Αφηρημένο

Ιστορικό

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο, παρά το γεγονός ότι η ανίχνευση του καρκίνου σε αρχικά στάδια αποτελέσματα στο ποσοστό επιβίωσης πάνω από 90%. Επί του παρόντος, λιγότερο από το 45% των ατόμων υψηλού κινδύνου στις ΗΠΑ ελέγχονται τακτικά, εκθέτοντας την ανάγκη για καλύτερη δοκιμές διαλογής. Πραγματοποιήσαμε δύο μελέτες ασθενών-μαρτύρων για να επικυρώσει μια δοκιμασία με βάση το αίμα που προσδιορίζει μεθυλιωμένο DNA στο πλάσμα από όλα τα στάδια της CRC.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία PCR για την ανάλυση των

Septin 9

(SEPT9) υπερμεθυλίωση στο DNA που εξάγεται από το πλάσμα, κλινική απόδοση βελτιστοποιήθηκε σε 354 δείγματα (252 CRC, 102 έλεγχοι) και να επικυρώνονται με τυφλό, ανεξάρτητη μελέτη των 309 δειγμάτων (126 CRC, 183 έλεγχοι). 168 πολύποδες και 411 επιπλέον ελέγχους ασθένεια αξιολογήθηκαν επίσης. Με βάση την μελέτη κατάρτισης ταξινόμηση SEPT9 με βάση ανιχνεύεται 120/252 CRCs (48%) και 7/102 ελέγχους (7%). Στη μελέτη δοκιμή 73/126 CRCs (58%) και 18/183 δείγματα ελέγχου (10%) ήταν θετικά για SEPT9 την επικύρωση των σετ εκπαίδευσης αποτελέσματα. Συμπερίληψη επιπλέον επαναληπτικές μετρήσεις αύξησε την ευαισθησία του προσδιορισμού στο σύνολο δοκιμής σε 72% (90/125 CRCs ανιχνεύεται), διατηρώντας παράλληλα το 90% ειδικότητα (19/183 για τους ελέγχους). Θετικές τιμές για πλάσματα από τις άλλες μορφές καρκίνου (11/96) και μη καρκινικές καταστάσεις (41/315) ήταν χαμηλές. Το ποσοστό ανίχνευσης των πολυπόδων (& gt? 1 cm) ήταν περίπου 20%

Συμπεράσματα /Σημασία

Ανάλυση των SEPT9 μεθυλίωσης του DNA στο πλάσμα αντιπροσωπεύει μια απλή, ελάχιστα επεμβατική μέθοδος για την ανίχνευση όλων των σταδίων της. CRC με δυνατότητα να ικανοποιήσουν ανικανοποίητες ανάγκες για αυξημένη συμμόρφωση στον πληθυσμό ελέγχου. Περαιτέρω κλινικές δοκιμές είναι δικαιολογημένη

Παράθεση:. Grützmann R, Molnar Β, Pilarsky C, Habermann JK, Schlag μμ, Saeger HD, et al. (2008) ευαίσθητη ανίχνευση του καρκίνου του παχέος εντέρου στο περιφερικό αίμα από Δοκιμασία Septin 9 μεθυλίωσης του DNA. PLoS ONE 3 (11): e3759. doi: 10.1371 /journal.pone.0003759

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, City of Hope Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Αύγ, 2008? Αποδεκτές: 21 Οκτωβρίου 2008? Δημοσιεύθηκε: 19 Νοεμ 2008

Copyright: © 2008 Grützmann et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από Epigenomics AG, στο Βερολίνο. Ο χορηγός μελέτη συμμετείχαν στο σχεδιασμό της μελέτης και της ανάλυσης των δειγμάτων. Ερμηνεία των δεδομένων και τη σύνταξη του εγγράφου, καθώς και την απόφαση να το υποβάλει προς δημοσίευση έγινε από όλους τους συγγραφείς, συμπεριλαμβανομένων των συγγραφέων που χρησιμοποιούνται από τον χορηγό

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Fabian μοντέλο, Volker Liebenberg, Theo deVos, Xiaoling Song, Robert H. Day, Andrew Z.Sledziewski και Catherine Lofton-Day απασχολούνται σε Epigenomics, τον χορηγό της μελέτης.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι ένα από τα πιο κοινά νεοπλάσματα που βρέθηκαν σε άνδρες και γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες. Η Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία είχε εκτιμήσει ότι 154.000 νέες περιπτώσεις CRC θα συμβεί το 2007, με αποτέλεσμα πάνω από 52.000 θανάτους. Η διαλογή των προγραμμάτων για τον εντοπισμό πρώιμων CRC στάδιο και προ-νεοπλασματικές καταστάσεις μπορεί να βελτιώσει σημαντικά την πορεία της νόσου, λόγω του οφέλους θεραπεία της έγκαιρης ανίχνευσης [1]. Τρέχουσες διαδικασίες ελέγχου μη επεμβατική, δεν είναι πολύ αποτελεσματική, δεδομένου ότι απαιτούν συμμόρφωση των ασθενών να αυτο-συλλογή δειγμάτων κοπράνων αναλύονται ετησίως για την παρουσία της λανθάνουσας αιμορραγίας (FOBT) [2]. Μέχρι σήμερα, οι βελτιώσεις στα περιττώματα που βασίζεται δοκιμές καθιστώντας τα πιο ευαίσθητα και πιο φιλική προς το χρήστη, δεν έχουν αυξηθεί σύμφωνα με CRC έλεγχο. Επεμβατικές δοκιμές διαλογής, όπως κολονοσκόπηση ή σιγμοειδοσκόπηση, αν και πιο αποτελεσματική, απαιτεί εκτεταμένη προετοιμασία του εντέρου, παραβίαση της ιδιωτικής ζωής, και καταστολή, και δεν ξεπεραστούν τα τρέχοντα ζητήματα συμμόρφωσης CRC έλεγχο. Υπάρχει αυξανόμενη προσδοκία ότι η νέα γενιά των δοκιμών διαλογής που βασίζεται στη μοριακή βιοδεικτών στο αίμα θα πρέπει να βελτιωθεί η συμμόρφωση του ασθενούς στη CRC ελέγχου, όπως αποδεικνύεται από την επιτυχία των άλλων προγραμμάτων προσυμπτωματικού ελέγχου, όπως η χοληστερόλη /λιπιδίων και ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA) [5] – [7].

