Αφηρημένο

Παχέος κρύπτες είναι στερεοτυπικές δομές με ξεχωριστές βλαστικών κυττάρων, πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται διαμερίσματα. Παχέος εντέρου προέρχονται από κολονική κρύπτη επιθήλια, αλλά, αντίθετα, αποτελούν μορφολογικά disarrayed αδένες. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε σε ποιο βαθμό παχέος εντέρου phenocopy παχέος αρχιτεκτονική κρύπτη και έτσι διατηρούν δομική οργάνωση της κανονικής εντερικού επιθηλίου. Ένα υποσύνολο των καρκίνων του παχέος εντέρου έδειξε κρύπτη-όπως διαμερίσματα με υψηλή WNT δραστηριότητα και την πυρηνική β-κατενίνης στην αιχμή του όγκου, δίπλα πολλαπλασιασμό, και ενισχυμένη έκφραση Cytokeratin 20 στα περισσότερα διαφοροποιημένα επιθήλια του όγκου του κέντρου όγκου. Αυτή η αρχιτεκτονική εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις συνθήκες ανάπτυξης, και ήταν πλήρως επαναλήψιμη σε ξενομοσχεύματα ποντικών καλλιεργημένων πρωτογενών και καρκινικών κυττάρων κόλου. Πλήρης κρύπτη-σαν οργάνωση που συνδέεται με χαμηλής ποιότητας όγκου και ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης της καλύτερη επιβίωση σε μια συλλογή από 221 παχέος εντέρου. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η πλήρης ενεργοποίηση των κονσερβών εντερική μορφογενετικών προγράμματα στον καρκίνο του παχέος εντέρου απαιτεί

in vivo

περιβάλλοντα ανάπτυξης. Επιπλέον, κρύπτη, όπως η αρχιτεκτονική συνδεόταν με λιγότερο επιθετικό βιολογία του όγκου, και μπορεί να είναι χρήσιμη για τη βελτίωση των σημερινών συστημάτων ταξινόμησης του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Cernat L, Blaj C, Jackstadt R, Brandl L, Engel J, Hermeking H, et al. (2014) του παχέος εντέρου Μιμούνται οργανωτική του δομή Κανονική εντερικών κρυπτών. PLoS ONE 9 (8): e104284. doi: 10.1371 /journal.pone.0104284

Επιμέλεια: Chunming Liu, το Πανεπιστήμιο του Κεντάκι, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 του Απρίλη 2014? Δεκτές: 7 Ιούλ 2014? Δημοσιεύθηκε: 11 Αυγούστου 2014

Copyright: © 2014 Cernat et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από το Wilhelm Sander-Stiftung (σε DH) και το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο-Έργο 107 /1.5 /S /78702 (για LC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) προέρχεται από την κανονική βλεννογόνο του κόλου με καλά χαρακτηρισμένη, σταδιακή συσσώρευση μεταλλάξεων που μετατρέπουν φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα σε κύτταρα όγκου με κακοήθη συμπεριφορά [1]. Κανονική βλεννογόνο του παχέος εντέρου είναι πολύ απλά οργανωμένη, βασικά ως ένα φύλλο επιθηλιακών κυττάρων με infoldings σχηματίζουν στερεοτυπικές κρύπτες [2]. Κάθε κρύπτη περιέχει διακριτές λειτουργικές διαμερίσματα με βλαστικά κύτταρα στη βάση κρύπτη, υπεύθυνος για τη συνεχή ανανέωση των επιθηλιακών κυττάρων ηλικίας, μια πολλαπλασιαζόμενα ζώνη ενισχύσεως διέλευσης που εκτείνεται προς τα μέσα του κρύπτη, και πιο ώριμα επιθηλιακά κύτταρα προς την κορυφή κρύπτη [3]. Τα πειραματικά δεδομένα, τα οποία προέρχονται κυρίως από τις μικρές εντερικές κρύπτες ποντικού, υποδηλώνουν υψηλή κανονική δραστηριότητα σηματοδότησης WNT εντός του διαμερίσματος των βλαστικών κυττάρων στο κρύπτη βάση [4], [5], ενώ τα ώριμα κύτταρα στα κρύπτη κορυφή χαρακτηρίζεται από την έκφραση δεικτών διαφοροποίησης, όπως όπως Cytokeratin 20 (ΟΚ20) [6].

