Αφηρημένο

Σιαλιδάσης αφαιρεί σιαλικό οξύ από sialoglycoconjugates και παίζει κρίσιμο ρόλο σε πολλές φυσιολογικές και παθολογικές διαδικασίες. Διάφορους ανθρώπινους καρκίνους εκφράσουμε αφύσικα υψηλό επίπεδο του πλάσματος συνδεόμενες με μεμβράνη σιαλιδάσης isoform.Visualization της σιαλιδάσης σε ζωντανούς ιστούς θηλαστικών θα ήταν χρήσιμη όχι μόνο για την κατανόηση των λειτουργιών σιαλιδάσης, αλλά και για τη διάγνωση του καρκίνου. Ωστόσο, δεδομένου ότι ενζυμική δραστηριότητα σιαλιδάσης θηλαστικών είναι εξαιρετικά χαμηλή σε σύγκριση με εκείνη των βακτηρίων και ιών σιαλιδασών, ήταν δύσκολο να ανιχνευθεί δράση σιαλιδάσης σε ιστούς θηλαστικών. Συνθέσαμε ένα παράγωγο νέα benzothiazolylphenol που βασίζεται σιαλικό οξύ (BTP-Neu5Ac) ως ένα φθορίζον υπόστρωμα σιαλιδάσης. BTP-Neu5Ac μπορεί να απεικονίσει τις δραστηριότητες σιαλιδάση ευαισθησία και επιλεκτικά στην οξεία τομές εγκεφάλου αρουραίων. Τα καρκινικά κύτταρα εμφυτεύθηκαν ορθοτοπικά στο παχύ έντερο του ποντικιού και του καρκίνου του παχέος εντέρου του ανθρώπου (στάδια Τ3-Τ4) ήταν σαφώς ανιχνεύθηκαν με BTP-Neu5Ac. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι BTP-Neu5Ac είναι χρήσιμο για ιστοχημική απεικόνιση της σιαλιδάσης δραστηριοτήτων

Παράθεση:. Minami Α, Otsubo Τ, ήτοι όχι D, Ikeda Κ, Kanazawa Η, Shimizu K, et al. (2014) Οπτικοποίηση της σιαλιδάσης σε θηλαστικά ιστούς και ανίχνευση του καρκίνου με νέα φθορισμού υπόστρωμα σιαλιδάσης. PLoS ONE 9 (1): e81941. doi: 10.1371 /journal.pone.0081941

Επιμέλεια: Alberto G. Passi, Πανεπιστήμιο Insubria, Ιταλία

Ελήφθη: 25 Ιουλίου 2013? Αποδεκτές: 17 Οκτωβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 10 Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Minami et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Grant-in-ενισχύσεις για Νέους επιστήμονες (Β) (KAKENHI?. δεν 24790080), Η Σασακάγουα επιστημονική Έρευνα Επιχορήγηση από την Ιαπωνία Επιστήμης Κοινωνίας και η επιδότηση Naito Ίδρυμα για την Προώθηση των συγκεκριμένων έργων έρευνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

σιαλιδάσης (ΕΚ 3.2.1.18) αφαιρεί σιαλικό οξύ από sialoglycoconjugates, όπως γλυκοπρωτεΐνες και γλυκολιπίδια. Θηλαστικών σιαλιδάση είναι γνωστό ότι έχει 4 ισομορφές (NEU1, NEU2, NEU3 και NEU4) και παίζει πολλούς ρόλους σε κυτταρικές λειτουργίες όπως η διαφοροποίηση, την ανάπτυξη, την απόπτωση και τη μετανάστευση, και επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [1], [2]. Οπτικοποίηση την αναλυτική κατανομή των σιαλιδάσης σε ιστούς θηλαστικών μπορεί να μας βοηθήσει να κατανοήσουμε τις φυσιολογικές και παθολογικές ρόλους της σιαλιδάσης. Επιπλέον, δεδομένου ότι το επίπεδο έκφρασης του NEU3, από πλάσμα συνδέεται με τη μεμβράνη σιαλιδάσης, αυξάνει αξιοσημείωτα σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους όπως του παχέος εντέρου, η νεφρική, του προστάτη και των ωοθηκών [1], [2], [3], η ανίχνευση των δραστηριοτήτων σιαλιδάσης μεμβράνη σε βιώσιμο ιστό καρκίνου θα είναι επίσης χρήσιμο για τη διάγνωση του καρκίνου και παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο από καρκίνο κατά τη διάρκεια μιας χειρουργικής επέμβασης.

X-Neu5Ac (5-βρωμο-4-χλωροϊνδολ-3-υλο-α-DN-ακετυλονευραμινικό οξύ) είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο τεχνητό υπόστρωμα σιαλιδάσης για κυτταροχημική και ιστοχημική απεικόνιση δράση σιαλιδάσης. Ενωση Χ (5-βρωμο-4-χλωρο-3-υδροξυϊνδόλη) απελευθερώνεται από το Χ-Neu5Ac με σιαλιδάση και οξειδώνεται σε αδιάλυτο στο νερό ορατή λουλακί μπλε. Προκειμένου να ενισχυθεί η ειδικότητα της χρώσης, οι ινδικού χρώματος υποστρώματα που χρησιμοποιούνται συχνά με ένα ισομοριακό μίγμα του Κ

3 [Fe (CN)

6] και Κ

4 [Fe (CN)

