις σχετικές εθνικές και διεθνείς κατευθυντήριες οδηγίες.

Κυτταρική καλλιέργεια και αντιδραστήρια

Δύο κυτταρικές σειρές HCC, HAK1-Β [19] και Huh7, διατηρήθηκαν σε RPMI1640 (Nacalai Tesque, Japan) και ϋΜΕΜ (Nacalai Tesque, Ιαπωνία), αντίστοιχα, ή μέσον LC, το οποίο είναι ένα μέσο με χαμηλή Fischer αναλογία (λόγος συγκέντρωσης BCAA πάνω συγκέντρωση αρωματικού οξέος) [20] που περιέχει 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). Αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν περιελάμβαναν αντι-ΕρΟΑΜ FITC συζευγμένο αντίσωμα (Abcam, USA), η Hoechst 33342 διάλυμα (Dojindo, Tokyo, Japan) για την πυρηνική χρώση και τον αριθμό των κυττάρων μετρώντας από συστοιχία σύστημα σάρωσης (τεχνολογία Thermo Fischer, USA)? 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) ελήφθη από την Kyowa Kirin, Ιαπωνία.

κατασκευή πλασμιδίου των Rheb συστατική δραστική μορφή

Σημαία-caRheb πλασμίδιο παρασχέθηκε από τον Δρ Tomohiko Maehama (The Tokyo Metropolitan Ινστιτούτο Ιατρικών Επιστημών, Tokyo, Japan).

shRNA πλασμίδια

Μικρές φουρκέτα RNA (shRNA) πλασμίδια ελήφθησαν από iGENE θεραπευτική (ΗΠΑ).

Το σύστημα lipofectamine shRNA σχεδιάστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αλληλουχίες στόχοι του shRNA είχαν ως εξής: SH-Raptor: 5′-GCGGAAAGGATTATGGGT-3 ‘? SH-Rictor: 5’-GTAGAAAGTTCAACGAGCT-3 ‘? και U6RepT7STOP (φορέας ελέγχου SH-RNA): 5’-CACCTTTTTTTAAAAAAATCCT-3 ‘

ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (Q-PCR)

Q-PCR χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση mRNA. επίπεδα του CYP3A4, Bmi1, EpCAM, FOXO3a, Raptor, και Rictor. Ένα σύνολο 1 × 10

5 κύτταρα HAK-1Β σπάρθηκαν σε μέσο RPMI1640 που περιείχε 10% FBS για 24 ώρες πριν από τα πειράματα. BCAA (4 mM) προστέθηκε στο μέσο και διατηρήθηκαν για 72 ώρες. RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο απομόνωσης TriPure (Roche Applied Science) και συμπληρωματικό DNA (cDNA) συντέθηκε χρησιμοποιώντας το cDNA υψηλής χωρητικότητας ανάστροφης μεταγραφής kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) διεξήχθη με τη χρήση του 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) και της ισχύος SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) που περιέχουν ειδικούς εκκινητές, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκε προς GAPDH έκφραση

Primer αλληλουχίες για PCR είχαν ως εξής: CYP3A4:. Προς τα εμπρός 5′-TTGGAAGTGGACCCAGAAAC-3 ‘, αντίστροφος 5′-CTGGTGTTCTCAGGCACAGA-3′? Bmi1: προς τα εμπρός 5’-CCAGGGCTTTCAAAAATGA-3 ‘, αντίστροφη 5′-GCATCACAGTCATTGCTGCT-3′? EpCAM: διαβιβάσει 5’-GCTGGTGTGTGAACACTGCT-3 ‘, αντίστροφη 5′-ACGCGTTGTGATCTCCTTCT-3’?

FOXO3a: διαβιβάσει 5′-TGCTGTATGCAAGAACTTTCCAGTAGCAG-3 ‘, αντίστροφη 5′-ACTCTAGCCCCCATGCTACTAGTG-3’? Raptor: προς τα εμπρός

5′-CCCTGCTACTCGCTTT-3 ‘, αντίστροφη 5′-GTGAGGTGTTTCCCCT-3’?