Προσδιορισμός των επιγενετικών γεγονότων είναι ένας ισχυρός υποψήφιος για την πρώιμη ανίχνευση της ασθένειας αφού ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης από ανώμαλη μεθυλίωση του DNA είναι μια καλά χαρακτηρισμένη συμβάν στη βιολογία του όγκου [8], [9], και περιγράφεται εκτενώς για CRC [10] – [12]. Αυξημένα επίπεδα του ελεύθερου κυκλοφορεί μεθυλιωμένο DNA στο αίμα των ασθενών με καρκίνο σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες έχουν αναφερθεί [13], [14]. Διάφορα εργαστήρια ανέφεραν επίσης ελπιδοφόρα υποψήφια δείκτη μεθυλίωση με βάση DNA για την ανίχνευση του CRC [15] – [19]. Μεταφράζοντας οι υποψήφιοι δείκτη σε κλινικά επικυρωθεί και εμπορικά βιώσιμη δοκιμές ήταν εξαιρετικά αργή και ανεπαρκής. Για τη διευκόλυνση βελτιώσεις στη μετάφραση βιοδείκτη ιατρική Pepe

et al.

Πρότεινε μια συστηματική διαδικασία για την επικύρωση των βιοδεικτών για την έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου με 5 διακριτές φάσεις, κάθε φάση παρέχοντας αυξημένο επίπεδο των αποδεικτικών στοιχείων της επικύρωσης δείκτη [20]. Σε μια πρώτη μελέτη που παρουσίασε το πρώτο επίπεδο των αποδεικτικών στοιχείων που SEPT9, ένας βιολογικός δείκτης μεθυλίωσης του DNA με βάση, διακρίσεις αποτελεσματικά CRC από την κανονική δείγματα [21]. Το γονίδιο Septin 9 ανήκει σε μια κατηγορία GTPases εμπλέκονται σε πολλές κυτταρικές διεργασίες [22] .Η γονιδίου έχει αποδειχθεί ότι έχει πολλαπλούς εναλλακτικά ματισμένες μεταγραφές που κωδικοποιεί τουλάχιστον 5 χαρακτηριζόμενη πολυπεπτίδια χαρακτηρίζονται v1-V5 [23], μερικές από τις οποίες έχουν συσχετιστεί με καρκίνο. Η αναλογία του V4 και V4 * έκφραση, ταυτόσημες πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από διαφορετικά προϊόντα μεταγραφής, έχει φανεί ότι μεταβάλλεται σε καρκίνο των ωοθηκών με V4 είναι η κυρίαρχη μορφή που εκφράζεται σε φυσιολογικά κύτταρα και V4 * εκφράζεται σε όγκους [24]. Πρόσφατες μελέτες της ισομορφής v1 υποδηλώνουν ότι η υπερ-έκφραση αυτού του πολυπεπτιδίου μπορεί να προωθήσει την εξέλιξη του όγκου σε ιστό μαστού [25]. προηγούμενη εργασία μας που περιγράφει παρεκκλίνουσα μεθυλίωση στην περιοχή υποκινητή της μεταγραφής v2 υποδεικνύει ότι η μεθυλίωση σε αυτήν την περιοχή σχετίζεται με καρκίνο του παχέος εντέρου [21]. Προχωρώντας προς τα εμπρός στη διαδικασία που προτείνει Pepe

et al

, στην έκθεση αυτή θα παρέχει το δεύτερο επίπεδο των αποδεικτικών στοιχείων, παρουσιάζοντας τα αποτελέσματα από την επικύρωση της κλινικής δοκιμασίας για SEPT9 σε δύο μεγάλες ανεξάρτητες ομάδες πλάσμα αποδεικνύοντας τις δυνατότητες αυτού του δείκτη για έγκαιρη ανίχνευση του CRC. Η αύξηση του αριθμού των επαναλήψεων της δοκιμασίας προσδιορισμού κατέληξε σε υψηλή ευαισθησία για CRC με εξαιρετική εξειδίκευση στους υγιείς μάρτυρες. Η ειδικότητα αξιολογήθηκε περαιτέρω σε έναν αριθμό ελέγχων νόσου. Τέλος, η SEPT9 μεθυλίωση των προκαρκινικών βλαβών έχει αναφερθεί.

Μέθοδοι

Ασθενείς

700 δείγματα ασθενών που συλλέγονται σε 9 περιοχές μετρήθηκαν στην μελέτη της κατάρτισης. Περιελάμβανε ασθενείς με όλα τα στάδια καρκίνου του παχέος εντέρου, τα άτομα χωρίς ασθένειες του παχέος εντέρου, όπως επαληθεύεται από την κολονοσκόπηση, πρόσθετους ελέγχους ασθένεια και έναν αριθμό ασθενών με αδενωματώδεις πολύποδες (Πίνακας 1). Ένα υποσύνολο των 354 δειγμάτων (μόνο CRCs και φυσιολογικά με πλήρη μέτρηση SEPT9) χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργηθεί το σύνολο εκπαίδευσης αλγόριθμο. Η μελέτη δοκιμή αποτελούνταν από 547 δείγματα ασθενούς (ένα υποσύνολο των 309 CRCs και φυσιολογικά με πλήρη μέτρηση SEPT9 χρησιμοποιήθηκε ως ένα σύνολο δοκιμής) συλλέγονται σε 14 θέσεις και περιλάμβαναν παρόμοιες κλινικές κατηγορίες δειγμάτων, όπως χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη της κατάρτισης. Πρόσθετοι έλεγχοι νόσος συλλέχθηκαν από άτομα με μη παχέος εντέρου και διάφορες μη-καρκινικές ασθένειες για τις πρόσθετες δοκιμές εξειδίκευσης. Δεν είναι όλα αυτά τα θέματα επαληθεύθηκαν με κολονοσκόπηση ως CRC-και /ή αδένωμα-free. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη ακολουθώντας τις τοπικές ηθικές κατευθυντήριες γραμμές.

