Abstract

Η κανονική παροδική δυναμικό υποδοχέα (trpC) κανάλια είναι Ca

2 + διαπερατοί στα κατιονικά κανάλια ελέγχου του Ca

2+ εισροή προκαλείται από την ενεργοποίηση του υποδοχέα συζευγμένου με πρωτεΐνη G και /ή με Ca

εξάντληση κατάστημα 2+. Εδώ διερευνηθεί η εμπλοκή του TRPCs στην κυτταρική διαφοροποίηση του καρκίνου του πνεύμονα. Η έκφραση του TRPCs και η συσχέτιση στον βαθμό διαφοροποίησης του καρκίνου σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR και ανοσοκηλιδώσεως με χρησιμοποίηση μικροσυστοιχίες ιστού από 28 δείγματα καρκίνου του πνεύμονα του ασθενούς. Η σύνδεση των TRPCs με τη διαφοροποίηση των κυττάρων ερευνήθηκε επίσης στον καρκίνο του πνεύμονα Α549 κυτταρική γραμμή με PCR και κηλίδωση Western. Η δραστηριότητα του καναλιού παρακολουθείται από Ca

2 + απεικόνισης και καταγραφής έμπλαστρο μετά τη θεραπεία με ολο-

trans-ρετινοϊκό οξύ

(ATRA). Η έκφραση του TRPC1, 3, 4 και 6 συσχετίστηκε με το βαθμό διαφοροποίησης των NSCLC σε ασθενείς, αλλά δεν υπήρχε συσχέτιση με την ηλικία, το φύλο, το ιστορικό καπνίσματος και του τύπου καρκίνου πνεύμονος. ATRA ρυθμίζεται προς τα πάνω TRPC3, TRPC4 και έκφραση TRPC6 και ενισχυμένη Ca

2 + εισροή σε κύτταρα Α549, ωστόσο, ATRA δεν έδειξε καμία άμεση επίδραση στα κανάλια trpC. Αναστολή των καναλιών trpC από αντισώματα πόρων αποκλεισμού μείωσε την μίτωση των κυττάρων, η οποία αντισταθμίζεται από χρόνια θεραπεία με ATRA. Ο αποκλεισμός των διαύλων trpC ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό Α549, ενώ η υπερέκφραση του TRPCs αύξησε τον πολλαπλασιασμό. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η έκφραση trpC συσχετίζεται με τη διαφοροποίηση του καρκίνου του πνεύμονα. TRPCs μεσολαβούν την φαρμακολογική δράση του ATRA και παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της διαφοροποίησης των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα και του πολλαπλασιασμού, η οποία δίνει μια νέα αντίληψη της βιολογίας του καρκίνου του πνεύμονα και του δυναμικού αντικαρκινική θεραπεία

Παράθεση:. Jiang ΗΝ, Zeng Β, Zhang Υ, Daskoulidou Ν, Ανεμιστήρας Η, Qu JM, et al. (2013) Συμμετοχή των trpC Κανάλια στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων Διαφοροποίηση και της ανάλυσης συσχέτισης στην Ανθρώπινη μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (6): e67637. doi: 10.1371 /journal.pone.0067637

Επιμέλεια: Peiwen Φέι, Πανεπιστήμιο της Χαβάης Cancer Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 Ιαν 2013? Αποδεκτές: 20 Μαΐου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 28 Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Jiang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τις επιχορηγήσεις από τη Σαγκάη Leading Talent Έργα (Νο 036, 2010) και Shuguang Παρακολούθηση του έργου της Επιτροπής της Σαγκάης Παιδείας (01SG06) (για να JMQ)? Leverhulme Εμπιστοσύνη Fellowship Award (με S.Z.X.)? Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Σαγκάης (Αρ 09ZR1406100) και τη Σαγκάη κορυφαία ακαδημαϊκά Έργου Πειθαρχία (Αρ B115) (για να H.N.J.). Β.Ζ. υποστηρίχθηκε από την Κίνα Υποτροφιών Συμβούλιο και το πανεπιστήμιο studentship. Ν.Ο. έλαβε 80η επέτειο διδακτορικής PhD από το Πανεπιστήμιο του Hull. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αν και το ποσοστό επιβίωσης έχει βελτιωθεί μετά την εισαγωγή του αντι-νεοπλασματικών παραγόντων τρίτης γενιάς και του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (αναστολείς EGFR) της τυροσινικής κινάσης, ο καρκίνος του πνεύμονα εξακολουθεί να είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο στον κόσμο [ ,,,0],1], [2], [3], [4], [5]. Ως εκ τούτου, η κατανόηση της παθογένειας της ανάπτυξης του καρκίνου του πνεύμονα και ο εντοπισμός νέων πιθανών στόχων είναι σημαντική για την ανάπτυξη θεραπευτικής στρατηγικής.

Ca

2+ είναι σημαντική στα καταρράκτες σηματοδότησης της ογκογένεσης. Η παροδική δυναμικό υποδοχέα οικογένεια κανάλι (TRP) ιόν έχει ενοχοποιηθεί στη ρύθμιση της ανάπτυξης και της εξέλιξης του καρκίνου μέσω της διαφοροποίησης των Ca

2+ εισροή και τα κατάντη σήματα που περιλαμβάνουν γονιδιακή μεταγραφή [6], [7], [8] . Μεταξύ των έξι υποοικογένειες (trpC, TRPM, TRPV, trpP, TRPML και TrpA) των καναλιών TRP, οι κανονικές το TRP (TRPCs) έχουν προταθεί ως πρωτεϊνικής κινάσης τυροσίνης ή συζευγμένο με πρωτεΐνη που λειτουργούν ως υποδοχείς Ca