σε αντίθεση με την κανονική βλεννογόνο του παχέος εντέρου, η διοικητική οργάνωση του CRC είναι πολύ λιγότερο καλά κατανοητή. CRCs σχηματίζουν μάζες όγκου και όχι φύλλα κυττάρων, με ποικίλους βαθμούς μορφολογικά disarrayed επιθηλιακών αδένων [7]. Ωστόσο, αυτοί οι όγκοι δεν φαίνεται να είναι τελείως ανοργάνωτη. Μια κλίση μεταξύ των λιγότερο διαφοροποιημένων κυττάρων του όγκου που βρίσκονται στην αιχμή του όγκου, και περισσότερο αδενικά διαφοροποιημένα κύτταρα στο κέντρο του όγκου μπορεί να παρατηρηθεί στις περισσότερες CRCs [8], [9]. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα που βρίσκονται στην αιχμή του όγκου συνήθως εκφράζουν ισχυρή πυρηνική β-κατενίνης, που δείχνει υψηλή δραστηριότητα σηματοδότησης WNT, και έχουν αμφισβητηθεί για να αντιπροσωπεύουν έναν πληθυσμό προγονικών κυττάρων της λειτουργικά ορίζεται καρκίνου του παχέος εντέρου βλαστικών κυττάρων [10], [11]. Αντίθετα, η έκφραση της ΟΚ20 προτάθηκε για την επισήμανση περισσότερο διαφοροποιημένα καρκινικά κύτταρα κόλου, αφού η έκφραση της ήταν αμοιβαία αποκλειόμενα με υποτιθέμενο δείκτες καρκίνου του παχέος εντέρου βλαστικών κυττάρων [11], [12]. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν κάποιο βαθμό δομικής οργάνωσης μέσα CRC, με καρκινικά βλαστικά κύτταρα που βρίσκονται στην αιχμή του όγκου και τη διαφοροποίηση προς το κέντρο του όγκου.

Λαμβάνοντας υπόψη αυτές τις διαπιστώσεις και τα γνωστά διαμερίσματα μέσα σε εντερικές κρύπτες, εμείς εδώ διερευνώνται, να ποιο βαθμό CRCs phenocopy κανονική του παχέος κρύπτες. Έχουμε κατηγοριοποιήσει το βαθμό κρύπτη-όπως αρχιτεκτονική σε ένα παχέος συλλογή περίπτωση του καρκίνου με τα δεδομένα μακροχρόνιας παρακολούθησης και αποδεικνύουν ότι

in vitro

και

in vivo

συνθήκες ανάπτυξης επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό από αυτή τη δομική οργάνωση .

Υλικά και Μέθοδοι

Ιστολογίας και Ανοσοϊστοχημείας

φορμόλη σταθερό, ενσωματωμένα σε παραφίνη φυσιολογικό ανθρώπινο βλεννογόνο του κόλου, οι πρωτογενείς ιστούς CRC, κόπηκαν ξενομοσχεύματος όγκους, και Matrigel σφαιροειδή κυττάρων ενσωματωμένα όγκου σε τομές 5 μm, αποπαραφινοποιήθηκαν, και αντιγόνα ανακτήθηκαν σε TRS6 (Dako Cytomation) για 20 λεπτά σε φούρνο μικροκυμάτων. Προσκολλητικά καλλιέργειες Caco2 και SW1222 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε καλυπτρίδες, σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη, και διαπερατά σε 2% TritonX-100. Τα πλακίδια ή καλυπτρίδες στη συνέχεια επωάστηκαν διαδοχικά με αντι-β-κατενίνης (BD Transduction Laboratories? 1:200), κουνελιού αντι-Κί67 (Cell Signaling? 1:200) και γίδινο αντι-ΟΚ20 (Santa Cruz Biotechnology? Δύο παρα δέκα ) για 1 ώρα κάθε σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν με PBS, και στη συνέχεια με FITC συζευγμένο γαϊδάρου αντι-κατσίκας (Jackson ImmunoResearch? 1:200), AlexaFluor 555 συζευγμένο κατσίκας αντι-ποντικού, και AlexaFluor 405 συζευγμένο γίδινο αντι-κουνελιού (Invitrogen? 1:500). Για την απεικόνιση της πυρηνικής β-κατενίνης στην κανονική του παχέος κρύπτες, πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (Vector Laboratories). Ομοεστιακή εικόνες φθορισμού ελήφθησαν σε LSM 700 μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ χρησιμοποιώντας το λογισμικό ΖΕΝ (Carl Zeiss). Για τα συμβατικά και διπλό ανοσοχρώση, αντι-β-κατενίνης πρότυπου ποντικού (Ventana Medical Systems) και /ή αντι-ΟΚ20 (Progen? 1:200) χρησιμοποιήθηκαν, και χρώση πραγματοποιήθηκε σε ένα Ventana Benchmark XT Autostainer με ultraView καθολική DAB και κιτ αλκαλική φωσφατάση ανίχνευσης (Ventana Medical Systems). Ισότυπου-μάρτυρες συμπεριλήφθηκαν για όλα τα αντιγόνα.

