Αφηρημένο

Στόχος

LC-MS /MS φωσφο-πρωτεομική είναι μια απαραίτητη τεχνολογία για να βοηθήσει να διαλευκάνουν τις πολύπλοκες μοριακών γεγονότων που οδηγούν σε καρκίνο και να διαδώσει. Έχουμε αναπτύξει μια παγκόσμια φωσφο-πρωτεομική ροής εργασίας για να προσδιορισθεί η δραστικότητα των οδών και των στόχων φαρμάκου σε παγκρεατικό καρκινικό ιστό σηματοδότησης για κλινική εφαρμογή.

Μέθοδοι

πεπτίδια που προκύπτουν από τρυπτική πέψη των πρωτεϊνών που προέρχονται από το κατεψυγμένο ιστό του παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα και το πάγκρεας φόντο (n = 12), σημάνθηκαν με ετικέτες tandem μάζας (ΤΜΤ 8-plex), διαχωρίστηκε από την ισχυρή χρωματογραφία ανταλλαγής κατιόντων, τότε αναλύθηκαν με LC-MS /MS εμπλουτισμένο άμεσα ή πρώτα για φωσφοπεπτίδια χρησιμοποιώντας IMAC και TiO

2, πριν από την ανάλυση. In-house, εμπορικά και δωρεάν βιοπληροφορικής πλατφόρμες χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό σχετικές βιολογικές εκδηλώσεις από το συγκρότημα του συνόλου δεδομένων.

Αποτελέσματα

Από 2.101 πρωτεΐνες που εντοπίζονται, 152 κατέδειξε σημαντική διαφορά σε αφθονία μεταξύ όγκου και μη ιστού όγκου. Θα περιλαμβάνονται πρωτεΐνες που είναι γνωστό ότι πάνω ρυθμισμένα σε καρκίνο του παγκρέατος (π.χ. Μουκίνη-1), αλλά η πλειοψηφία ήταν νέο υποψήφιο δείκτες όπως HIPK1 & amp? MLCK. Από τα 6.543 μοναδικά φωσφοπεπτίδια προσδιορίζονται (6.284 μοναδικές θέσεις φωσφορυλίωσης), 635 παρουσίασαν σημαντική ρύθμιση, ιδιαίτερα εκείνων που προέρχονται από τις πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κυτταρική μετανάστευση (παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτιδίων Rho γουανίνη & amp? MRCKα) και σχηματισμό συμφύσεων. θέσεις φωσφορυλίωσης Activator για FYN, ΑΚΤ1, ERK2, HDAC1 και άλλων φαρμακευτικών στόχων βρέθηκαν να είναι ιδιαίτερα διαμορφωμένο (≥2 φορές) σε διάφορες περιπτώσεις, τονίζοντας προφητική δύναμη τους.

Συμπέρασμα

Εδώ θα παρέχονται κρίσιμες πληροφορίες που θα μας επιτρέψει να εντοπιστούν τα κοινά και μοναδική μοριακή συμβάντα τα οποία ενδέχεται να συμβάλει με τον καρκίνο σε κάθε περίπτωση. Οι πληροφορίες αυτές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να βοηθήσει στην πρόβλεψη περισσότερα παραγγελία θεραπεία κατάλληλη για μια μεμονωμένη περίπτωση

Παράθεση:. Britton D, Zen Υ, Quaglia Α, Selzer S, Mitra V, Lößner C, et al. (2014) Ποσοτικοποίηση καρκίνο του παγκρέατος Proteome και Phosphorylome: Δείχνει Μοριακής Εκδηλώσεις πιθανόν να συνέβαλαν σε Καρκίνο και τη δραστηριότητα των φαρμακευτικών στόχων. PLoS ONE 9 (3): e90948. doi: 10.1371 /journal.pone.0090948

Επιμέλεια: Jon CD. Houtman, Πανεπιστήμιο της Αϊόβα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Αυγ 2013? Αποδεκτές: 5 Φεβ 2014? Δημοσιεύθηκε: 26 Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Britton et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Όλα τα έργα πραγματοποιείται σε αυτή τη μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Ινστιτούτο του ήπατος Σπουδών, Νοσοκομείο King ‘s College και Proteome Επιστημών plc από κοινού. Οι χρηματοδότες που χρησιμοποιούνται από τους επιστήμονες και κλινικούς ιατρούς που έπαιξαν βασικό ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση, και την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Έχουμε τα εξής ενδιαφέροντα. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από Proteome Επιστημών plc, τον εργοδότη του David Britton, Stefan Selzer, Vikram Mitra, Christopher Lößner, Stephan Jung, Gitte Böhm, Peter Schmid, Πέτρα Prefot, Claudia Hoehle, Σάσα Koncarevic, Malcolm Ward, Hans Dieter Zucht και ian Pike. Όλοι οι εργαζόμενοι της Proteome Επιστημών plc (εκτός νεοπροσληφθέντων Vikram Mitra) κατέχουν δικαιώματα προαίρεσης σε Proteome Επιστημών plc απόθεμα ή απόθεμα. Proteome Επιστημών παράγουν επίσης τα αντιδραστήρια ΤΜΤ χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη και τα αντιδραστήρια αυτά είναι τώρα άδεια για διανομή από Thermo Fisher Scientific. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει προσήλωση μας σε όλα τα PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Η πρωτεΐνη φωσφορυλίωσης είναι μια κοινή διαδικασία ρύθμισης της δραστικότητας ογκογόνο και όγκου πρωτεΐνες καταστολέα [1] – [3]. Σε πολλές περιπτώσεις, η φωσφορυλίωση έχει σαν αποτέλεσμα ενεργοποίησης, όπως αλλαγές στη λειτουργία της πρωτεΐνης, λόγω διαφοροποίησης των αναδίπλωσης των πρωτεϊνών, συγγένεια υποστρώματος, τη σταθερότητα, και τη δραστηριότητα των υποστρωμάτων της, με τη σειρά τους επηρεάζουν οδούς σηματοδότησης που ελέγχει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, μετανάστευση, διαφοροποίηση, και την απόπτωση, απορύθμιση εκ των οποίων συμβάλλουν στην φαινότυπο του καρκίνου [4]. Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια από τις πιο επιθετικές κακοήθη νεοπλάσματα με διάμεση επιβίωση των 6 μηνών. Ένα σημαντικό ποσοστό των ασθενών που διαγιγνώσκονται σε προχωρημένο στάδιο όπου επιλογές θεραπείας είναι πολύ [5] περιορίζεται. Όπως συμβαίνει για άλλους καρκίνους, μοριακή θεραπεία στόχευσης είναι πολλά υποσχόμενη για τη θεραπεία του προχωρημένου ή υποτροπιάζοντα καρκίνο του παγκρέατος [6]. Αν και μια ποικιλία μοριακών φαρμάκων που στοχεύουν ήταν διαθέσιμα κατά την τελευταία δεκαετία και πολλοί άλλοι αναμένεται επίσης μέσα στα επόμενα λίγα χρόνια, μια σημαντική ανακάλυψη εξακολουθεί να απαιτείται για την πρόβλεψη των επιπτώσεων των ναρκωτικών και την επιλογή φαρμάκου. Για παράδειγμα, sorafenib, ένας αναστολέας πολλαπλών κινασών που ενεργεί για υπερκινητικά υποδοχέα του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα, υποδοχέα αυξητικού παράγοντα που προέρχεται από αιμοπετάλια και Raf, έχει αποδεδειγμένη αποτελεσματικότητα σε ορισμένους ασθενείς με προχωρημένο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [7], αλλά δεν μπορούμε να προβλέψουμε επί του παρόντος επίδρασή της στην ένα μεμονωμένο ασθενή πριν από την έναρξη της θεραπείας. Για να ξεπεραστούν αυτές οι δυσκολίες, φαίνεται αποφασιστικής σημασίας να δημιουργηθεί μια αναλυτική προσέγγιση για να βοηθήσει την επιλογή των ναρκωτικών, όπου η έκφραση και τη δραστηριότητα των πολλαπλών στόχων ναρκωτικών αξιολογηθεί συνολικά για κάθε περίπτωση χωριστά. Η φωσφορυλίωση είναι ένα γεγονός κλειδί ρύθμισης δραστικότητας της πρωτεΐνης, ως εκ τούτου τη μέτρηση της φωσφορυλιώσεως πρωτεΐνη είναι ένας χρήσιμος δείκτης της κατάστασης ενεργοποίησης.

