Αφηρημένο

καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα (SCC) και το αδενοκαρκίνωμα είναι οι

πιο κοινή

ιστολογικών υποτύπων του μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), και έχουν παραδοσιακά καταφέρει στην κλινική ως μια ενιαία οντότητα. Αυξανόμενες ενδείξεις, ωστόσο, απεικονίζει την βιολογική ποικιλότητα των δύο αυτών ιστολογικών υποομάδων του καρκίνου του πνεύμονα, και υποστηρίζει την ανάγκη να βελτιωθεί η κατανόηση της μοριακής βάσης πέραν των διαφορετικών φαινοτύπων, αν έχουμε ως στόχο να αναπτύξει πιο συγκεκριμένες και εξατομικευμένες στοχευμένη θεραπεία. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει microRNA (miRNA) εξαρτώμενη μεταγραφική ρύθμιση των διαφορών μεταξύ των SCC και το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα ιστολογικά υποτύπων καρκίνου. Σε αυτό το έργο, σε συνδυασμό miRNA (667 miRNAs από TaqMan Χαμηλή Πίνακες πυκνότητας (TLDA)) και mRNA προφίλ (ολόκληρο το γονιδίωμα 44 K σειρά G112A, Agilent) πραγματοποιήθηκε σε δείγματα όγκων από 44 ασθενείς με NSCLC. Εννέα miRNAs και 56 mRNAs βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά σε SCC έναντι δείγματα αδενοκαρκινώματος. Έντεκα από αυτούς τους 56 mRNA είχαν προβλεφθεί ως στόχοι των miRNAs που προσδιορίζονται να εκφράζονται με διαφορετικό τρόπο σε αυτές τις δύο ιστολογική συνθήκες. Από αυτούς, 6 miRNAs (miR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422Α και miR-708) και 9 γονίδια-στόχους (CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1 ) επικυρώθηκαν με ποσοτική PCR σε μια ανεξάρτητη κοόρτη 41 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Περαιτέρω, η αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ mRNAs και microRNAs έκφραση επίσης επικυρωθεί. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι υπάρχουν διαφορές μεταγραφική ρύθμιση miRNA-εξαρτώμενη διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον καθορισμό βασικών χαρακτηριστικά των NSCLC, και μπορούν να παρέχουν νέες βιοδείκτες για εξατομικευμένες θεραπευτικές στρατηγικές

Παράθεση:. Μολίνα-Πινέλο S, Gutiérrez G, Pastor MD, Hergueta Μ, Moreno-Bueno G, García-Carbonero R, et al. (2014) microRNA-Dependent ρύθμιση της μεταγραφής σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (3): e90524. doi: 10.1371 /journal.pone.0090524

Επιμέλεια: Bernard Μαρί, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Γαλλία

Ελήφθη: 29 του Αυγ 2013? Αποδεκτές: 3η Φεβρουαρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 13 Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Molina-Πινέλο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. LPA είναι χρηματοδοτείται από Fondo de Investigación Sanitaria (PI081156, PI1102688 και R12 /0036/0028), Proyecto de Excelencia de la Consejería de Innovación, Επιστήμης και Empresa, Junta de Andalucía (P08-CVI-04090), και η Roche Κοινότητας στην 75η επέτειο, Ισπανία. SMP χρηματοδοτείται από Fondo de Investigación Sanitaria (CD1100153), Fundación Científica de la Asociación Española Contra el καρκίνο, Consejería de Salud, Servicio Andaluz de Salud (PI-0224/2009 και PI-0046/2012), και Fundación Mutua Madrileña (2009 ). MDP χρηματοδοτείται από Fondo de Investigación Sanitaria (CD0900148). RGC χρηματοδοτείται από Fondo de Investigación Sanitaria (PI10 /02164). GMB χρηματοδοτείται από SAF2010-20175 και στη Μαδρίτη Περιφερειακής Κυβέρνησης (S2010 /BMD-2303). AC εργαστήριο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις σε από το ισπανικό Υπουργείο Οικονομίας και Ανταγωνιστικότητας, ISCIII (PI12 /00137, RTICC: RD12 /0036/0028), Consejería de Επιστημών e Innovación (CTS-6844) και Consejería de Salud της Junta de Andalucia (PI-0135-2010 και PI-0306 έως 2012). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, που είναι υπεύθυνη για ένα εκατομμύριο θανάτους ετησίως [1]. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει το 80% όλων των όγκων του πνεύμονα, και περιλαμβάνει αρκετές ιστολογικές υποτύπους όπως καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου (LCC), πλακώδες καρκίνωμα (SCC), και το αδενοκαρκίνωμα. SCC και αδενοκαρκίνωμα είναι οι

πιο κοινή

τύπους NSCLC, αντιπροσωπεύοντας το 25% και το 40% όλων των περιπτώσεων, αντίστοιχα [2], [3]. SCC προέρχεται από δυσπλαστικό πολυστρωματικές επιθήλιο στο

κεντρική

αεραγωγούς, ενώ αδενοκαρκίνωμα προέρχεται κατά προτίμηση από πρόδρομα κύτταρα της επιφάνειας μονο- ή διπλής στιβάδας του επιθηλίου των πνευμόνων περιφέρειας [4].