Η

Όλοι οι ασθενείς με καρκίνο και των υγιών μαρτύρων που εγγράφονται στις δύο μελέτες ήταν τουλάχιστον 40 ετών με προτίμηση για τους ασθενείς 50 ετών και άνω και που προέρχονται κατά κύριο λόγο από τις ίδιες κλινικές. Όλα τα άτομα που συμμετέχουν δεν είχε ούτε μια προσωπική ιστορία του HIV, HBV ή HCV ή προηγούμενο ιστορικό καρκίνου, με εξαίρεση καρκινώματος ούτε συμπτώματα της σοβαρής οξείας ούτε επιδεινώνεται χρόνιας νόσου. Βασικοκυτταρικό καρκίνωμα

αίματος από όλα τα άτομα έχει συνταχθεί είτε πριν ή περισσότερο από 2 ημέρες και μέχρι 6 μήνες μετά την κολονοσκόπηση και πριν από την έναρξη κάθε ειδική θεραπεία του καρκίνου. διάγνωση του καρκίνου επιβεβαιώθηκε ιστολογικά από τις χειρουργικές δείγμα και μόνο αδενοκαρκινώματα συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη.

ροής επεξεργασίας δειγμάτων

Μια ροή εργασίας 3-μέρος αναπτύχθηκε για τη δοκιμή SEPT9 (Σχήμα 1). DNA Extraction: Ελεύθερη διακύμανση κυκλοφορούν DNA εκχυλίζεται από το πλάσμα με τη χρήση του μεγάλου όγκου κιτ εξαγωγής DNA Σύνολο νουκλεϊνικών οξέων (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) και η συσκευή Roche MagNaPure. Οκτώ ή 16 ml πλάσματος διανέμονται σε φρεάτια MagNaPure (1 mL ανά χώρισμα), εκχυλίζεται ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κιτ, και το DNA εκλούστηκε σε δείγματα 100 μL. Τα εκλούσματα από κάθε ασθενή συνενώθηκαν και συμπυκνώθηκαν σε ένα τελικό όγκο 100 μΐ χρησιμοποιώντας Microcon ΥΜ-30 φίλτρα (Millipore). Ένα κλάσμα 5 μL από κάθε δείγμα διατηρήθηκε για τη μέτρηση ολικού γενωμικού DNA χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία PCR πραγματικού χρόνου (CFF1) που περιγράφεται στο συμπληρωματικό πίνακα S1. Κατεργασία όξινου θειώδους: δείγματα Συμπυκνωμένο DNA ήταν κατεργασμένο με όξινο θειώδες χρησιμοποιώντας μεθόδους για την επίτευξη της μέγιστης μετατροπής και ανάκτηση του DNA [35]. Ένα κλάσμα 5 μL από κάθε δείγμα διατηρήθηκε για τη μέτρηση της συνολικής κατεργασία με όξινο θειώδες DNA χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία PCR πραγματικού χρόνου (HB14) που περιγράφεται στο συμπληρωματικό πίνακα S1. Real Time PCR Ανάλυση: Ο πραγματικός χρόνος SEPT9 δοκιμασία PCR έχει σχεδιαστεί περιβάλλει τη θέση έναρξης της μεταγραφής της μεταγραφής V2. Η διαδικασία ακολουθίες δοκιμασία σε πραγματικό χρόνο, τις συνθήκες ποδηλασίας και τον έλεγχο της ποιότητας περιγράφονται στο συμπληρωματικό κείμενο S1 και Συμπληρωματική Εικόνα S1. Για ολική γονιδιωματική και ολικές DNA όξινο θειώδες μετατρέπεται, PCR πραγματοποιήθηκε σε αραίωση 1:10 (σε ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης) των αντίστοιχων υλικών. Για μετρήσεις σε δείγματα SEPT9, οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε 10-12,5 μί μη αραιωμένου DNA, ανάλογα με το πείραμα. PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη συσκευή Roche LightCycler 2.0 με το κύριο μίγμα FastStart DNA κύριο HybProbe (Roche Applied Science). Κάθε εκτέλεση PCR περιλαμβάνεται μια καμπύλη DNA πρότυπο παρασκευάσθηκε χρησιμοποιώντας επεξεργασία διθειώδους CpGenome καθολική μεθυλιωμένο ϋΝΑ (Millipore (Chemicon), Billerica, ΜΑ) σε συγκεντρώσεις μεταξύ 50 pg /rxn-20 ng /rxn. Κάθε κίνηση περιελάμβανε επίσης ένα στοιχείο ελέγχου χωρίς πρότυπο το οποίο αφέθηκε μη προσαρμοσμένων σε όλη τη διαδικασία για τον έλεγχο της μόλυνσης, και 3 έλεγχοι χωρίς εκμαγείο που χρησιμοποιήθηκαν για τον καθορισμό της βασικής γραμμής της αντίδρασης PCR. Τα δείγματα αναλύθηκαν ως ενιαίο τριχοειδή αγγεία σε κάθε εκτέλεση PCR, και επαναλήψεις πραγματοποιήθηκαν σε ξεχωριστές PCR τρέχει. καμπύλες ενίσχυσης για κάθε αντίδραση ήταν το χέρι επαληθεύεται από 2 ανεξάρτητους κριτές.

