Αφηρημένο

Οι αλλαγές των Εφεσ κινασών τυροσίνης είναι συχνές εκδηλώσεις σε ανθρώπινους καρκίνους. Οι γενετικές παραλλαγές του EPHB6 έχουν περιγραφεί αλλά η λειτουργική έκβαση αυτών των μεταβολών είναι άγνωστη. Η τρέχουσα μελέτη διεξήχθη για την διαλογή για την εμφάνιση και να προσδιορίσει λειτουργικές συνέπειες των μεταλλάξεων EPHB6 σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Εδώ, η αλληλουχία ολόκληρη την περιοχή κωδικοποίησης του EPHB6 σε 80 μη μικροκυτταρικό ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και 3 καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τρεις δυνητικά σχετικές μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε πρωτογενή δείγματα των ασθενών με NSCLC (3,8%) των ασθενών. Δύο σημειακές μεταλλάξεις οδήγησαν σε ασταθή πρωτεΐνες. Μια στο πλαίσιο μετάλλαξη διαγραφής (del915-917) έδειξαν αυξημένη μετανάστευση και την επιτάχυνση της επούλωσης των τραυμάτων

in vitro

. Επιπλέον, η μετάλλαξη del915-917 αύξησε την μεταστατική ικανότητα των κυττάρων NSCLC σε

in vivo

μοντέλο ποντικού. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι μεταλλάξεις EPHB6 προώθηση μετάσταση σε ένα υποσύνολο των ασθενών με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Bulk E, Yu J, Hascher Α, Koschmieder S, Wiewrodt R, Krug U, et al. (2012) Μεταλλάξεις του EPHB6 Υποδοχέα Κινάσης Τυροσίνης επάγουν μία Pro-Μεταστατικό φαινότυπο σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (12): e44591. doi: 10.1371 /journal.pone.0044591

Συντάκτης: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, το Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 8η Μαΐου του 2012? Αποδεκτές: 3 Αυγ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 4 Δεκεμβρίου 2012 |

Copyright: © 2012 Μαζική et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. NSCLC έρευνα στο εργαστήριό μας χρηματοδοτείται από την Deutsche Krebshilfe και το Wilhelm-Sander Stiftung. ΩΣ. χρηματοδοτήθηκε από DFG Schw 407 /9-3. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου σχετίζονται με τον καρκίνο με την πλειονότητα των περιπτώσεων που ανήκουν στην ομάδα των μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [1], [2]. Ανάπτυξη των μακρινών μεταστάσεων είναι η κύρια αιτία που σχετίζονται με NSCLC θανάτου. Οι κινάσες τυροσίνης υποδοχέα (RTKs) παίζουν σημαντικό ρόλο στη μεταστατική διαδικασία [3], [4]. Ένα από τα πιο γνωστά RTK που σχετίζεται με ένα φαινότυπο μετάσταση, είναι ο υποδοχέας επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) με τα μέλη της οικογένειας ERBB2 /Her2, ErbB3 και ErbB4 της. RTKs όπως η οικογένεια EGFR είναι επομένως ελκυστικοί στόχοι για βελτιωμένη προσεγγίσεις μοριακής θεραπείας σε καρκίνους [3], [5]. Μέχρι σήμερα, η υπο-οικογένεια του υποδοχέα (Εφ) Ephrin είναι η μεγαλύτερη υποοικογένεια των RTK που αποτελείται από 16 μέλη σε σπονδυλωτά, δηλαδή EPHA υποδοχείς 1-10 (EPHA1-A10) και EphB υποδοχείς 1-6 (EPHB1-Β6) [6], [ ,,,0],7]. υποδοχείς EphB αλληλεπιδρούν με την οικογένεια Ephrin προσδεμάτων. Κατά την αλληλεπίδραση με τους συνδέτες τους Ephrin, ΕΡΗ υποδοχείς ρυθμίζουν μια ποικιλία βιολογικών δραστηριοτήτων, συμπεριλαμβανομένης της αλληλεπίδρασης κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου μετανάστευση [8], [9]. Η απώλεια της EPHB6 κινάσης-νεκρή σχετίζεται με προχωρημένα στάδια όγκων και εξέλιξης του καρκίνου [10] – [16]. Αρκετά δημοσιεύματα αναφέρουν υψηλή έκφραση EPHB6 είναι ένα ευνοϊκό προγνωστικό δείκτη σε νευροβλάστωμα [10] – [12]. Επιπλέον, η έκφραση του mRNA του EPHB6 ήταν μειωμένη σε μεταστατικό μελάνωμα και διηθητικού καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές με μεταστατικό δυναμικό [14] – [16]. Λειτουργικά, EPHB6 καταστέλλει εισβολής, ο ρυθμός ανάπτυξης και σχηματισμού αποικιών αποτελεσματικότητα των καλλιεργημένων κυττάρων καρκίνου του μαστού [17] – [18]., Ρυθμίζει την κυτταρική προσκόλληση και επηρεάζει τη μετανάστευση [19]

Προηγουμένως, εντοπίσαμε αρκετές ανθρώπινη RTKs των οποίων επίπεδο έκφρασης συσχετίζεται με την ανάπτυξη της μετάστασης σε πρώιμο στάδιο της NSCLC [20]. Ενώ η υψηλή έκφραση του mRNA από διάφορα RTKs συνδέθηκε με μια αυξημένη συχνότητα της ανάπτυξης μετάστασης, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA υψηλά των δύο RTKs EPHB6 και DKFZ1 έδειξε μειωμένο κίνδυνο για μετάσταση [20]. Πρόσφατα, ταυτοποιήσαμε EPHB6 ως επιγενετικώς σιγήσει καταστολέα μετάστασης σε NSCLC, και έκφραση EPHB6 εμπόδισε σχηματισμού μετάστασης σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος μετάσταση [21].