Υπάρχουν εκατοντάδες στόχων αντικαρκινικού φαρμάκου και ογκογόνες πρωτεΐνες σηματοδότησης οι οποίες είναι σχετικές με τη θεραπευτική επιλογή, συνεπώς, τη μέτρηση της έκφρασης και κατάσταση ενεργοποίησης του συνόλου χρησιμοποιώντας την τρέχουσα χρυσό πρότυπο ανάλυσης, ανοσοϊστοχημεία (IHC), δεν είναι εφικτή. Από την άποψη αυτή, IHC διατηρεί ένα ρόλο ως εργαλείο επικύρωσης. Αντίστροφη μικροσυστοιχίες πρωτεϊνών φάσης (RPMA) έχουν περιορισμούς λόγω περιορισμένου ρεπερτορίου αντισωμάτων και των φτωχών ειδικότητα /διασταυρούμενη αντιδραστικότητα. Επιπλέον, οι τεχνολογίες γονιδιωματική-based δεν επιτρέπουν μετρήσεις φωσφο-σηματοδότησης. Υγρή χρωματογραφία – διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-MS /MS) με βάση έχουν πρωτεομική προσεγγίσεις έχουν αναπτυχθεί για τον εντοπισμό και την ποσοτικοποίηση χιλιάδες πρωτεϊνών και θέσεις φωσφορυλίωσης τους [8], [9]. Σε αυτή τη μελέτη έχουμε αναπτύξει ένα LC-MS /MS με βάση φωσφο-πρωτεομική ροής εργασίας (SysQuant) να ξεπεραστούν πολλές από τις τεχνικές και βιο-πληροφορικής δυσκολίες που συνδέονται με την αποτελεσματική ποσοτικοποίηση της έκφρασης και τη δραστηριότητα των πρωτεϊνών σηματοδότησης, πολλά από τα οποία είναι το φάρμακο στόχους, σε ένα παγκόσμιο ή το σύστημα ευρύ επίπεδο στον ιστό του όγκου. Συγκρίναμε κατεψυγμένα εκτομή ιστού (όγκου σε σχέση με φόντο μη-όγκου) από δώδεκα περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος του παγκρέατος κεφάλι πόρου και αυξημένη απόδοση χρησιμοποιώντας ισοτοπολόγων ιόντων δημοσιογράφος της ΤΜΤ, με αποτέλεσμα την 8-plex αντιδραστήρια και ως εκ τούτου τη δυνατότητα να τρέξει οκτώ δείγματα ταυτόχρονα [10], [11]. Μοριακών γεγονότων που ενδέχεται να συμβάλλουν στον καρκίνο εντοπίστηκαν κοινές σε όλες τις περιπτώσεις, ωστόσο σε ορισμένες περιπτώσεις ήταν μοναδική για μια μεμονωμένη περίπτωση ή υποομάδας. Υπάρχουν, επίσης, φαίνεται να είναι μια σχέση μεταξύ του χρόνου της επανάληψης και την ομαδοποίηση των περιπτώσεων μετά από ανάλυση σε κύριες συνιστώσες των δεικτών Τ /ΝΤ φωσφοπεπτιδίων. Ανάλυση φωσφοπεπτιδίου χρησιμοποιώντας SysQuant μπορεί να εντοπίσει νέους θεραπευτικούς στόχους και επίσης να βοηθήσει διαστρωμάτωση των ασθενών σε διαφορετικές θεραπευτικές αγωγές με βάση την κατάσταση ενεργοποίησης των οδών σηματοδότησης και γνωστών στόχων του φαρμάκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθικές πτυχές και την έρευνα πρωτόκολλο εγκρίθηκαν από την επιτροπή βιοτράπεζα του Ινστιτούτου ήπατος Σπουδών, Νοσοκομείο Κινγκς Κόλετζ (Αναφορά Νο 08 /H0704 /117). Όλοι οι συμμετέχοντες παρείχαν έγγραφη συγκατάθεση να χρησιμοποιούν δείγματα ιστών τους για την έρευνα. Επελέγησαν δώδεκα περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος του παγκρέατος επικεφαλής των πόρων (Πίνακας S1 στους Πίνακες S1). Πρόσθετες μη εμπιστευτική κλινικές πληροφορίες, όπως το στάδιο του όγκου, το φύλο και την επανάληψη μπορεί να θεωρηθεί για κάθε περίπτωση στους πίνακες S2 & amp? S3 στους Πίνακες S1. Δείγματα ιστού όγκου (Τ) ελήφθησαν από τα παγκρεατικά μάζες όγκου, ενώ τα μη-καρκινική (ΝΤ) δείγματα ήταν από το πάγκρεας μακριά από την μάζα του όγκου. Όλα τα δείγματα ιστού καταψύχθηκαν εντός 30 λεπτών από χειρουργική εκτομή και αποθηκεύεται [στους -80 ° C] μέχρι την ανάλυση με SysQuant (διάμεσος χρόνος αποθήκευσης [18,5 μήνες] κυμαίνονται [4-28 μήνες]. Τ έναντι ΝΤ συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας SysQuant και πειραματική οι λεπτομέρειες περιγράφονται στο έγγραφο Methods S1. συνοπτικά, αυτό συνεπάγεται εκχύλιση πρωτεΐνης από δείγματα ιστών (μg ποσά που χρησιμοποιούνται για κάθε δείγμα παρουσιάζονται στον πίνακα S4 στους πίνακες S1), θρυψίνη πέψη των πρωτεϊνών σε πεπτίδια, ΤΜΤ 8-plex επισήμανση των πεπτιδίων (όγκου και μη όγκου ιστού από 4 περιπτώσεις ανά ΤΜΤ 8-plex) ακολουθούμενη από ανάμιξη για να σχηματιστεί ένα ενιαίο 8-plex μείγμα δείγματος (βλέπε πίνακα S5, στους πίνακες S1). Κάθε ΤΜΤ 8-plex δείγμα στη συνέχεια χωρίστηκε σε τρεις ανεξάρτητες κλάσματα, έκαστο των οποίων ήταν περαιτέρω διάσπαση σε 12 κλάσματα με ισχυρή ανταλλαγή κατιόντων (SCX) χρωματογραφία (Πίνακας S6, στους πίνακες S1). Η πρώτη σειρά 12 κλάσματα SCX στη συνέχεια αναλύθηκαν απ ‘ευθείας με LC-MS /MS χρησιμοποιώντας διπλότυπα δεδομένα που εξαρτώνται από την απόκτηση τρεξίματα που ακολουθείται από μια τρίτη επιχείρηση χρησιμοποιώντας εξαρτάται από το χρόνο απόρριψη όλων των χαρακτηριστικών που προσδιορίζονται στο τρεξίματα 1 & amp? 2. Τα υπόλοιπα δύο σετ των 12 κλάσματα πρώτα εμπλουτίζονται για φωσφοπεπτίδια χρησιμοποιώντας είτε χρωματογραφία συγγενείας ακινητοποιημένου μετάλλου (IMAC) ή ΤίΟ