Το διάγραμμα απεικονίζει τα κύρια στάδια επεξεργασίας του δείγματος και εργαστηριακές ροή εργασίας. Δείχνει όπου τα δείγματα ελέγχου διεργασίας εισάγεται εντός του ροή εργασίας και τι δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση της παραγωγής του κάθε σταδίου της διαδικασίας. Γκρι πλαίσια δείχνουν τεστ που συγκεκριμένα βήματα της ροής εργασίας.

Η

Η ανάλυση των δεδομένων

Τα δείγματα των ασθενών για την κατάρτιση και τη δοκιμή της μελέτης ομαδοποιούνται ανάλογα με τη διάγνωση και το φύλο και τυχαία σε παρτίδες εκχύλιση του DNA. Εκτός από τα δείγματα της μελέτης δοκιμής τυφλωμένοι πριν από την επεξεργασία της εργαστηριακής ανάλυσης και δεδομένων. Ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR δειγμάτων πλάσματος διεξήχθη όπως περιγράφεται νωρίτερα και επαναληπτικές ο μέσος όρος των μετρήσεων. [21] δοκιμή τετράγωνο Chi χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθούν τα ποσοστά ανίχνευσης μεταξύ των διαφόρων τοποθεσιών του όγκου, την ηλικία, το στάδιο του όγκου και των δύο φύλων. δοκιμή Wilcoxon-Mann-Whitney και δοκιμή Kruskall-Wallis χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση ποσοτικά μεθυλιωμένα συγκεντρώσεις Septin 9 DNA μεταξύ των διαφόρων τοποθεσιών του όγκου, την ηλικία, το στάδιο του όγκου και των δύο φύλων. διαστήματα εμπιστοσύνης για τις αναλογίες των ανιχνεύθηκαν δείγματα ορίζεται σε 95% και με βάση την διωνυμική κατανομή. Όλες οι τιμές P είναι δύο όψεων.

Αποτελέσματα

Ο στόχος αυτής της έρευνας ήταν να επικυρώσει τη χρήση SEPT9 υπερμεθυλίωση ως βιοδείκτη για καρκίνο του παχέος εντέρου με τον προσδιορισμό της βέλτιστης ταξινομητή χρησιμοποιώντας ένα σύνολο δειγμάτων (μελέτη κατάρτιση) και επιβεβαιώνοντας την επιλεγμένη ταξινομητή σε ένα ανεξάρτητο σύνολο του δείγματος (μελέτη δοκιμή). Κάθε δείγμα πλάσματος υποβλήθηκε σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας μια ροή εργασίας τριών βημάτων που περιγράφονται στο Σχήμα 1. Η διαδικασία της ροής εργασίας ήταν παρακολουθείται προσεκτικά με την προσθήκη των θετικών και αρνητικών μαρτύρων σε κάθε βήμα της διαδικασίας και μεμονωμένα δείγματα έγιναν δεκτές για την τελική ανάλυση μετά το πέρασμα προδιαγραφές ελέγχου ποιότητας (βλ Συμπληρωματικές Κείμενο S1).

κατάρτιση μελέτη

Οι δημογραφικές και κλινικές παραμέτρους των θεμάτων που περιλαμβάνονται στη μελέτη εκπαίδευσης περιγράφονται στον πίνακα 1. Τριακόσια πενήντα τεσσάρων καρκίνο του παχέος εντέρου και φυσιολογικά δείγματα ελέγχου που περιλαμβάνονται στο η κύρια ανάλυση των δεδομένων. Τα δεδομένα της μελέτης κατάρτισης αναλύθηκαν ποιοτικά, όπου μια αντίδραση SEPT9 ονομαζόταν θετική εάν ανιχνεύθηκε μια ξεχωριστή καμπύλη PCR. Κάθε δείγμα πλάσματος μετρήθηκε σε τρεις ανεξάρτητες αντιδράσεις PCR και με βάση την ανάλυση της κλινικής απόδοσης, τα δείγματα των ασθενών ταξινομήθηκαν ως θετική εάν δύο από τις τρεις επαναλήψεις PCR που ονομάζεται θετική. Με βάση αυτήν την ποιοτική αλγόριθμο μετρήσαμε ευαισθησία 48% για καρκίνο του παχέος εντέρου και ειδικότητα 93% για τις μη παχέος νόσο δείγματα κολονοσκόπηση-επαληθευτεί. Εναλλακτικά, μπορούμε προσδιορίζεται η βέλτιστη όρια με βάση ποσοτική ανάλυση του δείκτη SEPT9. Αυτοί οι ποσοτικοί αλγόριθμοι δεν βελτίωσε τη συνολική απόδοση δείκτη (βλέπε συμπληρωματικό πίνακα S2). Χρησιμοποιώντας την ποιοτική ανάλυση, αναλύσαμε συσχετίσεις μεταξύ ανίχνευσης του καρκίνου του παχέος εντέρου και διαφορετικές κλινικές παραμέτρους. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο ποσοστό ανίχνευσης από τη θέση του όγκου, την ηλικία ή το φύλο. Πρώιμο στάδιο των καρκίνων του παχέος εντέρου εντοπίστηκαν σε ελαφρώς χαμηλότερα ποσοστά (43%) από ό, τι αργότερα καρκίνους στάδιο (55%), αλλά η διαφορά δεν ήταν σημαντική. Επίσης δεν υπήρχε σημαντική ποσοτική διαφορά μεταξύ των ποσών των μεθυλιωμένων DNA SEPT9 μεταξύ των διαφόρων σταδίων (Σχήμα 2Α). Ο δείκτης SEPT9 ανιχνεύεται επίσης το 22% των πολυπόδων μεγαλύτερο από 1 cm.