Rictor: προς τα εμπρός 5′-GGAAGCCTGTTGATGG-3 ‘, αντίστροφη 5’-GGCAGCCTGTTTTATG-3 «

πλήθος των κυττάρων και EpCAM-θετικών κυττάρων ανίχνευση δοκιμασία

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία BCAA για 72 ώρες, στη συνέχεια καθορίζεται χρησιμοποιώντας 4% παραφορμαλδεϋδη και βάφτηκαν με Hoechst 33342 (10 mg /mL, Dojindo, Tokyo, Japan) για 1 λεπτό. Οι μετρήσεις κυττάρων εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο ενεργοποίησης στόχο και ένα σύστημα συστοιχίας σάρωσης. ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων ανιχνεύθηκαν με χρώση των κυττάρων με σταθερά FITC αντίσωμα EpCAM-συζευγμένο για 1 ώρα, και ο αριθμός των EpCAM-θετικών κυττάρων ανά 5000 κύτταρα ανιχνεύθηκαν από το σύστημα σάρωσης

δοκιμασία Απόπτωση

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με 5-FU (0, 1, 2 μg /mL) παρουσία ή απουσία 2 πιΜ BCAA για 72 ώρες σε πλάκες των 96 φρεατίων (Βϋ Biosciences). Αννεξίνης δέσμευση σε κυτταρικές μεμβράνες V οπτικοποιήθηκε με ένα κιτ ανίχνευσης Annexin V-FITC (TAKARA ΒΙΟ INC, Tokyo, Japan) και Hoechst 33342 διάλυμα από συστοιχία σάρωσης.

κηλίδωση Western

Ένα σύνολο 1 × 10

5 Huh7 κύτταρα σπάρθηκαν σε DMEM μέσο 24 ώρες πριν από την μελέτη πειράματα. Το μέσο αλλάχθηκε με μέσο LC για 3 ημέρες ή ϋΜΕΜ μέσο με διάφορες θεραπείες: knockdown για 5 ημέρες, η υπερέκφραση για 1 ημέρα, και η θεραπεία BCAA για 30 λεπτά ή 3 ημέρες. Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε με τον συνήθη τρόπο. Τα κύτταρα πλύθηκαν σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA που περιέχει πλήρη πρωτεάσης και κοκτέιλ αναστολέα φωσφατάσης (Roche Applied Science, Indianapolis, INC). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε αποκλεισμός One-Ρ (Nacalai Tesque, Ιαπωνία). Αντισώματα που περιλαμβάνονται κουνελιού αντι-Rictor (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ), αντι-Raptor κουνελιού (Bethyl Laboratories, Montgomery, ΤΧ), αντι-ρ-70S6 κινάσης κουνελιού, αντι-ολική-ρ-70S6 κινάση, κουνελιού αντι-ρ -4EBP1 (Τ37 /46), κουνελιού αντι-ρ-Akt (T308 ή S473), κουνελιού αντι-ρ-ΟδΚ3β (S9), κουνελιού αντι-β-κατενίνης (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ), και αντι-ποντίκι α-τουμπουλίνης (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ). Πυκνομετρία διεξήχθη απευθείας στην κηλιδωμένη μεμβράνη χρησιμοποιώντας ένα συζευγμένο φορτίο σύστημα κάμερα της συσκευής (LAS-4000 Mini, Fujifilm, Tokyo, Japan).

Νοκ ντάουν Πειράματα

Huh-7 κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο (NC) ή στόχου (mTORC1 ή mTOR2 ρυθμιστικής πρωτεΐνης που συνδέεται του Raptor και Rictor) μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) χρησιμοποιώντας Lipofectamine ™ LTX Αντιδραστήριο (Invitrogen Technology, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Επιλέχθηκαν σταθερά προϊόντα μεταμόλυνσης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21], για την αντίσταση σε πουρομυκίνη για 2 ημέρες και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS για 2 ημέρες. Q-PCR και κηλίδωση western επιβεβαίωσε νοκ ντάουν αποτελεσματικότητα.

Μελέτες σε ζώα

Ζώα.

Το ακόλουθο πειραματικό πρωτόκολλο αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων της Ajinomoto Co., Inc. Θηλυκά BALB /c γυμνά ποντίκια ή ποντίκια NOD /SCID στην ηλικία ελήφθησαν 6 εβδομάδων από την Charles River Japan (Yokohama, Ιαπωνία). Αυτά διατηρήθηκαν σε ξεχωριστά κλουβιά σε ένα καθαρό, κλιματιζόμενο δωμάτιο (24 ± 1 ° C) με μια 12 h 12-h κύκλο φωτός-σκότους (τα φώτα ήταν αναμμένα 0700 να 1900). Τα ζώα τρέφονται ένα απόθεμα διατροφή στείρα σκόνη (CRF-1, Oriental Yeast, Tokyo, Japan).

χημειοθεραπεία.

