Abstract

RUNX3 (μεταγραφή runt συγγενή παράγοντα-3) έχει αναφερθεί ότι καταστέλλουν την ογκογένεση και μετάσταση όγκου σε διαφορετικούς ανθρώπινους καρκίνους. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μικροσυστοιχία ιστού (TMA) για να προσδιοριστεί η σημασία των RUNX3 σε progession καρκίνο του προστάτη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν έκτοπη έκφραση του RUNX3 σε προστάτη καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με καρκινικά παρακείμενο φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη, και μειωμένη χρώση RUNX3 συσχετίστηκε σημαντικά με το στάδιο TNM. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι RUNX3 υπερέκφραση ανέστειλε την κυτταρική μετανάστευση του καρκίνου του προστάτη και εισβολή που προκύπτουν από την αυξημένη ρύθμιση προς τα άνω του αναστολέα ιστού μεταλλοπρωτεϊνάσης-2 (ΤΙΜΡ-2), η οποία στη συνέχεια αναστέλλει μεταλλοπρωτεϊνάση-2 (ΜΜΡ-2) έκφραση και δραστικότητα in vitro. Γκρεμίζω έκφρασης RUNX3 διέλυσε την ισορροπία του ΤΙΜΡ-2 /ΜΜΡ-2, ενώ η σιωπή του ΤΙΜΡ-2 είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της έκφρασης ΜΜΡ-2 σε κύτταρα του προστάτη. Δείξαμε επίσης ότι η αποκατάσταση του RUNX3 μειωμένη αγγειακή έκκριση ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και κατέστειλε την ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων και το σχηματισμό σωλήνα. Εντυπωσιακά, RUNX3 καταδείχθηκε ότι αναστέλλει μετάσταση όγκου και την αγγειογένεση in vivo. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας υποστηρίζουν την κατασταλτική του όγκου ρόλο του RUNX3 στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη, και παρέχουν πληροφορίες για την ανάπτυξη της στοχευμένης θεραπείας για την ασθένεια αυτή

Παράθεση:. Chen F, Wang Μ, Bai J, Liu Q, Xi Υ , Λι W, et al. (2014) Ο ρόλος της RUNX3 στην καταστολή Μετάσταση και αγγειογένεση του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 9 (1): e86917. doi: 10.1371 /journal.pone.0086917

Επιμέλεια: Jindan Yu, του Πανεπιστημίου Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 Αυγούστου του 2013? Αποδεκτές: 16 Δεκ του 2013? Δημοσιεύθηκε: 24, Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81302207). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο μεταξύ των ανδρών στις ΗΠΑ [1]. Η χειρουργική επέμβαση εξακολουθεί να είναι η πιο αποτελεσματική θεραπεία για την πρωτογενή καρκίνο του προστάτη, αν και περίπου 30% των ασθενών του προστάτη συμβαίνουν υποτροπή της νόσου ή /και της μετάστασης μετά την αρχική θεραπείες, με αποτέλεσμα την σχετικά σύντομη περίοδο επιβίωσης (12-15 μήνες) [2]. Η μετάσταση είναι μια εξαιρετικά πολύπλοκη διαδικασία, συμπεριλαμβανομένων των καρκινικών κυττάρων μεταναστεύουν έξω από πρωτοπαθείς όγκους και να εισβάλουν σε γειτονικό ιστό, intravasate στο αίμα ή το λεμφικό κυκλοφορία, επιβιώνουν στο ρεύμα του αίματος, και στοχεύουν σε συγκεκριμένα όργανα να κινήσει μεταστατικό έκφυση [3]. Είναι σημαντικό να κατανοήσουμε καλύτερα τη μηχανιστική βάση της μετάστασης των όγκων, εντοπίζοντας τα βασικά μόρια που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία, η οποία θα παρέχει γνώσεις σχετικά με την ανάπτυξη των πιο αποτελεσματικών στρατηγικών για την πρόληψη της εξέλιξης του όγκου.

Runt οικογενειακό τομέα, που αποτελείται από RUNX1, RUNX2, και RUNX3, είναι κύριος ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης στον πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση των κυττάρων. οικογένεια πρωτεϊνών RUNX περιέχει την καλά συντηρημένη περιοχή με 128 αμινοξέα περιοχή (Runt τομέα) και σχηματίζουν ένα σταθερό σύμπλοκο με PEBP2b /ΟΒΡΒ να ασκήσει την ικανότητά διενεργοποίηση του [4]. Και τα τρία μέλη της οικογένειας RUNX παίζουν σημαντικούς ρόλους σε κανονικές αναπτυξιακές διεργασίες και tumotigenesis [5]. RUNX πρωτεΐνες ρυθμίζουν την έκφραση κυτταρικών γονιδίων με σύνδεση προς προαγωγούς ή ενισχυτές των γονιδίων στόχων που σχετίζονται με τις αποφάσεις των κυττάρων-μοίρα, τα οποία γίνονται διαταραγμένο σε καρκινικά κύτταρα [6].