6] ως καταλύτη οξείδωσης. Ωστόσο, η ευαισθησία δεν είναι επαρκής για να τηρούν τις λεπτομερείς κατανομή της σιαλιδάσης σε ιστούς θηλαστικών [4]. Η ενζυμική δραστηριότητα του σιαλιδάσης θηλαστικών είναι εξαιρετικά χαμηλή σε σύγκριση με εκείνη των βακτήρια και ιούς [5], [6]. Προκειμένου να ενισχυθεί η ευαισθησία του X-Neu5Ac, ευαισθητοποιητή όπως Fast Red Violet LB (FRV LB) ως ζεύκτης για να σχηματίσει ένα αζώχρωμα χρησιμοποιείται με Χ-Neu5Ac [6], [7], [8]. Ωστόσο, δεδομένου ότι μία αντίδραση δύο σταδίων απαιτείται για χρώση με το FRV LB, μη ειδικής χρώσης που προκλήθηκε από τον ευαισθητοποιητή είναι αναπόφευκτη και καθιστά δύσκολη τη χρήση, ειδικά σε κλινικά πεδία. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε αναπτύξει νέα φθορίζοντα υποστρώματα σιαλιδάσης, παράγωγα benzothiazolylphenol που βασίζεται σιαλικό οξύ (ΒΤΡ-Neu5Ac), για ιδιαίτερα ευαίσθητη και ειδική απεικόνιση των σιαλιδάσης σε ζωντανούς ιστούς θηλαστικών με μια αντίδραση ενός σταδίου.

στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι BTP-Neu5Ac μπορεί να απεικονίσει τις δραστηριότητες σιαλιδάση ευαισθησία και επιλεκτικά στην οξεία τομές εγκεφάλου αρουραίων. BTP-Neu5Ac μπορεί επίσης να ανιχνεύσει σαφώς καρκινικά κύτταρα εμφυτεύονται ορθοτοπικά σε παχύ έντερο ποντικού και ανθρώπου καρκίνων του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Συνθετικές διαδικασίες

Η σύνθεση των ενώσεων περιγράφεται λεπτομερώς σε S1 αρχείου

Υλικά |

τα ακόλουθα προϊόντα αγοράστηκαν από τους προμηθευτές που αναφέρονται:.. σιαλιδάση από το

Arthrobacter ureafaciens

(AUSA, ανασυνδυασμένο εκφράζεται σε

Escherichia coli

, Calbiochem, San Diego, CA, USA), X-Neu5Ac (Institute Peptide, Osaka, Japan), αλοθάνιο (Takeda Pharmaceutical Company, Osaka, Japan), Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM, Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan), πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (ΜΡ Biomedicals, Santa Ana, CA, USA), ορό εμβρύου μόσχου (FBS, AusGeneX, Molendinar, QLD, Αυστραλία), φυκοερυθρίνη (ΡΕ) συζευγμένη κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (Santa Cruz Biotechnology, Ντάλας , ΤΧ, USA) και κουνελιού αντι-CD71 (υποδοχέας τρανσφερίνης) πολυκλωνικό αντίσωμα (Δοκιμασία Biotechnology, Sunnyvale, CA, USA). Αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή ρυθμιστικών διαλυμάτων τα προμηθευτήκαμε από την Wako Pure Chemical Industries.

Πειραματόζωα

αρουραίοι και τα ποντίκια αγοράστηκαν από Japan SLC (Hamamatsu, Japan). Είχαν στεγάζονται υπό κανονικές συνθήκες εργαστηρίου (23 ± 1 ° C, 55 ± 5% υγρασία) και είχε πρόσβαση σε πόσιμο νερό και τη διατροφή

κατά βούληση

. Τα φώτα ήταν ενεργοποιείται αυτόματα στις 8:00 και απενεργοποιείται στις 20:00. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τον οδηγό ιαπωνική Φαρμακολογικές Εταιρεία για τη φροντίδα και τη χρήση των πειραματόζωων, και τα πρωτόκολλα προ-εγκριθεί από το Animal Επιτροπή Ηθικής του Πανεπιστημίου της Σιζουόκα.

Ανάλυση Φάσματος

φθορισμού φάσματα 5 mM BTP2, BTP3 και BTP4 σε τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ACSF, ρΗ 7.3, 200 μΐ) που περιείχε 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,5 mM ΟαΟ

2, 1.3 mM MgCl

2 , 1,0 mM Ν &

2 ΡΟ

4, 26.2 mM NaHCO

3 και 11 mM ϋ-γλυκόζη μετρήθηκαν με έναν αναγνώστη μικροπλάκας, άπειρη M200 (Tecan, Männedorf, Schweiz). φάσματα διέγερσης αποκτήθηκαν με μήκη κύματος εκπομπής στα 518 nm για BTP2, 526 nm για BTP3 και 542 nm για BTP4. φάσματα εκπομπής αποκτήθηκαν με μήκη κύματος διέγερσης στα 370 nm για BTP2, 372 nm για BTP3 και 374 nm για BTP4. θέα φθορισμού από 5 mM BTP2, BTP3 και BTP4 στο ACSF και BTP2, BTP3 και BTP4 σε διηθητικό χαρτί απεικονίστηκαν υπό διέγερση υπεριώδες φως των 365 nm (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, Γαλλία) με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή, CX1 ( . Ricoh, Τόκιο, Ιαπωνία)

η ποσοτική ανάλυση της σιαλιδάσης

AUSA (10

0-10

5,7 μU ml

-1: μία μονάδα ορίστηκε ως η ποσότητα του ενζύμου που καταλύεται την αποδέσμευση 1 μπιοί σιαλικού οξέος για 1 λεπτό.) επωάστηκε σε 100 μΙ 100 mM ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού νατρίου (ρΗ 7.3) που περιέχει 10 μΜ BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac, BTP4-Neu5Ac ή ρεσορουφίνη -Neu5Ac (Res-Neu5Ac) στους 37 ° C για 60 λεπτά σε ένα 96-φρεατίων μαύρα μικροπλάκας (Corning, Corning, ΝΥ, USA). Η αντίδραση τερματίστηκε με προσθήκη 150 μΙ ανθρακικού νατρίου (500 mM, ρΗ 10,7) σε κάθε φρεάτιο. Ένταση φθορισμού μετρήθηκε με αναγνώστη μικροπλάκας (ex /em: 370 nm /518 nm για BTP2, 372 nm /526 nm για BTP3, 374 nm /542 nm για BTP4 και 570 nm /585 nm για ρεζορουφίνη).