Box-εκατοστημόριο οικόπεδα του συνόλου εκπαίδευσης μεθυλιωμένο SEPT9 DNA οι συγκεντρώσεις στο πλάσμα εμφανίζονται για φυσιολογικούς ασθενείς κολονοσκόπηση-επαληθεύεται (Normal) και σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου ( CRC). Μέσες συγκεντρώσεις DNA είναι κόκκινες οριζόντιες γραμμές? 25ο και 75ο εκατοστημόριο είναι μπλε οριζόντιες γραμμές. Το πλάτος της Θηκόγραμμα εκατοστημόριο σε οποιοδήποτε δεδομένο ύψος είναι ανάλογη με το ποσοστό των παρατηρήσεων που είναι πιο ακραία προς την κατεύθυνση που οδηγεί μακριά από το διάμεσο. Οι μεμονωμένες τιμές μέτρησης απεικονίζονται ως γκρι κύκλους. Β) οικόπεδα Box-εκατοστημόριο του συνόλου δοκιμών μεθυλιωμένο συγκεντρώσεις SEPT9 DNA στο πλάσμα.

Η

Μελέτη Test

Για να επιβεβαιώσετε την κλινική απόδοση του αλγορίθμου εκπαίδευσης SEPT9 συλλέξαμε δείγματα πλάσματος από έναν ανεξάρτητο σύνολο των ασθενών (σύνολο δοκιμής – Πίνακας 1). Σε σύγκριση με την εκπαίδευση που το σύνολο δοκιμής που περιέχονται σημαντικά λιγότερους καρκίνους πρώιμο στάδιο και ασθενείς με καρκίνο ήταν ελαφρώς μεγαλύτερης ηλικίας. Χρησιμοποιώντας το όριο SEPT9 καθορίζεται στη μελέτη της κατάρτισης ήμασταν σε θέση να επιβεβαιώσει την απόδοση του δείκτη στο σύνολο ελέγχου των 309 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και υγιείς μάρτυρες με ευαισθησία 58% και ειδικότητα 90% (Πίνακας 2).

Η

δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο ποσοστό ανίχνευσης από τη θέση του όγκου, την ηλικία ή το φύλο. καρκίνοι του παχέος εντέρου πρώιμο στάδιο εντοπίστηκαν σε χαμηλότερες τιμές (36%) από ό, τι αργότερα καρκίνους στάδιο (73%), αλλά η διαφορά στο ποσοστό ανίχνευσης δεν ήταν σημαντική. Ωστόσο, υπήρξε μία σημαντική ποσοτική διαφορά μεταξύ των ποσών των μεθυλιωμένων DNA SEPT9 μεταξύ των διαφόρων σταδίων (Ρ & lt? 0,002? Σχήμα 2Β). Μεγάλες πολύποδες (& gt? 1 cm). Ανιχνεύτηκαν σε ποσοστό 18%

Βελτιωμένη διαδικασία αποδίδει καλύτερα SEPT9 απόδοση

Κατά τη διάρκεια της ρουτίνας έλεγχο της ποιότητας μας, παρατηρείται σποραδική αναστολή της αντίδρασης PCR (βλέπε συμπληρωματική Εικόνα S2). Ως εκ τούτου αναλύσαμε ένα επιπλέον επαναληπτικές SEPT9 χρησιμοποιώντας 10 δείγματα φορές-αραιωμένο διαθέσιμη από τις αρχικές μετρήσεις συνολικών δις-DNA. Το οικόπεδο συσχέτιση του προτύπου μέτρησης SEPT9 (μέσος όρος των τριών πρότυπο επαναλήψεων) και μία μέτρηση του αραιωμένου δείγματος φαίνεται στο Σχήμα 3.

X-άξονα – συγκέντρωση SEPT9 σε πρότυπα δείγματα σύνολο ελέγχου (μέση τιμή τρεις τυπικές επαναλήψεις) Y-άξονα – συγκέντρωση SEPT9 στο 1:10 αραιωμένα σύνολο δοκιμής δειγμάτων (απλούν). MDNA – μεθυλιωμένο DNA. Ομάδα 1 – δείγματα με την ίδια ενίσχυση SEPT9 στο πρότυπο και συγκέντρωση αραιωμένου, ομάδα 2 – δείγματα με ενίσχυση SEPT9 μόνο στην τυπική συγκέντρωση, ομάδα 3 – δείγματα με ενίσχυση SEPT9 μόνο σε συγκέντρωση αραιωμένου. Πράσινο τρίγωνα – υγιή άνω και κάτω τελεία, κόκκινους κύκλους – καρκίνο του παχέος εντέρου, μαύρα τετράγωνα – πολύποδες

Η

Υπάρχουν τρεις ομάδες δειγμάτων:. Ομάδα1 στην οποία SEPT9 ενίσχυση ήταν πανομοιότυπη σε τυποποιημένα και τα αραιωμένα δείγματα, ομάδα 2, στην οποία μόνο δείγματα τυποποιημένη συγκέντρωση ενισχύεται και η ομάδα 3 στην οποία μόνο τα αραιωμένα δείγματα ενισχύονται. Ομάδα 2 αποτελείται από δείγματα για τα οποία δεν παρατηρήθηκε αναστολή PCR, αλλά περιείχαν τα επίπεδα του DNA του όγκου ανεπαρκής για την ενίσχυση του SEPT9 μετά την αραίωση. Ομάδα 3 δείγματα εμφανίζονται αναστολή PCR σε πρότυπη συγκέντρωση, αλλά όταν αραιωθεί, έδειξε SEPT9 ενίσχυση. Έχουμε ενσωματώσει το αποτέλεσμα της πρόσθετης αυτής της μέτρησης σε ένα νέο αλγόριθμο με τον οποίο ένα δείγμα του ασθενούς ταξινομείται θετικό εάν είτε δύο από τις τρεις τυπικές επαναλήψεις PCR είναι θετική (σύνολο εκπαίδευσης αλγόριθμο) ή η μέτρηση του αραιωμένου δείγματος είναι θετική. Reanalysis των σετ δοκιμών αποτελέσματα χρησιμοποιώντας αυτόν τον αλγόριθμο βελτίωσε δραματικά την απόδοση του προσδιορισμού SEPT9 (Πίνακας 2).