Εδώ, εξετάζεται η μεταβολή EPHB6 με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA, και που χαρακτηρίζεται από το λειτουργικές συνέπειες των μεταλλάξεων EPHB6

in vivo

και

in vitro

σε σχέση με το δυναμικό ρόλο τους στον NSCLC μετάσταση.

Α) οι λειτουργικές περιοχές του γονιδίου EPHB6 παρουσιάζεται σε σχέση να εξώνια τους και να εντοπιστεί μεταλλάξεις για EPHB6. Η περιγραφή των μεταλλάξεων αντιστοιχούν σε εντοπισμό τους στην αλληλουχία της πρωτεΐνης. Η R52C μεταλλάξεις, Q498H, και DPG915-917del εντοπίστηκαν σε δείγματα ασθενών με NSCLC στην παρούσα μελέτη. Β) ηλεκτροφόρημα της EPHB6-άγριου τύπου αλληλουχία και την μεταλλαγμένη διαγραφής για EPHB6. Γ) Τα επίπεδα έκφρασης του EPHB6-μεταλλακτών σε επιμολυσμένα κύτταρα. Μαζική επιμολυσμένα κύτταρα GFP διαλογή και επεκτάθηκαν σε μέσο επιλογής. Τα επίπεδα έκφρασης εμφανίζονται για μαζικές καλλιέργειες με & gt? 90% την έκφραση GFP. Οι διαφορές της ανάλυσης έκφρασης μεταξύ των επιπέδων πρωτεΐνης και τα επίπεδα mRNA απεικονίζεται. Για την ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου, η μέση και τυπική απόκλιση τριών ανεξάρτητων πειραμάτων φαίνονται. Η Western Blot παρουσιάζει ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Οι κυτταρικές σειρές NSCLC που εμπλέκονται στην παρούσα μελέτη έχουν περιγραφεί στο παρελθόν [21]. Εν συντομία, κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα Α549 καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C, υψηλή υγρασία και 5% CO

2 σε DMEM (Dulbeccos μέσο Eagle τροποποιημένο, Invitrogen, Carlsbad, CA). Το μέσο συμπληρώθηκε με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) και 1% στρεπτομυκίνη και πενικιλίνη. HTB56 και HTB58 κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C, υψηλή υγρασία, και 5% CO

2 σε ΜΕΜ (Τροποποιημένο μέσο Eagle, Invitrogen, Carlsbad. CA). Το μέσο συμπληρώθηκε με 10% FCS, 1% στρεπτομυκίνη και πενικιλλίνη, 1% γλουταμίνη, 1% πυροσταφυλικό νάτριο, και 1% μη απαραίτητα αμινοξέα acid.Cell ταυτότητα γραμμή επιβεβαιώθηκε με STR-γονότυπου.

Η

ασθενή δείγματα

Πρωτοβάθμια δείγματα όγκου και του όγκου χωρίς ιστούς των πνευμόνων ελήφθησαν κατά το χρόνο της αρχικής χειρουργικής επέμβασης από 80 ασθενείς με ιστολογία-αποδεδειγμένη NSCLC σε ένα πανεπιστημιακό νοσοκομείο στη Γερμανία. Τα δείγματα αμέσως σοκ κατεψυγμένα και αποθηκεύονται σε υγρό άζωτο. Τα δείγματα όγκων ελέγχθηκαν για το ποσοστό των κυττάρων του όγκου με ιστολογία, και μόνο βιοψίες όγκου με τουλάχιστον το 70% των καρκινικών κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν για επόμενες αναλύσεις. Ομοίως, τα δείγματα ελέγχου του καρκίνου χωρίς επιβεβαιώθηκαν και από την ιστολογική εξέταση. Όλοι οι ασθενείς παρέχεται γραπτή συγκατάθεση και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Münster.

Α) Πρωτεΐνη έκφραση σταθερά επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών Α549 που εκφράζουν άγριου τύπου EPHB6 ή το μεταλλαγμένο διαγραφή EPHB6. Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με χρήση EGFP -pcDNA3.1

+ φορέα για την ταυτοποίηση των επιλεγμένων κλώνων. Πολλαπλές κλώνοι ομαδοποιήθηκαν και περαιτέρω επιλέγονται ως καλλιέργειες χύμα. Β) δοκιμασίες μετανάστευσης Transwell διεξήχθησαν με κύτταρα ελέγχου κενού φορέα, EPHB6 μεταλλαγμένο και τα κύτταρα άγριου τύπου EPHB6. Πέντε διαφορετικά πειράματα εις τριπλούν αναλύθηκαν. *: Σημαντική (ρ & lt? 0,05) από τις διαφορές (ΕΙΤΕ ANOVA ή Τ-test) Η παρεχόμενη τιμή-ρ μεταξύ των τριών διαφορετικών κυτταρικών σειρών αναλύθηκαν στατιστικά από όλα τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν χρησιμοποιώντας το OneWay ANOVA-test. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων t-test κατά ζεύγη σε μια σημαντική τιμή ρ για τα κύτταρα ελέγχου έναντι EPHB6-wt κυττάρων (ρ & lt? 0.015) και μεταξύ των EPHB6-wt κυττάρων και των EPHB6-mut κυττάρων (ρ & lt? 0.005) . Γ)