Μεταξύ των τριών μελών της οικογένειας RUNX, RUNX3 ήταν αρχικά κλωνοποιήθηκε ως AML2 και εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 1ρ36.1. RUNX3 αναφέρθηκε αρχικά να συσχετίζεται με την γένεση και την εξέλιξη του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου ως καταστολέας όγκου [7]. Εκτός γαστρικό καρκίνο, έχει αναφερθεί ότι η έκτοπη έκφραση της RUNX3 παρατηρήθηκε σε διάφορους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, του γλοιώματος [8], [9]. Η ανάλυση των δειγμάτων κλινικής ιστού από την περιτοναϊκή μεταστάσεις που προκύπτουν από γαστρικών καρκίνων παρέχει την απόδειξη ότι η έκφραση RUNX3 μειώθηκε σημαντικά το μεταστατικό ιστό, σε σύγκριση με την κανονική γαστρικό βλεννογόνο ή πρωτογενή κύρια όγκων. ([10]) Σημαντικά, η μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης RUNX3 συνδέεται σημαντικά με κακή επιβίωση του καρκίνου και μελανώματος ασθενείς με γαστρικό [11], [12]. Σε προηγούμενη μελέτη μας, αποδείξαμε ότι RUNX3 μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκου με τη ρύθμιση κυτταρική μετανάστευση, εισβολή και την αγγειογένεση σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα [13]. Αυτές οι μελέτες προτείνουν ένα κεντρικό ρόλο του RUNX3 στην ογκογένεση και την εξέλιξη. Ωστόσο, η λειτουργία του RUNX3 στον καρκίνο του προστάτη δεν έχει ακόμη μελετηθεί καλά.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την έκφραση του RUNX3 σε σχέση με κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά χρησιμοποιώντας τον καρκίνο του προστάτη μικροσυστοιχιών ιστού. Βρήκαμε ότι η απώλεια της έκφρασης RUNX3 συσχετίζεται άμεσα με το στάδιο του καρκίνου του προστάτη ΤΝΜ. Επιπλέον, η αποκατάσταση της έκφρασης RUNX3 οδήγησε σε καταστολή της ΜΜΡ-2 και την επαγωγή του ΤΙΜΡ-2, τα οποία αντιπροσωπεύουν, τουλάχιστον εν μέρει, η καταστολή της tumopr εξέλιξη και μετάσταση. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με το ρόλο της στην ρύθμιση RUNX3 ΤΙΜΡ-2 /ΜΜΡ-2 σε φυσιολογικά κύτταρα του προστάτη. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι μείωση του VEGF έκκρισης που διεγείρεται από RUNX3 επανεισαγωγή ανέστειλε αγγειογένεση καρκίνου του προστάτη. κλινικά και μηχανιστικά δεδομένα μας έδειξαν ότι RUNX3 μπορεί να είναι ένας καταστολέας όγκων που εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και τη στόχευση του μονοπατιού RUNX3 αποτελούσε δυναμικό τροπικότητα θεραπεία για τον καρκίνο του προστάτη του ανθρώπου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη των μικροσυστοιχιών ιστού έγινε υπό ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Institutional Review Boards του Ενταγμένο Νοσοκομείο Xuzhou Medical College και όλων των εξετάσεων που πραγματοποιήθηκαν μετά από έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση.

όλα τα ζωικά τα πειράματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αρσενικά γυμνά ποντίκια (ηλικίας 6-7 εβδομάδων). Τα ποντίκια αγοράστηκαν από το Εργαστήριο SLAC Ζώων Ε.Π.Ε., Ο.Ε. (Σαγκάη, Κίνα) και φροντίζονται σύμφωνα με τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου. Όλα τα ζωικά πειραματικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από Θεσμικών Φροντίδα Ζώων και Χρήση Επιτροπή Xuzhou Medical College (IACUC Νο 1201).

Ασθενείς και δείγματα

Ο καρκίνος του προστάτη TMA αγοράστηκε από τη Σαγκάη Xinchao Βιοτεχνολογίας ( Σαγκάη, Κίνα). Οι όγκοι οργανώθηκαν σύμφωνα με το 2013 αναθεωρημένο σύστημα TNM ως εξής [14]: 139 υποθέσεις με τις φάσεις Ι-ΙΙ και 79 περιπτώσεις με τα στάδια III-IV. Επιπλέον, περιλαμβάνει 52 περιπτώσεις όγκων γειτονικό φυσιολογικό ιστό προστάτη. Η συστοιχία τελεία διάμετρος ήταν 1.5 mm, και κάθε τελεία αντιπροσώπευε μια κηλίδα ιστού από ένα άτομο δείγμα που επιλέχθηκε και παθολογικά επιβεβαιωθεί.

Ανοσοϊστοχημεία

χρώση ανοσοϊστοχημείας πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Το αντίσωμα αντι-RUNX3 πρωτογενούς κουνελιού (1:200) (Medical and Biological Laboratories, Nagoya, Japan), αντι-VIII (1:100), αντι-ΡΑΡ (1:100) (Santa Cruz, CA, USA) και το βιοτινυλιωμένο αντι-ποντικού IgG (1:200) (Boster Biotech, Wuhan, Κίνα) χρησιμοποιήθηκαν. Για την αξιολόγηση χρώση TMA, η ανοσολογική αντίδραση αξιολογήθηκε τυφλά από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές, χρησιμοποιώντας οπτικό μικροσκόπιο (Olympus ΒΧ-51 μικροσκόπιο φωτός), και η εικόνα που συλλέγονται από Camedia Δάσκαλος C-3040 ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. Η έκφραση του RUNX3 βαθμολογήθηκε ως θετική όταν το 10% των καρκινικών κυττάρων έδειξε ανοσοθετικότητα. Βιοψίες με κύτταρα όγκου 10% που δείχνει ανοσοχρώση θεωρήθηκαν αρνητικά [15].