2+ κανάλια ( ROCs) ή εσωτερική Ca

κατάστημα που λειτουργούν 2+ καναλιών (SOCs), που διαμεσολαβούν στην Ca

2+ εισόδου που προκαλείται από πολλές ορμόνες και αυξητικούς παράγοντες. Συνεπώς, η αναστολή αυτών των δραστηριοτήτων καναλιού ή έκφραση οδηγεί σε λειτουργικές αλλαγές στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, μετανάστευση, σχηματισμός αποικίας και την ανάπτυξη του όγκου [6], [9]. Πρόσφατα, αρκετές μελέτες έχουν αποδείξει την ύπαρξη trpC σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων ή ιστών καρκίνου, όπως TRPC1, 3, 6 σε κύτταρα μαστού καρκίνο MCF7 [10], [11] και τα κύτταρα καρκίνου του ήπατος HepG2 [12], TRPC1, 3, 4 σε κύτταρα προστάτη LNCaP καρκίνου του [13], [14], TRPC1, 4, 6, 7 σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα [15], TRPC1, 3, 5, 6 σε ανθρώπινα κακοήθη γλοιώματα [16], TRPC1, 3- 7 σε νευροβλαστώματος IMR-32 κύτταρα [17], TRPC3 σε ανθρώπινα αστροκύτωμα 1321Ν1 κυττάρων [18], TRPC6 σε οισοφάγου και γαστρικού καρκίνου [19], TRPC1, 3, 4, 6 και συγκολλημένα παραλλαγές τους στον καρκίνο των ωοθηκών [9], [ ,,,0],20], και TRPC1, 4 σε βασικοκυτταρικό καρκίνωμα [21]. Επιπλέον, μαρτυρίες από

in vitro

πειράματα έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση των καναλιών trpC ή σιωπή του γονιδίου έκφρασης με siRNA μπορεί να ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή κυτταρική επιβίωση, υποδεικνύοντας τα γονίδια αυτά είναι σημαντικά στην βιολογία του καρκίνου [6], [9] , [20].

η έκφραση της TRPC1, 3, 4, 6, στον καρκίνο του πνεύμονα έχει εντοπιστεί [22], [23] και η ένωση της έκφρασης TRPC3 με την πρόγνωση του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα έχει περιγραφεί [ ,,,0],23]. Εντούτοις, η συσχέτιση της έκφρασης trpC με το βαθμό διαφοροποίησης του καρκίνου του πνεύμονα και του υποκείμενου μηχανισμού είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Εδώ έχουμε ως στόχο να προσδιορίσει την έκφραση του TRPCs στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα και τον προσδιορισμό των ρόλων των TRPCs στη ρύθμιση της διαφοροποίησης των καρκινικών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό χρησιμοποιώντας αντισώματα αποκλεισμού συγκεκριμένο κανάλι trpC. Εξετάσαμε επίσης το δυναμικό συσχέτιση της έκφρασης trpC με βαθμό διαφοροποίησης του καρκίνου, τον τύπο των κυττάρων και το κάπνισμα με πραγματικού χρόνου PCR και ανοσοϊστοχημεία για τις μικροσυστοιχίες ιστού καρκίνου του πνεύμονα. Για να εξεταστεί περαιτέρω η σχέση της έκφρασης trpC με τη διαφοροποίηση των κυττάρων, ATRA, ένας ισχυρός επαγωγέας διαφοροποίησης των κυττάρων για πολλούς τύπους κυττάρων, χρησιμοποιήθηκε σε μια

in vitro

μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα ιστών του πνεύμονα

Είκοσι οκτώ ασθενείς (17 άνδρες και 11 γυναίκες), ηλικίας στα 61,1 ± 1,7 έτη, με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) είχαν προσληφθεί από το Νοέμβριο του 2008 και Δεκέμβριο του 2009. Όλοι οι ασθενείς με ΜΜΚΠ διαγνώστηκαν κλινικά σταδιακή Ι ή ΙΙ καρκίνο του πνεύμονα και έλαβε τη λειτουργία της Χειρουργικής θώρακος του Zhongshan Νοσοκομείο. Οι επιλέξιμες ασθενείς είχαν λάβει προηγούμενη θεραπεία, ιστολογικά ή κυτταρολογικά αποδείχθηκε NSCLC. Οι ασθενείς έλαβαν είτε προεγχειρητική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία εξαιρέθηκαν από αυτή τη μελέτη. Ο ιστός ο καρκίνος του πνεύμονα και ο κανονικός ιστός του πνεύμονα που περιβάλλει τον όγκο πέραν των 2 cm σε απόσταση ελήφθησαν από ίδιο ασθενή. Οι snap-κατεψυγμένοι ιστοί χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση mRNA και τα σταθεροποιημένα με φορμαλίνη ιστούς για τη μελέτη immuocytochemistry. Το σχέδιο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Zhongshan Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Fudan, και οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση, σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Καρκίνο του Πνεύμονα ιστικές μικροσυστοιχίες

πνεύμονα μικροσυστοιχίες καρκινικού ιστού ήταν γίνονται χρησιμοποιώντας σταθεροποιημένα με φορμαλίνη καρκινικούς ιστούς [24]. πυρήνες ιστού με 2 mm σε διάμετρο συλλέχθηκαν με βάση την οπτική ευθυγράμμιση με την αντίστοιχη χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης (ΗΕ). Ένας πυρήνας του φυσιολογικού πνευμονικού ιστού και δύο πυρήνες του ιστού του όγκου ελήφθησαν από κάθε ασθενή και τοποθετήθηκε σε μπλοκ παραφίνης δέκτη. Οι τομές ιστού πάχους 5-μm χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοχρώση. Όλα τα δείγματα για τις μικροσυστοιχίες ιστού εξετάστηκαν από έναν παθολόγο με ταξινόμηση ιστολογικά και το βαθμό διαφοροποίησης σύμφωνα με την ταξινόμηση του ΠΟΥ [25].