NSCLC , ανεξάρτητα από τον ιστολογικό υπότυπο, έχει

παραδοσιακά αντιμετωπίζονται στην κλινική ως ενιαία οντότητα ομοιογενής. Ωστόσο, ολοένα και περισσότερες ενδείξεις απεικονίζει τη μεγάλη βιολογική ποικιλομορφία αυτής της ασθένειας, η οποία σταδιακά οδηγεί σε πιο συγκεκριμένες διαγνωστικές και θεραπευτικές στρατηγικές, ανάλογα με την οικεία ιστολογική υπότυπο. Πράγματι, οι εξελίξεις στην στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα τώρα απαιτούν ακριβή κατάταξη των NSCLC [5]. Για παράδειγμα, ο EGFR μεταλλάξεις είναι πιο διαδεδομένες σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, και η παρουσία αυτών των μεταλλάξεων σχετίζεται με την ευαισθησία σε αναστολείς τυροσίνης κινάσης του EGFR [6]. Ομοίως, ALK traslocations, παρούσα σε μόνο 4% των αδενοκαρκινώματα, είναι προγνωστικά της υψηλής ευαισθησίας για ALK-κατευθυνόμενη θεραπείες όπως crizotinib. Αντίθετα, FGFR1 ενίσχυσης είναι πιο συχνά παρατηρείται σε SCC, και τώρα θεωρείται δυνητικά προσφυγής στόχο σε κλινικές δοκιμές με αναστολείς FGFR [7]. Ως εκ τούτου, μια μεγαλύτερη γνώση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην γένεση, την εξέλιξη και την εξάπλωση των διαφόρων υποτύπων του NSCLC είναι αναγκαία για την ανάπτυξη ειδικών διαγνωστικών μεθόδων και τον σχεδιασμό πιο κατάλληλη, εξατομικευμένη και αποτελεσματικές θεραπευτικές στρατηγικές.

Οι μεγάλες προόδους στη γονιδιωματική τεχνολογίες έχουν δημιουργήσει πολλές υποψήφιες βιοδείκτες με πιθανή κλινική αξία σε NSCLC. Τα microRNAs, όπως μετα-μεταγραφική διαμορφωτές, αποτελούν βασικούς παράγοντες στη ρύθμιση πολλών βιολογικών διεργασιών. Δυσλειτουργία του φυσιολογικοί ρόλοι τους συμβάλλει σε πολλές παθολογικές καταστάσεις, μεταξύ των οποίων την έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου. Στο πλαίσιο αυτό, μια σειρά από μελέτες έχουν αξιολογήσει τον πιθανό ρόλο των miRNA υπογραφές για διακρίσεις ιστολογικών υποτύπων ή να προβλέψει επανεμφάνιση ή την επιβίωση των ασθενών με NSCLC [8], [9], [10], [11], [12], [ ,,,0],13], [14], και miRNA προφίλ έχει προταθεί ως μια ιδιαίτερα αξιόπιστη στρατηγική για την ταξινόμηση NSCLCs [11], [15], [16]. Παρ ‘όλα αυτά, η υψηλή πολυπλοκότητα της ρύθμισης μεταγραφικό περιπλέκει την πλήρη κατανόηση των γονιδίων ρυθμιστικών δικτύων που εμπλέκονται σε αυτές τις διαδικασίες.

Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει τις διαφορές μεταγραφική ρύθμιση miRNA-εξαρτώμενη μεταξύ SCC και το αδενοκαρκίνωμα ιστολογικών υποτύπων καρκίνου του πνεύμονα. Με αυτό το σκοπό, miRNA και mRNA σε συνδυασμό προφίλ έκφρασης αναλύθηκαν σε δείγματα όγκων NSCLC, και οι πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των οποίων είχαν διερευνηθεί. Σε αυτή τη μελέτη έχουμε εντοπίσει και να επικυρωθεί ένα υποσύνολο της απελευθερωμένης miRNAs και γονιδίων στόχων που είναι σε θέση να προσδιορίσει διακριτά μοριακά χαρακτηριστικά αυτών των δύο μεγάλων ιστολογικών υποτύπων του NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι ασθενείς και οι όγκου δείγματα

οι ασθενείς που συμπεριελήφθησαν στη μελέτη αυτή έπρεπε να έχουν ιστολογικά επιβεβαιωμένη πρώιμο στάδιο SCC ή αδενοκαρκίνωμα NSCLC. δείγματα όγκων από 85 ασθενείς προοπτικά συλλέγονται κατά τη διάρκεια της χειρουργικής διαδικασίας και αμέσως snap-καταψύχθηκε στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω χρήση. Γειτονικά μη-όγκου πνευμονικού ιστού επίσης συλλέχθηκαν από ασθενείς που περιλαμβάνονται στην ομάδα επικύρωσης. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από τα θεσμικά διοικητικά συμβούλια αναθεώρηση του συμμετέχοντα κέντρα [Νοσοκομείο Universitario Doce de Octubre (Μαδρίτη) και το Νοσοκομείο Universitario Virgen del Rocío (Σεβίλλη)] και όλοι οι ασθενείς παρείχαν ενυπόγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση πριν από την εισαγωγή στη μελέτη. Κλινικά και παθολογικά στοιχεία που προέρχονται από τα ιατρικά αρχεία και κεντρικά εξετάζονται για τους σκοπούς της παρούσας μελέτης. Ο πληθυσμός της μελέτης διαιρέθηκε σε μία κοόρτη εκπαίδευση (Ν = 44) που χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη του προφίλ και ένα ανεξάρτητο ομάδα επικύρωσης (Ν = 41). Τα κύρια χαρακτηριστικά του πληθυσμού της μελέτης συνοψίζονται στους Πίνακες 1 και 2.