2 (Πίνακας S6, στους Πίνακες S1). Τα προκύπτοντα 24 φωσφοπεπτιδίου εμπλουτισμένα κλάσματα επίσης αναλύθηκαν με LC-MS /MS. Συνολικά 108 ξεχωριστές εκτελέσεις LC-MS /MS πραγματοποιήθηκαν για κάθε ΤΜΤ 8-plex δείγμα. δεδομένα φασματομετρία μάζας πρώτες αναζητήθηκαν κατά της UniProtKB βάση δεδομένων ανθρώπου /Swiss-Prot χρησιμοποιώντας μασκότ και Sequest (μέσω Proteome Discoverer). αγώνες φάσμα πεπτίδιο (PSMs) απορρίφθηκαν, αν εντοπιστεί μόνο με χαμηλή εμπιστοσύνη (≥5% FDR), έδειξε ≤75% βαθμολογίας φωσφο-RS πιθανότητα, και είχε λείπουν κανάλια ποσοτικοποίηση (π.χ. όχι όλες τις κορυφές για ισοβαρή ετικέτες ορατές στα φάσματα). τιμές Raw ένταση του ισοβαρή ετικέτες από PSMs διέλευση φίλτρα χρησιμοποιούνται για την ποσοτικοποίηση, αλλά πρώτα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας άθροισμα των προεξοχών (όπως φαίνεται στο Σχήμα S1) για να μειωθεί το δυναμικό πειραματική /συστηματική προκατάληψη. Σύνδεση

2 αναλογίες υπολογίστηκαν από ισοβαρή εντάσεις ετικέτα, που δείχνει τη ρύθμιση μεταξύ της T πάνω NT για κάθε περίπτωση. Μια φωσφοπεπτιδίου Τ /ΝΤ log

2 αναλογία είναι η μέση καταγραφής Τ /ΝΤ

αναλογία 2 από όλα τα PSMs μοναδική για τη συγκεκριμένη αλληλουχία του πεπτιδίου. Μια πρωτεΐνη Τ /ΝΤ log

2 αναλογία είναι η μέση καταγραφής Τ /ΝΤ

αναλογία 2 από κάθε μοναδική μη φωσφορυλιωμένη πεπτίδια μοναδική για τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Μία μονόπλευρη t-test (δοκιμασία τοποθεσία για ένα δείγμα) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό ρ-τιμές. P-τιμές συναρτήσει του log

αναλογίες 2 Τ /NT για Volcano οικόπεδα για τον εντοπισμό σημαντικά ρυθμίζονται πεπτίδια. Στο επίπεδο πρωτεΐνης, προστέθηκαν σχολιασμού χρησιμοποιώντας GO-όρους, KEGG-μονοπάτια και πληροφορίες Drugbank, και πρωτεΐνες επίσης αντιστοιχίζεται με μονοπάτια χρησιμοποιώντας πόρους όπως ο David και κορδόνι. Στο σχολιασμό επίπεδο ιστοσελίδα φωσφορυλίωσης χρησιμοποιώντας PhosphoSitePlus προστέθηκαν, συμπεριλαμβανομένων των γνωστών λειτουργικών και βιολογικών /παθολογικό ρόλο του site φωσφορυλίωσης. Μερική ελαχίστων τετραγώνων Διαχωριστική Ανάλυση (PLS-DA) χρησιμοποιήθηκε για τη μοντελοποίηση και διερεύνηση της πολυμεταβλητή σύνολο δεδομένων για τον εντοπισμό των ακραίων τιμών και ομάδες από όλες πεπτίδιο ισοβαρή εντάσεις ετικέτα από κάθε φίλτρο περνά PSM, καθώς και log