Γραμμές κυττάρων και διαμόλυνση

ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές PC3, DU145 και κυττάρων του προστάτη RWPE-1 αγοράστηκαν από την Shanghai Ινστιτούτο Βιοχημείας και Βιολογίας Κυττάρου, κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). HUVECs ελήφθησαν από Nanjing Kaiji Biotech. κύτταρα DU145 καλλιεργήθηκαν σε μέσο Ρ12 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS). κύτταρα RWPE-1 διατηρήθηκαν σε Κ-SFM mediun με 10% FCS. PC3 κύτταρα και HUVECs καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FCS. Τα κύτταρα ήταν σε 37 ° C υγροποιημένο επωαστή με 95% αέρα, 5% CO

2. Τα πλασμίδια έκφρασης pFlag-ελέγχου και pFlag-RUNX3 ελήφθησαν από τον Δρ Πέι-Jung Lu (Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Cheng-Kung, Ταϊνάν, Ταϊβάν).

Για παροδική επιμόλυνση, επιμόλυνση του pFlag ελέγχου και pFlag-RUNX3 πλασμιδίων σε PC3 και DU145 κύτταρα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 αντιδραστήριο διαμόλυνσης (Invitrogen, Σαγκάη, Κίνα) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Επιμόλυνση του si-RUNX3, si-TIMP-2 και τον έλεγχο siRNA σε RWPE-1 κύτταρα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο siLentFect λιπιδίων (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Για σταθερή επιμόλυνση, ο λεντοϊού φορείς έκφρασης LV5-RUNX3 και LV5-Control ελήφθησαν από τη Σαγκάη Gene Pharma Company (Κίνα). Οι φακοϊούς αναμίχθηκαν με πολυβρένιο (5 μg /ml) και προστέθηκε σε κύτταρα DU145 για μόλυνση. Οι θετικοί κλώνοι επιλέχθηκαν σε πουρομυκίνη (5 μg /ml). Οι σταθερές επιμολύνσεις RUNX3 απομονώθηκαν μετά από 2 εβδομάδες κατά τη διάρκεια επιλογής.

Μετανάστευση και εισβολή Δοκιμασία

μετανάστευση των κυττάρων και προσδιορισμού εισβολή προσδιορίστηκαν με τη χρήση ενός τροποποιημένου δύο δοκιμασία μετανάστευσης θάλαμο με μέγεθος πόρων 8 μm . Για δοκιμασία μετανάστευσης, 1 × 10

6 PC3 και DU145 κύτταρα σπάρθηκαν σε μέσο άνευ ορού στον άνω θάλαμο. Μετά από 12 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα στον άνω θάλαμο αφαιρέθηκαν προσεκτικά με μια μπατονέτα και τα κύτταρα που είχαν διασχίσει τη μεμβράνη μονιμοποιήθηκαν σε μεθανόλη, βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και μετρήθηκαν. Για την ανίχνευση εισβολής, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού στον άνω θάλαμο. Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ° C, noinvasive κύτταρα απομακρύνθηκαν απαλά από το άνω μέρος του matrigel με ένα βαμβάκι-στυλεό. Διηθητική κύτταρα στον πυθμένα του matrigel μονιμοποιήθηκαν σε μεθανόλη και χρωματίστηκαν με ιώδες leucocrystal. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, τα κύτταρα μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο σε πέντε πεδία (πάνω, κάτω, μέση, αριστερά, δεξιά. × 200).

HUVEC την ανάπτυξη και την Tube Δοκιμασία Σχηματισμού

Τα επιμολυσμένα PC3 και DU145 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 6 φρεατίων με φρέσκο ​​πλήρες μέσο για 24 ώρες, το μέσο συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε για την απομάκρυνση τυχόν κυτταρικών θραυσμάτων πριν από τη χρήση του ως ρυθμισμένο μέσο. Για την ανίχνευση της κυτταρικής ανάπτυξης, 2 × 10

4 HUVECs αιωρήθηκε σε 100 μΙ ρυθμισμένο μέσο και εμβολιάστηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

4 σε μια πλάκα καλλιέργειας 96 φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας μέτρηση κυττάρων kit-8 (CCK-8) που αγοράστηκαν από Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας (Σαγκάη, Κίνα). Για δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα, πλάκα 48 φρεατίων επικαλύφθηκε με Matrigel (BD Biosciences, NJ, USA) και διατηρήθηκε σε 37 ° C για 0,5 ώρα. Στη συνέχεια, 2 × 10

4 HUVECs εναιωρήθηκαν σε 100 μΙ ρυθμισμένου μέσου και εφαρμόστηκε σε προ-επικαλυμμένη πλάκα 48 φρεατίων. Μετά από επώαση στους 37 ° C για άλλες 24 ώρες, ο αριθμός των τριχοειδών σωλήνων που μοιάζουν από τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο Nikon ανεστραμμένο (Nikon, Ιαπωνία).

ELISA για VEGF

PC3 και DU145 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας ιστού 6-φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα ανά φρεάτιο. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pFlag ελέγχου και pFlag-RUNX3 με ασιτία ορού. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. συγκέντρωση του VEGF προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ Quantikine ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (R &? D Systems, ΜΝ, USA).