Η

μικροσυστοιχιών Gene Expression προφίλ

πειράματα μικροσυστοιχιών πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Ανθρώπου ολόκληρο το γονιδίωμα 44 K σειρά G4112A (τεχνολογίες Agilent , Wilmington, DE). RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen) και RNAesy Extraction Kit (Qiagen, Germany) όπως υποδεικνύεται από τους κατασκευαστές. Το RNA επισημαίνονται και ποικιλία σε υβριδισμό χρησιμοποιώντας το Low RNA γραμμική ενίσχυση Kit και το In Situ Hybridization Kit Plus (τεχνολογίες Agilent, Wilmington, DE) αντίστοιχα. Μετά την υβριδοποίηση και πλύση, οι πλάκες σαρώθηκαν σε ένα Axon GenePix Scanner (Αχοη Instruments Inc., Union City, CA) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Feature Extraction λογισμικού 6.1.1 (τεχνολογίες Agilent, Wilmington, DE). RNA από δείγματα όγκου σημάνθηκαν με Cy5-dUTP, και υβριδοποιήθηκε έναντι πισίνα αναφοράς καρκίνου του πνεύμονα (σημασμένο με Cy3 με-dUTP) που αποτελείται από πρωτογενή καρκινικό ιστό από ασθενείς με διαφορετικές ιστολογικές υποτύπους καρκίνου του πνεύμονα. Ως έλεγχος, δέκα επιπλέον υβριδισμοί διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας την αμοιβαία σήμανση φθοριοχρωμίου.

Για την ανίχνευση διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων μεταξύ των δύο ιστολογικών υποτύπων, δύο τύποι ανάλυσης έγιναν με το εργαλείο MIDAW [17]. Πρώτον, ένα t-test έγινε με ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) ελέγχου υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον ενιαίο-βήμα διαδικασία Bonferroni. Γονίδια που πέρασε το φίλτρο t-test υποβλήθηκαν σε ένα δεύτερο φίλτρο. Μόνο τα γονίδια που δείχνει μια τιμή αναλογίας μέσος λογάριθμος κατώτερη ότι -0,3 ή μεγαλύτερη από 0,3 (ισοδύναμο με 2-φορές αλλαγή) επελέγησαν ως εκφράζονται διαφορικά. Δεύτερον, μια διακριτική ανάλυση για τον προσδιορισμό του συνόλου των καλύτερων γονιδίων σήμανσης έγινε με βάση την ανάλυση Πρόβλεψη των μικροσυστοιχιών αλγορίθμου (PAM). έχουν μικροσυστοιχιών πίνακες ανεπεξέργαστα δεδομένα έχουν κατατεθεί στην Omnibus γονιδιακής έκφρασης κάτω από τον αριθμό των GSE42998.

microRNA qRT-PCR Δοκιμασία

Το συνολικό RNA, που περιέχει μικρά RNA, εξήχθη από δείγματα καρκινικού ιστού από κιτ απομόνωσης mirVana miRNA (Ambion, Austin, ΤΧ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συνολική απόδοση του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Nanodrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο (Nanodrop Tech, DE, USA). Η Agilent 2100 Bioanalyzer χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της ποσότητας και της ποιότητας των δειγμάτων RNA (Agilent, ΡβΙο Alto, CA). Ώριμη έκφραση ανθρώπινης miRNA ανιχνεύθηκε και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τις TaqMan Low Density Arrays (TLDA) με βάση 7900 ΗΤ μικρο fluidic κάρτες Applied Biosystems ‘(Applied Biosystems, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συστοιχία v2.0 Ανθρωπίνων microRNA Card Set (Αριθμός Καταλόγου 4400238) είναι ένα σύνολο δύο καρτών που περιέχει συνολικά 384 TaqMan microRNA Αναλύσεις ανά κάρτα για να καταστεί δυνατή η ακριβής ποσοτικοποίηση των 667 ανθρώπινου microRNAs, όλα καταχωρήθηκαν στη βάση δεδομένων miRBase. TLDAs διεξήχθησαν σε μια διαδικασία δύο σταδίων. Εν συντομία, κατά το πρώτο βήμα, 450 ng ολικού RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα χρησιμοποιώντας Megaplex RT Εκκινητές και το κιτ αντίστροφη μεταγραφή TaqMan miRNA σε συνολικό όγκο 7,5 μΐ. Οι 7,5 μλ αντιδράσεις επωάστηκαν σε ένα G-Storm Thermal Cycler (Gene Technologies, Essex, UK) για 2 λεπτά στους 16 ° C, 1 λεπτό στους 42 ° C, και 1 λεπτό στους 50 ° C κατά τη διάρκεια 40 κύκλων, που πραγματοποιήθηκε για 5 min στους 85 ° C, και στη συνέχεια διατηρήθηκε στους 4 ° C. Στο δεύτερο βήμα, 6 μL δείγματος cDNA και TaqMan Οικουμενική PCR κύριο μείγμα φορτώθηκαν στα λιμάνια πλήρωσης στο μικρορευστονικής κάρτα TLDA. Η κάρτα εν συντομία σε φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε 331 g για τη διανομή δειγμάτων στις πολλαπλές φρεάτια που συνδέονται με τις θύρες πλήρωσης και στη συνέχεια σφραγίζεται για την αποτροπή καλά-to-καλά μόλυνση. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν σε πλάκα 384 φρεατίων στους 50 ° C για 2 sec και 94,5 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 30 sec στους 97 ° C και 1 λεπτό στους 59 ° C. Τέλος, οι κάρτες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και αναλύθηκαν σε ένα ABIPrism 7900 HT Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας. Οι πίνακες των πρώτων δεδομένων TLDA έχουν κατατεθεί στην Omnibus γονιδιακής έκφρασης κάτω από τον αριθμό των GSE43000. Έκφραση των miRNAs στόχου ομαλοποιήθηκε με την έκφραση της RNU48. Ένα μη-ανθρώπινο miRNA, χρησιμοποιήθηκε σε κάθε πείραμα ως αρνητικός έλεγχος. όριο κύκλου (Ct) τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση του λογισμικού V.2.3 SDS χρησιμοποιώντας αυτόματες ρυθμίσεις βάσης και το ελάχιστο όριο του 0,2. Σχετική ποσοτικοποίηση της έκφρασης miRNA υπολογίσθηκε από την 2