Ανίχνευση της σιαλιδάσης σε μεμβράνη PVDF

AUSA (10

-1 έως 10

4 μU) στυπώθηκε σε διφθοριούχο πολυβινυλιδίνιο (PVDF) με τη χρήση ενός dotblotter 96 φρεατίων (κύκλος μέγεθος καλά: 28,3 χιλιοστά

2, Sanplatec, Osaka, Japan). Κάθε φρεάτιο πλύθηκε με 100 mM ρυθμιστικού φωσφορικού νατρίου (ρΗ 7.3), και στη συνέχεια προστέθηκαν 50 μΙ από 10 μΜ BTP4-Neu5Ac ή X-Neu5Ac σε ρυθμιστικό φωσφορικό νάτριο. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 6 ώρες, τα διαλύματα αντίδρασης απομακρύνθηκαν, και στη συνέχεια οι μεμβράνες PVDF παρατηρήθηκαν με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή κάτω από υπεριώδες φως (365 nm) για BTP4-Neu5Ac ή με ένα SZX7 στερεοφωνικό μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan) υπό το ορατό φως για το X-Neu5Ac.

Απεικόνιση δράση σιαλιδάσης σε φέτες εγκεφάλου

Wistar αρουραίοι (αρσενικοί, ηλικίας 7-10 εβδομάδων, n = 3) αναισθητοποιήθηκαν με αλοθάνιο και αποκεφαλίστηκαν. Ο εγκέφαλος του κάθε αρουραίου γρήγορα συγκομίζονται και βυθίζεται σε παγωμένο ACSF για να καταστείλει την υπερβολική νευρωνική διέγερση και ζημιές. ACSF που χρησιμοποιούνται σε αυτό το πείραμα ήταν συνεχώς διοχετεύθηκε με 95% O

2 και 5% CO

2. φέτες Στεφανιαία εγκεφάλου (400 μm σε πάχος) παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα LinearSlicer PRO-7 (Dosaka ΕΜ, Kyoto, Japan) σε παγωμένο ACSF. Οξεία τομές εγκεφάλου διατηρήθηκαν σε ACSF σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 60 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με 400 μλ ACSF που περιέχει 1 mM BTP2-Neu5Ac (n = 3), BTP3-Neu5Ac (n = 4) ή BTP4-Neu5Ac (n = 4 ) στους 27 ° C για 1 ώρα. θαλάμους επώασης συνεχώς φυσαλίδες με 95% O

2 και 5% CO

2 κατά τη διάρκεια της χρώσης. Οι φέτες πλύθηκαν τρεις φορές με ACSF και μεταφέρθηκαν σε IWAKI 3,5 mm με βάση το γυαλί πιάτα (Asahi Glass, Tokyo, Japan) που γεμίζουν με ACSF. Φθορισμός παρατηρήθηκε με τη χρήση ενός μικροσκοπίου φθορισμού IX71 (φίλτρο φίλτρο διέγερσης /εκπομπής: BP330-385 /BA420 ή BP330-385 /BA510IF, Όλυμπος). επίπεδο υποβάθρου φθορισμού για σιαλιδάσης απεικόνιση δραστικότητα προσδιορίστηκε με επώαση των φετών του εγκεφάλου σε ACSF χωρίς ένα υπόστρωμα. Σε όλες τις παρατηρήσεις με το μικροσκόπιο φθορισμού, το κέρδος του ενός DP70 Ψηφιακό Μικροσκόπιο φωτογραφική μηχανή (Όλυμπος) ορίστηκε να μην ανιχνεύει φθορισμό υποβάθρου.

Για ολόκληρη την απεικόνιση περιοχή της φέτας εγκεφάλου, φωτογραφίες τραβήχτηκαν διαδοχικά και κάθε κομμάτι πλακάκια χρησιμοποιώντας Photoshop CS4 (Adobe Systems, San Jose, CA, USA). Όταν απαιτείται, ίδια επεξεργασία διεξήχθη στο ακόλουθο πείραμα.

Η κυτταροτοξικότητα

MDCK κύτταρα εκτέθηκαν σε ένα απαλλαγμένο από ορό μέσο (SFM) που περιέχει 10 ή 100 μΜ BTP-Neu5Ac ή BTP. Κυκλοφόρησε LDH μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία συζευγμένη ενζυματική δοκιμασία (CytoTox-OneTM, Promega, WI, USA).

Mouse μοντέλο όγκου κόλου

Μυοειδούς Colon 26 NL-17 κύτταρα καρκινώματος καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 μονάδες κ.εκ.

-1 πενικιλλίνη και 100 μg ml

-1 στρεπτομυκίνη στους 37 ° C υπό την παρουσία 5% CO

2 σε υγρή ατμόσφαιρα. Καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα εμφυτεύθηκαν ορθοτοπικά ακολουθώντας ένα πρωτόκολλο που βασίζεται στη μέθοδο που αναφέρεται από Takahashi

et al.

[9] BALB /cCrSlc ποντικοί (αρσενικοί, ηλικίας 6 εβδομάδων) υποβλήθηκαν σε νηστεία για 12 ώρες και στη συνέχεια αναισθητοποιούνται με ένυδρη χλωράλη (400 mg kg

-1 σωματικού βάρους). Για την επαγωγή κολίτιδας, τα ποντίκια ενέθηκαν ενδοπρωκτικά με 200 μΙ 0.1 Μ HCl σε μία θέση κόλον 1,5 cm μακριά από τις πρωκτό μέσω του πρωκτού. Μετά από 10 λεπτά, τα ποντίκια ενέθηκαν ενδοπρωκτικά με 200 μΙ 0.1 Μ ΚΟΗ για εξουδετέρωση, ακολουθούμενη από ένεση με 400 μΙ PBS. Μετά από 9 ώρες, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν ξανά και εγχύθηκαν ενδοπρωκτικά με 200 μΙ Colon26 NL-17 κύτταρα (8 χ 10

6 κύτταρα) αναστέλλεται με DMEM χωρίς ορό με τον ίδιο τρόπο. Ο πρωκτός αμέσως συσφίγγεται με μια μικρή klemme για 2 ώρες. Σε 1 (n = 3) ή 2 εβδομάδες (η = 3) μετά από ορθοτοπική εμφύτευση του καρκίνου του παχέος εντέρου, κόλον συλλέχθηκαν μετά από ενδοκαρδιακή έγχυση με PBS για να απομακρυνθεί το αίμα από ολόκληρο το σώμα.