Cells Πολιτισμού και Gene Η επιμόλυνση

Α549 κυτταρική γραμμή, μια ευρέως χρησιμοποιούμενη πνεύμονα μοντέλο καρκινικού κυττάρου που προέρχονται από adenocarcinomic ανθρώπινο κυψελιδικά βασικά επιθηλιακά κύτταρα, αναπτύχθηκε σε μέσο DMEM /F12 (Invitrogen, Paisley, UK) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και διατηρήθηκαν στους 37 ° C κάτω από 95% αέρα και 5% CO

2. Ανθρώπινα TRPC1, TRPC3 και TRPC6 ενισχύθηκαν από το cDNA του ανθρώπινου καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα και τα ανθρώπινα TRPC4 ενισχύθηκαν από το cDNA του ανθρώπινα αορτικά ενδοθηλιακά κύτταρα με 100% ταυτότητα με τις αλληλουχίες στην Genbank (αριθμοί πρόσβασης: X89066 (TRPC1)? U47050 ( TRPC3), NM_016179 (TRPC4α) και BC093660 (TRPC6). Η trpC cDNAs υποκλωνοποιήθηκαν σε pcDNA3.1 ή pEGFP-C1 φορείς και λειτουργική έκφραση τους έχει επιβεβαιωθεί όπως έχουμε αναφερθεί [9]. Α549 κύτταρα μορφομετατράπηκαν με TRPC1, 3, 4, και 6 το πλασμίδιο cDNA σε φορέα pcDNA3 χρησιμοποιώντας Lipofectamine2000 (Invitrogen). Τα επιμολυσμένα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκα 48 φρεατίων για το πείραμα.

Giemsa χρώση, μίτωση και Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Δοκιμασίες

κύτταρα Α549 απλώθηκαν σε δίσκους 3.5-cm με μια τελική πυκνότητα 4 × 10

4 κύτταρα ανά δίσκο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ ATRA ή όχημα. Το μέσο καλλιέργειας ανανεώνεται κάθε 24 ώρες. Τα κύτταρα στερεώθηκαν με μεθανόλη για 10 λεπτά και χρωματίστηκαν με ένα 1:09 αραιωμένο διάλυμα Giemsa (Sigma) που εργάζονται σε PBS σε ρΗ 6,5 για 45 λεπτά, και πλένεται με νερό και ξηραίνεται στον αέρα. Ο συνολικός αριθμός κυττάρων και μιτωτικά κύτταρα μετρήθηκαν στις εικόνες φωτογραφήθηκαν κάτω από 200 × μεγέθυνση. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε επίσης χρησιμοποιώντας WST-1 δοκιμασία (Roche, UK) [9].

RT-PCR και Real-time PCR

Ολικό RNA εξήχθη από ανθρώπινο πνεύμονα και πνευμονικό καρκινικούς ιστούς ή κύτταρα Α549 χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, UK). Το RNA ποσοτικοποιήθηκε με ένα nanophotometer (Implen, γερμανικά). Το mRNA (1 μg) μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας Multiscribe ανάστροφης μεταγραφάσης (Applied Biosystems, USA) και τυχαίων εκκινητών (Promega, UK). Ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας StepOne ™ Σύστημα PCR Πραγματικού χρόνου ή ABI PRISM 7900 HT Ακολουθία Σύστημα Ανίχνευσης (Applied Biosystems, UK). Η ομάδα εναρκτήρα σχεδιάστηκε απέναντι ιντρονίου και οι ακολουθίες δόθηκαν στον Πίνακα S1. Κάθε αντίδραση περιείχε 1 × SYBR καθολική Master Mix (Applied Biosystems) 10 μΙ, 1 μΙ cDNA, και προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές 1,5 μΙ το καθένα. Το γονίδιο housekeeping αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης GAPDH ανθρώπινη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. Μη πρότυπο ή μη-RT ορίστηκε ως αρνητικός έλεγχος. Ο κύκλος PCR συνίστατο από ένα αρχικό κύκλο 50 ° C για 2 λεπτά ακολουθούμενο από 95 ° C για 10 λεπτά, στη συνέχεια 50 επαναλαμβανόμενους κύκλους 95 ° C για 15 s, 54 ° C θερμοκρασία ανόπτησης C για 30 s, και την επέκταση εκκινητή στους 72 ° C για 30 s.

αντισώματα, Western Blotting και ανοσοϊστοχημεία

κουνελιού πολυκλωνικά αντισώματα anti-trpC (T1E3, T5E3, T367E3 και T45E3) δημιουργήθηκαν κατά του εξωκυττάριου τρίτο βρόχο (Ε3) περιοχή κοντά στον πόρο του καναλιού [26]. Η ειδικότητα των αντισωμάτων Ε3-στόχευση δοκιμάστηκε με ELISA, Western και λειτουργικές δοκιμασίες, και φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS) [9], [26]. Η διαδικασία για την κηλίδωση Western έχει περιγραφεί προηγουμένως [26]. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (Sigma-Aldrich, Poole, UK) και οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE πηκτή πριν από τη μεταφορά σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Το στύπωμα επωάστηκε με αντισώματα αντι-trpC κουνελιού (1:200) όλη τη νύκτα στους 4 ° C, πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), και επωάστηκαν με αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG-HRP στο 1:2000 αραίωσης (Sigma). Το αντι-β-ακτίνης κουνελιού (Santa Cruz Biotech, USA) σε αραίωση 1:400 χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο για την πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση. Οπτικοποίηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια ECLplus ανίχνευσης (GE Healthcare, UK) και έκθεση σε φιλμ ακτίνων-Χ. Η ποσοτικοποίηση αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Image J (ΝΙΗ, USA). Η διαδικασία ανοσοχρώση ήταν παρόμοια με τις εκθέσεις μας [9], [27] και το σύστημα Vectastain ABC (Vector Laboratories, Peterborough, UK) χρησιμοποιήθηκε. Το κουνέλι αντι-TRPC1, 3, 4 και 6 αντισώματα αγοράστηκαν από Abcam (Cambridge, UK) χρησιμοποιήθηκαν για τον ανθρώπινο ιστό πνεύμονα και χρώση τμήμα καρκίνο του πνεύμονα. Η ποσοτικοποίηση χρώση αξιολογήθηκε με βαθμολόγηση θετικά χρωματισμένων κυττάρων και χρώση ένταση κατατάσσεται ως 0 (αρνητική), 1 (ασθενής), 2 (ενδιάμεσο) και 3 (ισχυρή) [28].