Συνολικά παχέος ανίχνευση του καρκίνου έφθασε το 72%, διατηρώντας παράλληλα πολύ υψηλή ειδικότητα 90%. Ιδιαίτερα εντυπωσιακή ήταν βελτιώσεις στην ανίχνευση του καρκίνου πρώιμο στάδιο (στάδιο I /II – ευαισθησία 62%). Επιβεβαιώνοντας την πιθανή αξία των SEPT9 ως πρώιμο δείκτη ανίχνευσης για καρκίνο του παχέος εντέρου

Μη καρκίνου του παχέος εντέρου (NCC) και μη καρκινικές ασθένειες (NCD) δείγμα ανάλυση

επίσης συλλέγονται και αναλύονται ένα υποσύνολο των δειγμάτων πλάσματος από ασθενείς με διάγνωση μη ορθοκολικούς καρκίνους (NCC), συμπεριλαμβανομένων της ουροδόχου κύστης, του μαστού, του πνεύμονα, του ήπατος, του παγκρέατος και καρκίνοι του προστάτη, καθώς και μη -cancerous ασθένεια που μπορεί να έχουν σύγχυση επιπτώσεις στην απόδοση δείκτη SEPT9. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, SEPT9 είναι εξαιρετικά ειδικό για τον καρκίνο του παχέος όταν συγκρίνεται με την ανίχνευση ΕΚΚΠ: μόνο μερικά δείγματα πλάσματος από καρκίνο του ήπατος (2 από 8 δείγματα), ο καρκίνος του πνεύμονα (4 από 13) και του καρκίνου της ουροδόχου κύστης (4 από 19) ασθενείς ήταν θετικό για το δείκτη. Το χαμηλό ποσοστό των SEPT9 παρόν σε πολλαπλές ομάδες μη καρκινική νόσο, π.χ. χρόνια νεφρική ανεπάρκεια, γαστρίτιδα, και χρόνιες αναπνευστικές λοιμώξεις (βλέπε Πίνακα 3) σημεία στην υψηλή εξειδίκευση του για τον ορθοκολικό καρκίνο κακοήθειας.

Η

Συζήτηση

Στην έκθεση αυτή προσδιορίζονται απόδοση ενός πραγματικού δοκιμασία -Time PCR για μεθυλιωμένο DNA SEPT9 πρώτα σε μια μελέτη εκπαίδευση και στη συνέχεια με ένα τυφλό ανεξάρτητη μελέτη δοκιμών. Συνολική ευαισθησία για παχέος εντέρου ήταν συγκρίσιμη και στις δύο μελέτες, όπως προσδιορίζονται χρησιμοποιώντας το αρχικό αλγόριθμο εκπαίδευσης. Ευαισθησία αυξήθηκε σε 72% με ένα πρόσθετο SEPT9 αντιγραφή της 10-πλάσια του δείγματος αραιωμένου πλάσματος. Ο δείκτης δείχθηκε να είναι ευαίσθητη για καρκίνους του παχέος αρχικών σταδίων προσδιορισμό 62% του Σταδίου CRCs Ι /ΙΙ. Υπήρχε μια τάση για καρκίνους του παχέος εντέρου νωρίς για να ανιχνευθούν σε ελαφρώς χαμηλότερα ποσοστά από ό, τι αργότερα καρκίνους στάδιο τόσο στην μελέτη της κατάρτισης και τις δοκιμές, αλλά οι διαφορές δεν ήταν σημαντικές λόγω του ανεπαρκούς αριθμού των δειγμάτων για κάθε επιμέρους στάδιο του καρκίνου. Η ευαισθησία της ανίχνευσης CRC ήταν εντελώς ανεξάρτητη από τη θέση του όγκου στο παχύ έντερο. Αυτό μπορεί να είναι ένα γενικό χαρακτηριστικό των βιοδεικτών μεθυλίωσης από το Τσεν

et al.

Σημείωσε μια παρόμοια έλλειψη συσχετισμού με το στάδιο ή θέση σε μια πρόσφατη μελέτη στα κόπρανα των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου [26]. Άλλες κοπράνων εξετάσεις όπως FOBT και iFOBT έχει αποδειχθεί ότι έχουν μειωμένη ευαισθησία και για τους δύο εγγύς καρκίνους του παχέος εντέρου και καρκίνους πρώιμο στάδιο [27]. Τέλος, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η βιοδείκτης είναι επίσης πολύ ειδική (90-93%) σε υγιή άτομα.

Έχουμε αναπτύξει μια πολύ ευαίσθητη δοκιμασία PCR για την ανίχνευση μεθυλιωμένου v2 υποκινητή του SEPT9 σε δείγματα πλάσματος. Αποτελεσματική επικύρωση των δοκιμών αυτών να εξαρτάται τόσο από την ποιότητα του βιοδείκτη και για την ποιότητα και τη συνέπεια των βημάτων της ροής εργασίας, συμπεριλαμβανομένης και της τελικής μέτρησης δείκτη. Εμείς ελεγχόμενη ροή εργασίας μας σε κάθε βήμα? αξιολόγηση μεταβλητότητα των εκχύλιση του DNA, διθειώδες μετατροπής και ενίσχυση PCR και λόγω αυτού του ελέγχου ποιότητας ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει σποραδικές αναστολή PCR στο σύνολο δοκιμής. Η υπέρβαση αυτού του ζητήματος αραιώνοντας το PCR αντίδραση 10-φορές και συνδυάζοντας αυτή τη μέτρηση με το μη αραιωμένο μέτρηση έδωσε την πραγματική απόδοση του δείκτη SEPT9. Η χρήση των τεσσάρων δοκιμασία επαναλήψεις (3 τυπικές επαναλήψεις και 1 αραιωμένο) επιτρέπει εναλλακτική ανάλυση εστιάζει είτε σε ευαισθησία ή την ειδικότητα του προσδιορισμού δείκτη. Απαιτώντας SEPT9 να είναι παρούσα σε όλα τα τυποποιημένα επαναλήψεις ή ένα αραιωμένο επανάληψη πριν ένα δείγμα ταξινομείται θετικό, το τεστ επιτυγχάνει πολύ υψηλή ειδικότητα (97%) και εξακολουθεί να διατηρεί σημαντική ευαισθησία (65%). Όταν μόνο 1 από 4 επαναλήψεις (είτε ένα πρότυπο ή ένα αραιωμένο) απαιτείται να είναι θετικό για μια θετική κλήση (λειτουργία υψηλής ευαισθησίας) τα ευαισθησία αυξάνεται σε 77%, ενώ η ειδικότητα είναι ακόμα σεβαστό σε 75% [βλέπε συμπληρωματικό πίνακα S3].