ανθρώπινου κόλον δειγμάτων καρκίνου

Δύο χειρουργικά δείγματα ελήφθησαν από ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου (UICC Τ Τ3 και Τ4 ταξινόμηση) και χρωματίστηκαν με BTP4-Neu5Ac εντός 2 ωρών μετά την επέμβαση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Σιζουόκα Γενικού Νοσοκομείου (Πρωτόκολλο 13-03-59) και το Πανεπιστήμιο της Σιζουόκα (Πρωτόκολλο 25-2) και είναι σύμφωνη με τη Διακήρυξη των Δικαιωμάτων του Ανθρώπου, το Ελσίνκι, το 2002. Όλοι οι ασθενείς έδωσαν ενυπόγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση.

Ανίχνευση καρκίνου του παχέος εντέρου με BTP4-Neu5Ac

ιστούς ποντικού και ανθρώπου καρκίνου του κόλου επωάστηκαν σε PBS το οποίο περιείχε 100-200 μΜ BTP4-Neu5Ac στους 37 ° C για 60 λεπτά. Μετά την πλύση με PBS, ο φθορισμός παρατηρήθηκε με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (φίλτρο διέγερσης /φίλτρο εκπομπής: BP330-385 /BA420) ή IVIS Σύστημα Απεικόνισης (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ, USA). επίπεδο υποβάθρου φθορισμού προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κανονικό παχύ έντερο επωάζονται σε PBS χωρίς BTP4-Neu5Ac.

Η ιστοπαθολογική λεκέδες

Ποντίκι και το ανθρώπινο παχύ έντερο, που είχαν χρησιμοποιηθεί για σιαλιδάσης απεικόνισης δραστηριότητα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη . Αφού ενσωματωμένα με παραφίνη, ο ιστός τεμαχίστηκε σε 4-7-μm πάχους τομές και χρωματίστηκαν με τη χρήση αντι-CD71 αντίσωμα κουνελιού ως πρωτεύον αντίσωμα, αντι-κουνελιού αντίσωμα συζευγμένο με ΡΕ κατσίκας IgG ως το δευτερεύον αντίσωμα και 4 ‘, 6-διαμινο-2-φαινυλινδόλης (DAPI, Dojindo Laboratories, Κουμαμότο, Ιαπωνία).

επαναληψιμότητα

Όλες οι χρώσεις επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές και επαναληψιμότητα επιβεβαιώθηκε.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Σχεδιασμός νέων υπόστρωμα σιαλιδάσης για ιστοχημική απεικόνιση

για να απεικονίσει δραστηριότητα σιαλιδάσης στον ιστό, το άγλυκο της σιαλιδάσης υπόστρωμα θα πρέπει να είναι ένα αδιάλυτο στο νερό βαφή χρώση για να συνδεθεί με τον ιστό . Δεδομένου ότι το φθοροφόρο του 4-μεθυλο-α-D-

N

-ακετυλνευραμινικό οξύ (4MU-Neu5Ac), ένα συνήθως χρησιμοποιούμενο τεχνητό υπόστρωμα σιαλιδάσης για την ποσοτικοποίηση της δραστικότητας του ενζύμου, είναι υδατοδιαλυτό, 4MU-Neu5Ac δεν είναι κατάλληλο για ιστοχημική απεικόνιση δράση σιαλιδάσης. Benzothiazolylphenol (ΒΤΡ), ένα αδιάλυτο στο νερό φθοροφόρο, δείχνει έντονο φθορισμό σε ένα στερεό κατάσταση [10]. Οι φθορίζοντες ανιχνευτές ΒΤΡ-based έχουν χρησιμοποιηθεί για ορισμένες βιολογικές και χημικές δεικτών [11], [12], [13]. Όταν τα παράγωγα ΒΤΡ, BTP2 [14], BTP3 [15] και BTP4 [15], τέθηκαν σε ένα τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ACSF, ρΗ 7.3), που κατακρημνίστηκαν στον πυθμένα δοκιμαστικούς σωλήνες (Σχήμα 1 Α).

Α, φθορισμού θέα BTP2, BTP3 και BTP4 σε ACSF (επάνω) και σε χαρτιά φίλτρου κάτω από 365 nm υπεριώδες φως (κάτω) φαίνεται στην εικόνα. Β-D, διέγερσης (μπλε κουκκίδες και γραμμές) και εκπομπή (κόκκινα σημεία και γραμμές) φάσματα BTP2 (Β), BTP3 (C) και BTP4 (D) μετρήθηκαν σε ACSF (ρΗ 7.3). Μπλε και κόκκινο αριθμοί αντιπροσωπεύουν μήκος κύματος (nm) στο αποκορύφωμά της έντασης φθορισμού. Συντομογραφίες:. RF, σχετική ένταση φθορισμού

Η

BTP2, BTP3 και BTP4 έχουν διαφορετικές εκπομπές και φάσματα διέγερσης (Σχήμα 1 Β-Δ). Από φθορίζουσες χρωστικές χρώσης που έχουν διαφορετικά φάσματα διέγερσης και εκπομπής έχουν ένα πλεονέκτημα έναντι επιλογή του φίλτρου καθορίζει να λάβει εικόνες φθορισμού, χρησιμοποιήσαμε αυτά τα τρία παράγωγα ΒΤΡ ως άγλυκο της σιαλιδάσης υποστρώματος.