ολόκληρου κυττάρου Patch Clamp

Το σύνολο των ρευμάτων των κυττάρων καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας Axoclamp 2Β ή Axopatch B200 ενισχυτή καθήλωσης και να ελέγχεται με pClamp 10 λογισμικό. Οι διαδικασίες για την καταγραφή των ρευμάτων trpC ήταν παρόμοιες με τις προηγούμενες εκθέσεις μας [29], [30]. Ένα πρωτόκολλο τάσης 1-s ράμπα από -100 mV έως 100 mV εφαρμόσθηκε σε μία συχνότητα 0,2 Hz από ένα δυναμικό κράτησης 0 mV. Σήματα ελήφθησαν δείγματα σε 3 kHz και διηθείται σε 1 kHz. Χρησιμοποιήθηκε Το γυάλινο μικροηλεκτρόδιο με αντίσταση 3-5 ΜΩ. Το 200 ηΜ Ca

2+ διάλυμα πιπέτας (115 ΟδΟΙ, 10 EGTA, 2 MgCl

2, 10 HEPES, και 5,7 CaCl

2 σε mM, ρΗ ρυθμίστηκε στο 7.2 με CsOH και την οσμωτικότητα ρυθμίστηκε να -290 mOsm με μαννιτόλη). Η υπολογιζόμενη χωρίς Ca

2 + ήταν 200 nM χρησιμοποιώντας EQCAL (Biosoft, Cambridge, UK). Το πρότυπο διάλυμα λουτρού περιείχε (mM): 130 NaCl, 5 KCI, 8 D-γλυκόζη, 10 HEPES, 1.2 MgCl

2 και 1,5 CaCl

2. Το ρΗ ρυθμίστηκε στο 7,4 με ΝαΟΗ. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου (23-25 ​​° C).

Ca

2 + Imaging

κύτταρα Α549 φορτώθηκαν με 2 μΜ Fura-PE3 AM στους 37 ° C για 30 λεπτά σε Ca

2 + -δωρεάν διάλυμα λουτρού, ακολουθούμενη από μια 20-λεπτη πλύση σε πρότυπο διάλυμα λουτρού σε θερμοκρασία δωματίου. Fura-PE3 φθορισμός παρακολουθήθηκε με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο επιφθορισμού (Nikon Ti-Ε, Japan). Μια λάμπα xenon τόξο φωτός που παρέχονται διέγερσης, το μήκος κύματος του οποίου επιλέχθηκε από ένα σύστημα απεικόνισης της Nikon που ελέγχεται από NIS Elements 3.0 του λογισμικού. Διπλού μήκους κύματος ενθουσιασμένος στα 340 nm και 380 nm χρησιμοποιήθηκε για φθορισμό Fura-PE3, και η εκπομπή συλλέχθηκε μέσω ενός φίλτρου 510-nm και φωτογραφήθηκε από Orca-R2 CCD κάμερα (Hamamatsu, Ιαπωνία). Η αναλογία του Ca

2 + χρωστική φθορισμού σε F

340 /F

380 μήκος κύματος μετρήθηκε [30]. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου.

Αντιδραστήρια και Χημικά

Όλες οι γενικές άλατα αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (Poole, UK). χλωριούχο γαδολίνιο (Gd

3+), 2-aminoethoxydiphenyl βορικό (2-ΑΡΒ), θρυψίνη, all-

trans

ρετινοϊκό οξύ (ATRA), και εκκινητές PCR αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich, και Fura -PE3 AM ήταν από Invitrogen (Paisley, UK).

Στατιστικά

τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM Η στατιστική σημαντικότητα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ANOVA και η διαφορά μεταξύ των ομάδων εκτιμήθηκε με ϋυηηβίί

t-test

στο λογισμικό SPSS.

t

test του Student εφαρμόστηκε για δύο ομάδα σύγκρισης. Η ανάλυση Ridit χρησιμοποιήθηκε για τις ημιποσοτική δεδομένα της ανοσοκηλιδώσεως πειράματος. Η

P

αξία & lt?. 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Η έκφραση της TRPCs στον Καρκίνο του Πνεύμονα

Η έκφραση της TRPCs στο φυσιολογικό ανθρώπινο πνεύμονα και πνεύμονα καρκινικούς ιστούς εξετάστηκε με ανοσοκηλίδωση (Εικ. 1Α). Σε κανονικές τομές πνευμονικό ιστό, τα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα βάφτηκαν με αντι-TRPC1 και αντισώματα αντι-TRPC6, αλλά η χρώση για TRPC3 και TRPC4 ήταν αρνητικά ή πολύ αδύναμη. Σε τμήματα πλακώδες καρκίνωμα πνεύμονα, πλακώδους κύτταρα έντονα χρωματίστηκαν με αντι-TRPC1, αντι-TRPC3, αντι-TRPC4 και αντισώματα αντι-TRPC6. Ομοίως, η θετική χρώση για TRPC1, TRPC3, TRPC4 και TRPC6 παρατηρήθηκε επίσης σε τμήματα του πνεύμονα adenocardionoma. Χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου, μπορούμε ποσοτικοποιηθεί η έκφραση του TRPCs σε φυσιολογικό πνεύμονα και καρκίνο ιστούς. Η mRNAs του TRPC1, 3, 4 και 6 ανιχνεύθηκαν στα δύο φυσιολογικού πνεύμονα και καρκίνο του πνεύμονα ιστούς. Το επίπεδο έκφρασης των TRPC1 και TRPC6 ήταν πολύ υψηλότερη από εκείνη των TRPC3 και TRPC4. Τα mRNAs για TRPC5 και TRPC7 ήταν μη ανιχνεύσιμα σε φυσιολογικούς και καρκινικούς ιστούς πνεύμονα (Εικ. 1Β-C). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν την ύπαρξη TRPC1, 3, 4, 6 ισομορφές σε NSCLC.