-ΔCt μέθοδος (Applied Biosystems δελτίο χρήστη αρ. 2 (P /N 4303859)). Μόνο miRNA ανιχνεύσιμη σε τουλάχιστον 80% των δειγμάτων θεωρήθηκαν για αξιολόγηση. Η σημαντικότητα των διαφορών έκφρασης των miRNAs που παρατηρείται μεταξύ των δύο histolofical υποομάδες (αδενοκαρκίνωμα και SCC) εκτιμήθηκε από το t-test.

mRNA και miRNA έκφραση Συσχέτιση

Αξιολόγησης

Για να αξιολογηθεί η πιθανή συσχέτιση μεταξύ διαφορικά εκφρασμένων mRNA και miRNA που παρατηρήθηκε στη μελέτη μας, ψάξαμε για τους μεταγραφικούς στόχους των καθορισμένων miRNAs σε τρεις βάσεις δεδομένων Ιστού για την πρόβλεψη στόχων των miRNAs: Miranda [18], TargetScan απελευθερώσει 6.0 [19], και miRWalk [20]. επιλέχθηκαν υποθετικών γονιδίων στόχων που ταιριάζουν με εκείνα που βρέθηκαν να απορυθμισμένη του πληθυσμού μας ασθενή για περαιτέρω επικύρωση από qPCR.

Επικύρωση προφίλ έκφρασης μικροσυστοιχιών Gene από qPCR

Έντεκα διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ των δύο συνθήκες μελέτης (SCC και αδενοκαρκίνωμα NSCLC), τα οποία προσδιορίζονται ως πιθανούς στόχους του αρκετών dis-ρυθμιζόμενη miRNAs, επιλέχθηκαν για περαιτέρω επικύρωση από qPCR στην αρχική κοόρτη εκπαίδευση και στη συνέχεια σε μια ανεξάρτητη ομάδα επικύρωσης. Το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA με υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Εν συντομία, μονόκλωνο cDNA συνετέθη από 1 μα ολικού RNA σε 10 μΙ όγκο αντίδρασης, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η αντίδραση επωάστηκε στους 25 ° C για 10 λεπτά που ακολουθήθηκε από 120 λεπτά στους 37 ° C και απενεργοποίηση στους 85 ° C για 5 λεπτά. Το σύστημα έκφρασης Δοκιμασία TaqMan Gene (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων μεταγραφής των επιλεγμένων γονιδίων (

CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1, DMRT2, DSC3

και

KRT6A )

. Τρεις ενδογενή γονίδια ελέγχου (

B2M

,

ACTB

και

GAPDH

) και ένα μη-πρότυπο ελέγχου (NTC) επίσης υπολογίζεται για κάθε RNA δείγμα. Επιλέξαμε

Β2Μ

για ομαλοποίηση σε διαφορετικά γονίδια, καθώς αυτό το γονίδιο έδειξε την πιο σχετικά σταθερή έκφραση σε διαφορετικά δείγματα ιστού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η έκφραση του γονιδίου για κάθε γονίδιο προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το διάμεσο επίπεδο έκφρασης των τριών τεχνικών επαναλήψεις. Οι αντιδράσεις PCR εκτελέστηκαν σε ένα σύστημα ανίχνευσης Applied Biosystems 7900HT Ακολουθία σε 10 όγκους μι στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 sec και 60 ° C για 1 λεπτό. Οι τιμές Ct που λαμβάνονται με την V.2.3 λογισμικού SDS (Applied Biosystems). Σχετική ποσοτικοποίηση της έκφρασης mRNA υπολογίστηκε από την 2

-ΔCt μέθοδος (Applied Biosystems δελτίο χρήστη αρ. 2 (P /N 4303859)).

Επικύρωση προφίλ έκφρασης των miRNAs TLDA από qPCR

η έκφραση των εννέα επιλεγμένων miRNAs (miR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422Α, miR-483-5p, miR-494, miR-601 και miR-708) αξιολογήθηκε σε η ανεξάρτητη κοόρτη επικύρωση από τους ειδικούς προσδιορισμούς TaqMan microRNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Applied Biosystems). Εν συντομία, 2 ng /μL ολικού RNA μετατράπηκε σε cDNA με αντίδραση της αντίστροφης μεταγραφάσης που διεξήχθη με διαδοχική επώαση στους 16 ° C για 30 λεπτά, 42 ° C για 30 λεπτά και 85 ° C για 5 λεπτά. μίγμα της αντίδρασης PCR (10 μί) περιείχε 0,66 μΙ προϊόντος RT, 5 μί TaqMan 2Χ καθολική PCR Master Mix και 0.5 μL του κατάλληλου Δοκιμασία TaqMan microRNA (20Χ) που περιέχουν εκκινητές και ανιχνευτή για τον miRNA ενδιαφέροντος (Applied Biosystems). Το μίγμα αρχικά επωάζεται στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 60 δευτερόλεπτα. έκφραση microRNA ποσοτικά με τη συγκριτική 2

-ΔΔCt μέθοδο, την εξομάλυνση των τιμών Ct για RNU48. Στην ομάδα επικύρωσης, οι τιμές έκφραση του όγκου ήταν επιπλέον κανονικοποιούνται σε τιμές έκφραση σε ζεύγη παρακείμενο φυσιολογικό ιστό των πνευμόνων.