Υδρόλυση BTP-Neu5Ac με σιαλιδάση από

Arthrobacter ureafaciens

η

Συνθέσαμε ΒΤΡ που βασίζεται παράγωγα σιαλικού οξέος (ΒΤΡ-Neu5Ac), BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac και BTP4-Neu5Ac, σύμφωνα με το συνθετικό σχήμα που φαίνεται στο Σχήμα 2, . Αυτά τα παράγωγα του σιαλικού οξέος ήταν υδατοδιαλυτό και έδειξε μικρή φθορισμού. Όταν BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac και BTP4-Neu5Ac επωάστηκαν σε ACSF που περιέχει 10

0-10

5,7 μU ml

-1 σιαλιδάση από το

Arthrobacter ureafaciens

(AUSA) σε 37 ° C για 60 λεπτά (ρΗ 7,3), οι εντάσεις φθορισμού αυξήθηκαν αναλογικά προς τη συγκέντρωση της AUSA και έφθασε ένα πλατό σε υψηλές συγκεντρώσεις (Σχήμα 3 Α-C). συντελεστές απόσβεσης (Μ

-1 εκατοστά

-1) από BTP2, BTP3 και BTP4 σε χλωροφόρμιο ήταν 14970, 12440 και 14350, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac και BTP4-Neu5Ac είναι χρήσιμες για την ποσοτική ανάλυση των σιαλιδάσης δραστηριοτήτων

Προϋποθέσεις:. (Α) Amberlite IR-120 (H

+), ξηρό MeOH, τη διάρκεια της νύχτας, 92% απόδοση. (Β) ΑοΟΙ-AcOH, όλη τη νύκτα, quant. (Γ) BTP2~4, ΝαΗ, THF-DMF, σε θερμοκρασία δωματίου, όλη τη νύκτα. (Δ) NaOMe, ξηρό MeOH, 6 ώρες, θερμοκρασία δωματίου, κατόπιν υδ., MeOH, θερμοκρασία δωματίου, 2 ημέρες.

Η

Α-Δ, οι σχετικές εντάσεις φθορισμού αναλογικά αυξάνεται με αυξανόμενες ποσότητες AUSA σε 10 μΜ BTP2-Neu5Ac (Α), BTP3-Neu5Ac (Β) και BTP4-Neu5Ac (C), αλλά όχι σε 10 μΜ Res-Neu5Ac (D). Κάθε ράβδος και γραμμή αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± S.E.M. (N = 3). Οι εντάσεις φθορισμού κάθε μαύρη γραμμή τέθηκαν σε 10

5. Res: 10 μΜ ρεσορουφίνη. Ε, AUSA στυπώθηκαν σε μεμβράνες PVDF χρωματίστηκε με 10 μΜ BTP4-Neu5Ac ή X-Neu5Ac. Οι μεμβράνες PVDF παρατηρήθηκαν κάτω από υπεριώδες φως για BTP4-Neu5Ac ή ορατό φως για το X-Neu5Ac. Το μπλε χρώμα που προκαλείται από χρώση AUSA με 100 μΜ X-Neu5Ac εμφανίζεται στα δεξιά της διακεκομμένης γραμμής.

Η

ρεζορουφίνη είναι ένα αδιάλυτο στο νερό φθοροφόρο με μοριακό μέγεθος παρόμοιο με αυτό του BTP- Neu5Ac. Οι ρεζορουφίνη με βάση υποστρώματα γλυκοσιδάση έχουν χρησιμοποιηθεί για κυτταροχημική χρώση και μέτρηση της δραστικότητας του ενζύμου [16]. Στην περίπτωση των παραγώγων του σιαλικού οξέος με ρεσορουφίνη (Res-Neu5Ac), εντάσεις φθορισμού δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά από AUSA (μονόδρομη ΑΝΟνΑ, Εικόνα 3 D). BTP-Neu5Ac θα ήταν πιο κατάλληλη από Res-Neu5Ac για να χωρέσει την τσέπη αντίδραση της σιαλιδάσης.

AUSA καθάρισε σε μια μεμβράνη PVDF με διαφορετικές συγκεντρώσεις βάφτηκε με 10 μΜ BTP4-Neu5Ac. Ως αποτέλεσμα της παρατήρησης με υπεριώδες φως, οι εντάσεις φθορισμού θα μπορούσε να αλλάξει σε μια ευρεία δυναμική περιοχή (Σχήμα 3 Ε, άνω). Η ευαισθησία του BTP4-Neu5Ac ήταν αξιοσημείωτα υψηλότερη από εκείνη του X-Neu5Ac (Σχήμα 3 Ε, κάτω).

Οπτικοποίηση της σιαλιδάσης σε οξεία φέτες εγκεφάλου αρουραίου

Για να απεικονίσει δράση σιαλιδάσης στην εγκεφάλου αρουραίου, οξεία τομές εγκεφάλου επωάστηκαν με ACSF (ρΗ 7.3) που περιέχει 1 mM BTP2-Neu5Ac, 1 mM BTP3-Neu5Ac ή 1 mM BTP4-Neu5Ac στους 27 ° C για 60 λεπτά. θαλάμους επώασης συνεχώς φυσαλίδες με 95% O

2 και 5% CO

2 κατά τη διάρκεια της χρώσης για να κρατήσει την κατάσταση φέτα υγιή. Μετά την πλύση με ACSF, λευκής ουσίας έδειξε έντονο φθορισμό σε φέτες βάφονται με BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac και BTP4-Neu5Ac (Σχήμα 4 Α-C). Αυτό το αποτέλεσμα ήταν σύμφωνο με τα αποτελέσματα των προηγούμενων μελετών που δείχνουν ότι η λευκή ουσία του εγκεφάλου των θηλαστικών εμφανίζει έντονη δράση σιαλιδάσης χρησιμοποιώντας 4MU-Neu5Ac ή X-Neu5Ac με FRV LB [8], [17].