In vitro

δοκιμασία μηδέν επούλωση των πληγών. Τα κύτταρα γδαρμένο από ένα ρύγχος πιπέτας 10 μl. Οι περιοχές μηδέν καταγράφηκαν κατά τη διάρκεια μιας periode 17 ωρών. Δεικνύονται μέσα από τρία διαφορετικά πειράματα, που υπολογίζεται ως ποσοστό από το ένα αρχικό σημείο για όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές. Η ANOVA-test (ρ & lt? 0.002) έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των τριών κυτταρικών γραμμών. Δ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες από τις δοκιμασίες μηδέν στην αρχή και το τέλος των πειραμάτων.

Η

Α) Αριθμός των πνευμονικών μεταστάσεων σε αξιολογήσιμους NOD /SCID ποντίκια τέσσερις εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση, το καθένα με 3 × 10

5 σταθερώς επιμολυσμένα κύτταρα Α549 που εκφράζουν EPHB6-wt κυττάρων (n = 9), EPHB6-del915-917 (n = 9) ή κενό φορέα ελέγχου (n = 2). Κουκκίδες αντιπροσωπεύουν μεμονωμένα ποντίκια και οριζόντιες γραμμές τη μέση τιμή των μεταστάσεων. Β) Εικόνες από εκπρόσωπο σύνολό τους πνεύμονες των ποντικών NOD /SCID, μεταμοσχεύθηκαν με κύτταρα Α549 που εκφράζουν EPHB6-κβ, EPHB6-del915-917, ή κενό φορέα ελέγχου. Οι μεταστάσεις στους πνεύμονες χαρακτηρίζεται από μαύρα βέλη. Γ) Οι εικόνες από τα τμήματα του πνεύμονα του NOD ποντίκια /SCID, χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη. Οι μεταστάσεις χαρακτηρίζονται από μαύρα βέλη. Τρία αντιπροσωπευτικά παραδείγματα παρουσιάζονται το καθένα για τα ποντίκια μεταμοσχεύθηκαν με κύτταρα Α549 που εκφράζουν EPHB6-κβ ή EPHB6-del915-917.

Η

Α) Η πολλαπλασιαστική δράση των κενών έλεγχο φορέα, EPHB6 άγριου τύπου και μεταλλαγμένα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα χρωματομετρική δοκιμασία ΜΤΤ μετά από 72 ώρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο +/- τυπική απόκλιση τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Διαφορές στατιστικά δεν ήταν σημαντικές (ANOVA). Β) Μέγεθος κυψέλης από μεμονωμένα κύτταρα (n = 20) που αναπτύσσονται σε πλαστικά πιάτα αναλύθηκε με μικροσκοπία ζωντανό βίντεο και καταγράφεται. κύτταρα μεταλλαγμένη EPHB6 έδειξαν σημαντικά μειωμένο μέγεθος των κυττάρων σε σύγκριση με EPHB6 άγριου τύπου και με κύτταρα μάρτυρες (ρ & lt? 0,05, t-test).

Η

EPHB6 Sequencing

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας DNazol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν με λογισμικό Primer3 (ΔΙΑΝΟΜΕΑΣ) για την ενίσχυση της πολυμεράσης-αλυσίδα-αντίδραση (PCR) θραύσματα μεγέθους μεταξύ 400 και 800 bps και καλύπτουν την πλήρη κωδικοποιητική περιοχή του γονιδίου EPHB6 (οι λεπτομέρειες του PCR παρέχονται στο συμπληρωματικό υλικό). Όλα Όλα τα θραύσματα ενισχύθηκαν με PCR με Taq DNA πολυμεράση (συνολικός όγκος αντίδρασης 20 μλ) συμπληρωμένο με ένα σπιτικό PCR ενισχυτή όπως περιγράφεται [22]. Και οι δύο κλώνοι υποβλήθηκαν σε αλληλούχιση χρησιμοποιώντας εκκινητές PCR. Πρόσθετες εσωτερικοί εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για PCR προϊόντα περισσότερο από 600 bp για την εξασφάλιση διπλής έλικας πληροφορίες αλληλουχίας για ολόκληρο το θραύσμα PCR. Αλληλούχιση διεξήχθη επί ABI3730xl αυτοματοποιημένο sequencers DNA με το BigDye Terminator V3.1 Kit Cycle Sequencing (Applied Biosystems). Η αλληλουχία κωδικοποιητική περιοχή του

EPHB6

συγκρίθηκε με την αλληλουχία αναφοράς (GenBank αριθμός πρόσβασης Νο NM_004445).