Ένα εκατομμύριο κύτταρα HAK-1Β ανεστάλησαν σε 100 μL RPMI1640 με FBS, και μια υποδόρια ένεση εκτελέστηκε. Η συχνότητα και το μέγεθος των υποδόριων όγκων καταγράφηκαν όταν ο μέσος όγκος είχε φθάσει 100 mm

3 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7]. ενέσεις όγκου 50 μί 10% DMSO /PBS (έλεγχος), ή 5-FU (250 μg /όγκου) δόθηκαν δύο φορές την εβδομάδα και 3% BCAA-συμπληρώνονται ή 3% δίαιτα καζεΐνης συμπληρωμένο παρεσχέθη ημερησίως για 2 εβδομάδες αρχίζοντας 7 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου. Οι όγκοι των όγκων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μετρήσεις δαγκάνα και υπολογίζεται με τον τύπο V = 1/2 ×

μια

2 ×

β

όπου

μια

είναι η σύντομη άξονα και

b

είναι ο μεγάλος άξονας του όγκου. Στις 14

ης ημέρας, όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν κάτω από αναισθησία, απομονωμένες όγκοι ζυγίστηκαν, τους όγκους τους υπολογίζεται, και ιστών αναλύθηκαν για έκφραση mRNA.

Ογκογένεση.

Ένα εκατομμύριο κύτταρα Huh7 επιμολυσμένα με lipofectal σωματίδια που περιέχουν NC, αρπακτικών ή Rictor shRNA, πλασμίδιο ελέγχου cDNA (pcDNA), ή Flag caRheb πλασμίδιο συλλέχθηκαν και εγχύθηκαν υποδορίως σε NOD /SCID ποντίκια (η = 5 σε κάθε ομάδα). Οι όγκοι των όγκων αξιολογήθηκαν όπως προηγουμένως. Ποντικοί που φέρουν το NC, knockdown (KD), ή υπερέκφραση ξενομοσχεύματα θυσιάστηκαν μετά από 4 εβδομάδες.

Στατιστικές μέθοδοι.

Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SE. Σημασία προσδιορίστηκε σε EXSUS έκδοση 7.7.1 (CAC Corporation, Τόκιο, Ιαπωνία) με τη διενέργεια τεστ Dunnett, δοκιμασία Tukey και Φοιτητών

t-test

, και οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε Ρ τιμές & lt? 0.05

Αποτελέσματα

Η επίδραση των BCAA για EpCAM-θετικότητα σε κύτταρα HAK-1Β

κύτταρα HAK-1Β ήταν περίπου 10% EpCAM-θετικών (Σχήμα S1).? αυτό μειώθηκε σημαντικά με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με την παρουσία 1-4 mM BCAA (Σχήμα 1Α). 4 mM BCAA οδήγησε σε αύξηση στην έκφραση του CYP3A4 mRNA, ένα διαφοροποιημένο δείκτη, και αντίθετα 1-4mm BCAA έτεινε να μειωθεί στην έκφραση του mRNA Bmi1, μια αδιαφοροποίητη δείκτη (Εικόνα 1Β). Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν BCAA μειωμένη EpCAM-θετικότητα μέσω της διαφοροποίησης. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε χημειοθεραπευτικό ευαισθησία HAK-1B που περιέχουν ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων. έκφραση V Αννεξίνη, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της πρωτογενούς συμβάν απόπτωση, αυξάνεται με αυξανόμενες δόσεις της 5-FU? Αυτή η αύξηση ήταν μεγαλύτερη σε κύτταρα επεξεργασμένα με συνδυασμό BCAA και 5-FU (Σχήμα 1 C). Επιπλέον, ο πολλαπλασιασμός HAK-1Β πιο έντονα αναστέλλεται από ένα συνδυασμό BCAA και 5-FU παρά με 5-FU μόνη της (Σχήμα 1 D).

τεστ Dunnett, * ρ & lt? 0.05, ** p & lt? 0.01 n = 6, μέση ± SE.

Το ποσοστό των αννεξίνης V-θετικά κύτταρα (C) και η σχετική αριθμός βιώσιμων κυττάρων (D) με συστοιχία σάρωση σε κύτταρα HAK-1B καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 που περιείχε 10% FBS με ή χωρίς 2 mM BCAA σε παρουσία (1 ή 2 μg /mL) ή απουσία της 5-FU για 72 ώρες με τη χρήση του πρωτοκόλλου ενεργοποίηση στόχος της συστοιχίας σάρωσης. Φοιτητής

t-test

, * ρ & lt? 0.05, ** p & lt? 0.01, η = 7, μέση ± SE.

Η

Τα ίδια αποτελέσματα ελήφθησαν με κύτταρα Huh7 και έδειξε στο σχήμα S2 ΑΒ.