3′-UTR Δοκιμασία Reporter για το miR-στόχος Επικύρωση

Επιβεβαίωση

του miR-149-δέσμευσης προς την 3 ‘UTR του ABCC3 και του miR-378 και miR-422-σύνδεση προς το 3′ UTR του TMEM45B. ΗΕΚ 293 κύτταρα σε 80% συρροή συν-επιμολύνθηκαν με πλασμίδια αναφοράς λουσιφεράσης που φέρουν τον πλήρη 3’-UTR του επιθυμητού γονιδίου (μεταγωγής με Genomics) μαζί με 100 ηΜ του κάθε miR-μιμητικό ή ελέγχου miRNA (Sigma). DharmaFECT Duo (Thermo Scientific) χρησιμοποιήθηκε ως το αντιδραστήριο επιμόλυνσης σε

Opti-ΜΕΜ

(Life Technologies). Η φωταύγεια αναλύθηκε 24 ώρες αργότερα με τη χρήση LightSwitch Δοκιμασία Αντιδραστήρια (μεταγωγής με Genomics) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Knockdown αξιολογήθηκε με υπολογισμό της λουσιφεράσης λόγους σήματος για ειδικές miRNA /μη-στόχευσης ελέγχου, χρησιμοποιώντας κενό φορέα ρεπόρτερ ως έλεγχος για μη-ειδικές επιδράσεις. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν. t-test εκτελέστηκε για τα φρεάτια από πολλαπλά πειράματα, και συγκρίναμε μιμούνται-επιμολυσμένα κύτταρα με ένα μιμητικό ελέγχου για κάθε φορέα του γονιδίου.

Διαγνωστική αξιολόγηση των επιδόσεων των επιλεγμένων γονιδίων

υπολογίστηκαν παράμετροι διάγνωσης απόδοσης για επιλεγμένα γονίδια στους πίνακες 2×2-έκτακτης ανάγκης. διαστήματα εμπιστοσύνης για τις παραμέτρους αυτές υπολογίστηκαν με τη μέθοδο Pearson με βάση την κατανομή F. Ως ευαισθησία, ειδικότητα, θετική προγνωστική αξία (PPV) και αρνητική προγνωστική αξία (NPV) είναι στατιστικά μέτρα της απόδοσης ενός δυαδικού δοκιμή ταξινόμησης, οι τιμές της γονιδιακής έκφρασης μετατράπηκαν σε δυαδικές μεταβλητές με μέση τιμή έκφρασης, όπως την τιμή αναφοράς (υψηλή έναντι χαμηλή έκφραση). Αυτές οι παράμετροι υπολογίστηκαν για κάθε επικυρωμένο ζεύγος mRNA miRNA /στόχο. Η ταυτόχρονη εμφάνιση της υψηλής έκφρασης των miRNAs και η έκφραση του mRNA χαμηλό στόχο στην κατάλληλη ιστολογική κατάσταση (SCC ή αδενοκαρκίνωμα) θεωρήθηκε ένα πραγματικό θετικό τεστ. Ευαισθησία ή αλήθεια μέτρα θετικό ρυθμό το ποσοστό των πραγματικών θετικών οποία αναγνωρίζονται σωστά. Ειδικότητα ή αλήθεια μέτρων αρνητικό ποσοστό το ποσοστό των αρνητικών που έχουν αναγνωριστεί σωστά. Η PPV περιγράφει την πιθανότητα να έχουν την κατάσταση δώσει θετικό αποτέλεσμα της δοκιμής ελέγχου στο αναλύονται πληθυσμού. Το ΚΠΑ περιγράφει την πιθανότητα του να μην έχουμε την κατάσταση δοθεί ένα αρνητικό αποτέλεσμα δοκιμασίας διαλογής στην αναλύονται πληθυσμού.

Αποτελέσματα

Προφίλ Ανάπτυξης

προφίλ γονιδιακής έκφρασης με ιστολογική υπότυπο.

Ολόκληρο το γονιδίωμα συστοιχίες έκφρασης πραγματοποιήθηκαν σε δείγματα όγκων των ασθενών της κλάσης εκπαίδευση, και τα προφίλ έκφρασης των SCC και το αδενοκαρκίνωμα του όγκου των τύπων συγκρίθηκαν ένα γονίδιο σε έναν χρόνο, χρησιμοποιώντας το ένα δείγμα

t

– δοκιμή. Μετά ένα στάδιο προσαρμογής Bonferroni, 727 γονίδια ταυτοποιήθηκαν να εκφράζονται διαφορικά κατά περισσότερο από δύο φορές σε είτε ιστολογικές υπότυπο σε σχέση με την ομάδα αναφοράς (πίνακες Α, Β, C και D στον Πίνακα S1). Από αυτά τα 727 γονίδια, πέντε είχαν επάνω ρυθμισμένη και 195 ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα, και 13 επάνω ρυθμισμένη και 516 ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ασθενείς με SCC.

Επιπλέον, μια δεύτερη ανεξάρτητη αξιολόγηση του mRNA διαφορικής έκφρασης διεξήχθη με διακριτική ανάλυση δεδομένων μικροσυστοιχιών για την ελαχιστοποίηση των ψευδώς θετικών ευρημάτων. Η Ανάλυση Πρόβλεψη των μικροσυστοιχιών αλγορίθμου (ΡΑΜ) εντοπίστηκαν 61 γονίδια που καθόρισε μια μοριακή υπογραφή σε θέση να διακρίνουν αδενοκαρκίνωμα από δείγματα SCC (σχήμα 1). Από αυτά τα 61 γονίδια, 56 ταιριάζουν απελευθερωθεί γονίδια που βρέθηκαν από το παρελθόν πραγματοποιηθεί ένα δείγμα t-test, και, συνεπώς, επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση και επικύρωση.