ζυμογραφία ζελατίνης

Δύο εκατομμύρια κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 100 mm για 24 h. Οι πρωτεΐνες στο ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκαν, τοποθετήθηκαν σε 10% SDS-PAGE που περιείχε 0,1% ζελατίνη (Sigma, Σαγκάη, Κίνα). Μετά την ηλεκτροφόρηση, γέλη επωάστηκε σε Triton Χ-100 ρυθμιστικό αλλαγής (20 mM Tris-HCI [ρΗ 8,0], 150 mM NaCl, 5 mM ΟαΟ και 2,5% Triton Χ-100) για 30 λεπτά ακολουθούμενο από 10 min πλύση με ρυθμιστικό διάλυμα επώασης (ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα χωρίς Triton Χ-100) για 3 φορές. Gel επωάστηκε σε ρυθμιστικό επώασης όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Μετά την επώαση, η πηκτή χρωματίστηκε με 0,5% Coomassie Blue R-250 (Sigma, Σαγκάη, Κίνα) για 1 ώρα, στη συνέχεια απο-χρωματίστηκαν σε 30% μεθανόλη και 10% παγόμορφο οξικό οξύ για 1 ώρα. Τα πηκτώματα φωτογραφήθηκαν και έπειτα quantitatedively μετρήθηκε με πυκνομετρία σάρωσης.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

mRNA καθαρίστηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy (Qiagen, Valencia, CA), και cDNA σύνθεση πραγματοποιήθηκε με iScript Επιλέξτε cDNA Synthesis Kit (Biorad, Hercules, CA). Σε πραγματικό χρόνο PCR ενίσχυση του ΤΙΜΡ-2, ΜΜΡ-2 και GAPDH διεξήχθη για 20 s στους 95 ° C, ακολουθούμενη από 50 κύκλους στους 95 ° C για 3 s και ανόπτηση στους 60 ° C για 30 s χρησιμοποιώντας ένα ΑΒΙ PRISM 7500 Σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας (Νέα Υόρκη, ΗΠΑ). Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν προς εκείνες του γονιδίου GAPDH οικοκυρικής και εκφράζονται ως αναλογία του ποσοστού των μεμονωμένων γονιδίων για τον έλεγχο GAPDH. Οι ειδικές αλληλουχίες εκκινητών για κάθε γονίδιο έχουν ως εξής: Timp2 εμπρός, TCTGGAAACGACATTTATGG? αντίστροφη GTTGGAGGCCTGCTTATGGG-3? Timp2 προς τα εμπρός, ACTGTTGGTGGGAACTCAGAAG? CAAGGTCAAT GTCAGGAGAGG και GAPDH προς τα εμπρός, τετραγωνικού GAA GGTCGGAGTCAACGGATT? αντίστροφη, CCTGGAAGATGGTGATGGGATT.

Ανάλυση Western Blot

κύτταρο ή ιστό εκχυλίσματα διαχωρίστηκαν σε ένα 10% πήκτωμα SDS-πολυακρυλαμιδίου. Οι πρωτεΐνες μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα ακόλουθα αντισώματα: αντι-RUNX3, κουνελιού αντι-ΜΜΡ-9, ΜΜΡ-2, ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 (Cell Signaling Technology, ΜΑ, USA) και αντι-β-ακτίνης ποντικού (Santa Cruz, CA, USA). Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα (αίγας αντι-κουνελιού και κατσίκας αντι-ποντικού IgG) για 2 ώρες, χρωματισμένο με υγρό χρωματισμό το οποίο περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα 10 ml αλκαλικής φωσφατάσης και αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας ΝΒΤ /χρώμα ΒΟΙΡ υπόστρωμα (Promega, Madison, USA ).

In vivo πειραματική μετάσταση Μοντέλα

Δύο ομάδες των 8 αρσενικών άτριχων ποντικών στεγάστηκαν σε εγκαταστάσεις φράγματος SPF κάτω από ένα σκοτεινό κύκλο /12 h φως. Οι ποντικοί εγχύθηκαν μέσω της φλέβας της ουράς με RUNX3 σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα DU145 (1 × 10

6 κύτταρα ανά πλευρά) σε 100 μΙ PBS. Μια βελόνα ινσουλίνης χρησιμοποιήθηκε για τις ενέσεις στην φλέβα της ουράς. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με αποκλεισμό trypan blue και μόνο μονοκύτταροι εναιωρήματα & gt? 95% βιώσιμα χρησιμοποιήθηκαν. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία στις 8 εβδομάδες μετά την εμφύτευση, οι πνεύμονες μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλδεΰδης, και αιματοξυλίνη και εοσίνη (ΗΕ) βάφτηκαν για μεταστατικών οζιδίων.

Υποδόρια in vivo πειράματα

Για να αξιολογηθεί σωλήνα σχηματισμός, δύο ομάδες των 8 αρσενικών γυμνών ποντικών εγχύθηκαν με RUNX3 σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα DU145 (1 × 10

6 κύτταρα ανά πλευρά) σε 100 μΙ PBS /Matrigel (50:50) υποδορίως. Τα ζώα παρακολουθούνται καθημερινά. Το σωματικό βάρος κάθε ποντικού καταγράφεται και ο όγκος του όγκου προσδιορίστηκε με καλίμπρα βερνιέρου κάθε μέρα, μετά την φόρμουλα του Α χ B

2 × 0,52, όπου το Α είναι η μακρύτερη διάμετρος του όγκου και το Β είναι η συντομότερη διάμετρο. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία στις 8 εβδομάδες μετά την εμφύτευση, και οι όγκοι αφαιρέθηκαν χειρουργικά και σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλδεΰδης για ιστολογία. Όλες οι διαδικασίες πειραματόζωο πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τους θεσμικούς κανόνες δεοντολογίας, καθώς και να εγκριθεί από την Επιτροπή των Xuzhou Medical College για τη χρήση και τη φροντίδα των ζώων.