Οι ομάδες ασθενών ελέγχου στις μελέτες μας περιλάμβανε ένα πρωτεύον σύνολο των ατόμων, χωρίς παθήσεις του παχέος εντέρου, όπως επαληθεύεται από την κολονοσκόπηση, αλλά κάποια με συνθήκες που πιθανόν να είναι παρόντες μέσα στον πληθυσμό ελέγχου CRC. Κάναμε κάθε δυνατή προσπάθεια για να αποφευχθεί η στρέβλωση της διαδικασίας επιλογής των ασθενών στη μελέτη, απαιτώντας από τους ελέγχους να είναι στο ίδιο εύρος ηλικίας ως CRCs και να προέρχονται κατά κύριο λόγο από τις ίδιες κλινικές όπως CRC ασθενείς μας. Παρά τις προσπάθειες αυτές κάποιες προκαταλήψεις παρέμεινε: η πλειοψηφία των ασθενών CRC στην κατάρτιση και σετ δοκιμής είναι άνδρες (57% και 60% αντίστοιχα), και σετ δοκιμής οι ασθενείς είναι λίγο μεγαλύτερα από ό, τι εκπαίδευση σύνολο των ασθενών. Ωστόσο, από τη στιγμή που διαπιστώθηκε ότι η ανίχνευση του CRC είναι ανεξάρτητη από την ηλικία και το φύλο η αναφερόμενη απόδοση SEPT9 θα πρέπει να είναι ανεπηρέαστη. πρωταρχική ανάλυση μας συγκρίνει την απόδοση του δείκτη στο πλάσμα από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου εναντίον των θεμάτων χωρίς παχέος νόσο. Είχαμε διενεργήσει επιπρόσθετες αναλύσεις χρησιμοποιώντας μη-καρκινικές ελέγχου των ασθενειών και πλάσματος από καρκίνους πλην του παχέος για τον εντοπισμό δυνητικών ζητημάτων ειδικότητα. Οι αριθμοί των ασθενών με αυτές τις συνθήκες δεν είναι σταθμισμένα σύμφωνα με τον επιπολασμό τους, και ως εκ τούτου αληθινή ιδιαιτερότητα όσον αφορά αυτές τις ασθένειες δεν μπορεί να προσδιοριστεί για τον πληθυσμό ελέγχου στόχου. Δεδομένου ότι η παρατηρούμενη θετική ποσοστό του δείκτη είναι πολύ χαμηλό στα δείγματα ελέγχου, πιστεύουμε ότι ο δείκτης SEPT9 θα έχουν καλές επιδόσεις στο μέλλον προοπτικές κλινικές μελέτες, όταν μετράται σε πληθυσμό CRC έλεγχο.

Η δοκιμή SEPT9 στοχεύει στην ανίχνευση ασυμπτωματικών παχέος περιπτώσεις καρκίνου. Έχουμε λάβει, επίσης, τα προκαταρκτικά στοιχεία για την ανίχνευση πολυπόδων με τη δοκιμασία SEPT9 που δείχνουν κάποια προ-κακοήθεις αλλαγές εντοπίζονται με δοκιμή μας. Η τελική δοκιμή ελέγχου CRC θα πρέπει επίσης να στοχεύουν αδενώματα, που θα προχωρήσει σε καρκίνο και ότι θα μπορούσε να αφαιρεθεί κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης της κολονοσκόπησης. Ενώ σήμερα δεν έχει ακόμη κατανοήσει πλήρως τη φυσική ιστορία των αδενωμάτων, και δεν μπορούμε να προβλέψουμε ποια θα εξελιχθούν σε καρκίνο, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι επιγενετικών δεικτών, όπως SEPT9, μπορεί να βοηθήσει με τέτοια πολύποδα διαστρωμάτωση.

Η

Septin 9

γονίδιο, που ονομάζεται επίσης ΓΧΣ, κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη Septin θηλαστικών που εμπλέκονται σε πολλές κυτταρικές διεργασίες. Η διακοπή της δράσης της

Septin 9

αποτέλεσμα ατελή διαίρεση κυττάρου [28].

Septin 9

και άλλες πρωτεΐνες έχουν δειχθεί ότι είναι συνεργάτες σύντηξης του πρωτο-ογκογονιδίου

MLL

προτείνοντας ένα ρόλο στην ογκογένεση [29], [30].

Septin 9

έχει επίσης δειχθεί να είναι σε μια συχνά διαγράφονται περιοχή σε καρκίνους μαστού και ωοθήκης σε απώλεια της ετεροζυγωτίας (ΑΕ) μελέτες, ένα εύρημα το οποίο εμπλέκει περαιτέρω το γονίδιο σαν ένα πιθανό καταστολέα όγκου [31]. Burrows

et al.

Ανέφεραν μια σε βάθος μελέτη της έκφρασης των πολλαπλών ισομορφών του

Septin 9

γονιδίων στον καρκίνο των ωοθηκών και έδειξαν ιστού ειδική έκφραση διαφόρων μεταγραφών [32]. Η έκφραση του V4 μεταγραφής του

Septin 9

δείχθηκε να είναι απούσα ή μειωθεί σε διάφορες κυτταρικές γραμμές και θα μπορούσε να επανενεργοποιηθεί με επεξεργασία με 5-αζακυτιδίνη, παρέχοντας αρχική απόδειξη του δυναμικού ρύθμιση του γονιδίου από το DNA μεθυλίωση. Πρόσθετη απόδειξη του ελέγχου μεθυλίωση της μεταγραφής v2 παρασχέθηκε σε πρόσφατη ποσοτική ανάλυση σε ιστούς και πλάσμα από ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο [21]. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη από Bennett

et al.