2 αναλογίες Τ /ΝΤ (φωσφοπεπτίδια ) από όλα τα όπλα της ροής εργασίας (ΣΕΕΑ, TiO

2 και μη εμπλουτισμένα). Η SysQuant ροή εργασίας, συνδυάζοντας φωσφο-πρωτεομική προετοιμασία του δείγματος, η ανάλυση LC-MS /MS, και βιοπληροφορική ανάλυση, χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό σημαντικών μοριακών γεγονότων πιστεύουμε ότι συμβάλλει στον καρκίνο του παγκρέατος, στις περιπτώσεις που αναλύθηκαν εδώ.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Όλα τα πεπτίδια που προσδιορίζονται από Sequest και μασκότ σε αυτή τη μελέτη εξήχθησαν από Proteome Discoverer και μπορούν να προβληθούν στο zip αρχεία S1, S2, S3 και. Αρχείο S1 περιέχει όλα τα πεπτίδια (φωσφορυλιωμένη και μη-φωσφορυλιωμένη) που προσδιορίζονται από τα δείγματα στην ΤΜΤ 8-plex-1, το αρχείο S2 περιέχει όλα τα πεπτίδια που ταυτοποιήθηκαν από τα δείγματα στην ΤΜΤ 8-plex-2, και S3 αρχείο περιέχει όλα τα πεπτίδια που προσδιορίζονται από δείγματα σε ΤΜΤ 8-plex-3. Αυτά τα αρχεία Συμπληρωματικό zip εμφανίσετε λεπτομερείς πληροφορίες, συμπεριλαμβανομένων Sequest Xcorr, μασκότ ιόντα βαθμολογίες, ΔM [ppm], q-αξίες καφετιέρα, και άλλες σημαντικές πληροφορίες. Τα δεδομένα από αυτά υπερέχουν τα έγγραφα εισήχθησαν σε εργαλεία in-house βιοπληροφορικής για την αναγνώριση βιολογικά σχετικές εκδηλώσεις.

Συνολικά εντοπίσαμε 6543 μοναδικές αλληλουχίες φωσφοπεπτίδια (6284 μοναδικές θέσεις φωσφορυλίωσης), από 2.101 πρωτεΐνες (Πίνακας 1). Το Σχήμα 1 δείχνει αναγνωρισμένο πεπτίδιο (φωσφορυλιωμένο και μη φωσφορυλιωμένο) διανομή πάνω από τρεις βραχίονες (Μη εμπλουτισμένο, TiO

2, IMAC) της ροής εργασίας SysQuant για κάθε ΤΜΤ 8-plex. Το σχήμα 1 απεικονίζει επίσης τον αριθμό των πεπτιδίων που ανιχνεύθηκαν συνολικά για τα τρία αναλυτικά επαναλήψεις (μετά τον συνδυασμό αριθμών από διαφορετικά κλάσματα) σε κάθε μία και όλες ΤΜΤ 8-plex δείγματα. Όταν τα αποτελέσματα από κάθε μία από τις παράλληλες συστατικών (TiO

2, IMAC, μη εμπλουτισμένο) συγκρίνονται τα οφέλη μιας συνδυασμένη προσέγγιση εμπλουτισμού και πολλαπλές αναλυτικής επαναλήψεις (συμπεριλαμβανομένης χρησιμοποίηση της εξαρτημένης χρόνου λίστα απόρριψης), είναι εμφανείς. Ο μεγαλύτερος συνολικός αριθμός των φωσφο-πεπτιδίων παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας IMAC εμπλουτισμού που αντιπροσώπευαν το 79% του συνόλου των μοναδικών φωσφοπεπτίδια εντοπιστεί. Ωστόσο, το TiO

2 κλάσματα εξατομικεύονται σχεδόν 19% του συνόλου το οποίο θα πρέπει να χαθεί χρησιμοποιώντας μια ενιαία στρατηγική εμπλουτισμού φωσφο-πεπτίδιο (Εικόνα 1: ΤΜΤ 8-plex-ALL: Α). Το ίδιο ισχύει και για τις τρεις αναλυτικοί κύκλοι πραγματοποιήθηκαν σε κάθε δείγμα. Αν έγινε ένα εξαρτώμενο τρέχει μόνο δεδομένα μόνο 20.318 μοναδικά πεπτίδια δει (Εικόνα 1: ΤΜΤ 8-plex-ALL: D). Μια δεύτερη δεδομένα εξαρτώμενη κίνηση προσθέτει 5868 πεπτίδια ενώ η χρήση του εξαρτώνται από το χρόνο λίστα απόρριψης σε κίνηση 3 επιτρέπονται επιπλέον 3.257 πεπτίδια να προσδιορίζονται συνολικά. Συλλογικά (τρέξει 2 &? 3) αυτό αντιπροσωπεύει ένα επιπλέον 45% επί τρέξιμο 1 μόνο και 31% του συνολικού αριθμού των μοναδικών πεπτιδίων. Είναι σημαντικό ότι τα πεπτίδια που προσδιορίζονται στην τρίτη κίνηση είναι γενικά χαμηλότερης αφθονίας. Μπορούμε επίσης απεικονίζουν (Εικόνα S2) τον αριθμό των μοναδικών φωσφοπεπτίδια και μη φωσφοπεπτίδια που προσδιορίζονται σε κάθε ακατέργαστο αρχείο, από κάθε κλάσμα SCX, σε κάθε σκέλος της ροής εργασίας (μη-εμπλουτίζουν, TiO

2, και το iMac), από κάθε ΤΜΤ 8-plex δείγματος (TMT 8-plex-1, 2, & amp? 3)

διαγράμματα Venn καταδεικνύουν τον αριθμό των.? Α: μοναδικές αλληλουχίες φωσφοπεπτιδίου, Β: μοναδικό μη-φωσφοπεπτιδίου ακολουθίες, και C: συνολικός αριθμός μοναδικών πεπτιδικών αλληλουχιών που εντοπίζονται στην TiO

2, IMAC, και /ή μη-εμπλουτίζουν βραχίονα του SysQuant ροή εργασίας, σε όλα τα τρία ΤΜΤ 8-plex δείγματα συνολικά (ΤΜΤ 8-plex-ALL) και χωριστά ανά ΤΜΤ 8-plex (ΤΜΤ 8-Plex 1, ΤΜΤ 8-Plex 2, ΤΜΤ 8-plex 3). D: δείχνει το επίπεδο της επικάλυψης παρατηρούμε για το πεπτίδιο ταυτοποιήσεις από αναλυτικό γύρο 1, αναλυτική μέτρηση 2, και αναλυτικές επιχείρηση 3 (συμπεριλαμβανομένου του χρόνου κατάλογο εξαρτάται από την απόρριψη που καταρτίζονται από τις αναγνωρίσεις από το πείραμα 1 και 2)

Η

.