Χημειοθεραπευτικοί ευαισθησία

in vivo

Για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι EpCAM θετικότητα αυξάνει χημειοθεραπευτικών ευαισθησία στην παρουσία των BCAA, χρησιμοποιήσαμε συνδυασμό BCAA και θεραπεία 5-FU σε ένα γυμνό μοντέλο BALB /c ποντικού που μεταμοσχεύονται με υποδόρια HAK-1Β. αποτελεσματικότητα

Αντικαρκινική ήταν σημαντική, με 5-FU μόνη της, και μια ακόμη ισχυρότερη αντικαρκινική επίδραση επιτεύχθηκε με συνδυασμό BCAA και θεραπεία 5-FU. Ωστόσο, η αντικαρκινική δράση του BCAA από μόνη της δεν ήταν αξιοσημείωτη (Σχήμα 2Α, Β, Εικόνα S3). mRNA έκφραση EpCAM μειώθηκε σημαντικά σε BCAA αγωγή όγκων ποντικού (Σχήμα 2C). FOXO mRNA (Εικόνα 2D), ανέφεραν ότι εκφράζεται σε ΚΕΠ [22], ήταν σημαντικά μειωμένη κατά παρόμοιο τρόπο.

Η σχετική έκφραση του mRNA διαφόρων μορίων κάθε όγκου συσχετίστηκε με ιδιότητες CSC (C, D). Έλεγχος: 10% ένεση DMSO /αλατούχου /όγκου + 3% καζεΐνη που περιέχει δίαιτα, 5-FU: 250 μg /όγκου ένεση + 3% καζεΐνη που περιέχει δίαιτα, δίαιτα BCAA: 10% ένεση DMSO /αλατούχου /όγκου + 3% BCAA που περιέχουν, 5-FU + δίαιτα BCAA: 250 μg /όγκου ένεση + 3% BCAA περιέχει δίαιτα για 14 ημέρες. δοκιμασία του Tukey: * p & lt? 0.05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0,001 έναντι του ελέγχου, #p & lt? 0,05 έναντι 5-FU, $$ p & lt? 0,01 vs. BCAA, η = 6, μέση ± SE.

Η

Μηχανισμός επιδράσεις BCAA επί ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων Huh7

Λαμβάνοντας υπόψη την πειραματική αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης των κυττάρων Huh7, τους χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση του μηχανισμού BCAA, υποθέτοντας ότι το 40% του Huh7 ήταν EpCAM-θετικά, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [7]. Όπως και στην HAK-1Β, ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων σε Huh7 ήταν σημαντικά μειωμένες με BCAA? Επιπλέον, mTORC1 ενεργοποιήθηκε κατά την επεξεργασία BCAA και αναστέλλεται από ραπαμυκίνη (Σχήμα 3Α, το Σχήμα S4A). Η μείωση σε κύτταρα EpCAM-θετικά λόγω BCAA πλήρως καταργείται δια προκατεργασίας με ραπαμυκίνη, ένας αναστολέας της mTORC1 (Σχήμα 3Α, το Σχήμα S4A). Επιπλέον, μεσαίες LC, ένα χαμηλό μέσο αναλογία Fischer, ανέστειλε δραστηριότητα mTORC1 και αύξησε το ποσοστό της ΚΕΠ (Σχήμα 3Β). ενεργοποίηση mTORC1 κατεστάλη από τον μέσο LC (Σχήμα 3Β, Σχήμα S4B).

Η μεταβολή ποσοστού ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων σε 5000 κύτταρα με υπερέκφραση του caRheb ή πλασμιδίου cDNA ελέγχου (pc DNA) σε μέσο ελέγχου (DMEM που περιείχε 10% FBS) με και χωρίς 4 mM διέγερση BCAA για 24 ώρες σε Huh7 (C).

Η ανίχνευση της φωσφορυλίωσης της κινάσης p70S6, μέλος της κατάντη σηματοδότησης mTOR, με την παρουσία DMEM, θεραπεία BCAA, προεπεξεργασία με ραπαμυκίνη και θεραπεία BCAA, ή διέγερση LC για 72 ώρες σε Huh7 ( Α, Β).

δοκιμασία του Tukey ** p & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου, $$$ p & lt? 0.001 έναντι BCAA, n = 8, μέσος όρος ± SE (A)

Student t-test * ρ & lt.? 0.05, **** p & lt? 0,0001, η = 8, μέσος όρος ± SE (Β, C).