Α-Γ , δραστηριότητα σιαλιδάσης απεικονίστηκε σε οξεία στεφανιαία φέτες ενήλικα εγκεφάλους αρουραίων με BTP2-Neu5Ac (Α), BTP3-Neu5Ac (Β) και BTP4-Neu5Ac (C) σε pH 7,3. Συντομογραφίες: cc, μεσολόβιο? ΕΚ, εξωτερική κάψουλα? fi, fimbria? ισχίο, τον ιππόκαμπο? ic, εσωτερική κάψουλα. D, φέτες εγκεφάλου βάφτηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις (1-1000 μΜ) BTP4-Neu5Ac. Ε, δραστηριότητα σιαλιδάσης απεικονίστηκε με 10 μΜ BTP4-Neu5Ac ή 10 μΜ BTP4-Neu5Ac περιέχει 1 mM DANA, ένας αναστολέας σιαλιδάσης. φίλτρα εκπομπής που μεταδίδουν ανωτέρω 420 και 510 nm χρησιμοποιήθηκαν σε Α-Δ και Ε, αντίστοιχα. Κλίμακας μπαρ σε κάθε πάνελ αντιπροσωπεύουν 2 mm.

Η

Από BTP4 διεγείρεται πιο αποτελεσματικά με το φίλτρο διέλευσης ζώνης διέγερσης (330-385 nm) από ένα μικροσκόπιο φθορισμού από BTP2 ή BTP3, απεικόνιση με BTP4-Neu5Ac παρουσίασαν το πιο έντονο φθορισμό σε αυτές τις σειρές BTP-Neu5Ac. Αναλύσαμε επίσης την ευαισθησία και την ειδικότητα των BTP4-Neu5Ac προς σιαλιδάση. Στην περίπτωση της σιαλιδάσης απεικόνισης δραστηριότητα με Χ-Neu5Ac και FRV LB, μία υψηλή συγκέντρωση του X-Neu5Ac, γενικά 1 mM, είναι απαραίτητη για τη βελτίωση της ευαισθησίας και της ειδικότητας προς δράση σιαλιδάσης θηλαστικών [7], [8]. Από την άλλη πλευρά, BTP4-Neu5Ac μπορεί να ανιχνεύσει δραστηριότητες σιαλιδάσης με χαμηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος ακόμη και μικρότερη από 10 μΜ (Σχήμα 4 D). Όταν 2,3-αφυδρο-2-αποξυ-Ν-ακετυλονευραμινικό οξύ (DANA, 1 mM), ένας αναστολέας σιαλιδάσης, εφαρμόστηκε κατά τη διάρκεια της χρώσης με BTP4-Neu5Ac, φθορισμός αξιοσημείωτα εξασθενημένος σε ολόκληρη την περιοχή του εγκεφάλου (Σχήμα 4 Ε). BTP-Neu5Ac είναι ειδικά υδρολύεται με σιαλιδάση, καταλήγοντας σε μια αξιοσημείωτη αύξηση στην ένταση φθορισμού.

Από BTP-Neu5Ac, ένα υδρόφιλο υπόστρωμα, το οποίο συμπληρώνεται στον εξωκυττάριο χώρο υδρολύθηκε με σιαλιδάση θηλαστικών ζωντανών ιστών κάτω από φυσιολογικές συνθήκες εξωκυτταρικό , σιαλιδάσης θα διασπάσει BTP-Neu5Ac κυρίως στην κυτταρική επιφάνεια. Η σιαλιδάση NEU3 μεμβράνη πλάσματος υδρολύεται γαγγλιοσίδη αποτελεσματικά και υποστρώματα χαμηλού μοριακού βάρους όπως 4MU-Neu5Ac ελαφρώς [18], [19]. Αν και το βέλτιστο ρΗ του NEU3 είναι 3,8, NEU3 υδρολύει γαγγλιοσίδιο σε ακόμη ουδέτερο ρΗ [19], [20]. Η NEU1 λυσοσωματικής σιαλιδάση αναφέρθηκε επίσης να είναι παρούσα σε μεμβράνες πλάσματος και για την υδρόλυση 4MU-Neu5Ac αποτελεσματικά [21], [22], [23]. Επιπλέον, η κυτοσολική σιαλιδάσης NEU2 έχει μία μορφή δεσμευμένη σε μεμβράνη και υδρολύει 4MU-Neu5Ac [24]. Ως εκ τούτου, όχι μόνο NEU3 αλλά και άλλα σιαλιδάσης ισοένζυμα θα συμμετέχουν στη δράση σιαλιδάσης ανιχνεύεται με BTP-Neu5Ac.

Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας του BTP-Neu5Ac και BTP

Για τη μέτρηση της κυτταροτοξικότητας, τα κύτταρα MDCK εκτέθηκαν σε BTP-Neu5Ac ή BTP για 6 (τα δεδομένα δεν φαίνονται) ή 16 (Σχήμα 5) ώρες. Ως αποτέλεσμα των μετρήσεων για τα ποσά των γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) από κύτταρα με κατεστραμμένα μεμβράνη, δεν παρατηρήθηκε σημαντική κυτταροτοξικότητα ανιχνεύθηκε για BTP-Neu5Ac και BTP (μονόδρομη ΑΝΟνΑ).

MDCK κύτταρα εκτέθηκαν σε ένα μέσο χωρίς ορό (SFM) που περιέχει 10 ή 100 μΜ BTP-Neu5Ac (α) ή BTP (Β) για 16 ώρες και κυκλοφόρησε LDH μετρήθηκε. απελευθέρωσης LDH εμφανίζεται ως σχέση σε πλήρη απελευθέρωση LDH (100%) με κατεργασία με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης.