Από τα 6543 φωσφοπεπτίδια εντοπίστηκαν, 5409 ήταν ποσοτικά. Λόγω του μεγάλου αριθμού των μετρήσιμων φωσφοπεπτίδια αυτά θα πρέπει να προβληθούν σε ένα ξεχωριστό αρχείο excel (S4 File), αντί ως μέρος του κύριου εγγράφου. Αρχείο S4 εμφανίζει τις ακολουθίες φωσφοπεπτιδίου, τα φωσφορυλιωμένα κατάλοιπα και το όνομα της πρωτεΐνης και ο αριθμός UniProt στην οποία ανήκει το πεπτίδιο. Αρχείο S4 εμφανίζει επίσης όλα τα ποσοτικά και στατιστικά στοιχεία σχετικά με τα φωσφοπεπτίδια στον όγκο σε σχέση με μη-όγκου από όλες τις περιπτώσεις, και δίνει επίσης πληροφορίες σχολιασμό συμπεριλαμβανομένων των γνωστών λειτουργικών αποτελεσμάτων της εκδήλωσης φωσφορυλίωσης. Η πληροφορία αυτή εξάγεται από τη βάση δεδομένων PhosphositePlus και μπορεί να παρατηρηθεί σε στήλες BM-CP. Αρχείο S4 παρέχει επίσης λειτουργική πληροφορίες σχετικά με την πρωτεΐνη, πληροφοριών που προέρχονται από τους όρους GO (στήλες CQ-DC) και κατά πόσον οι εν λόγω πρωτεΐνες γνωστές φαρμακευτικών στόχων (στήλες DD-DG) εξάγεται από τη βάση δεδομένων των ναρκωτικών Τράπεζα. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τη σχετική αφθονία πρωτεΐνης και κανονικοποιημένα επίπεδα φωσφοπεπτιδίου (φωσφοπεπτιδίου κανονικοποιούνται σε επίπεδο πρωτεΐνης) αναφέρονται σε αρχείο S5. Η σχετική αφθονία των φωσφοπεπτιδίων σε όγκο έναντι μη καρκινικό ιστό θα αλλάξει από περίπτωση σε περίπτωση κυρίως λόγω των αλλαγών στο επίπεδο έκφρασης της φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης ή λόγω διαμορφωμένων δραστικότητα των κινασών και φωσφατασών επαγωγή ή την αντιστροφή φωσφορυλίωση του υποστρώματος πρωτεΐνης, αντίστοιχα. Σε S5 αρχείο που εξομαλύνει τη σχετική αφθονία ενός φωσφοπεπτιδίου με τη σχετική αφθονία της αντίστοιχης πρωτεΐνης. Σχετική πρωτεΐνη αφθονία υπολογίζεται χρησιμοποιώντας μόνο μη-φωσφορυλιωμένων πεπτιδίων ως εκ τούτου υπάρχουν περιπτώσεις όπου δεν είμαστε σε θέση να πραγματοποιήσει ομαλοποίηση λόγω της απουσίας του μη-φωσφορυλιωμένων πεπτιδίων σε μερικές από τις πρωτεΐνες.

PLS-DA

Η πρώτη κύρια συνιστώσα (PC1) δείχνει τη μεταβλητότητα εισάγεται λόγω των τρία διαφορετικά σκέλη της ροής εργασίας. Αυτές οι τρεις βραχίονες IMAC, ΤίΟ

2 και ολικές πρωτεΐνες (δηλαδή μη-εμπλουτισμένο), όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α και Σχήμα S3, έχουν διαχωριστεί οι μεταβλητές σε 3 ξεχωριστές συστάδες. Το στερεό μαύρο κύκλο στο σχήμα 2Α απεικονίζει το χώρο Τ2 διανυκτέρευση βασίζονται σε επίπεδο εμπιστοσύνης 95%. PC1 εξηγεί 13,6% της συνολικής διακύμανσης στο σύνολο δεδομένων. Η δεύτερη κύρια συνιστώσα (PC2) απεικονίζει τη μεταβλητότητα που εισήχθησαν από διάφορες ΤΜΤ 8-plex κανάλια. Αυτή η μεταβλητότητα τονίζει πρωτίστως από τον ασθενή να διακύμανση του ασθενούς, η οποία είναι 10,56% της συνολικής διακύμανσης στο σύνολο δεδομένων. Η μεταξύ μεταβολή της κατηγορίας, δηλαδή του όγκου (Τ) έναντι μη-όγκου (ΝΤ), παρουσιάζεται από την τρίτη κύρια συνιστώσα (PC3), το οποίο εξηγεί 14.36% της συνολικής διακύμανσης στο σύνολο δεδομένων. Εικόνα 2Β και το Σχήμα S4 δείχνει την ομαδοποίηση των μεταβλητών σε δύο ξεχωριστές ομάδες, δηλαδή Τ και ΝΤ. Οι διαφορές μεταξύ των διαφόρων κλάδων της ροής εργασίας έχει επηρεάσει και PC3, η οποία απεικονίζεται ο όμιλος TotalProtein (μη εμπλουτισμένο) πεπτίδια σε ένα ενιαίο σύμπλεγμα στο Σχήμα 2Β. Μόνο ασθενής 12 δεν παρουσιάζει διαφορές σε Τ σε σύγκριση με ΝΤ σύμφωνα με το σχήμα 2Β. Οι PLS bi-οικόπεδα αποδείξει ότι δεν υπήρχαν ακραίες τιμές σε αυτό το σύνολο δεδομένων, όπως φαίνεται στο οικόπεδο Hoteling Τ2-Range (Σχήμα S3). PLS επιβεβαίωσε ότι το πείραμα ήταν επιτυχής, και ότι υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ Τ και ΝΤ. Οι διαφορές μεταξύ των τριών διαφορετικών χέρια του υπάρχει η ροή εργασίας, αλλά TiO

2 και το iMac έχουν σχεδόν ίση συσχέτιση. Μαζί PC1, PC2 και PC3 εξηγήσει 38,52% της συνολικής διακύμανσης στο σύνολο δεδομένων. Το υπόλοιπο μεταβολή στο σύνολο δεδομένων μπορεί να αποδοθεί σε μικτά αποτελέσματα της ανάλυσης και βιολογική μεταβλητότητα

Α:. PC1 και PC2 οικόπεδο βαθμολογίας από τις δύο πρώτες κύριες συνιστώσες που περιγράφουν 13,6% (PC1) και 10,6% (PC2) της η συνολική διακύμανση στα δεδομένα (πρώτες ισοβαρή εντάσεις ετικέτα από κάθε PSM πέρασμα σετ φίλτρων). Ο κύκλος απεικονίζει το χώρο Τ2 διανυκτέρευση βασίζονται σε επίπεδο εμπιστοσύνης 95%. Β: PC2 και PC3 οικόπεδο βαθμολογία από τις επόμενες κύριες συνιστώσες που περιγράφουν 10,6% (PC2) και 14,4% (PC3) της συνολικής διακύμανσης των δεδομένων. C: PC1 και την πλοκή βαθμολογία PC2 από τις δύο πρώτες κύριες συνιστώσες που περιγράφουν 25,8% (PC1) και 19,3% (PC2) της συνολικής διακύμανσης των δεδομένων (διάμεσος log

2 αναλογίες Τ /ΝΤ όλων των μετρήσιμων φωσφοπεπτιδίων σε κάθε περίπτωση ). Εδώ θα εμφανίσει επίσης το χρόνο της υποτροπής σε μήνες για κάθε περίπτωση, μετά από χειρουργική επέμβαση