Στατιστική Ανάλυση

αριθμητικά δεδομένα εκφράζονται ως μέσο ± SD Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ των μέσων για τις διάφορες ομάδες αξιολογήθηκαν με Instat 5.0 (λογισμικό GraphPAD, San Diego, CA) χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). Για TMA, στατιστική ανάλυση έγινε με SPSS 11.5 (SPSS). Η συσχέτιση μεταξύ της χρώσης RUNX3 και των κλινικοπαθολογική παραμέτρων των ασθενών με καρκίνο του προστάτη, όπως η ηλικία, το μέγεθος του όγκου, το βαθμό του όγκου και το στάδιο TNM, αξιολογήθηκε από χ

2 τεστ. Η σημασία των δεδομένων in vivo προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δίπλευρη Mann-Whitney U. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά διαφορετικά σε

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η έκφραση RUNX3 είναι μειωμένη σε Ανθρώπινο Καρκίνος του προστάτη

Πρέπει πρώτα καθοριστεί αν η έκφραση RUNX3 μεταβάλλεται σε ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη. χρώση Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε σε slide ΤΜΑ περιέχουν όγκου παρακείμενων φυσιολογικών ιστών του προστάτη και τους ιστούς καρκίνου του προστάτη. Οι presentative φωτογραφίες παρουσιάστηκαν στο σχήμα. 1Α. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι υπήρχε ένα σημαντικά χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης RUNX3 στους όγκους από ό, τι στον όγκο γειτονικό φυσιολογικό ιστούς προστάτη (

P

& lt? 0,01, Σχήμα 1Β.). Αυτά πρότεινε ότι RUNX3 ήταν κοινώς εκφράζεται σε φυσιολογικό ιστό ανθρώπινου προστάτη αλλά μειωμένη ή απούσα σε ιστό καρκίνου του προστάτη.

Ένα αντιπροσωπευτικό ανοσοϊστοχημική φωτογραφίες πάρθηκαν σε διαφορετικές μεγεθύνσεις σε όγκο παρακείμενο φυσιολογικό ιστό του προστάτη και του καρκίνου του προστάτη ιστούς (× πίνακας Top 100, το κάτω πλαίσιο × 400). Β σε σύγκριση με εκείνη στον όγκο παρακείμενο φυσιολογικό ιστό του προστάτη, το συνολικό επίπεδο έκφρασης του RUNX3 στους ιστούς του καρκίνου του προστάτη ήταν σημαντικά χαμηλότερη (

P

& lt? 0,01, χ

2 τεστ). C Μειώθηκε η έκφραση RUNX3 συσχετίζεται με το στάδιο TNM (

P

& lt? 0,01, χ

2 δοκιμών, συγκρίνοντας Ι-ΙΙ έναντι ΙΙΙ-IV).

Η

Απώλεια RUNX3 η έκφραση σε καρκίνο του προστάτη συνδέεται με Tumor Stage

σε όλους τους 218 ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, η σχέση ανάμεσα στην έκφραση RUNX3 και παθολογικές και κλινικά χαρακτηριστικά φαίνεται στον πίνακα 1. η μέση (SD) ηλικία των ασθενών ήταν 58,7 έτη ( διάμεση 66,5 έτη? εύρος, 37-87 ετών). Επειδή στάδιο TNM είναι ένας σημαντικός προγνωστικός δείκτης για ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, ανιχνεύσαμε την έκφραση RUNX3 σε 139 πρώιμου σταδίου (Ι-ΙΙ) και σε 79 τελευταίο στάδιο (III-IV) κατηγορίες ιστών καρκίνου του προστάτη. Βρήκαμε χρώση RUNX3 μειώθηκε δραματικά στα τελευταία στάδια σε σύγκριση με το αρχικό στάδιο Ι-ΙΙ (

P

& lt?. 0.01, σχήμα 1Γ). Ωστόσο, δεν βρήκαμε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης RUNX3 με άλλα κλινικοπαθολογική μεταβλητές, όπως η ηλικία, το μέγεθος του όγκου και της ποιότητας των όγκων.

Η

Αποκατάσταση της έκφρασης RUNX3 κύτταρα που αναστέλλονται Καρκίνος του προστάτη Μετανάστευση και την εισβολή in vitro

Δεδομένου ότι η έκφραση RUNX3 σχετίζεται με το στάδιο TNM με καρκίνο του προστάτη, RUNX3 μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο σε ένα ή περισσότερα στάδια της μετάστασης του καρκίνου του προστάτη. Εξετάζουμε πρώτα την επίδραση του RUNX3 επαναφορά σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη τη μετανάστευση και την εισβολή. Είμαστε παροδικά επιμολυσμένα PC3 και DU145 κύτταρα με pFlag-ελέγχου και πλασμίδια pFlag-RUNX3. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, πρωτεΐνη ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα (Εικ. 2Α και Β). Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε κυτταρική δοκιμασία μετανάστευσης και δοκιμασία εισβολής. Στην δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων, βρήκαμε ότι η αποκατάσταση RUNX3 σε PC3 και DU145 κύτταρα μείωσε την ικανότητα να μεταναστεύει μέσω Boyden θαλάμου κατά 55% και 63%, αντίστοιχα (Σχ 2C και D). (

P

& lt? 0,05) . Στην δοκιμασία εισβολής κυττάρων, RUNX3-επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν σημαντικά χαμηλότερα επεμβατική δραστικότητα από τον έλεγχο, με μεταστατικών κυττάρων κατά 57% και 82% το PC3 και DU145 κύτταρα, αντίστοιχα (Σχ. 2Ε και F) (

P

& lt ? 0,05). Ωστόσο, η αποκατάσταση του RUNX3 δεν είχε καμία επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του προστάτη (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α και Β Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, η έκφραση του RUNX3 σε PC3 και DU145 κύτταρα αξιολογήθηκε με Western κηλίδα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Γ και Δ δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων. Εκπρόσωπος τομείς της μετανάστευσης κυττάρων στη μεμβράνη (μεγεθύνσεις, × 200). Μέσος αριθμός μετανάστευση των κυττάρων ανά πεδίο. προσδιορισμούς κυτταρικής εισβολής Ε και F Matrigel. Εκπρόσωπος εικόνες δείχνουν τα κύτταρα που εισέβαλαν μέσα από την Matrigel όταν επιμολυσμένα με RUNX3 πλασμίδιο ή τον έλεγχο. Εκπρόσωπος histograph της εισέβαλαν καρκινικών κυττάρων εμφανίζεται και ο αριθμός των εισέβαλαν καρκινικών κυττάρων ποσοτικά. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά από τους ελέγχους (*