Η Ανάλυση Πρόβλεψη των μικροσυστοιχιών αλγορίθμου εντοπίστηκαν 61 γονίδια που ορίζεται μοριακό υπογραφή για κάθε ιστολογική υπότυπο. δενδρόγραμμα των διαμορφωτών »αντιπροσωπεύει μια ανεξέλεγκτη ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης των 19 αδενοκαρκινώματος και 25 SCC με βάση το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης τους. Ο χάρτης ζέστη ήταν χρώμα που κωδικοποιείται χρησιμοποιώντας κόκκινο για ρύθμιση προς τα πάνω και το πράσινο για την ρύθμιση προς τα κάτω από μια πισίνα αναφοράς καρκίνο του πνεύμονα. Από την

επάνω μέρος του χάρτη σωρού,

χρώματα αντιστοιχούν σε προφίλ γονιδιακής έκφρασης των δειγμάτων SCC (μπλε) έναντι δείγματα αδενοκαρκινώματος (κόκκινο).

Η

προφίλ έκφρασης microRNA από ιστολογική υπότυπο.

συστοιχίες τα microRNAs TLDA πραγματοποιήθηκαν σε δείγματα όγκων των ασθενών της κλάσης εκπαίδευση. Εννέα miRNAs (miR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422Α, miR-483-5p, miR-494, miR-601 και miR-708) βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά μεταξύ της SCC και το αδενοκαρκίνωμα ιστολογικών υποτύπων από FDR-διορθωμένη όριο του 0,05. Οκτώ από τους 9 αυτούς miRNAs ήταν υπερ-εκφράζεται σε SCC σε σύγκριση με το αδενοκαρκίνωμα, και μία (MIR-375) ήταν υπερ-εκφράζεται σε αδενοκαρκίνωμα έναντι SCC (Πίνακας 3).

Η

πρόβλεψη στόχου microRNA.

Έντεκα από τα 56 γονίδια (20%) βρέθηκαν να απελευθερωθεί από τον τύπο του όγκου στη μελέτη μας βρέθηκαν να είναι υποθετική στόχοι τουλάχιστον ενός από τα 9 miRNAs προσδιορίζονται επίσης να εκφράζονται διαφορικά σε πληθυσμό της μελέτης μας σύμφωνα με ιστολογική υποτύπου (SCC έναντι αδενοκαρκίνωμα). Για τις 8 υπερεκφράζεται miRNAs στο SCC, 8 mRNA (

CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B

και

MUC1

) είχαν προβλεφθεί ως στόχοι από διάφορους αλγόριθμους. Αυτά τα γονίδια βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε SCC σε σύγκριση με αδενοκαρκίνωμα στη μελέτη μας (Πίνακας 2). Τρία από αυτά τα 8 γονίδια (

CEACAM6, MLPH

και

TMEM45B)

είχαν προβλεφθεί στόχους του περισσότερες από μία από αυτές τις miRNAs (σχήμα 2). Όπως φαίνεται στον πίνακα 2, τρία γονίδια (

DSC3, KRT6A

και

DMRT2

) έχουν προβλεφθεί ως στόχοι του miR-375, το miRNA ρυθμίζεται προς τα πάνω σε αδενοκαρκίνωμα, και αυτά τα γονίδια ήταν σταθερά κάτω ρυθμισμένα σε αυτή την ιστολογική υπότυπο.

Το γράφημα δείχνει τα μεταγραφικά στόχους του με διαφορετικό τρόπο εκφράζεται miRNAs στο SCC και το αδενοκαρκίνωμα του όγκου τους τύπους χρησιμοποιώντας τρεις βάσεις δεδομένων web της πρόβλεψης στόχου miRNA (Μιράντα, TargetScan και miRWalk). Το σύστημα προεπιλεγμένο χρώμα χρησιμοποιείται για να αντιπροσωπεύσει το επίπεδο έκφρασης είναι κόκκινο /μπλε (κόκκινο για υπερ-έκφραση των mRNAs ή miRNAs στην SCC έναντι αδενοκαρκίνωμα και μπλε για τα κάτω την έκφραση των mRNAs ή miRNAs στην SCC έναντι αδενοκαρκίνωμα). Η

βέλη

δείχνουν mRNA καταστολή από το

που συνδέονται miRNAs

. Τετράγωνα αντιπροσωπεύουν απορυθμισμένη mRNAs και οβάλ αντιπροσωπεύουν διαφορικά εκφρασμένων miRNAs στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα και του SCC.

Η

Προφίλ Επικύρωση

Επικύρωση της διαφορικής γονιδιακής έκφρασης με ποσοτική RT-PCR.

έντεκα απορυθμισμένη γονίδια (

CEACAM6, CGN, CLDN3, ABCC3, MLPH, ACSL5, TMEM45B, MUC1, DSC3, DMRT2

και

KRT6A),

προσδιορίζονται ως υποθετικό γονιδίων στόχων της απελευθερωμένης miRNAs στη μελέτη μας , στη συνέχεια επιλέγονται για περαιτέρω επικύρωση από rtPCR τόσο στην ομάδα της κατάρτισης και σε μια ανεξάρτητη ομάδα ασθενών.

στην ομάδα εκπαίδευσης, 9 από τα 11 γονίδια που εξετάστηκαν επιβεβαιώθηκαν να εκφράζονται διαφορικά από ιστολογική υποτύπου από ποσοτική PCR (Σχήμα 3).

CEACAM5

,

CLDN3, CGN, ABCC3, MUC1, ACSL5

,

MLPH

και

TMEM45B

ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε SCC, και

KRT6A

σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε αδενοκαρκίνωμα.

Για την επικύρωση γονίδια που ταυτοποιούνται ως εκφράζονται διαφορικά με ιστολογία όγκων στα δεδομένα μικροσυστοιχιών, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των mRNAs ποσοτικοποιήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔCt από

Β2Μ

η γονιδιακή καθαριότητας. Οι γραφικές παραστάσεις δείχνουν μέσες τιμές ΔCt των επικυρωμένων γονιδίων σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα έναντι SCC. Τα στοιχεία που προέρχονται από RT-qPCR παρουσιάζονται ως log

2 2

-ΔCt τιμές.