Α, παραδείγματα της ανθρώπινης φυσιολογικού πνεύμονα (

n

= 20) και τον ιστό του καρκίνου του πνεύμονα τμήματα (

n

= 28), συμπεριλαμβανομένου του αδενοκαρκινώματος (AC) και καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC) βάφτηκαν με αντι-TRPC1, αντι-TRPC3, αντι-TRPC4 και αντισώματα αντι-TRPC6 χρησιμοποιούν το σύστημα Vectastain ABC. Η θετική χρώση δείχθηκε ως καφέ χρώμα. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη. Β, το mRNA ανιχνεύθηκε με PCR πραγματικού χρόνου σε φυσιολογικούς ιστούς πνεύμονα χρησιμοποιώντας τους εκκινητές στον Πίνακα S1. Η GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος γονιδίου σπίτι διατήρησης για την ποσοτικοποίηση (

n

= 25 ασθενείς για TRPC1, 4, 5 και 6 ομάδες?

n

= 24 για TRPC3? Και

n =

9 για TRPC7). C, τα επίπεδα mRNA σε ιστούς του καρκίνου του πνεύμονα (AC:

n

= 9-15? SCC:

n

= 8-11)

Η

Συσχέτιση του. trpC Έκφραση για τον καρκίνο διαφοροποίηση βαθμό

Η διαφορά στα επίπεδα mRNA μεταξύ των βαθμών διαφοροποίησης του καρκίνου, τύπους κυττάρων, καπνιστής και μη καπνιστής εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Η έκφραση του TRPC1, 3, 4 και 6 κανάλια ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην φτωχά διαφοροποιημένο καρκίνο του πνεύμονα από ό, τι στο καλά μετρίως διαφοροποιημένα ομάδα (Εικ. 2Α, βλέπε επίσης Πίνακα S2). Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική διαφορά μεταξύ των καπνιστής και μη καπνιστής ομάδων (Εικ. 2Β). ανάλυση multivariance γραμμικής παλινδρόμησης έδειξε επίσης μια αρνητική συσχέτιση της έκφρασης του mRNA της TRPC1, TRPC3, TRPC4 και TRPC6 να πνεύμονα βαθμού διαφοροποίησης του καρκίνου με τυποποιημένη ακολουθία συντελεστή β της TRPC1 (-0.563) & gt? TRPC4 (-0.360) & gt? TRPC6 (0.271 ) και TRPC3 (-0.057), αντίστοιχα. Σταδιακή παλινδρόμησης έδειξε ότι TRPC1 ήταν μια σημαντική μεταβλητή (Ρ & lt? 0.01)., Αλλά η συσχέτιση της διαφοροποίησης του καρκίνου βαθμό με το φύλο, την ηλικία, το κάπνισμα, και τον τύπο των καρκινικών κυττάρων δεν ήταν σημαντική

Ένα, η έκφραση του mRNA της TRPCs σε ιστούς του καρκίνου του πνεύμονα με καλά μέτρια (βαθμός II (

n

= 17) και του βαθμού ΙΙΙ (

n

= 6)) ή κακή (βαθμός IV,

n

= 5) βαθμού διαφοροποίησης ανιχνεύθηκε με PCR πραγματικού χρόνου. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως γονιδιακού ελέγχου καθαριότητας. Β, η έκφραση του mRNA των TRPCs στους ιστούς του καρκίνου του πνεύμονα που λαμβάνεται από καπνιστής (20 τσιγάρα την ημέρα για περισσότερο από 10 χρόνια,

n

= 11) και μη καπνιστής (

n = 17

). C, παράδειγμα δύο μικροσυστοιχίες ιστού με φυσιολογικό πνεύμονα (Ν) και ο καρκίνος του πνεύμονα (C) ετικέτες χρωματίστηκαν με αντίσωμα αντι-TRPC1. Ο τύπος και η διαφοροποίηση των κυττάρων βαθμός κάθε τμήματος χαρακτηρίζονταν από HE-χρώση. Τα δύο παραδείγματα (11C και 9Γ) με καλά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα παρουσιάστηκαν στα ένθετα. Ο συσχετισμός της χρώσης ένταση σε άλλους παράγοντες δείχθηκε στον πίνακα και η σημασία αξιολογήθηκε με ανάλυση Ridit. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?. 0.001

Η

Επίσης, διερευνήθηκε η συσχέτιση του καρκίνου του πνεύμονα βαθμού διαφοροποίηση στα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης trpC χρησιμοποιώντας ημιποσοτική ανοσοχρώση. Δύο μικροσυστοιχίες ιστού με 20 φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων και 28 δείγματα NSCLC συμπεριλαμβανομένων 15 περιπτώσεις με αδενοκαρκίνωμα, 11 περιπτώσεις με καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων, και 2 περιπτώσεις με μικτές κυτταρικούς τύπους του αδενοχοληδωτό καρκινώματος κατασκευάστηκαν (Σχ. 2C). Ο τύπος κυττάρου καρκίνου του πνεύμονα επιβεβαιώθηκε με HE-χρώση. Η TRPC1, TRPC3, και TRPC6 στα γειτονικά τμήματα μικροσυστοιχιών ιστού έντονα χρωματίστηκαν με αντι-TRPC1, 3, και 6 αντισωμάτων με ένα ποσοστό θετικά χρωματισμένων τμημάτων καρκίνος του 71,4%, 75,0% και 71,4%, αντίστοιχα, ενώ ήπια χρώση ήταν δει για TRPC4 με ένα θετικό ποσοστό χρώση 32,1%. Για κανονική τομές πνεύμονα στις μικροσυστοιχίες, το ποσοστό θετικών χρώση για TRPC1, 3, 4 και 6 ήταν 70%, 70%, 45%, και 85%, αντίστοιχα. Η ανάλυση Ridit έδειξε ότι η ένταση χρώσης του TRPC1 συνδέθηκε με το βαθμό διαφοροποίησης (Σχ. 2C). Ωστόσο, η ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης multivariance δεν έδειξε σημαντική συσχέτιση των βαθμολογιών χρώση των πρωτεϊνών του trpC στον καρκίνο του πνεύμονα βαθμό διαφοροποίησης, τον κυτταρικό τύπο, το κάπνισμα, την ηλικία και το φύλο.