Η

Τέλος, EpCAM-θετικά κύτταρα μειώθηκαν σημαντικά από την ενεργοποίηση mTORC1 μέσω υπερέκφραση caRheb, ενός παράγοντα ενεργοποίησης της mTORC1 χωρίς διέγερση BCAA ( Εικόνα 3C). Έτσι, η επίδραση των BCAA επί ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων εξαρτάται από την ενεργοποίηση mTORC1.

Η σχέση μεταξύ του σήματος mTOR και EpCAM-θετικότητα

Τα σήματα mTOR περιλαμβάνουν δύο υποκατηγορίες: mTORC1 και mTORC2 [23]. Ειδικότερα, mTORC1 έχει Raptor, μια ρυθμιστική πρωτεΐνη του συγκροτήματος mTORC1, και διεγείρεται από BCAA, ειδικά λευκίνη. Σε αντίθεση, mTORC2 έχει Rictor, μια ρυθμιστική πρωτεΐνη του mTORC2 συγκρότημα, το οποίο σηματοδοτεί Akt κατάντη.

Η ραπαμυκίνη αναστέλλει mTORC1 και mTORC2, ανάλογα με τη διάρκεια της διέγερσης [24,25]. Έτσι, μπορούμε να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα της αναστολής mTORC1 μόνη ή διπλή αναστολή των mTORC1 /2 επί ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων με προ-θεραπεία με ραπαμυκίνη για 1 ώρα ή 24 ώρες, αντίστοιχα. Βρήκαμε ότι ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά με την αναστολή της mTORC1. Σε αντίθεση, ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων μειώθηκε με διπλή αναστολή των mTORC1 /2, ειδικά αναστολή mTORC2, με προκατεργασία για 72 h (Σχήμα 4Α).

τεστ Dunnett, * ρ & lt? 0.05, *** p & lt? 0,001 έναντι του ελέγχου, n = 6, μέση τιμή ± SE

Οι σχετικές εκφράσεις του EpCAM, c-myc, και FOXO3a mRNA κατά Raptor και Rictor νοκ ντάουν (BD)

τεστ Dunnett, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001 έλεγχο έναντι n = 8, μέση τιμή ± SE.

Η

Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η παρουσία ή η απουσία της EpCAM-θετικών κυττάρων εξαρτάται από mTORC1 ή mTORC2, αντίστοιχα. Στη συνέχεια εξετάστηκε η έκφραση του EpCAM mRNA σε παρουσία mTORC1 ή mTORC2 απώλεια της λειτουργίας με knockdown του Raptor ή Rictor, αντίστοιχα. Η απώλεια της λειτουργίας προκαλείται mTORC1 έκφραση mRNA EpCAM να αυξηθεί παρομοίως με αναστολή mTORC1 δια προκατεργασίας με ραπαμυκίνης για 1 ώρα. Ωστόσο, η απώλεια της λειτουργίας προκαλείται mTORC2 έκφραση mRNA EpCAM να μειωθεί σημαντικά. Επιπλέον, c-myc και έκφραση FOXO3a mRNA αντιδρά παρομοίως με EpCAM έκφραση mRNA (Σχήμα 4Β-D).

Rictor, Raptor, και β-κατενίνης έχουν συσχετισθεί με την mTOR και σήματα Wnt /β-κατενίνης (Σχήμα 5Α). Όταν mTORC1 ανεστάλη από Raptor νοκ ντάουν, φωσφορυλίωση της κινάσης p70S6, κατάντη σήμα της mTORC1, μειώθηκε και η φωσφορυλίωση της Akt (Ser473) αυξήθηκε. Αυτό υποδηλώνει ότι η αναστολή της φωσφορυλίωσης mTORC2 με P70S6kinase καταργήθηκε από Raptor knockdown. Σε αντίθεση, όταν mTORC2 αναστάλθηκε από Rictor knockdown, φωσφορυλίωση κινάσης p70S6 αυξάνεται, και η φωσφορυλίωση της Akt μειωθεί.

Rictor ή Raptor Knockdown σε σύγκριση με αρνητικό έλεγχο (NC), caRheb σε σύγκριση με τον έλεγχο του πλασμιδίου cDNA (pc DNA), η θεραπεία BCAA σε σύγκριση με ϋΜΕΜ (FBS 10%) μόνο (Ctrl) (Α). Η αναλογία μέσος όγκος όγκους και ογκογένεση στο 4

ου εβδομάδες σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος με μεταμοσχευμένα κύτταρα με αρνητικό έλεγχο, knockdown του Raptor, Rictor για 5 ημέρες, ή υπερέκφραση πλασμίδιο ελέγχου DNA, caRheb για 1 ημέρα (C), και ο ρυθμός ογκογένεση (Β)

τεστ Dunnett, * ρ & lt?. 0.05, *** p & lt? 0.001 vs. Ν.Ο. n = 5, μέσος όρος ± SE.