Η

Εκτός από την εξέταση των πρώτων ισοβαρή εντάσεις ετικέτα στο T & amp.? NT δείγματα για τον εντοπισμό των ακραίων τιμών και των ομάδων, PLS-DA χρησιμοποιήθηκε επίσης για να διερευνήσει το αρχείο καταγραφής

2 αναλογίες Τ /ΝΤ από όλες φωσφο-πεπτίδια (διάμεση τιμή από IMAC, TiO

2, μη εμπλουτισμένο) σε κάθε περίπτωση, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2C. Μια λεπτή σχέση μεταξύ της ομάδας των περιπτώσεων και την ώρα της υποτροπής φαίνεται να βγείτε, ωστόσο, ο αριθμός των βιολογικών επαναλήψεων θα πρέπει να αυξηθεί πριν καταλήξει σε οποιαδήποτε τελικά συμπεράσματα. Τούτου λεχθέντος, είναι ενδιαφέρον να παρατηρήσουμε τις περιπτώσεις 14 και 9 ομαδοποιούνται στενά και στις δύο περιπτώσεις βιώσει πολύ νωρίς υποτροπή σε 2 και 5 μήνες μετά την επέμβαση, αντίστοιχα. Περιπτώσεις 10 και 8 ομαδοποιούνται επίσης μαζί, αλλά μακριά από όλες τις άλλες περιπτώσεις. Περίπτωση 10 έδειξε επανεμφάνιση σε 31 μήνες και 8 περίπτωση είχε κανένα σημάδι υποτροπής ακόμη και 23 μήνες μετά τη χειρουργική επέμβαση. Περιπτώσεις 4, 12, 1, 7, 5, και 13 ομαδοποιούνται και αυτές έδειξαν επανάληψη μεταξύ 10 έως 21 μήνες μετά τη χειρουργική επέμβαση. Είναι ενδιαφέρον την περίπτωση 6, η οποία δεν έχει ακόμη να δείξει την επανάληψη, ομαδοποιούνται επίσης με τις υποθέσεις που παρουσίασαν υποτροπή σε 10 έως 21 μήνες. Περίπτωση 11 δεν το έκανε ομάδα με οποιεσδήποτε άλλες περιπτώσεις.

Σημαντικά ρυθμισμένη έκφραση πρωτεΐνης

Προσδιορίσαμε την σχετική αφθονία των πρωτεϊνών σε όγκου σε σύγκριση με μη καρκινικό ιστό, χρησιμοποιώντας διάμεσος log

2 T /αναλογίες NT των μη φωσφορυλιωμένων πεπτιδίων μοναδικό για κάθε πρωτεΐνη ως υποκατάστατα για να υπολογιστεί η σχετική αφθονία των αντίστοιχων πρωτεϊνών. Μια μονόπλευρη t-test χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των p-τιμές και αυτά σχεδιάστηκαν έναντι log

2 αναλογίες Τ /ΝΤ σε οικόπεδο ηφαίστειο για να ανιχνεύσει σημαντική (Σύνδεση

2 Τ /NT≥0.3 ή ≤-0,3 και p ≤ 0,05) κανονισμοί για όλες τις υποθέσεις (Εικόνα 3Α). Συνολικά υπήρχαν 152 πρωτεΐνες σημαντικά ρυθμίζονται βάσει Σύνδεση

2 Τ /NT≥0.3 ή ≤-0,3 και p ≤ 0,05 (File S6_Sheet ‘Pro_TvNT & gt? Ή & lt? 0.3_p & lt? 0,05). Ο Πίνακας 2 παρουσιάζει τα 12 πιο σημαντικά απορυθμίζεται πρωτεϊνών στον όγκο σε σύγκριση με μη καρκινικό ιστό, και παρέχει επίσης μια περιγραφή κάθε γνωστή λειτουργία της κάθε πρωτεΐνης ή συσχέτιση με τον καρκίνο [13] – [31]. Η υπερέκφραση του βλεννίνη-1 συνδέεται συχνά με τον καρκίνο και βρήκαμε επίσης Μουκίνη-1 να είναι σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε παγκρεατικό ιστό του όγκου. Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε περισσότερο σημαντική πάνω ρυθμισμένα πρωτεΐνες από Μουκίνη-1, μερικές από τις οποίες μπορεί να αποδειχθεί ότι είναι περισσότερο ειδικοί δείκτες του καρκίνου του παγκρέατος, ίσως ακόμη και νέων θεραπευτικών στόχων π.χ. Ομοπεδίου-αλληλεπιδρούν πρωτεϊνική κινάση 1 (HIPK1). HIPK1, η οποία ανυψώθηκε σε όγκο σε σύγκριση με μη-όγκου σε όλες τις περιπτώσεις (διάμεσος log

2 T /ΝΤ = 1,00? Ρ = 1,59 Ε -04), είναι μία από τις τέσσερις HIPK κινάσες σερίνης /θρεονίνης που είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρούν με και ρυθμίζουν τη δραστηριότητα πολλών κυτταρικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων αρκετών παραγόντων μεταγραφής και συμπαράγοντες [32], [33], [34]. έχουν HIPKs εμπλακεί στον έλεγχο μιας σειράς κυτταρικών οδών για τη ρύθμιση των διαφόρων διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένης της απάντησης βλάβες στο DNA, τις προδιαγραφές των ιστών, και τον πολλαπλασιασμό [34].

οικόπεδα ηφαίστειο δείχνει -λογάριθμος

10 P-τιμές σε σχέση με το log

2 αναλογίες Τ /NT για? Α: σχετική αφθονία πρωτεΐνης (που καθορίζεται από το μέσο καταγραφής μη-φωσφοπεπτιδίου

2 αναλογίες Τ /ΝΤ), Β: φωσφοπεπτίδια που μετράται στο IMAC, C: TiO

2, D: και μη εμπλουτισμένο βραχίονα της ροής εργασίας SysQuant . Κόκκινοι κύκλοι επισημαίνουν σημαντικά διαμορφωμένο πρωτεΐνες (log

2 αναλογίες Τ /ΝΤ ≥0.3 ή ≤-0,3 και p-τιμές ≤0.05) και φωσφοπεπτίδια (log

2 αναλογίες Τ /ΝΤ ≥0.75 ή ≤-0,75 και p τιμαί ≤0.05). Ε: είναι ένα διάγραμμα Venn που απεικονίζει την κατανομή των 635 φωσφοπεπτιδίων μεταξύ των τριών σκελών της ροής εργασίας που ήταν σημαντικά διαμορφωμένο