P

& lt? 0,05, ANOVA)

Η

Επεμβατική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων μπορεί να ρυθμίζεται από MMPs.. Για να μελετηθεί ο πιθανός ρόλος των MMPs σε RUNX3 επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής εισβολής, εκτελέσαμε ζυμογραφία ζελατίνης για τη μέτρηση των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 δραστηριότητες. Η δραστικότητα του ενζύμου ΜΜΡ-2 κατεστάλη μετά αναγκάστηκε έκφραση του RUNX3 σε PC3 και DU145 κύτταρα (Εικ. 3Α). κηλίδα Western χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει τα ΤΙΜΡ-1, ΤΙΜΡ-2, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 εκφράσεις σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η αναστολή της επίπεδο πρωτεΐνης ΜΜΡ-2 οφείλεται στην αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-2 μετά RUNX3 υπερέκφραση σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 3Β). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση του ρόλου του RUNX3 στη ρύθμιση TIMP-2 /MMP-2, φυσιολογικό κύτταρο του προστάτη RWPE-1 χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη μας και τα στοιχεία μας έδειξαν ότι γκρεμίσουμε έκφρασης RUNX3 χώρισε το υπόλοιπο του TIMP-2 /MMP -2 (Σχ. 3C), ενώ η σιωπή του ΤΙΜΡ-2 είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της ΜΜΡ-2 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε κύτταρο του προστάτη (Σχ. 3D και Ε). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι RUNX3 εμπλέκεται στη ρύθμιση της ΤΙΜΡ-2 /ΜΜΡ-2.

Α Η δραστικότητα του ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 αξιολογήθηκαν με ζυμογραφία ζελατίνης. Β ανάλυση Western blot των σχετικών επιπέδων της πρωτεΐνης ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, ΤΙΜΡ-1, ΤΙΜΡ-2 και β-ακτίνης σε RUNX3 επανέκφραση και ομάδας ελέγχου τόσο για PC3 και κυτταρικές γραμμές DU145. C Western Blot για την πρωτεΐνη έκφραση του ΜΜΡ-2, ΤΙΜΡ-2 και β-ακτίνης σε RUNX3 τεμαχισμό και την ομάδα ελέγχου για RWPE-1 κυτταρική γραμμή. D ανάλυση στυπώματος Western για ΜΜΡ-2 και β-ακτίνης έκφραση μετά γκρεμίσουμε του ΤΙΜΡ-2. Ε Real Time PCR για την έκφραση του mRNA της MMP-2 μετά γκρεμίσουμε του TIMP-2. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος ± S.D. *

P

& lt?. 0.05

Η

Αποκατάσταση της έκφρασης RUNX3 μειωμένη αγγειογένεση in vitro

Για να προσδιοριστεί περαιτέρω η επίδραση της αποκαταστάθηκε έκφρασης RUNX3 για αγγειογενετική δυνατότητες του ανθρώπινου προστάτη καρκινικά κύτταρα, τα αγγειογόνο δυναμικό του υπερκειμένου του PC3 και DU145 κύτταρα επιμολυσμένα με pFlag ελέγχου ή pFlag-RUNX3 προσδιορίστηκαν με δοκιμασία ενδοθηλιακού πολλαπλασιασμού των κυττάρων και δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα. Στη δοκιμασία του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, βρήκαμε ότι ρυθμισμένο μέσο από PC3 και DU145 κύτταρα επιμολυσμένα με pFlag-RUNX3 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων σε σύγκριση με εκείνα των κυττάρων ελέγχου (Εικ. 4Α και Β). Στην δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα, ο βαθμός σχηματισμού σωλήνα εκτιμήθηκε ως το ποσοστό του εμβαδού επιφανείας κυττάρου έναντι συνολικής επιφάνειας. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C και D, ο μέσος αριθμός των πλήρων σωληνοειδών δομών που σχηματίζονται από HUVECs ήταν σημαντικά μειωμένη σε ρυθμισμένο μέσο από RUNX3 υπερεκφράζουν PC3 και DU145 κύτταρα σύγκριση με τους ελέγχους φορέα (

P

& lt? 0,05).

Α και Β CCK-8 δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρου διεξήχθη για την ανίχνευση του πολλαπλασιασμού HUVECs. Γ και Δ Αντιπροσωπευτικά φωτογραφίες τραβήχτηκαν επί τόπου για το σχηματισμό του σωλήνα στο υπερκείμενο των PC3 και DU145 κύτταρα μεταδιεγείρονται με pFlag ελέγχου και pFlag-RUNX3. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Ε ELISA για την έκκριση του VEGF σε PC3 και DU145 κύτταρα μεταδιεγείρονται με pFlag ελέγχου και pFlag-RUNX3. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος ± S.D. *

P

& lt?. 0.05

Η

Ο VEGF είναι ένα σημαντικό μιτογόνο και την επιβίωση παράγοντας για τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Σε απάντηση στην αγγειογενετική διέγερση, ενδοθηλιακά κύτταρα να εισέλθει σε πολλαπλασιαστική κατάσταση. Για την αξιολόγηση του μηχανισμού RUNX3 ρύθμιση της αγγειογένεσης, ELISA διεξήχθη για την ανίχνευση VEGF που εκκρίνεται στο ρυθμισμένο μέσο καλλιέργειας των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Ε, σημαντική μείωση στην έκκριση VEGF παρατηρήθηκε σε ρυθμισμένο μέσο από PC3 και DU145 κύτταρα επιμολυσμένα με pFlag-RUNX3 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (

P

& lt? 0,05).