Η

Όταν mTORC1 ενεργοποιήθηκε από caRheb υπερέκφραση ή 4 mM θεραπεία BCAA, η φωσφορυλίωση της κινάσης p70S6 αυξηθεί και φωσφορυλίωση της Akt μειώθηκε. Επιπλέον, η πρωτεΐνη β-κατενίνης μειώθηκε κατά αναστολή της φωσφορυλίωσης της ΟδΚ3β μέσω ενεργοποίησης mTORC1.

Επιπλέον, η ΟδΚ3β φωσφορυλιώθηκε από Akt (Ser473) σε απάντηση Raptor νοκ ντάουν? Ωστόσο, φωσφορυλίωση ΟδΚ3β και πρωτεΐνης β-κατενίνης δεν επηρεάστηκε από Rictor knockdown.

Ογκογένεση του mTOR-νοκ ντάουν και mTORC1-ενεργοποιημένα κύτταρα

Η ενεργοποίηση της mTORC1 ή την αναστολή της mTORC2 υποτέθηκε για να καταστείλει EpCAM-θετικών κυττάρων. Το ογκογόνο ικανότητα του ΚΕΠ εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος εμφυτεύθηκαν υποδορίως με Raptor ή Rictor knockdown, πλασμίδιο cDNA ελέγχου, ή κύτταρα που υπερεκφράζουν caRheb Huh7 σε ποντικούς για 4 εβδομάδες (Σχήμα 5Β και 5Γ).

BCAA ενεργοποιηθεί mTORC1? Ωστόσο, BCAA έχει διπλή επιπτώσεις στην mTORC1. Η διέγερση με υψηλές δόσεις BCAA μειώθηκε ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων μέσω ενεργοποίησης του mTORC1, ενώ η διέγερση με χαμηλές δόσεις αυξημένη ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων μέσω αναστολής της mTORC1 (Σχήμα 3Α και 3Β). BCAA υψηλής δόσης δεν θα μπορούσε να διατηρηθεί μέσω εμφύτευση του όγκου, και ογκογένεση δεν καθιερώθηκε όταν υποδορίως εμφυτευμένων κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με BCAA υψηλών δόσεων. Αντ ‘αυτού, χρησιμοποιείται caRheb-κύτταρα που υπερεκφράζουν ως κύτταρα mTORC1 ενεργοποίησης για τη μελέτη ογκογένεση, η οποία θα μπορούσε να διατηρήσει την ενεργοποίηση mTORC1 για τουλάχιστον μία εβδομάδα.

Αν και το μέγεθος του όγκου ήταν μικρότερη στην ομάδα που εμφυτεύεται με Raptor knockdown κυττάρων από ό, τι σε η ομάδα αρνητικού ελέγχου (Σχήμα 5C), ογκογένεση διατηρήθηκε σε όλες τις 5 ποντίκια, όμοια με την εμφυτευμένη ομάδα αρνητικού κυττάρου διαμόλυνση ελέγχου (Σχήμα 5Β). Ωστόσο, οι δύο ομάδες που αποτελούνται από κύτταρα knockdown Rictor και caRheb υπερεκφράζουν κύτταρα είχαν 0/5 ποντικούς ή μόνο 1/5 ποντικούς διατηρούν δυναμικό ογκογένεσης, αντίστοιχα. Επιπλέον, το μέγεθος του όγκου στην ομάδα caRheb υπερέκφραση ήταν μικρότερη από ό, τι στην ομάδα cDNA πλασμίδιο ελέγχου.