Κυτταρική καλλιέργεια και ξενομοσχεύματα ποντίκι

κύτταρα Caco2 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection και τα κύτταρα SW1222 ελήφθησαν από το Ludwig Institute for Cancer Research (New York, USA). καλλιέργειες κυττάρων Προσκολλητικά αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ, Biochrom), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 1% γλουταμίνη, και 1χ πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Σφαιροειδείς καλλιέργειες αναπτύχθηκαν σε μέσο StemPro ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα SFM παρουσία 20 ng /ml EGF και 10 ng /ml bFGF (Life Technologies) σε φιάλες εξαιρετικά χαμηλές προσάρτησης (Corning). Ζωτικής σημασίας ιστό ενός σποραδικές πρωτογενούς αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου αποκτήθηκε μέσα από τον ιστό Stiftung Ανθρώπου & amp? Cell Research (HTCR, München, Germany), διαχωρίζονται σε αναστολές μόνο κύτταρο χρησιμοποιώντας κολλαγενάση IV (Worthington Βιοϊατρική) και ϋΝάσης Ι (Sigma-Aldrich), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10], και επεκτάθηκε σε σφαιροειδείς καλλιέργειες. Για περαιτέρω αναλύσεις, σφαιροειδή κυτταρικές σειρές και πρωτογενή κύτταρα όγκου συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 200 g, επαναιωρήθηκαν σε Matrigel, σταθεροποιήθηκαν σε παραφορμαλδεΰδη, και στη συνέχεια στριμώχνεται μεταξύ HistoGel στρωμάτων (ThermoScientific) για εμβάπτιση σε παραφίνη. Για την ανάπτυξη ξενομοσχεύματος, 10

6 κυττάρων από καλλιέργειες προσκολλημένων κυττάρων ή 10

5 σφαιροειδή προερχόμενο πρωτογενή κόλον καρκινικά κύτταρα αιωρήθηκαν σε 100 μΐ ενός μίγματος 1:01 PBS και αυξητικού παράγοντα-εξαντλημένο Matrigel (BD Bioscience) πριν από υποδόρια ένεση σε ηλικίας 6-8 εβδομάδων NOD /SCID (NOD.CB17-Prkdc

scid, Το Εργαστήριο Jackson) ποντίκια. Τα ζώα στεγάστηκαν σε κλουβιά παθογόνου ελεύθερο μικρο-απομονωτή και θυσιάστηκαν όταν ξενομοσχεύματα έφθασε σε διάμετρο 1 cm. Ξενομοσχεύματος όγκοι αφαιρέθηκαν έπειτα, σταθερό φορμαλίνη και εμβαπτισμένες σε παραφίνη. Τρεις ανεξάρτητες ξενομοσχεύματα υποβλήθηκαν σε περαιτέρω έρευνα για κάθε κυτταρική σειρά ή πρωτογενούς όγκου. Πειραματικές διαδικασίες που χρησιμοποιούν τα ζώα εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από την Regierung von Oberbayern.

CRC συλλογή του δείγματος και τα στατιστικά στοιχεία

αντλήθηκαν CRC δείγματα από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε εκ προθέσεως θεραπευτική χειρουργική εκτομή μεταξύ του 1994 και του 2006 στο Πανεπιστήμιο του από τα αρχεία του Ινστιτούτου παθολογίας. δεδομένων παρακολούθησης καταγράφηκαν από το Αρχείο Καρκίνου του Μονάχου. Δείγματα και δεδομένα ανώνυμα, και η ανάγκη για συναίνεση παραιτήθηκε από την επιτροπή θεσμική ηθική της Ιατρικής Σχολής του LMU. Τα κριτήρια ένταξης εντοπίστηκαν αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου με την απουσία των κομβικών (N0) ή μακρινή μετάσταση (M0) κατά το χρόνο της διάγνωσης (UICC σταδίου Ι και ΙΙ). ιστούς όγκων συγκεντρώθηκαν σε ιστικές μικροσυστοιχίες (TMAs) με 6 πυρήνες εκπρόσωπο ενός χιλιοστού, συμπεριλαμβανομένων των άκρων του όγκου και των κέντρων του όγκου της κάθε περίπτωσης. Η τελική συλλογή αποτελείται από 221 περιπτώσεις CRC εκ των οποίων σε 41 περιπτώσεις (19%) ασθενείς είχαν πεθάνει από όγκου τους εντός της περιόδου παρακολούθησης. δεδομένα επιβίωσης για λογοκρισία όταν περίπτωση παρακολούθηση διακόπηκε ή ασθενείς είχαν πεθάνει από άλλες αιτίες πλην CRC. Τα χαρακτηριστικά Υπόθεση συνοψίζονται στον Πίνακα 1. TMA πλακιδίων στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε μονά και διπλά χρώσεις για β-κατενίνης και ΟΚ20, όπως περιγράφεται παραπάνω. Ολόκληρα τμήματα ιστού των μεμονωμένων περιπτώσεων με ετερογενή β-κατενίνης και ΟΚ20 διανομής χρησιμοποιήθηκαν για αναλύσεις τριπλή ανοσοποιητικό φθορισμού. Καρκίνος ειδική επιβίωση αναλύθηκε με την μέθοδο Kaplan-Meier και οι ομάδες συγκρίθηκαν με την δοκιμασία log-rank. Στατιστικά στοιχεία υπολογίστηκαν με τη χρήση του SPSS (IBM).