Τοποκατευθυνόμενη Μεταλλαξογένεση

Η περιοχή κωδικοποίησης του cDNA ανθρώπινης EPHB6 (βάση 833-3853 NCBI Accession Νο NM_004445) κλωνοποιήθηκε στον pcDNA4 να /HisA φορέα έκφρασης /myc (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Μεταλλάξεις στην ακολουθία κωδικοποίησης του EPHB6 εισήχθησαν με την τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση κιτ QuickChange XL (Stratagene, La Jolla, CA, USA) χρησιμοποιώντας εκκινητές με τις αλληλουχίες: προς τα εμπρός (5′-AGGCTGGCGGGGAAAGGCCTTCCCAGG), αντίστροφη (5′- CCTGGGAAGGCCTTTCCCCGCCAGCCT) και χρησιμοποιώντας φορέα pcDNA4-EPHB6 ως μήτρα. Στη συνέχεια, η σωστή αλληλουχία επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας. Εκκινητές για περαιτέρω μεταλλάξεις θα πρέπει να παρέχονται κατόπιν αιτήσεως.

κατασκευάσματα έκφρασης και διαμόλυνση

Ανθρώπινα κύτταρα Α549 ήταν συν-επιμολύνονται χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο επιμόλυνσης Nanofectin (PAA, Αυστρία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η συν-επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε με είτε pcDNA4 (άδειο τον φορέα ελέγχου), κατασκεύασμα έκφρασης EPHB6 άγριου τύπου (pcDNA4-EPHB6-wt) ή EPHB6 κατασκευάσματα μεταλλαγμένο έκφραση, το καθένα με κατασκεύασμα φορέα EGFP έκφραση (pcDNA3.1-GFP, εκφράζοντας ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη EGFP) για την επιλογή και την ταυτοποίηση των επιμολυσμένων κυττάρων. Τα επιμολυσμένα κύτταρα επελέγησαν με 700 μg /ml G418 (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) και 400 μg /ml ζεοκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Μαζική καλλιέργειες ήταν FACS ταξινομημένο για GFP-έκφραση και να επεκταθούν. Εκτός από τις μαζικές καλλιέργειες, θα συγκεντρώνονται επίσης πολλαπλές υψηλής GFP που εκφράζουν τους κλώνους να αποκτήσει επαρκή επίπεδα έκφρασης. Η έκφραση επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western και σε πραγματικό χρόνο RT-PCR.

Απομόνωση RNA και αντίστροφη μεταγραφή

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Μια συνολική ποσότητα 1 μg RNA από κάθε δείγμα μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας τυχαία εναύσματα και MMLV αντίστροφης μεταγραφάσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Promega, Madison, Wisconsin, USA).

Γονιδιακής Έκφρασης Αναλύσεις από την Quantitative Σε πραγματικό χρόνου RT-PCR

Για ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR, cDNA ενισχύθηκε σε ΑΒΙ Prism 7700 ανιχνευτή αλληλουχίας (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). EPHB6 ανιχνεύθηκε με τους ακόλουθους εκκινητές και ανιχνευτή: προς τα εμπρός (5′-TGGACTATCAGCTCCGCTACTATG), αντίστροφη (5′- GTGGCAGTGTTGGTCTCGC) και ανιχνευτή (5′-φώνων CCAGGCAGAAGACGAATCCCACTCCTT-TAMRA). Οι σχετικές ποσότητες της γονιδιακής έκφρασης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την έκφραση του GAPDH ως εσωτερικό πρότυπο

Ανάλυση Western Blot

Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντισώματα:. Αντι-ανθρώπινο EPHB6 (1 μg /ml, Abnova Corporation, Neihu, Taipei, Ταϊβάν, ή ABGENT, San Diego, CA, USA) και β-ακτίνης (40 ng /ml, Sigma, USA) ως πρωτεύοντα αντισώματα, κατσίκας αντι-ποντικού και αίγας αντι-κουνελιού (και τα δύο από Dianova, Hamburg, Germany) ως δευτερεύοντα αντισώματα. Η ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη όπως περιγράφεται [23]. Η

Δείτε Μπλε Plus2

δείκτη πρωτεΐνης (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης μεγέθους.

Boyden Επιμελητηρίου Δοκιμασία

Ένα σύνολο από 5 × 10

5 Α549 κύτταρα ( σε 100 μΙ ϋΜΕΜ με 5% FCS) σπάρθηκαν στο άνω μέρος ενός θαλάμου TRANSWELL® (παρεμβλημάτων Transwell φίλτρο διαμέτρου 6,5 mm, με μέγεθος πόρων 5 μm, Corning Inc., Corning, ΝΥ), το οποίο ήταν 30 λεπτά προεπικαλυμμένα με 50 μg ινονεκτίνη. Στο κάτω μέρος του θαλάμου 600 μΙ μέσου ϋΜΕΜ με 20% FCS (μία διαβάθμιση ορός χρησιμοποιήθηκε ως χημειοπροσελκυστικό) προστέθηκε και η δοκιμασία πραγματοποιήθηκε για 16 ώρες στους 37 ° C και 5% CO

2 πριν μεταναστεύσει κύτταρα ήταν αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Ολες οι δοκιμασίες επαναλήφθηκαν τέσσερις φορές και ανεξάρτητα εκτελούνται εις τριπλούν