P

τιμή κάτω από 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Η

Με βάση τα αποτελέσματα που επιτεύχθηκαν στην ομάδα κατάρτισης, επιλέχθηκαν 9 mRNA και 9 miRNAs για περαιτέρω επικύρωση από Taqman-RT-qPCR στην όγκου και συμφωνημένα φυσιολογικό ιστό από μια ανεξάρτητη ομάδα των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Σε αυτή την ομάδα, τα πρότυπα έκφρασης των mRNAs ήταν σύμφωνα με εκείνα ποσοτικοποιούνται στην κοόρτη εκπαίδευσης. Έκφραση μοτίβα με ιστολογική υπότυπο όλων των 9 mRNAs δοκιμάστηκαν έμοιαζε εκείνοι που παρατηρήθηκε στην ομάδα εκπαίδευση, και οι διαφορές που παρατηρούνται μεταξύ των υποομάδων ήταν όλες στατιστικά σημαντικές (Σχήμα 4). Όσον αφορά τις 9 miRNAs, πέντε (MIR-149, miR-205, miR-378, miR-422Α και miR-708) βρέθηκαν να είναι σημαντικά υπερ-εκφράζεται σε SCC και miR-375 ήταν σημαντικά υπερ-εκφράζεται σε αδενοκαρκίνωμα (σχήμα 5).

η έκφραση των εννέα mRNAs ελέγχθηκε με PCR πραγματικού χρόνου σε μια ανεξάρτητη ομάδα των ασθενών με NSCLC. τα επίπεδα έκφρασης του mRNA προσδιορίστηκαν σε δείγματα όγκων και αντιστοιχισμένο φυσιολογικό ιστό πνεύμονα από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και σχετική έκφραση με ιστολογική υποτύπου αξιολογήθηκε. Διάμεση τιμές ΔΔCt προσδιορίστηκαν σε επικυρωμένων γονιδίων σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα και SCC. Τα στοιχεία που προέρχονται από RT-qPCR παρουσιάζονται ως 2

-ΔΔCt τιμές.

P

τιμή κάτω από 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Η

Η έκφραση της απελευθερωμένης miRNAs αξιολογήθηκε στην ομάδα επικύρωσης. επίπεδα έκφρασης microRNA προσδιορίστηκαν σε όγκο και αντιστοιχισμένο φυσιολογικό πνευμονικό ιστό των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα και σχετική έκφραση με ιστολογική υποτύπου αξιολογήθηκε. Μέσες τιμές ΔΔCt προσδιορίστηκαν σε εννέα miRNAs σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα έναντι SCC. Τα στοιχεία που προέρχονται από RT-qPCR παρουσιάζονται ως 2

-ΔΔCt τιμές.

P

τιμή κάτω από 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Η

Συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των miRNAs και mRNA.

Για να μελετηθεί η λειτουργική συνάφεια των miRNAs στη ρύθμιση των ειδικών mRNAs που προσδιορίζονται ως πιθανούς βιοδείκτες, αναλύσαμε στην κοόρτη επικύρωσης τη συσχέτιση μεταξύ miRNAs και προέβλεψε έκφρασης στόχου-mRNAs σε κάθε ασθενή (εικόνα 6). Μια αντίστροφη συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ

ABCC3, MUC1

και

CEACAM6

και τα επίπεδα έκφρασης του miR-149. Επιπλέον, τα υψηλότερα επίπεδα

CEACAM6

συσχετίστηκαν με χαμηλότερα επίπεδα miR-205 και miR-708, που είναι η συσχέτιση σημαντική για miR-708 (r = -0.362? P = 0,030).

ACSL5

και

KRT6A

είχε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με το miR-205 (r = -0,475? P = 0,003) και miR-375 (r = -0,311? P = 0.065), αντίστοιχα .

Στην περίπτωση της

TMEM45

Β, σημαντικές συσχετίσεις βρέθηκαν για miR-378 και miR-422Α (r =

–

0.394, p = 0,016 και r =

–

0,413, p = 0,015, αντίστοιχα).

αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ένα πιθανό ρόλο του miRNAs στη ρύθμιση αυτών των γονιδίων. Στη συνέχεια, μερικοί από αυτούς τους στόχους εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης. Πετύχαμε ότι η υπερέκφραση του miR-149 σε ΗΕΚ 293 κύτταρα κάτω ρυθμίζει τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης του κατασκευάσματος ανταποκριτή που περιέχει την ABCC3 3-UTR (σχήμα 7). Αυτό δείχνει ότι miR-149 συνδέεται απευθείας σε αυτό το RNA στόχο και αναστέλλει την έκφραση τους. Επιπλέον, η υπερέκφραση του miR-378 και miR-422Α αναστέλλουν σημαντικά την έκφραση TMEM45B (σχήμα 7).

Η έκφραση των 6 επικυρωμένων miRNAs και εκείνη των υποθετικών γονιδίων στόχων τους μετρήθηκε σε κάθε ασθενή στην κοόρτη επικύρωσης. Η σημασία της αντίστροφη σχέση μεταξύ κάθε μία από αυτές miRNA /ζευγάρια mRNA εκτιμήθηκε με συντελεστή συσχέτισης του Spearman του. Ρ τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Α) Οι σχέσεις μεταξύ

ABCC3

,

MUC1

και

CEACAM6

με miR-149. Β) Οι σχέσεις μεταξύ

ACSL5

και

CEACAM6

με miR-205. Γ) Σχέση μεταξύ των

TMEM45B

και miR-378. Δ) Σχέση μεταξύ των

TMEM45B

και miR-422Α. Ε) Σχέση μεταξύ των

CEACAM6

και miR-7018. ΣΤ) Σχέση μεταξύ των

KRT6A

και miR-miR-175.