Προς τα πάνω ρύθμιση trpC έκφρασης με χρόνια θεραπεία με ATRA

TRPC1, 3, 4 και 6 ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα Α549, αλλά TRPC5 και TRPC7 ήταν μη ανιχνεύσιμα αν και οι ομάδες εναρκτήρα για TRPC5 και TRPC7 μπορούν να ενισχύσουν το mRNA που απομονώνεται από τα κύτταρα του εγκεφάλου ή HepG2 (Εικ. 3Α). Οι δύο ζώνες TRPC1 στο πήκτωμα ήταν α και β ισομορφές, και οι ζώνες για TRPC4 ήταν α, β, γ και δ ισομορφές, αντίστοιχα, όπως περιγράφεται στο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα [9]. Τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης για TRPC3, TRPC4 και TRPC6 αυξήθηκαν σημαντικά κατά τη χρόνια θεραπεία με 1 μΜ ATRA για 96 ώρες (Σχ. 3Β-C), ωστόσο, ο κανονισμός για την έκφραση TRPC1 δεν ήταν σημαντική. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν επίσης ότι η έκφραση ορισμένων ισομορφών trpC σχετίζεται με τη διαφοροποίηση των κυττάρων.

Α, Ο mRNAs του TRPC1, 3, 4 και 6 ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα Α549 με RT-PCR χρησιμοποιώντας τον εκκινητή ορίζεται στον πίνακα S1. Οι PCR ζώνες για TRPC5 και TRPC7 ήταν αρνητικά στα κύτταρα Α549, αλλά θετική στον ανθρώπινο εγκέφαλο ή HepG2. Β, το mRNA ανιχνεύθηκε με PCR πραγματικού χρόνου στα κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με all-

trans

ρετινοϊκό οξύ (ATRA, 1 μΜ) για 96 ώρες. Η β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένα γονίδιο οικοκυρική για σχετική ποσοτικοποίηση. Η 2

(- ΔΔCt) μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό. C, οι πρωτεΐνες trpC ποσοτικοποιήθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-TRPC1 (T1E3), αντι-TRPC3, αντι-TRPC4 (T45E3) και αντισώματα αντι-TRPC6. αντίσωμα αντι-β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για την σχετική πρωτεΐνη ποσοτικοποίησης (

n

= 3 ανεξάρτητα πειράματα και κάθε πείραμα με δείγματα εις τριπλούν).

Η

Επιδράσεις της ATRA σε Ca

2 + έκλυσης και Εισροή σε Α549 κύτταρα και trpC Κανάλι Δραστηριότητα

Α549 κύτταρα σε χρόνια θεραπεία με ATRA (1 μΜ) για 4 ημέρες με κάθε 24ωρο αναψυκτήριο του μέσου καλλιέργειας κυττάρων. Η δυναμική του ενδοκυττάριου Ca

2 + παρακολουθήθηκε από Fura-PE3 /AM. Θρυψίνη σε 0,2 nM προκάλεσε μια ισχυρή Ca

2+ απελευθέρωση στο Ca

2 + δωρεάν λύση, την οποία ακολούθησε μια δεύτερη Ca

2+ αιχμής σε κύτταρα Α549. Έγχυση με 1.5 mM Ca

2+ μετά το κατάστημα-εξάντληση με θρυψίνη αύξησε το Ca

2+ εισροή στις ΑΤΡΑ-κατεργασμένων κυττάρων (Σχ. 4Α-Β), γεγονός που υποδηλώνει την χρόνια θεραπεία με ATRA ενίσχυσε την Ca

2 + εισροή, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στο Ca

2+ σήμα απελευθέρωσης. Χρησιμοποιώντας εγγραφή έμπλαστρο ολόκληρων κυττάρων, η τρέχουσα κυττάρων Α549 δεν άλλαξε από οξεία έγχυση με ATRA (Σχ. 4C-E). Για τη διερεύνηση των δυνατοτήτων άμεσο αποτέλεσμα ATRA επί κανάλια trpC, τα κύτταρα ΗΕΚ-293 που εκφράζουν διεγέρσιμα TRPCs χρησιμοποιήθηκαν για την καταγραφή ολόκληρου κυττάρου patch. Τα ρεύματα του TRPC3, 6 και ρεύματα TRPC4 ενεργοποιήθηκαν με θρυψίνη ή Gd

3+ (100 μΜ), αντιστοίχως. Η σχέση ρεύματος-τάσης (

IV

) καμπύλες για αυτά τα ρεύματα ήταν παρόμοια με προηγούμενη έκθεσή μας [29]. ATRA σε 1 μΜ και 10 μΜ δεν είχε διεγερτική ή κατασταλτική δράση σε αυτά τα κανάλια, αλλά όλα αυτά τα ρεύματα είχαν μπλοκαριστεί από την trpC blocker 2-APB, γεγονός που υποδηλώνει ότι ATRA δεν είχε καμία οξεία άμεση επίδραση στο Ca

2+ τρέχουσα ή Ca

2 + εισροή μέσω των καναλιών trpC (Σχ. 4F-Ι). Η χρόνια αύξηση του Ca

εισροή 2+ στο ATRA επεξεργασμένα κύτταρα Α549 θα μπορούσε να συμβάλει αποκλειστικά και μόνο από το γονίδιο ρύθμιση προς τα πάνω trpC.

Α, κύτταρα Α549 φορτώθηκαν με 2 μΜ Fura-PE3 /AM και το Ca

2 + μετρήθηκε ως ο λόγος (F

340 /F

380) του Ca

2 + φθορισμού χρωστική ουσία.