In vitro Wound Healing -. Scratch Δοκιμασία

Α549 κύτταρα σπάρθηκαν σε φιάλη καλλιέργειας ιστού των 25-mL σε πυκνότητα 350.000 κύτταρα ανά φιάλη και καλλιεργήθηκαν επί μία περίοδο τριών ημερών. μονοστοιβάδες κυττάρων σε συρροή στη συνέχεια γδαρμένο χρησιμοποιώντας μια άκρη 10 μί-πιπέτα. Το μέσο αλλάχθηκε και η επούλωση των πληγών καταχωρήθηκε από ζωντανή μικροσκόπιο βίντεο. Εικόνες συνελήφθησαν σε διαστήματα 10 × min για 17 ώρες χρησιμοποιώντας ένα ZEISS (φωτός) μικροσκόπιο Axiovert 40C, που συνδέεται με μια CCD κάμερα (Hamamatsu). απόκτησης εικόνας ελεγχόταν από Hipic 32 (Υψηλής Απόδοσης Σύστημα Ελέγχου εικόνα) ή wasabi (Hamamatsu Λογισμικό Imaging). Η ανάλυση της επούλωσης του τραύματος διεξήχθη χρησιμοποιώντας το Java-based ImageJ πρόγραμμα επεξεργασίας εικόνας. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν ανεξάρτητα για τρεις φορές.

Ανάλυση του Κυττάρου Μέγεθος

Α549 κύτταρα που εκφράζουν EPHB6-άγριου τύπου, το EPHB6-μεταλλαγμένο ή χαμηλή EPHB6 (έλεγχος /κενός φορέας μεταδιηγερμένα) σπάρθηκαν σε φιάλες κυτταρικής καλλιέργειας που προεπικαλύφθηκαν με μήτρα κολλαγόνου. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για πέντε ώρες και στη συνέχεια παρακολουθείται χρησιμοποιώντας ένα ZEISS (φως) μικροσκόπιο Axiovert 40C, που συνδέεται με μια CCD βιντεοκάμερα (Hamamatsu). απόκτησης εικόνας ελεγχόταν από Hipic 32 (Υψηλής Απόδοσης Σύστημα Ελέγχου εικόνα) ή wasabi (Hamamatsu Λογισμικό Imaging). Η ανάλυση του μεγέθους των κυττάρων μεμονωμένων κυττάρων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24], χρησιμοποιώντας το λογισμικό απεικόνισης Amira και το πρόγραμμα επεξεργασίας εικόνας που βασίζονται σε Java ImageJ. Το λογισμικό αναλύει τις παραμέτρους των κυτταρικών λειτουργιών από μεμονωμένα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του προσδιορισμού της περιοχής κυττάρων (σε μm

2).

Πειράματα μετάσταση in vivo

Για όλα τα πειράματα του ποντικιού, χρησιμοποιήσαμε ηλικίας 8 έως 10 εβδομάδες NOD.CB17-Prkdc & lt? scid & gt? /J (NOD /SCID) λαμβάνονται από τα Charles River. Για να αναλυθεί ανάπτυξη μετάστασης κατά την ενδοφλέβια ένεση των κυττάρων του όγκου, 22 NOD ποντικοί /SCID ακτινοβολήθηκαν με μία μοναδική δόση 3,5 Gy από κοβάλτιο-60 μονάδα 1 ημέρα πριν την μεταμόσχευση. Ένα σύνολο 3 × 10

5 σταθερώς επιμολυσμένα κύτταρα (διαλυμένο σε 200 μΐ PBS) εγχύθηκαν ενδοφλεβίως εντός της φλέβας της ουράς. Τέσσερις εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση, οι ποντικοί θανατώθηκαν και η ανάπτυξη της μετάστασης πνεύμονα αναλύθηκε. Σε δύο περιπτώσεις, τα ποντίκια πέθαναν μέσα σε μία εβδομάδα μετά τη μεταμόσχευση: ένα ποντίκι μεταμοσχεύτηκαν EPHB6-wt κυττάρων που εκφράζουν Α549 και ένα ποντίκι μεταμοσχεύτηκαν EPHB6-μεταλλαγμένο κύτταρα που εκφράζουν Α549. ανάπτυξη Μετάσταση αξιολογήθηκε με απαρίθμηση επιμέρους μεταστατικών οζιδίων. Για ιστολογικές αναλύσεις, οι πνεύμονες μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη. Σε όλα τα πειράματα, ομάδες θεραπείας τυχαιοποιήθηκαν για την πρόληψη επιπτώσεων κλουβί.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα πειραματικά δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος συν την τυπική απόκλιση, αν δεν υποδεικνύεται διαφορετικά. Οι μέσες τιμές των τριών ομάδων συγκρίθηκαν με μονόδρομη ΑΝΟνΑ των ανεπεξέργαστων δεδομένων ή σε περίπτωση δύο ομάδων από το Students t-test. Ένα διπλής όψης σ ​​& lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

EPHB6 Παραλλαγές σε NSCLC

Όλα τα εξώνια ολόκληρης της περιοχής κωδικοποίησης της EPHB6 σε ακολουθία με αλληλουχίας Sanger βασίζεται στην μια ομάδα ασθενών με NSCLC. Μεταξύ 80 ασθενών με NSCLC, τρία (3.8%) περιπτώσεις βρέθηκαν να έχουν μη συνώνυμες μεταλλάξεις EPHB6 (R52C, η = 1? Q498H, η = 1? Και DPG915-917del, n = 1). Δεν μεταλλάξεις EPHB6 εντοπίστηκαν στο Α549 κυτταρικές σειρές, HTB56 ή HTB58. Μια ανάλυση βιοπληροφορικής SIFT και Polyphen αναφέρεται το σημείο μεταλλάξεις R52C και Q498H ως πιθανώς επιζήμια (Πίνακας 1). Μια αναζήτηση της βάσης δεδομένων των πρόσφατων προσπαθειών αλληλουχίας μεγάλης κλίμακας αποκάλυψε επιπλέον μεταλλάξεις που μέχρι στιγμής δεν έχουν ακόμη διερευνηθεί (Εικ. 1Α).