Η

Για να κατανοήσουμε καλύτερα τις βιολογικές διεργασίες και KEGG οδών σηματοδότησης που διαφέρουν μεταξύ των όγκων. και μη-καρκινικά έχουμε επιλέξει τους αριθμούς ένταξη όλων σημαντικά διαμορφωμένων πρωτεϊνών και φορτώθηκε αυτά στην DAVID Βιο-πληροφορικής πόρων. Το μονοπάτι σηματοδότησης Focal πρόσφυση KEGG επηρεάστηκε πιο σημαντικά δίνοντας μια βαθμολογία Benjamini από 1.0e-3. περιλαμβάνονται σημαντικά διαμορφωμένο εστιακών πρωτεΐνες πρόσφυσης? Ταλίν-1, Filamin-Α, Filamin-Β, Filamin-C, βινκουλίνης, Ινωδονεκτίνης, Zyxin, και την αλυσίδα της κινάσης φως μυοσίνη, λείο μυ (Σχήμα 4 & amp? S6_Sheet αρχείου? Amp FA &? Lamellipodium). Talin-2, κινάσης εστιακής προσκόλλησης 1 (FAK1), πρωτεϊνική φωσφατάση 1 ρυθμιστικής 12Α υπομονάδα ήταν επίσης πρωτεΐνες εστιακή πρόσφυση και σημαντικά διαμορφωμένο αλλά μπορεί να δει μόνο σε File S6, καθώς αυτές οι πρωτεΐνες δεν ήταν ποσοτικώς σε ορισμένες περιπτώσεις, και το Σχήμα 4 δείχνει μόνο πρωτεΐνες ποσοτικά σε όλες τις περιπτώσεις (π.χ. δεν υπάρχει Ν /Α). Όλες αυτές οι εστιακής πρωτεϊνών προσκόλλησης, εκτός FAK1, ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε όγκο έναντι μη-όγκου υποδηλώνοντας αυξημένο μέγεθος ή /και τη συχνότητα των εστιακών συμφύσεων σε κύτταρα εντός του όγκου. Εστιακή συμφύσεις είναι γνωστό ότι παίζουν ένα ρόλο στη μετανάστευση πολλών τύπων κυττάρων [35], [36], [37]. Κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης οι εστιακές συμφύσεις μπορούν να αγκυροβολήσουν τα κύτταρα προς την εξωκυτταρική μήτρα μετά τον σχηματισμό των προεξοχών κυττάρου ή προεξοχές? όπως pseudopodium, filopodium και lamellipodium [37]. Οι εστιακές πρωτεΐνες προσκόλλησης βινκουλίνης και ελαφριά αλυσίδα μυοσίνης κινάσης είναι επίσης γνωστό ότι εμπλέκονται στο σχηματισμό του ελασματοπόδια και προάγουν κυτταρική κινητικότητα. Στις Σχήμα 4 παραθέτουμε πρωτεΐνες είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στο σχηματισμό των προβλέψεων για την ανάπτυξη και εστιακές συμφύσεις, που φαίνεται να διαμορφώνεται σημαντικά και μετρήσιμα σε όλες τις περιπτώσεις. Η μεμβράνη του πλάσματος που εκτείνονται σε εξωκυττάρια μήτρα υποδοχείς (ιντεγκρίνες) είναι απαραίτητα συστατικά των συμφύσεων ωστόσο δεν παρατηρήσαμε στατιστικά σημαντική διαφοροποίηση της κάθε ιντεγκρίνης έκφρασης, αλλά τήρησε σημαντική διαφοροποίηση της ιντεγκρίνης φωσφορυλίωσης, όπως συζητήθηκε αργότερα. Η συναρμολόγηση των εστιακών συμφύσεων επίσης περιλαμβάνει ενεργοποίηση σηματοδότησης Rho, καθώς και μυοσίνη επαγόμενη συσταλτικότητα [37]. Το Σχήμα 4 δείχνει επίσης μυοσίνη 9, 10, 11, και 14 ήταν σημαντικά αυξημένα σε όγκου σε σύγκριση με μη καρκινικό ιστό

Όλες οι πρωτεΐνες στο σχήμα αυτό έχουν αποδειχθεί ότι σχετίζονται με τους όρους GO ‘lamellipodium’ & amp.? «Εστιακή πρόσφυση» και επίσης φαίνεται να είναι σημαντικά (p ≤ 0,05) άνω ή κάτω ρυθμίζονται σε όγκο σε σύγκριση με μη καρκινικό ιστό και μετρήσιμα σε κάθε περίπτωση (π.χ. όλες οι πρωτεΐνες που περιέχουν NA για κάθε περίπτωση εξαιρέθηκαν από τον πίνακα). Σύνδεση

2 αναλογίες T /NT των μη φωσφορυλιωμένα πεπτίδια από κάθε πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκαν ως υποκατάστατα για να υπολογίσει τη σχετική αφθονία των αντίστοιχων πρωτεϊνών. Σύνδεση

2 αναλογίες Τ /ΝΤ των μη φωσφορυλιωμένη πεπτίδια μέσο όρο σε τρία σκέλη της ροής εργασίας (ΣΕΕΑ, TiO

2, μη-εμπλουτίζουν).

Η

Λειτουργική ρόλους των τεσσάρων πρωτεΐνες στο σχήμα 4 (πρωτεΐνη τομέα ΕΑΥ και SH3 1, μοεσίνη, Palladin, και PDZ και LIM πεδίου πρωτεΐνη 7) έχουν ήδη συζητηθεί στον πίνακα 2, αλλά Αλφα-actinin-4 (ACTN4) είναι μια πρωτεΐνη πρόσδεσης ακτίνης με πολλαπλούς ρόλους σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Σε μη-μυϊκά κύτταρα, έχει βρεθεί κατά μήκος δέσμες μικρονηματίων και ενώσεις προσφύσεως τύπου, όπου εμπλέκεται στη δέσμευση της ακτίνης στη μεμβράνη. Πιστεύεται ότι εμπλέκεται σε μεταστατικές διαδικασίες όπως Li Fu et al [38] έδειξε ότι η υπερέκφραση του ACTN4 σε συνδυασμό με 67 LR συνδέεται με οισοφαγικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (ESCC) εξέλιξης. Απέδειξαν ότι ACTN4 είχε εκφράζονται διαφορικά σε ESCC ιστό σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς και ότι τα επίπεδα έκφρασης του ACTN4 προοδευτικά αυξήθηκαν από το στάδιο Ι έως III. Κλινικοπαθολογοανατομικές συσχέτιση με τη χρήση TMA αποκάλυψε ότι η υπερέκφραση της ACTN4 συσχετίστηκε σημαντικά με προχωρημένο στάδιο του όγκου (P = 2.6E-2) και της λέμφου μετάσταση στους λεμφαδένες (P = 4.9E-02) [38]. Plectin έχει επίσης προταθεί ως βιοδείκτης του καρκίνου, ειδικότερα για τον καρκίνο του παγκρέατος [39]. Αν και κανονικά μία κυτταροπλασματική πρωτεΐνη, plectin εκφράζεται επί της κυτταρικής μεμβράνης σε πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος (PDAC) και μπορεί επομένως να χρησιμοποιηθεί για την στόχευση κυττάρων PDAC [39]. Η μελέτη μας επιβεβαιώνει ότι και οι δύο βιοδείκτες καρκίνου είναι σημαντικά πάνω από εκφράζεται σε όγκο σε σύγκριση με μη καρκινικό ιστό σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος (διάμεσος log