απελευθέρωση Ca 2+ ήταν αναφέρθηκαν από θρυψίνη (0,2 nM) και Ca

εισροή 2+ εισήχθη από 1,5 mM Ca

2 + στο διάλυμα έγχυσης. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 1 μΜ ATRA επί 96 ώρες και τα κύτταρα ελέγχου επωάστηκαν με ίδιο όγκο οχήματος. Β, Mean ± s.e.m. δεδομένα για το Ca

2+ εισόδου μετά την εξάντληση κατάστημα από θρυψίνη όπως φαίνεται στο (Α).

n

= 21-32 για κάθε ομάδα, ***

P

& lt? 0.001. C, ρεύματα ολόκληρου κυττάρου του δείγματος στην τάση εντολή του ± 80 mV σε κύτταρα Α549 πριν και μετά την διαπότιση με ATRA (1 μΜ), θρυψίνη (0,2 ηΜ) και 2-ΑΡΒ (100 μΜ). D,

IV

καμπύλες για (C). Ε, Mean δεδομένα για την επίδραση της ATRA. F-Η, Επίδραση του ATRA επί πλήρων κυττάρων ρεύματα TRPC3, TRPC4 και TRPC6 στα κύτταρα ΗΕΚ293 που υπερεκφράζουν μεμονωμένων ισομορφών trpC. Ι, μέση ± s.e.m. στοιχεία μετρήσεων στους -80 mV, και

n =

4-6 για κάθε ομάδα.

Η

κυττάρων Διαφοροποίηση Εποπτεύεται από trpC Κανάλι Δραστηριότητα

Η διαφοροποίηση των Α549 πνεύμονα καρκινικά κύτταρα εκτιμήθηκε με χρώση Giemsa που μπορεί να απεικονίσει χρωμοσώματα. Κυττάρων με πυρηνική μίτωση εμφανίζεται σκούρο μπλε πυρήνα ή δύο μονά χρώση των πυρήνων (Εικ. 5). ATRA (1 μΜ) ανέστειλε σημαντικά την μίτωση των κυττάρων στις 24 ώρες και 48 ώρες, κυτταρική καλλιέργεια. Το ποσοστό των μιτωτικών κυττάρων έγινε λιγότερο στις 72 ώρες και κυτταρικής καλλιέργειας 96 ώρες και η διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων δεν παρουσίασε καμία σημασία (Σχ. 5Β). Η απώλεια στατιστική διαφορά μετά από καλλιέργεια κυττάρων 72 ωρών θα μπορούσατε να οφείλεται στην αναστολή επαφή κύτταρο που σημειώθηκαν στα συρρέοντα κύτταρα μετά από 3 έως 4 ημέρες καλλιέργειας κυττάρων. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε την επίδραση των αναστολέων διαύλου trpC σε μίτωση εντός 48 ωρών πολιτισμό. Η εξειδίκευση και η λειτουργία του αποκλεισμού αντισωμάτων trpC πόρου έχουν αποδειχθεί σε προηγούμενες μελέτες [9], [31], [32], [33]. Αναστολή της TRPC1, TRPC3 και TRPC6 κανάλια T1E3 και T367E3 αντισωμάτων ανέστειλε σημαντικά την μίτωση, ενώ οι επιδράσεις των T1E3 και T367E3 έδειξε λιγότερο αποτελεσματική μετά από θεραπεία με ATRA σε σύγκριση με τις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με το βρασμένο αντίσωμα ή την ομάδα χωρίς προσθήκη αντισώματος.

Α, Παράδειγμα Giemsa χρώση των κυττάρων Α549 και την αγωγή με ή χωρίς ATRA επί 0-96 ώρες. Τα μιτωτικά κύτταρα υποδεικνύεται από το βέλος. Β, Ποσοστό μιτωτικά κύτταρα στον έλεγχο και ATRA-αγωγή ομάδες (

n

= 32-40 μικροσκοπικά πεδία για κάθε ομάδα που περιέχει 6 δίσκων καλλιέργειας, ***

P

& lt? 0.001). C, Επίδραση των δεσμευτικών αντισωμάτων στην κυτταρική μίτωση trpC κανάλι. Το μέσο χωρίς αντίσωμα (No-Ab) και το βρασμένο αντίσωμα (βραστά Ab) ως έλεγχοι (

n

= 18 μικροσκοπικά πεδία από 6 φρεάτια καλλιέργειας για κάθε ομάδα, NS: μη σημαντική, *

P

& lt? 0,05 και **

P

& lt? 0,01). Οι δέλτα (Δ) μεταβολές του ATRA επαγόμενης αναστολής συγκρίθηκαν επίσης μεταξύ των βραστά Ab (Control) και ομάδες αποκλεισμού αγωγή αντισώματος.

Η

trpC Channel και Α549 κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Κυττάρων διαφοροποίησης και πολλαπλασιασμού είναι δύο στενά συνδεδεμένα κυτταρικές διεργασίες, επομένως παρατηρήσαμε επίσης επίδραση της δράσεως του διαύλου trpC επί του πολλαπλασιασμού Α549 κυττάρων. Ο αριθμός των κυττάρων αυξήθηκε κατά ~ 8-πτυχώσεις μετά κυτταρική καλλιέργεια 96 ωρών. ATRA (1 μΜ) ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μετά από 72 ώρες και κυτταρική καλλιέργεια 96 ωρών (Σχ. 6Α), γεγονός που υποδηλώνει την επίδραση του ATRA επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού είναι μια αργή διαδικασία έναρξης. Ωστόσο, η αντι-πολλαπλασιαστική δράση αναστέλλοντας τη δραστηριότητα του καναλιού trpC ήταν πολύ πιο γρήγορα και η σημαντική διαφορά επιτεύχθηκε μέσα σε 24 ώρες μετά την επώαση με 2-ΑΡΒ, ένα μη επιλεκτικό αποκλειστή διαύλου trpC. Το ΕΚ