μεταλλάξεις EPHB6 εντοπίστηκαν σε διάφορα εξώνια και λειτουργικές περιοχές του γονιδίου. Περιέργως, ο del915-917 διαγραφής (Εικ. 1Β) βρισκόταν δίπλα σε δύο μεταλλάξεις (D915G και G914V) προσδιόρισε πρόσφατα σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου [25], [26]. Το σύμπλεγμα των μεταλλάξεων σε αυτή την περιοχή μεταξύ του καταλυτικού τυροσινικής κινάσης (Tyrkc) τομέα και στείρα άλφα μοτίβο (SAM) προτείνει περαιτέρω λειτουργική σημασία. Αυτή η μετάλλαξη ταυτοποιήθηκε σε έναν ασθενή με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Η μετάλλαξη ήταν ετερόζυγο και ανιχνεύθηκε επίσης σε αντίστοιχο φυσιολογικό ιστό πνεύμονα υποδεικνύοντας μία μετάλλαξη βλαστικής σειράς. Οι άλλες μεταλλάξεις μόνο ανιχνεύθηκαν στον όγκο και όχι σε υγιή ιστό συμφωνημένα inficating μια σωματική μετάλλαξη.

Για λειτουργικές δοκιμασίες, EPHB6-άγριου τύπου και διάφοροι μεταλλάκτες (R52C, Q498H, del915-917 και η μετάλλαξη P728S περιγράφηκε προηγουμένως στον καρκίνο των ωοθηκών [LIT]) ήταν σταθερώς συν-επιμολυσμένα με ένα EGFP-πλασμιδίων που εκφράζουν στο Α549 γραμμή NSCLC-κυττάρου που εκφράζει πολύ χαμηλά επίπεδα EPHB6. EGFP θετικοί κλώνοι συλλέχθηκαν και η ανάλυση της έκφρασης εκτελέστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα EPHB6 σε μονά κλώνους και για μαζικές καλλιέργειες (Εικ. 2Α). Παρά την επιτυχή επιμόλυνση με αυξημένα επίπεδα mRNA, πρωτεΐνη έκφραση των περισσότερων από τις μεταλλάξεις EPHB6 δεν αύξησε πέρα ​​από τα επίπεδα που παρατηρήθηκαν σε άδειο φορέα επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 1 C). Μόνο για το del915-917 μετάλλαξη, η έκφραση της πρωτεΐνης σε επίπεδα παρόμοια με EPHB6 άγριου τύπου επιτεύχθηκε (Εικ. 2Α). Λόγω της ανεπάρκειας των κατάλληλων πρωτεϊνών έκφραση των R52C και G498H μεταλλάξεις και το περιγράφηκε προηγουμένως P728S μεταλλαγμένο, έχουμε λειτουργικά επικεντρώθηκε στην μετάλλαξη del915-917 σε NSCLC σε επόμενα πειράματα.

Επιδράσεις της EPHB6 Μεταλλάξεις για τη Μετανάστευση και την Μετάσταση του NSCLC κύτταρα

Όπως έχει ήδη αναφερθεί, EPHB6 άγριου τύπου ανέστειλε τη μετανάστευση των σταθερά επιμολυσμένων κυττάρων Α549 σε θάλαμο φρεατίων (Boyden θάλαμο) δοκιμασία. Αντιθέτως, κύτταρα επιμολυσμένα με το del915-917 μεταλλαγμένο EPHB6 μετανάστευσε σημαντικά ταχύτερη σε αυτή τη δοκιμασία (Εικ. 2Β). Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς μηδέν με επαναλαμβανόμενες μικροσκοπία βίντεο για να ακολουθήσει το κλείσιμο μηδέν πάροδο του χρόνου. Άγριου τύπου EPHB6 ανέστειλε

in vitro

επούλωσης τραύματος σε σύγκριση με τον κενό φορέα, ενώ τα κύτταρα μεταλλαγμένο EPHB6 κλείσει τη θέση πολύ πιο γρήγορα από ό, τι άγριου τύπου (τρία ανεξάρτητα πειράματα, ρ & lt? 0.002, ANOVA? Ρ & lt? 0,0004, t-test ) (Σχ. 2C, D). Φάνηκε ότι το μεταλλαγμένο EPHB6 δεν απλά αναστέλλουν τη δράση άγριου τύπου EPHB6, αλλά επιταχύνθηκε το κλείσιμο της πληγής σε σύγκριση με άδειο φορέα και άγριου τύπου. Μετά από οκτώ ώρες προσκόλληση, η ανοικτή περιοχή των EPHB6 μεταλλαγμένων κυττάρων αρχίζει να μειώνεται δύο φορές (3%), πιο γρήγορα, όπως θα μπορούσε να αναγνωριστεί για τα κύτταρα άγριου τύπου EPHB6 (1,6%). Ακόμη και τα κύτταρα ελέγχου παρουσίασαν μικρότερη επιτάχυνση του κλεισίματος του τραύματος (2%) σε αυτό το χρονικό σημείο.