Αποκατάσταση της Έκφρασης RUNX3 Αναστολή Μετάσταση in vivo

Επειδή έκφραση RUNX3 μειωμένη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή in vitro, μια ουραία φλέβα μεταστατικό δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν τα in vivo επιδράσεις της έκφρασης RUNX3 στην μεταστατική δραστικότητα των κυττάρων DU145. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου μολυσμένα με κενό φορέα ιό, χρώση έδειξε ότι ένεση στην ουραία φλέβα των κυττάρων σταθερώς μολυσμένα με LV5-RUNX3 σε αθυμικά γυμνά ποντίκια οδήγησε σε σημαντικά μικρότερο αριθμό οζιδίων στον πνεύμονα (Εικ. 5Α και Β). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω αυτή μακρινή μετάσταση, εκτελέσαμε ανοσοϊστοχημεία για τον εντοπισμό κρίσιμων δεικτών του καρκίνου του προστάτη. Το ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA) και όξινη προστατική φωσφατάση (ΡΑΡ) θεωρούνται ότι είναι κρίσιμη δείκτες για τη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη [16]. Ωστόσο, το PSA δεν εκφράζεται σε κύτταρα DU145 [17]. Έτσι, χρησιμοποιείται ΡΑΡ στη μελέτη μας για τη διερεύνηση της πηγής των κόμβων του όγκου στον πνεύμονα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5C, PAP θετικός στον πνευμονικό ιστό έδειξε ότι η μακρινή μετάσταση στο ζωικό μοντέλο ήταν από τα κύτταρα DU145 που ενέθηκαν από το δοχείο ουρά. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν τις αξιοσημείωτες ανασταλτικές επιδράσεις του RUNX3 στην πνευμονική μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη.

Ένα Ποντικοί εγχύθηκαν με ένεση μέσω της φλέβας της ουράς με κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια έκφρασης. Ομάδες που περιέχονται 8 ποντίκια. Οκτώ εβδομάδες αργότερα, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και ο πνεύμονας μετάσταση των κυττάρων DU145 μετρήθηκε με μακροσκοπική μετά αυτοψία. Η ιστολογική ανάλυση των μεταστατικών αλλοιώσεων στα πλευρά γυμνών ποντικών διεξήχθη με χρώση HE. Β Ποσοτικοποίηση των οζίδια στον πνεύμονα με αλλαγμένα επίπεδα RUNX3. Οι αριθμοί των οζιδίων ήταν τυφλά αξιολογήθηκε σε 5 τυχαία πεδία ανά εμφύτευμα σε 200 μεγεθύνσεις. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος ± S.D. *

P

& lt? 0,05. C Εκπρόσωπος ανοσοϊστοχημική φωτογραφίες της έκφρασης ΡΑΡ στον πνευμονικό ιστό (μεγεθύνσεις, × 200 και × 400). * Ιστός όγκου.

Η

Αποκατάσταση της Έκφρασης RUNX3 Καταστέλλεται Ογκογένεση in vivo

Για να διερευνηθεί η επίδραση της θεραπείας RUNX3 επί της ανάπτυξης όγκου in vivo, καθιερώσαμε μια υποδόρια όγκου σε γυμνούς ποντικούς. Σύκο. 6Α έδειξε ότι η πρωτεΐνη RUNX3 υπερεκφράστηκε μετά σταθερά μολυνθεί με LV5-RUNX3. Όγκων σε ποντίκια σταθερά μολυνθεί με LV5-RUNX3 είχε υποστεί σημαντική αναστολή της ανάπτυξης σε σύγκριση με τους ελέγχους (

P

& lt? 0,05). Μια αντιπροσωπευτική φωτογραφία που δείχνει την ανάπτυξη του όγκου στον έλεγχο και RUNX3 εκφράζονται ποντίκια (Σχ. 6Β).

Γυμνά ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως με κύτταρα DU145 εκφράζουν σταθερά LV5-RUNX3 ή LV5-Control. κηλίδα Western χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί το επίπεδο της πρωτεΐνης RUNX3. Β Οι όγκοι παρακολουθήθηκαν για συνολικά οκτώ εβδομάδες. διάμετρος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο κάθε εβδομάδα, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με τον ακόλουθο τύπο του A × B

2 × 0,52, όπου το Α είναι η μακρύτερη διάμετρος του όγκου και Β είναι η συντομότερη διάμετρο. Ο όγκος του όγκου ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε 8 εβδομάδες σε ποντίκια που έλαβαν φακοϊούς ελέγχου σε σύγκριση με εκείνους που έλαβαν φακοϊών RUNX3 (*

P

& lt? 0,05). C Εκπρόσωπος ποντίκια που έφεραν όγκους που έλαβαν θεραπεία με σύγκριση της ομάδας ελέγχου με την ομάδα RUNX3. D Τα επίπεδα έκφρασης του RUNX3 και VIII αναλύθηκαν σε ιστούς όγκων με ανοσοϊστοχημεία με αντιπροσωπευτικές εικόνες έδειξαν (μεγεθύνσεις, × 400). Ε Ποσοτικοποίηση του σχηματισμού μικροαγγείων σε όγκους με τροποποιημένα επίπεδα RUNX3. MVD αξιολογήθηκε μέσω της καταμέτρησης του σκάφους. Οι αριθμοί των χρωματισμένων μικροαγγείων ήταν τυφλά αξιολογηθεί σε 5 τυχαία πεδία ανά εμφύτευμα σε 200 × μεγεθύνσεις. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά από τους ελέγχους (

P

& lt? 0,05).