50 για 2-APB ήταν 87,9 μΜ (Εικ. 6Β). Χρησιμοποιώντας τα αντισώματα αποκλεισμού T1E3 και T367E3 να εμποδίσει ειδικά TRPC1 και TRPC3 /6 σε κύτταρα Α549 ανέστειλε επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων χωρίς αγωγή ATRA, αλλά η ανασταλτική δράση ήταν πιο έντονη όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ ATRA επί 48 ώρες (Σχ . 6C), γεγονός που υποδηλώνει τη δραστηριότητα του καναλιού trpC μπορεί να αυξηθεί με ATRA. Για να καταδειχθεί περαιτέρω η εμπλοκή των καναλιών trpC στον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του πνεύμονα, τα κύτταρα Α549 επιμολύνονται με TRPC1, 3, 4, και 6 το πλασμίδιο cDNA. Το κυτταρικό πολλαπλασιασμό αυξήθηκε στα κύτταρα Α549 που υπερεκφράζουν TRPC1 και TRPC6, αλλά όχι σημαντική για τα κύτταρα που υπερεκφράζουν TRPC3 και TRPC4 (Εικ. 6D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα ρυθμίζεται από την δραστικότητα των διαύλων trpC.

Α, η χρονική πορεία για την επίδραση της ATRA επί του πολλαπλασιασμού Α549 κυττάρων. Β, κύτταρα Α549 επωάστηκαν με 2-ΑΡΒ σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 24 ώρες (

n

= 8 φρεάτια για κάθε ομάδες) και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με WST-1 κιτ προσδιορισμού κυτταρικού πολλαπλασιασμού. C, τα κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με ειδικές Ε3-στόχευσης trpC δεσμευτικά αντισώματα ή συνδυασμό με ATRA επί 48 ώρες (

n

= 6-7 για κάθε ομάδα? Σύγκριση με τον έλεγχο (

#)? * Ή

#

P

& lt? 0,05, ** ή

##

P

& lt? 0,01). D, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων Α549 αξιολογήθηκε με WST-1 μετά από επιμόλυνση με TRPC1, 3, 4, και 6 το πλασμίδιο cDNAs για 48 ώρες (

n

= 8 για κάθε ομάδα, **

P

& lt?. 0.01)

η

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι TRPC1, TRPC3, TRPC4 και TRPC6 υπάρχουν στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένου του αδενοκαρκινώματος, πλακώδες καρκίνωμα και το αδενοκαρκίνωμα που προέρχεται από κυτταρική σειρά Α549. Το επίπεδο έκφρασης των καναλιών trpC συσχετίζεται με το βαθμό διαφοροποίησης του καρκίνου του πνεύμονα. ATRA ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση του γονιδίου trpC σε κύτταρα Α549. Η αναστολή της δράσεως του διαύλου trpC δείχνει αντιπολλαπλασιαστική δράση. Αυτά τα ευρήματα είναι σημαντικά για την κατανόηση των ρόλων των καναλιών trpC στη διαφοροποίηση των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα και του πολλαπλασιασμού.

έχουν κανάλια trpC ανιχνευθεί σε πολλούς ιστούς [32], [34], [35], [36], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου ιστούς, όπως ο καρκίνος του μαστού [37], τον καρκίνο των ωοθηκών [9], [20], ηπάτωμα [12], του καρκίνου του προστάτη [13], καρκίνωμα βασικών κυττάρων [21], καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων [15], κακοήθη γλοιώματα [16] , γλοιοβλάστωμα [8], και γαστρικών όγκων [19]. Το επίπεδο έκφρασης του κάθε ισομορφής trpC σε διαφορετικό τύπο καρκινικών κυττάρων ή ιστών είναι μεταβλητές, γεγονός που υποδηλώνει τη συμβολή ή βιολογική σημασία της κάθε ισομορφής trpC σε διαφορετικό τύπο καρκίνου θα μπορούσε να είναι διαφορετική. Για παράδειγμα, η έκφραση του TRPC7 είναι αρνητικό σε Α549 και SKOV-3, αλλά θετική σε κύτταρα HepG2 σε αυτή τη μελέτη και τα διαφοροποιημένα κύτταρα νευροβλαστώματος [17]. Επιπλέον, οι εναλλακτικές ματισμένες παραλλαγές μπορεί επίσης να συμβάλει στην λειτουργικότητα των καναλιών trpC, όπως TRPC1 και TRPC4 ματισμένες ισομορφές στον καρκίνο των ωοθηκών SKOV3 κύτταρα [9]. Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης των καναλιών trpC μπορεί να εξαρτάται από την κατάσταση διαφοροποίησης των καρκινικών κυττάρων, επειδή βρήκαμε την έκφραση του mRNA του TRPC1, TRPC3, TRPC4 και TRPC6 στη χαμηλή διαφοροποίηση καρκίνος βαθμού πνεύμονα ήταν χαμηλότερη από ότι στο καλά διαφοροποιημένο καρκίνο , το οποίο είναι συνεπές με την παρατήρηση μας στον καρκίνο των ωοθηκών [9] και το χαμηλό επίπεδο έκφρασης των TRPC4 και TRPC6 σε ανώριμα βλαστικά κύτταρα [38]. Παρά το γεγονός ότι τα δεδομένα μας έδειξαν ότι τα επίπεδα του mRNA της TRPCs σε φυσιολογικό πνεύμονα ήταν υψηλότερα από ότι στον καρκίνο του πνεύμονα, είναι δύσκολο να γίνει η σύγκριση αυτή που οφείλονται στη διακύμανση τύπων κυττάρων, επειδή οι φυσιολογικά δείγματα πνεύμονα περιέχει πολύ περισσότερα μη επιθηλιακά κύτταρα από εκείνο στο τα δείγματα στερεού όγκου, όπως αγγειακά κύτταρα, κυψελιδικά μακροφάγα, ινοβλάστες, και τα κύτταρα του αίματος. Η ανοσοχρώση για τις μικροσυστοιχίες ιστού καρκίνου του πνεύμονα έδειξαν λιγότερο σημαντική, γεγονός που θα μπορούσε να οφείλεται στη χαμηλή ευαισθησία της μεθοδολογίας σε σύγκριση με την υψηλή ευαισθησία της PCR πραγματικού χρόνου.