Υποδηλώνει ότι η μεθυλίωση του γονιδίου Septin 9 παρουσιάζεται επίσης σε καρκίνους κεφαλής και λαιμού, ωστόσο η περιοχή της εκδήλωσης μεθυλίωσης δεν περιγράφεται [33]. Υπερ-έκφραση του

Septin 9

ισομορφές έχει επίσης καταδειχθεί σε έναν αριθμό ιστών όγκου. Μια προηγούμενη μελέτη του πάνω από 7000 κανονικών και καρκινικών ιστών υποδεικνύει ότι ιστού ειδική έκφραση της Septin 9 μεταγραφές συμβαίνει σε μια ευρεία ποικιλία καρκίνων [23] Οι συγγραφείς εικάζουν ότι το γονίδιο είναι πιθανό ένα γονίδιο του καρκίνου του τύπου II όπου οι μεταβολές στην ρύθμιση του ελέγχου επεξεργασίας μεταγραφής RNA των διαφόρων προϊόντων πρωτεΐνης και τα επίπεδα αυτών των ισομορφών μεταβάλλεται πρωτεΐνης μπορεί να δώσει απαντήσεις σε ρόλο του γονιδίου στην κακοήθεια. Αυτή η υπόθεση είναι σύμφωνη με πρόσφατες μελέτες που δείχνουν Septin 9 ισομορφή υπερέκφραση συνδυάζεται με ένα ογκογόνο φαινότυπο [24], [25] και την απόδειξη ότι Septin 9 v1 υπερέκφραση συνδέεται με την αντίσταση του όγκου σε φάρμακα που διαταράσσουν το σχηματισμό μικροσωληνίσκων [34 ].

Μέχρι στιγμής τρέχουσες στρατηγικές ελέγχου CRC απέτυχε να βελτιώσει τη συμμόρφωση του ασθενούς και να μειώσει τη θνησιμότητα από καρκίνο του παχέος εντέρου. Οι περισσότεροι ειδικοί προβλέπουν μια βελτιωμένη συμμόρφωση των ασθενών ελέγχου CRC με εξέταση αίματος που βασίζεται, όπως ήταν η περίπτωση για τον προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου του προστάτη με PSA ή σε καρδιακή νόσο με τη χοληστερόλη /δοκιμή λιπιδίων. Η παρούσα έκθεση περιγράφει την πρώτη επικύρωση της δοκιμής μεθυλίωσης του DNA με βάση το πλάσμα πραγματοποιείται σε δύο μεγάλες μελέτες καλά ελεγχόμενες περίπτωση ελέγχου που επιβεβαιώνει την κλινική δυναμικό της SEPT9 βιοδείκτη για την εφαρμογή ελέγχου CRC. Πιστεύουμε ότι μια τέτοια εύκολα χορηγούμενη δοκιμή με βάση το αίμα για την έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου του παχέος εντέρου που ακολουθείται από κολονοσκόπηση για θετικά άτομα έχει τη δυνατότητα να είναι ένα πολύ αποτελεσματικό εργαλείο για τη μείωση της θνησιμότητας από αυτή τη νόσο. Τα εντάλματα δοκιμασία δείκτη SEPT9 περαιτέρω αξιολόγηση ως ένα τεστ για την έγκαιρη ανίχνευση CRC και προοπτικές μελέτες προγραμματιστεί για τον προσδιορισμό των κλινικών επιδόσεων των πληθυσμών διαλογής κατευθυντήρια γραμμή επιλέξιμες διαλογής.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Κείμενο S1.

συμπληρωματικές μέθοδοι

doi: 10.1371 /journal.pone.0003759.s001

(0,03 MB DOC)

Πίνακα S1.

Primer, ανιχνευτή και blocker αλληλουχίες του SEPT9 πραγματικού χρόνου PCR δοκιμασία δείκτη, και ο έλεγχος και CFF1 HB14 PCR δοκιμασίες σε πραγματικό χρόνο

DOI: 10.1371 /journal.pone.0003759.s002

(0,02 MB DOC)

Πίνακας S2. απόδοση

SEPT9 δείκτη στο σύνολο εκπαίδευσης – εναλλακτικών αλγορίθμων

doi: 10.1371 /journal.pone.0003759.s003

(0,02 MB DOC)

Πίνακα S3.. απόδοση δείκτη

SEPT9 στο σύνολο δοκιμής – εναλλακτική ανάλυση

doi: 10.1371 /journal.pone.0003759.s004

(0,03 MB DOC)

Εικόνα S1.

Shewhart διαγράμματα ελέγχου της συνολικής αποκατάστασης γονιδιακού DNA (άνω) και SEPT9 DNA δείκτη (κάτω) για την επεξεργασία των ελέγχων στο σύνολο εκπαίδευσης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0003759.s005

(0,08 MB DOC )

Εικόνα S2.

Shewhart διαγράμματα ελέγχου της συνολικής αποκατάστασης γονιδιακού DNA (άνω) και SEPT9 DNA δείκτη (κάτω) για την επεξεργασία των ελέγχων στο σύνολο δοκιμής

doi:. 10.1371 /journal.pone.0003759.s006

(0,08 MB DOC )

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς επιθυμούν να ευχαριστήσω τους διαγνωστική τεχνολογία ελέγχου και την ανάπτυξη των ομάδων Epigenomics για την εκτέλεση των κλινικών μελετών. Παρουσιάζονται εν μέρει: Abstract # LB165 AACR Ετήσια Συνάντηση 2007, Los Angeles CA