Συζήτηση

Ένα από τα νέα συμβολή της παρούσας μελέτης ήταν η διαπίστωση ότι τα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν αυξημένη ευαισθησία σε παράγοντες χημειοθεραπείας μετά EpCAM-θετικά κύτταρα διαφοροποιούνται από επεξεργασία BCAA μέσω ενεργοποίησης mTORC1 (Σχήμα 1). Επιπλέον, η χαμηλή διέγερση BCAA με μέσο LC με χαμηλή Fischer αναλογία (λόγος συγκέντρωσης BCAA πάνω συγκέντρωση αρωματικό οξύ), οδήγησε στην καταστολή της ενεργοποίησης mTORC1, με αποτέλεσμα την αύξηση ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων (Σχήμα 3Β). Σε ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα ή κίρρωση, υπολευκωματιναιμία και μειωμένες τιμές στο πλάσμα για την αναλογία Fischer των BCAA σε αρωματικά οξέα συνήθως παρατηρούνται [26]. Αυτοί οι ασθενείς μπορεί να αναπτύξουν HCC ή έχουν μια υποτροπή της HCC. BCAA συμπλήρωση είναι γνωστό ότι βελτιώνει την αναλογία Fischer σε κίρρωση του ήπατος [27]. Ως εκ τούτου, μια υψηλότερη αναλογία Fischer μπορεί να αποτρέψει το ήπαρ καρκινογένεση ή υποτροπή οφείλεται σε ΚΕΠ. Στην Ιαπωνία, οι κόκκοι BCAA ενδείκνυνται για μη αντιρροπούμενη κίρρωση σε ασθενείς με υπολευκωματαιμία παρά την επαρκή διαιτητική πρόσληψη, και από του στόματος χορήγηση των κόκκων BCAA ανυψώνει τις συγκεντρώσεις των BCAA στο πλάσμα σε περίπου 1 mM [20]. Μετά από του στόματος χορήγηση BCAA σε αρουραίους, η συγκέντρωση στο πλάσμα του BCAA σε πυλαίας φλέβας ήταν αρκετές φορές υψηλότερη από τη συγκέντρωση του BCAA στο περιφερικό αίμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, θεωρείται ότι η συγκέντρωση των BCAA χρησιμοποιούνται

in vitro

(2

~ 4 mm) δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από τη συγκέντρωση των BCAA

in vivo

.

Βρήκαμε επίσης ότι mTORC1 ενεργοποίηση από κατεργασία BCAA κατέστειλε ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων και αυξημένη την ευαισθησία των χημειοθεραπευτικών παραγόντων σε HCC όγκου (Σχήμα 2). Εξετάσαμε ΕρΟΑΜ mRNA στο συκώτι μετά από χορήγηση BCAA σε κανονικούς ποντικούς για να διερευνηθεί εάν υπάρχει οποιαδήποτε επίδραση στο ήπαρ. Ως αποτέλεσμα, BCAA δεν έδειξε καμία επίδραση στην έκφραση του EpCAM στο ήπαρ (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

Ο μηχανισμός των αποτελεσμάτων της θεραπείας BCAA σε ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων αξιολογήθηκε με επιταχυνόμενη διαφοροποίηση στον καρκίνο κύτταρα μέσω ενεργοποίησης της mTORC1. Η φωσφορυλίωση της ΟδΚ3β ανεστάλη με την ενεργοποίηση mTORC1 και της κατάντη σήμα Wnt /β-κατενίνης, ενώ φωσφορυλίωση β-κατενίνης διατηρήθηκε, με αποτέλεσμα την αποικοδόμηση β-κατενίνης. Ήταν συναχθεί ότι αυτή ανέστειλε την πυρηνική μετατόπιση της β-κατενίνης, και στη συνέχεια ανέστειλε την μεταγραφή του c-myc, EpCAM, και Bmi1. Επιπλέον, οι μεταγενέστεροι σήματα EpCAM προσδιορίστηκαν να έχουν ένα c-myc σημάτων μεταγραφής [28], η οποία συσχετίζεται με την έκφραση του EpCAM και c-myc. Αυτά πρότεινε ότι EpCAM, c-myc έκφραση μειώθηκε και ενεργοποίηση mTORC1 αύξησε την ευαισθησία σε χημειοθεραπεία (Σχήμα 2).

Επιπλέον, βρήκαμε ότι η ενεργοποίηση mTORC1 μείωσε την πρωτεΐνη έκφραση του Rictor μέσω υπερέκφρασης caRheb (Σχήμα 5Α). Μελέτες έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι η ενεργοποίηση του p70S6 ανάδρασης κινάσης ανέστειλε φωσφορυλίωση Rictor, με αποτέλεσμα την καταστολή της λειτουργίας Rictor [29]. Ωστόσο, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η έκφραση της πρωτεΐνης του Rictor μειωθεί. Ο μηχανισμός με τον οποίο η ενεργοποίηση mTORC1 μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης του Rictor παραμένει ασαφής και αποτελεί ένα δυνητικό κατεύθυνση μελλοντική έρευνα.