2 T /NT = 0,29 και ρ-τιμή = 3.33E-02 για ACTN4, και διάμεση log

2 T /NT = 0,32 και ρ-τιμή = 1.63E-03 για Plectin).

Catenin δέλτα-1 είναι απαραίτητη για το σχηματισμό της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου (ενώσεις προσφύσεως), μέσω της αλληλεπίδρασής της με η κυτταροπλασματική ουρά της κλασικής και τύπου καντερίνες II. Κατενίνης δέλτα-1 ρυθμίζει επίσης τις δραστηριότητες της οικογένειας Rho των GTPases (RhoA, Rac και Cdc42), γεγονός που υποδηλώνει ότι μαζί με άλλα υποστρώματα Src, κατενίνης δέλτα-1 ρυθμίζει τη δυναμική της ακτίνης. Έτσι, κατενίνης δέλτα-1 είναι ένας κύριος ρυθμιστής του σχηματισμού προσφύσεων διασταύρωση, και πιθανόν συμμετέχει στη ρύθμιση της ισορροπίας μεταξύ της κόλλας και κινητικά κυτταρικό φαινότυπο [40]. Εδώ παρατηρούμε μειώθηκαν σημαντικά τα επίπεδα της κατενίνης δέλτα-1 σε όγκου σε σύγκριση με μη καρκινικό ιστό (διάμεσος log

2 T /NT = -0,29 και p-value = 1.34E-02). Κατά την εξέταση των σημαντικό ρόλο κατενίνης δέλτα-1 παίζει στο σχηματισμό /διατήρηση ενώσεις προσφύσεως μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων, και λαμβάνοντας υπόψη παρατηρούμενη μείωση μας στην έκφραση και φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης αυτής υποδεικνύει ότι αυτά τα γεγονότα μπορούν να συμβάλλουν στην διάσπαση των επιθηλιακών κυττάρων, ως εκ τούτου, επιθηλιακό να μεσεγχυματικά μετάβαση . για τον καρκίνο του παγκρέατος

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον ανακαλύπτει ότι η κινάση ελαφριά αλυσίδα μυοσίνης (MLCK) είναι σημαντικά υπερεκφράζεται σε όγκο σε σύγκριση με μη καρκινικό ιστό (διάμεση τιμή log

2 Τ /ΝΤ = 0.5 & amp? ρ- value = 2.95E -02). MLCK είναι Ca

2 + /εξαρτώμενη από καλμοδουλίνη πρωτεϊνική κινάση που ρυθμίζει μία ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών, όπως, σύσπαση των μυών και κυτταρική μετανάστευση, μέσω φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών ελαφριά αλυσίδα μυοσίνης. Δεδομένου ότι η μετανάστευση των κυττάρων του όγκου είναι ένα βασικό βήμα στην εξάπλωση του όγκου, της κινάσης μυοσίνης ελαφριάς αλυσίδας (MLCK) μπορεί να θεωρηθεί ως ένα θεραπευτικό στόχο για την πρόληψη της εξάπλωσης του όγκου. Στην πραγματικότητα, η ενεργοποίηση MLCK και έκφρασης έχουν βρεθεί να σχετίζεται θετικά με μεταστατικό ροπή. Επιπλέον, οι αναστολείς MLCK δειχθεί ότι μειώνει την διεισδυτικότητα των διαφόρων καρκινικών κυττάρων [41]. Ενδιαφέρον περιπτώσεις 14, 9, 4, και 13 έχουν υψηλότερα επίπεδα MLCK και τρεις από τις τέσσερις από αυτές τις περιπτώσεις καταδεικνύουν επίσης πολύ νωρίς στην επανάληψη (2 μήνες, 5 μηνών, 10 μηνών, & amp? Η μεγαλύτερη με 21 μήνες υποτροπή, αντίστοιχα) . Ίσως αυτές οι τέσσερις περιπτώσεις θα ωφελούνταν από θεραπεία με αναστολέα MLCK αν διαστρωμάτωση των ασθενών βασίστηκαν στην υψηλή έκφραση του στόχου φαρμάκου σε όγκο έναντι μη-όγκου. Περίπτωση 10 έδειξε τα χαμηλότερα επίπεδα των MLCK σε όγκο σε σύγκριση με μη-όγκου που συσχετίζεται με αυτήν την υπόθεση που δείχνει το μεγαλύτερο χρονικό διάστημα πριν από την επανάληψη των 31 μηνών. MLCK παίζει επίσης ένα ρόλο στην ρ38 ΜΑΡΚ σηματοδότησης ένα μονοπάτι που αποδεικνύουν αυξημένη δραστικότητα σε αρκετές από τις όγκων σε αυτή τη μελέτη, όπως συζητείται αργότερα.

Παρατηρώντας αυξημένη έκφραση μυοσίνης σε ιστό όγκου έχει επίσης ιδιαίτερο ενδιαφέρον ως MYH9 (διάμεσος log

2 Τ /ΝΤ = 0,29 και p-value = 5.93E-03), MYH10 (διάμεση τιμή log

2 Τ /ΝΤ = 0,23 και p-value = 2.18E-02), & amp? MYH14 (διάμεσος log

2 T /NT = ρ-τιμή 0,35 και = 2.03E-02) είναι όλα κυτταρικά μυοσίνες που είναι κρίσιμα για την κυτοκίνηση, το σχήμα των κυττάρων, και εξειδικευμένες λειτουργίες, όπως έκκριση και κάλυψη. Κατά τη διάρκεια της εξάπλωσης των εν λόγω τρεις κυτταρικές, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην κυτταροσκελετού αναδιοργάνωση, σχηματισμός εστιακές επαφές (στο κεντρικό τμήμα, αλλά όχι τα περιθώρια εξάπλωσης κύτταρα), και MYH10 επάγει lamellipodial επέκταση ενώ η λειτουργία αυτή είναι μηχανικά ανταγωνίζεται από MYH9, η οποία πιστεύεται ότι προκαλεί lamellipodial ανάκλησης.