Η

ΗΕΚ 293 επιμολύνθηκαν με φορέα αναφοράς λουσιφεράσης που περιέχει την περιοχή 3 ‘UTR της ABCC3 και TMEM45B. φορείς Reporter συν-επιμολύνθηκαν με ένα miRN μιμούνται ή ελέγχου miRN μιμούνται. Μετά 24 ώρες επώαση, μετρήθηκε η δραστικότητα λουσιφεράσης. * P & lt? 0,05 και ** p & lt? 0.001 από

t-test

Η

διαγνωστική απόδοση των επιλεγμένων γονιδίων να διακρίνει SCC από αδενοκαρκίνωμα ιστολογική NSCLC υπότυποι

Τέλος. , αξιολογήσαμε την ειδικότητα και την ευαισθησία αυτών των έξι επικυρωμένων miRNAs σε συνδυασμό με προβλεπόμενη mRNAs τους να διακρίνουν μεταξύ SCC και αδενοκαρκινώματος (εικόνα 8). Η καλύτερη απόδοση παρατηρήθηκε για

KRT6A,

ως στόχο του miR-375, με ευαισθησία και ειδικότητα τιμές 94,1% και 88,9%, αντίστοιχα. Καλή διαγνωστική απόδοση παρατηρήθηκε επίσης για

CEACAM6, ACSL5 y MLPH,

ως στόχοι του miR-205, με χαμηλότερες τιμές ειδικότητα (71,4 – 76,2%), αλλά μεγαλύτερη ευαισθησία (100%). Τέλος,

TMEMB45B,

ως στόχο του miR-378, έδειξε ευαισθησία 87,5% και ειδικότητα 57,7%. Τα άλλα ζευγάρια miRNA /mRNA αποκάλυψε χαμηλότερες τιμές ευαισθησίας και ειδικότητας, αν και ήταν μεγαλύτερη από 75% και 50% σε όλες τις περιπτώσεις, αντίστοιχα (Πίνακας S2).

Οικόπεδο δείχνει ειδικότητα και την ευαισθησία των επικυρωμένων miRNAs σε συνδυασμό με προέβλεψε mRNAs σε διακρίσεις μεταξύ των SCC και το αδενοκαρκίνωμα. Τα χρώματα αντιπροσωπεύουν κάτω-ρυθμίζονται mRNA από έξι απελευθερωμένης miRNAs στην SCC ή αδενοκαρκίνωμα.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη αναλύονται οι υπογραφές έκφραση mRNA και miRNA των ασθενών με διαφορετικούς υποτύπους του NSCLC . Αυτό μας επέτρεψε να κατασκευάσουμε ένα ισχυρό μεταγραφικό προφίλ αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και SCC. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν όχι μόνο την ύπαρξη ενός mRNA και /ή πρότυπα έκφρασης των miRNAs που είναι σε θέση να διακρίνουν μεταξύ SCC και το αδενοκαρκίνωμα, αλλά και ότι το τροποποιημένο υπογραφή της γονιδιακής έκφρασης εν μέρει προκαλούνται από συγκεκριμένους απορρύθμιση των miRNAs.

Κατ ‘αρχάς, αναλύσαμε δύο προσεγγίσεις το σύνολο των δεδομένων των μικροσυστοιχιών έκφραση του γονιδιώματος για την ελαχιστοποίηση των ψευδώς θετικών. Εξετάσαμε διαφορική επίπεδα γονιδιακής έκφρασης από διακρίσεις ανάλυση δεδομένων μικροσυστοιχιών και από το ένα δείγμα

t-test

. Πενήντα έξι γονίδια βρέθηκαν να απελευθερωθεί σημαντικά από τις δύο αναλύσεις και επομένως επιλέχθηκαν για περαιτέρω αξιολόγηση και την επικύρωση. Είναι αξιοσημείωτο ότι πολλά από αυτά είχαν προηγουμένως εμπλακεί σε σχετικές βιολογικές διαδικασίες (σύμφωνα με γονίδιο οντολογία) στον καρκίνο του πνεύμονα. Για παράδειγμα, ορισμένα γονίδια της

KRT

οικογένεια, οι οποίες κάτω-ρυθμίζονται σε αδενοκαρκίνωμα, εμπλέκονται σε πολλές κρίσιμες κυτταρικές λειτουργίες όπως η κυτταρική μετανάστευση, την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό [21]. Δεύτερον, miRNA διαμόρφωση της γενικής εικόνας που προσδιορίζονται 9 miRNAs που εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ των δύο ιστολογικών υποτύπων του NSCLC που μελετήθηκαν. Έξι από αυτούς (miR-149, miR-205, miR-375, miR-378, miR-422Α και miR-708) περαιτέρω επικυρωθεί σε μια ανεξάρτητη ομάδα των ασθενών με NSCLC ως βιοδείκτες είναι σε θέση να διακρίνουν το αδενοκαρκίνωμα και SCC. Για να εκτιμηθεί κατά πόσον αυτά τα miRNAs θα μπορούσε να ρυθμίζουν άμεσα ορισμένα από τα 56 απελευθερωμένης γονίδια εντοπίστηκαν, χρησιμοποιήθηκαν διάφορες ευρέως χρησιμοποιούνται αλγόριθμοι. Έντεκα από αυτούς τους 56 γονίδια (20%) ήταν ως εκ τούτου προβλέπεται να είναι υποθετική στόχοι τουλάχιστον ενός από τα έξι miRNAs βρέθηκε να εκφράζεται διαφορικά σε SCC σε σύγκριση με το αδενοκαρκίνωμα.