Για να αναλυθεί η

in vivo

αποτελέσματα των μεταλλάξεων EPHB6 στην μεταστατική ικανότητα των κυττάρων NSCLC, εκτελέσαμε

in vivo

δοκιμασίες μετάσταση. NOD ποντίκια /SCID εγχύθηκαν ενδοφλέβια με EPHB6-wt κυττάρων (η = 10), EPHB6-del915-917 κύτταρα (n = 10) και κενά κύτταρα ελέγχου φορέα (n = 2). Τέσσερις εβδομάδες μετά την μεταμόσχευση τα ποντίκια θανατώθηκαν και αναλύθηκαν. Ένα ποντίκι από κάθε ομάδα ποντικών μεταμοσχευμένων με κύτταρα EPHB6-wt και EPHB6-mut εκφράζουν πέθαναν μέσα σε μία εβδομάδα μετά τη μεταμόσχευση. Ποντίκια που ενέθηκαν με κύτταρα που υπερεκφράζουν EPHB6 άγριου τύπου έδειξε χαμηλότερους αριθμούς των πνευμονικών μεταστάσεων σε σύγκριση με τα ποντίκια που ενέθηκαν με είτε κενές κύτταρα ελέγχου φορέα ή EPHB6-μεταλλαγμένα κύτταρα (Εικ. 3): ένα ποντίκι βρέθηκε χωρίς μετάσταση, 2 ποντίκια με κάθε 1 ή 3 μετάσταση και ένα ποντίκι με κάθε 4, 5 ή 8 μετάσταση. Ένα ποντικού που μεταμοσχεύονται με τα κύτταρα άγριου τύπου EPHB6 βρέθηκε με έναν υψηλό αριθμό μετάστασης πνεύμονα. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε όλα τα ποντίκια που ενέθηκαν με μετάσταση κυττάρων EPHB6 μεταλλαγμένο πνεύμονα ήταν ανιχνεύσιμα (Εικόνα 3? Ρ. = 0,011, δοκιμή t των δεδομένων από τα ποντίκια μεταμοσχεύθηκαν με EPHB6-wt σε σύγκριση με EPHB6-mut κύτταρα). Ένα

in vitro

δοκιμασία πολλαπλασιασμού μετά από 72 ώρες (Σχ. 4Α) έδειξαν ότι EPHB6 μεταλλαγμένα κύτταρα δεν διέφεραν από EPHB6 άγριου τύπου κύτταρα που εκφράζουν την άποψη της πολλαπλασιαστικής δραστηριότητας. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε δοκιμασίες πολλαπλασιασμού αναλύθηκαν μετά από 48 ώρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα πειράματα μάλλον πρότειναν ότι η αυξημένη μεταστατική δραστηριότητα

in vivo

συνδέθηκε με την αλλοίωση των εγγενών μεταναστευτικών ιδιοτήτων. έκφραση υποδοχέα EPHB6 άγριου τύπου δεν μεταβλήθηκε σημαντικά το σχήμα των κυττάρων (αν και η διακύμανση του μεγέθους σχήματος αυξήθηκε), ενώ το μέγεθος των κυττάρων EPHB6 μεταλλαγμένου που μεγάλωσε σε τακτικές πλαστικά πιάτα μειώθηκε σημαντικά (Σχήμα 4Β? ρ. & lt? 0,05, t-test του δεδομένα από 20 κύτταρα των κυττάρων EPHB6-κβ και EPHB6-mut εκφράζοντας). Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, η χημειοταξία των κυττάρων EPHB6 σε πλαστικά πιάτα φάνηκε να μειώνεται, πιθανότατα λόγω της μειωμένης ιδιότητες πρόσφυσης. Αλλά οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντική (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται)

Συζήτηση

εφρίνης -. Αλληλεπιδράσεις υποδοχέα Εφεσ συχνά απελευθερωθεί στον καρκίνο (αναφοράς). Στην τρέχουσα μελέτη προσδιορίσαμε μεταλλάξεις EPHB6 ως προ-μεταστατικό χαρακτηριστικό σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Μία μετάλλαξη, del915-917, ήταν επίσης παρούσα σε συμφωνημένα φυσιολογικό ιστό, υποδηλώνοντας έντονα ένα βλαστικής σειράς μεταβολή. Βλαστικής σειράς αλλοιώσεις έχουν περιγραφεί προηγουμένως για EPHB6 στην οικογενή καρκίνο του παχέος εντέρου Μέχρι σήμερα, οι λειτουργικές συνέπειες αυτών των γενετικών αλλοιώσεων σε κυτταρικό επίπεδο είναι άγνωστες [25].

Μεταβολές των υποδοχέων Eph συμβαίνουν συχνά στον καρκίνο του πνεύμονα. Μία μελέτη μεγάλης κλίμακας προσδιορισμό της αλληλουχίας που βρέθηκαν μεταλλάξεις σε 10 από τα 13 γονίδια υποδοχέων Eph σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα [27]. Λόγω της πληθώρας των γεγονότων σηματοδότησης που σχετίζονται υποδοχέα Eph και την πολύπλοκη δικτύωση των υποδοχέων, το λειτουργικό αποτέλεσμα των εκτροπών υποδοχέα Eph παραμένουν ασαφείς [28]. Για τις περισσότερες από τις μεταβολές υποδοχέα Eph έχουν αναγνωριστεί μέχρι σήμερα, λειτουργικές συνέπειες δεν έχουν μελετηθεί.