Η αναστολή της λειτουργίας mTORC2 με Rictor knockdown οδήγησε στην ενεργοποίηση της κινάσης p70S6, ένα σήμα από mTORC1, μειωμένη EpCAM, c-myc, και έκφραση FOXO3a και φωσφορυλίωση της Akt, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην ΟδΚ3β και πρωτεΐνη έκφραση της β-κατενίνης. Δεν ήταν σαφές εάν p70S6 κινάσης ενεργοποιείται απευθείας μέσω Rictor knockdown, αν και είναι πιθανό ότι η ενεργοποίηση mTORC1 και αναστολή των σημάτων Akt οδήγησε σε μειωμένη έκφραση EpCAM. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η αναστολή της mTORC2, και όχι mTORC1, καταστέλλει την καρκινογένεση [19,30]. Σε άλλες εκθέσεις, φωσφορυλίωση της Akt (Ser473) συσχετίζεται σημαντικά με βλαστική ικανότητα καρκίνο [31,32]. Η κλινική έρευνα έχει αναφερθεί ότι οι ασθενείς με υψηλή Rictor ή EpCAM έκφραση του mRNA σε απομονωμένες καρκίνο του ήπατος είχε ένα υψηλότερο ποσοστό υποτροπής [33,34].

Σε αυτή τη μελέτη, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η CSC δυναμικό συνδέεται στενά με τα σήματα mTORC. Επιπλέον, mTORC2 έχει ένα ρόλο στη διατήρηση του δυναμικού των βλαστικών κυττάρων ενώ mTORC1 καταστέλλει τη δυνατότητα αυτή (Σχήμα 6).

Ο υποσιτισμός ή χαμηλή αναλογία Fischer κατέστειλε την ενεργοποίηση mTORC1 η οποία οδήγησε σε αύξηση βλαστική ικανότητα του καρκίνου. Αντίθετα, mTORC2 διατηρεί βλαστική ικανότητα του καρκίνου. Ωστόσο, mTORC1 αναστέλλει mTORC2. BCAA καταστέλλει βλαστική ικανότητα καρκίνο με ενεργοποίηση mTORC1, και ενισχύει κατά του όγκου επιδράσεις των παραγόντων χημειοθεραπείας.

Η

Είναι πιθανό ότι η ενεργοποίηση και μόνο του mTORC1 με κατεργασία BCAA οδήγησε σε μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης Rictor, η οποία ήταν παρόμοια με Rictor knockdown, αναστέλλοντας έτσι mTORC2 και ενεργοποιώντας mTORC1. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι mTORC2 μπορεί να είναι ένα πραγματικό θεραπευτικό του καρκίνου στόχου, ιδιαίτερα σε σχέση με CSC καρκινογένεση και την ενεργοποίηση του mTORC1 μόνος που οδηγεί σε μειώσεις στις EpCAM και c-myc έκφρασης. Έτσι, προτείνουμε ότι οι νέες στρατηγικές θεραπεία του καρκίνου στοχεύει να αναστέλλει mTORC2 και να ενεργοποιήσετε mTORC1 ταυτόχρονα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

αντιπροσωπευτική εικόνα του EpCAM θετικών κυττάρων που χρωματίστηκαν ως μέθοδος περιγράφεται στο Υλικά & amp? Μέθοδοι

doi:. 10.1371 /journal.pone.0082346.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Το ποσοστό των κυττάρων αννεξίνης ν-θετικής (Α) και ο σχετικός αριθμός βιώσιμων κυττάρων (Β) με συστοιχία σάρωση σε κύτταρα Huh7 καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS με ή χωρίς 4 mM BCAA σε παρουσία (1 ή 2 μg /mL) ή απουσία της 5-FU για 72 ώρες με τη χρήση του πρωτοκόλλου ενεργοποίηση στόχος της συστοιχίας σάρωσης. Φοιτητής

t-test

, * ρ & lt? 0.05, ** p & lt? 0.01, n = 7, μέση τιμή ± SE

doi:. 10.1371 /journal.pone.0082346.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

όγκος του όγκου στο μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού HAK-1Β την 14η ημέρα μετά τη χορήγηση της BCAA και ένεση 5-FU. δοκιμασία του Tukey: * p & lt? 0.05, ** p & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου, $$ p & lt? 0,01 έναντι BCAA, n = 6, μέση τιμή ± SE

doi:. 10.1371 /journal.pone.0082346.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

Η ανίχνευση του συνολικού-ρ-70S6 κινάσης με την παρουσία DMEM, θεραπεία BCAA, προ-θεραπεία με ραπαμυκίνη (Α) και κατεργασία BCAA, ή διέγερση LC (Β) για 72 ώρες σε Huh7

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0082346.s004

(ΔΕΘ)