Η

Για να εξεταστεί αν η καταστολή της ανάπτυξης του όγκου συνδέεται με την επίδραση των ένεση RUNX3 σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα, η όγκοι ανατμήθηκαν για να εξετάσει την έκφραση RUNX3 με ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6C, η πρωτεΐνη RUNX3 ήταν overexpressesed σε RUNX3 ένεση ξενομοσχεύματος σε σύγκριση με χαμηλή έκφραση RUNX3 στην ομάδα ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα ενισχυθεί περαιτέρω η σημαντική επίδραση της καταστολής RUNX3 στην ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη.

Αποκατάσταση RUNX3 Έκφραση μειωμένη αγγειογένεση in vivo

Δεδομένου ότι RUNX3 δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων in vitro, είναι πιθανό ότι RUNX3 καταστέλλεται ογκογένεση in vivo μέσω αποκλεισμού VEGF σε ενδοθηλιακά κύτταρα (αγγειογένεση). Έχουμε έτσι δοκιμαστεί η επίδραση του RUNX3 επί της αγγειογένεσης. DU145 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά RUNX3 ή ελέγχου φορέων αναμίχθηκαν με Matrigel και εγχύθηκε σε αμφότερες τις πλευρές των γυμνών ποντικών. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν 56 ημέρες μετά την εμφύτευση. Ο αριθμός των VIII-θετικών μικροαγγείων ήταν πολύ χαμηλότερη στα τμήματα από ξενομοσχεύματα του RUNX3 κυττάρων που εκφράζουν DU145 (Εικ. 6C και D), υποδεικνύοντας ότι RUNX3 εξασθενημένο κύτταρο καρκίνου του προστάτη επάγει αγγειογένεση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αλλοιωμένη ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση με αποκατασταθεί έκφραση RUNX3 συσχετίστηκε με αλλαγμένη αγγειογένεση.

Συζήτηση

Ο ρόλος του RUNX3 στην ογκογένεση έχει μελετηθεί εκτεταμένα τα τελευταία χρόνια. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση RUNX3 μειώθηκε σε πολυάριθμους τύπους ανθρώπινων καρκίνων, όπως του καρκίνου του μαστού, ορθοκολικό καρκίνο, καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων, μελάνωμα [8], [11], [13], [18]. Υπήρξε απόδειξη ότι RUNX3 μεθυλίωση ήταν ιδιαίτερα συχνό σε διάφορες πληθυσμιακές ομάδες των καρκίνων του προστάτη αλλά όχι σε φυσιολογικά βλεννογόνο του προστάτη [19], [20]. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν έναν σημαντικό ρόλο για RUNX3 σε ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, δεν έχει εξεταστεί η λειτουργία του RUNX3 στον καρκίνο του προστάτη. Καλύτερα να κατανοήσουν ο ακριβής ρόλος του RUNX3 στην ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη, χρησιμοποιήσαμε τεχνολογία ΤΜΑ, in vitro μοντέλο των κυττάρων και in vivo ζωικό μοντέλο για τη διερεύνηση του ρόλου της RUNX3 στον καρκίνο του προστάτη. κλινικά αποτελέσματα μας έδειξαν ότι RUNX3 χάθηκε στον καρκίνο του προστάτη και συσχετίζεται με το στάδιο TNM. in vitro μελέτες μας αποκάλυψαν ότι RUNX3 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη μειώνει τη μετανάστευση των κυττάρων, την εισβολή και την αγγειογένεση ικανότητες, που ήταν σύμφωνο με τη λειτουργία του RUNX3 in vivo.

Η χειρουργική εκτομή είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη στρατηγική στη θεραπεία με την πρωτογενή καρκίνο του προστάτη [2]. Ωστόσο, για τους ασθενείς με τα προηγμένα ασθένειες, η χειρουργική επέμβαση δείχνει λιγότερο benifits [21]. Έτσι, είναι απαραίτητο να προβλεφθεί ο κίνδυνος υποτροπής για την ελαχιστοποίηση των αρνητικών επιπτώσεων και τη μεγιστοποίηση του θεραπευτικού αποτελέσματος της θεραπείας του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, τα διαθέσιμα προγνωστικών παραγόντων για τον καρκίνο του προστάτη, το πιο σημαντικό είναι το στάδιο Διεθνής Ένωση κατά του Καρκίνου ΤΝΜ όπως καθορίζεται από το βάθος της εισβολής, συμμετοχή των λεμφαδένων, και η παρουσία των μακρινών μετάσταση [14]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η έκφραση RUNX3 χάθηκε στον ιστό του καρκίνου του προστάτη. Επιπλέον, η πρωτεΐνη RUNX3 ήταν σημαντικά μειωμένη σε προχωρημένο στάδιο (Εικ. 1). κλινικά στοιχεία μας υποστήριξε με σαφήνεια την άποψη ότι η αλλοιωμένη έκφραση του RUNX3 συμβάλλει στην ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη και μετάσταση. Έχει αναφερθεί ότι η μειωμένη έκφραση του RUNX3 ήταν συχνά προκαλούνται από CpG νησιού υπερμεθυλίωση [19]. Επιπλέον, σημειακές μεταλλάξεις του RUNX3 παρατηρήθηκαν σε γαστρικό και της ουροδόχου κύστης καρκίνους [22], [23].