Αρκετές σωματικές μεταλλάξεις του γονιδίου EPHB6 έχουν προηγουμένως ταυτοποιηθεί στον καρκίνο του πνεύμονα [27], ορθοκολικό καρκίνο [25], [26 ], τον καρκίνο των ωοθηκών [29] και του γλοιώματος [26].

Σε αυτή τη μελέτη, η διαλογή των 80 δειγμάτων ασθενών NSCLC και 3 κυτταρικές σειρές NSCLC προσδιορίζονται 3 προηγουμένως άγνωστων μεταλλάξεων για το γονίδιο EPHB6. Ένα από αυτό το μεταλλάξεων, del915-917, έγκειται στο πεδίο μεταξύ της κινάσης της τυροσίνης και της άλφα μοτίβου (SAM) περιοχή στείρα, όπου 2 σωματικές μεταλλάξεις πρόσφατα εντοπίστηκαν σε καρκίνο του παχέος εντέρου [25], [26]. Η λειτουργία αυτής της περιοχής προτείνεται να σχετίζονται με τον καρκίνο, και τα ευρήματά μας σε αυτό το έργο υποστηρίζουν την πρόταση αυτή. Η

in vivo

πειράματα δείχνουν σαφώς ότι η έκφραση του μεταλλαγμένου EPHB6 ενισχυμένη μετάσταση. Επιπλέον EPHB6-μεταλλαγμένα κύτταρα που εκφράζουν έδειξε μια τριπλή αυξημένη μετανάστευση μεταξύ φρεατίων προς μια κλίση ορού (χημειοταξία). Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με το

in vivo

αποτελέσματά μας. Τα ποντίκια μεταμοσχεύθηκαν με EPHB6-mut κύτταρα αναπτύχθηκαν σημαντικά (p = 0,011) πιο μεταστάσεις στους πνεύμονες, όπως τα ποντίκια μεταμοσχεύθηκαν με EPHB6-wt κυττάρων. Εκτός από τις αλλαγμένη λειτουργίες του EPHB6 del (915 έως 917) μετάλλαξη, ορισμένες πτυχές μπορεί επίσης να προτείνει ένα κέρδος της λειτουργίας. Για παράδειγμα, τα μοτίβα της επούλωσης τραυμάτων διέφερε μεταξύ EPHB6 wildytpe και μεταλλαγμένων. Είναι πιθανό ότι υπάρχουν διαφορές σηματοδότησης μεταξύ του άγριου τύπου και του μεταλλαγμένου υποδοχέα. Από την άλλη πλευρά, θα μπορούσε επίσης να είναι ενδιαφέρον να υποθέσουμε ότι ο μεταλλαγμένος υποδοχέας θα μπορούσε να δράσει κυρίαρχο αρνητικό προς άλλους ανασταλτικούς υποδοχείς ΕΡΗ. Αυτή η κυρίαρχη αρνητική δραστηριότητα θα μπορούσε να οδηγήσει στην παρατήρηση του δυνητικού κέρδους της λειτουργίας δραστικότητας. Σαφώς, μελλοντικές μελέτες θα μπορούσε να αποκαλύψει τις υποκείμενες διαφορές στη σηματοδότηση και την επιρροή των άλλων κρατών της ΕΡΗ και δικτύων EPH-υποδοχέα. Οι μελλοντικές μελέτες θα μπορούσε επίσης να αποκαλύψει τις λειτουργικές επιδράσεις των μη del915-917 μεταλλάξεις. Είναι πιθανό ότι αυτά αδρανοποιούν επίσης EPHB6 αλλά αυτό πρέπει να επιβεβαιωθεί στο μέλλον.

Πρόσφατα, θα μπορούσαμε να αποδείξει ότι EPHB6 συχνά σιγήσει επιγενετικών μηχανισμών στον καρκίνο του πνεύμονα [21], και άλλοι θα μπορούσαν να δείχνουν την ίδια μηχανισμός αδρανοποίησης στον καρκίνο του μαστού [14]. Οι μελέτες μας έδειξαν επίσης ότι η απώλεια του EPHB6 προκαλεί μια εξαιρετικά μεταστατικό φαινότυπο. Σε συμφωνία, EPHB6 είναι ο υποδοχέας κινάσης τυροσίνης για τον οποίο χαμηλή έκφραση πιο στενά συνδεδεμένη με κακή πρόγνωση σε πρώιμο στάδιο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [20]. EPHB6 θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στη μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα, δεδομένου ότι συχνά επιγενετικώς σιγήσει ή /και μεταλλάσσεται σε ένα σημαντικό κλάσμα των ασθενών. Αυτό καθιστά πιθανό ότι EPHB6 είναι μια σχετική τροποποιητής του μεταστατικού ικανότητας στον καρκίνο του πνεύμονα.

Στο σύνολό τους, οι μεταλλάξεις σε EPHB6 που συμβαίνουν σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα θα μπορούσε να οδηγήσει σε μια προ-μεταστατικό φαινότυπο. Απώλεια της λειτουργίας EPHB6 από μειωμένη έκφραση ή μεταλλάξεων αδρανοποίηση μπορεί συνεπώς να συμβάλει στη μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα.

Ευχαριστίες

Είμαστε ευγνώμονες στον Δρ Jianping Wu (Πανεπιστήμιο του Μόντρεαλ, Κεμπέκ, Καναδάς) για την παροχή EPHB6 cDNA.