Η

ανίχνευση καρκινικών κυττάρων σε ιστούς κόλου ποντικού

Πρόσφατα, η τεχνολογία για την απεικόνιση του καρκίνου έχει προχωρήσει σημαντικά. Για παράδειγμα, Oku

et al.

Ανέπτυξε μια νέα ποζιτρόνιο πομπού-επισημασμένου λιποσώματος για τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (ΡΕΤ) για την εικόνα ενός μικρού καρκίνου του εγκεφάλου χωρίς διείσδυση, σε πραγματικό χρόνο [25]. Urano

et al.

Αναπτύξει ένα μονοκλωνικό αντίσωμα καρκίνο στόχευση συζευγμένο με ρΗ-ενεργοποιήσιμο ανιχνευτές φθορισμού για

in vivo

ανίχνευση όγκων [26]. Ένα εξαιρετικά ευαίσθητο και ειδικό φθορίζοντα ανιχνευτή ο καρκίνος έχει πλεονεκτήματα για την ανίχνευση μικρών καρκίνων, επειδή το ελάχιστο μέγεθος ενός όγκου ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ενδοσκόπηση φθορισμού (περίπου ~ 1 mm) είναι πολύ μικρότερο από εκείνο με το ΡΕΤ, υπολογιστική τομογραφία (CT) και η μαγνητική τομογραφία ( MRI) (περίπου 5-20 mm) [27], [28]. Νωρίτερα ανίχνευση καρκίνων και μετά από ταχεία σκλήρυνση τους εμποδίζει αποτελεσματικά όχι μόνο κακοήθεις μεταβολή των καρκίνων αλλά επίσης άπω μετάσταση και υπόσχεται έντονα βελτίωση της πρόγνωσης.

Δεδομένου ότι ο καρκίνος του παχέος εντέρου έχει αναφερθεί ότι παρουσιάζουν έντονη δραστικότητα ενζύμου ενός membrane- πλάσματος συνδέονται σιαλιδάση [29], προσπαθήσαμε να ανιχνεύσει τον καρκίνο του παχέος εντέρου με BTP4-Neu5Ac σε ζώντες ιστούς του παχέος εντέρου. Στα ποντίκια εμφυτεύτηκε ορθοτοπικά με Colon26 NL-17 κύτταρα, τα οποία είναι άκρως μεταστατικά καρκινικά κύτταρα απομονώνονται από ένα αδενοκαρκίνωμα κόλου ποντικού 26. Μετά 1 ή 2 εβδομάδες, οι ιστοί κόλου συλλέχθηκαν και επωάστηκαν σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) που περιέχει 100 μΜ BTP4- Neu5Ac. Έντονη φθορισμός παρατηρήθηκε στο κόλον εμφυτεύθηκε Colon26 NL-17 κύτταρα αλλά όχι σε φλεγμονώδεις ή φυσιολογικό παχύ έντερο (Σχήμα 6 Α-Ο, Εικόνα S1). Ενώ φυσιολογικό ιστό κόλου έδειξε ασθενή φθορισμό, φθορισμός του καρκίνου του παχέος εντέρου ήταν πολύ ισχυρότερη από εκείνη του φυσιολογικού ιστού (Σχήμα 6 D-F). Οι περιοχές που δείχνουν έντονο φθορισμό στο κόλον εμφυτεύθηκε Colon26 NL-17 κύτταρα επιβεβαιώθηκαν ότι έχουν καρκίνο με ανοσοϊστοχημική χρώση (Σχήμα 6 G). Ως εκ τούτου, οι καρκίνοι του παχέος εντέρου θα μπορούσαν να διακριθούν εύκολα από φυσιολογικούς ιστούς χρησιμοποιώντας BTP-Neu5Ac.

Α, Μία εβδομάδα μετά την ορθοτοπική εμφύτευση του παχέος εντέρου του Colon26 NL-17 κύτταρα, ζωντανούς ιστούς παχέος εντέρου βάφτηκαν με BTP4-Neu5Ac. Arrowhead υποδεικνύει την περιοχή του καρκίνου. Β και C, Φλεγμονώδεις (Β) ή κανονικό (C) κόλον επίσης χρωματίστηκαν με BTP4-Neu5Ac. Αριστερό, μεσαίο και δεξί πάνελ σε πάνελ Α-Γ δείχνουν φωτεινό πεδίο, συγχωνεύονται και φθορισμού απόψεις, αντίστοιχα. Δ και Ε, μεγεθυμένη εικόνα του καρκίνου (D) και φυσιολογικά (Ε) περιοχή βάφονται με BTP4-Neu5Ac. F, το επίπεδο φθορισμού Υπόβαθρο πάνελ D και Ε απεικονίζεται. G, χρώση ανοσοϊστοχημική (ερυθρός φθορισμός) χρησιμοποιώντας κουνελιού αντι-CD71 αντίσωμα και συζευγμένο με ΡΕ αντίσωμα IgG αίγας αντι-κουνελιού και πυρηνική χρώση με DAPI (μπλε φθορισμός) διεξήχθησαν για την ανίχνευση καρκίνου του παχέος εντέρου σε διατομές των ιστών κόλου ποντικού που ήταν χρησιμοποιείται για σιαλιδάσης απεικόνισης δραστηριότητα σε πίνακες Α και D. τα βέλη δείχνουν τις περιοχές που παρουσιάζουν έντονο φθορισμό των BTP στον πίνακα Α και D. Κλίμακα μπαρ στο πάνελ C αντιπροσωπεύει το 2,5 mm και είναι κοινή σε πίνακες Α και Β μπαρ κλίμακας στον πίνακα F αντιπροσωπεύει 0,5 mm και είναι κοινή σε πάνελ D και το μπαρ Κλίμακα Ε στον πίνακα G αντιπροσωπεύει 0,2 χιλιοστά.

η

δραστηριότητες σιαλιδάσης εκφράζονται σε Colon26 NL-17 έχουν αναφερθεί για να είναι πιο αδύναμος μεταξύ αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου 26 sublines όπως NL- 4, NL-17, NL-22 και NL-44 [30]. Δεδομένου ότι ακόμα και Colon 26 NL-17 αδενοκαρκίνωμα εμφυτεύονται ορθοτοπικώς στο παχύ έντερο ποντικών ανιχνεύθηκαν με BTP-Neu5Ac σαφώς, BTP4-Neu5Ac θα είναι αρκετά ευαίσθητη για ανιχνευτή καρκίνου.

Ανίχνευση καρκίνου σε ανθρώπινους ιστούς παχέος εντέρου

έχει αναφερθεί ότι το επίπεδο έκφρασης της Neu3 mRNA σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου είναι 3-100 φορές υψηλότερη από ότι σε φυσιολογικό ιστό [29]. Ως εκ τούτου, πρέπει επίσης να προσπαθήσει να ανιχνεύσει την ανθρώπινη καρκίνο του παχέος εντέρου με BTP4-Neu5Ac. Μετά την επώαση του ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου ζώντες ιστούς, κατηγοριοποιούνται ως Τ3 από τον χαρακτηρισμό Τ της Ένωσης για τον διεθνή έλεγχο του Καρκίνου (UICC), σε PBS που περιέχει 200 ​​μΜ BTP4-Neu5Ac, έντονος φθορισμός παρατηρήθηκε στις περιφέρειες του όγκου, αλλά όχι στις κανονικές περιοχές (Σχήμα 7 Α-G). Οι περιοχές που δείχνουν έντονο φθορισμό και μη φθορισμού επιβεβαιώθηκε ότι είναι ο καρκίνος και φυσιολογικούς ιστούς, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας χρώση αιματοξυλίνης-eosin (Σχήμα 7 Η και Ι). Καρκίνος κατηγοριοποιούνται ως Τ4 ανιχνεύθηκε επίσης με BTP4-Neu5Ac σε ανθρώπινους ιστούς κόλου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αν και χρειάζεται πρόσθετη αξιολόγηση της τοξικότητας, θα ήταν δυνατόν να χρησιμοποιηθεί BTP4-Neu5Ac για την ανίχνευση του καρκίνου του όχι μόνο στην παθολογική εξέταση, αλλά και μη επεμβατική διάγνωση.

Α, υπόδειγμα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου (περιοχή που περικλείεται με μια λευκή γραμμή ) λήφθηκε από χειρουργική ιστό καρκίνου (UICC Τ κατάταξη: Τ3). B-D, ο ιστός κόλου χρωματίστηκε με BTP4-Neu5Ac. Β, Γ και Δ δείχνουν φωτογραφικά, συγχωνεύονται και φθορίζουσες εικόνες, αντίστοιχα. E-G, διευρυμένη εικόνες φθορισμού των κανονικών (Ε) και του καρκίνου (F και G) περιοχές αποκτήθηκαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Η και Ι, ένα διάμηκες φέτας ιστού κόλον παρασκευάστηκε στο διακεκομμένη γραμμή στον πίνακα Β Μη φθορισμό και ο φθορισμός περιοχές στο πάνελ C βάφτηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη και παρουσιάζονται σε πίνακες Η και Ι, αντίστοιχα. Ράβδοι κλίμακας στον πίνακα Β, Ε και Η αντιπροσωπεύουν 10 mm (κοινή σε πάνελ Β-ϋ), 500 μm (κοινή σε πάνελ E-G) και 250 μm (κοινή σε πάνελ Η και Ι), αντίστοιχα.

Συμπεράσματα

Έχουμε αναπτύξει νέα φθορίζοντα υποστρώματα σιαλιδάσης για ιστοχημική χρώση σιαλιδάσης δραστηριοτήτων στους ιστούς των θηλαστικών. Από σιαλιδάση παίζει κρίσιμο ρόλο σε πολλές βιολογικές λειτουργίες, όπως λυσοσωμικής καταβολισμό, του ανοσοποιητικού συστήματος και των νευρικών λειτουργιών [2], [31], BTP-Neu5Ac είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την λεπτομερή διερεύνηση της σιαλιδάσης λειτουργίες. Δεδομένου ότι οι κυτταροτοξικότητες των BTP-Neu5Ac και BTP ήταν μη ανιχνεύσιμη, BTP-Neu5Ac μπορεί να χρησιμοποιηθεί για βιολογική δοκιμασία σιαλιδάσης στο ζωντανό ιστό, π.χ. time-lapse απεικόνιση. Τέλος, οι καρκίνοι του παχέος εντέρου ανιχνεύθηκαν με BTP4-Neu5Ac σε ένα ζωντανό ιστό, υποδηλώνοντας ότι BTP-Neu5Ac θα είναι επίσης χρήσιμο για ιχνηλάτες καρκίνου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

Ανίχνευση καρκίνου του παχέος εντέρου με BTP4-Neu5Ac σε δύο εβδομάδες μετά την εμφύτευση των καρκινικών κυττάρων. Δύο εβδομάδες μετά την εμφύτευση orthotopical Colon26 NL-17 κύτταρα, άνω και κάτω τελείες ποντίκι βάφτηκαν με BTP4-Neu5Ac. Φλεγμονώδεις ή φυσιολογικό κόλον επίσης χρωματίστηκαν με BTP4-Neu5Ac. Αριστερά και δεξιά πάνελ δείχνουν φθορισμού εικόνες και εικόνες φωτεινό πεδίο συγχωνεύθηκε με φθορίζουσες εικόνες, αντίστοιχα. μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 5,0 χιλιοστά

doi:. 10.1371 /journal.pone.0081941.s001

(ΔΕΘ)

αρχείου S1.

Συνθετικές διαδικασίες και

φάσματα 1Η των νέων ενώσεων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0081941.s002

(PDF)