Η

Αποτελέσματα

Κρύπτη-όπως λειτουργικά διαμερίσματα και ο σχηματισμός του άξονα σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Για να απεικονίσει διαφορετικά λειτουργικά διαμερίσματα εντός των φυσιολογικών παχέος εντέρου κρύπτες και CRCs, ιδρύσαμε τριπλό ανοσοποιητικό χρώσεις φθορισμού για β-κατενίνης, proliferation- σχετίζονται Ki-67 αντιγόνο (Ki67) και Cytokeratin 20 (ΟΚ20). Όπως ήταν αναμενόμενο, συνεστιακή απεικόνιση των φυσιολογικών κρυπτών υποδεικνύεται WNT ενεργός διαμερίσματα με πυρηνική έκφραση του β-κατενίνης στην κρύπτη βάση, ένα Κί67 εκφράζουν διέλευσης ζώνης ενίσχυση του πολλαπλασιασμού των επιθηλιακών προγεννητόρων, και πιο διαφοροποιημένα επιθηλιακά κύτταρα που εκφράζουν ΟΚ20 προς κορυφές των κρυπτών ‘(εικόνα 1Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι, οπτικοποίηση των αδύναμων, αλλά διακριτές πυρηνικής β-κατενίνης στην κρύπτη βάση που απαιτείται υψηλές μεγεθύνσεις και μικρή πυρηνική αντιχρωματισμός (Σχήμα 1Α, Σχήμα S1). Εμείς στη συνέχεια υποβλήθηκε πρωτογενή CRCs στην ίδια τριπλή πρωτόκολλο χρώσης. Παρόμοια με προηγούμενα ευρήματα [8], [9], ισχυρή πυρηνική έκφραση της β-κατενίνης περιοριζόταν σε κύτταρα όγκου στην αιχμή του όγκου και περιλαμβάνονται μορφολογικά αδιαφοροποίητα κύτταρα καρκίνου κόλου διηθητικά περιβάλλοντα στρωματικά ιστό (Εικόνα 1Β). Είναι ενδιαφέρον, και αντίθετα με την πυρηνική β-κατενίνης, χρώση ΟΚ20 ήταν πιο έντονη στις πιο κεντρικές και αδενικό διαφοροποιημένα επιθήλια των όγκων, τις γειτονικές νέκρωσης όγκων (Εικόνα 1Β). Κί67 βρέθηκε μεταξύ αυτών των ζωνών και μειώθηκε σε καρκινικά κύτταρα με ισχυρή έκφραση ΟΚ20 (Σχήμα 1Β). Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι, παρά το σχηματισμό disarrayed αδένα, του παχέος εντέρου διατηρούν κάποιο βαθμό δομικής οργάνωσης και του σχηματισμού άξονα βρέθηκε σε φυσιολογικό κολονικό κρύπτες.

Τριπλό ανοσοποιητικό χρώση για β-κατενίνης (βCat), Κί67 και ΟΚ20. (Α) Παχέος κρύπτες δείχνουν την έκφραση της πυρηνικής β-κατενίνης στη βάση τους, Ki67 επεκτείνεται προς τα μέσα κρύπτη, και ΟΚ20 στην κορυφή. Οπτικοποίηση της πυρηνικής β-κατενίνης απαιτείται αντικηλίδωση με DAPI και υψηλή μεγέθυνση (

αριστερό πάνελ ένθετο

). Κόκκινο και μπλε γραμμές σκιαγραφούν κρύπτη μέρη με και χωρίς πυρηνικά β-κατενίνης, αντίστοιχα. (Β) του παχέος εντέρου εμφανίζουν μια παρόμοια οργάνωση με πυρηνικά β-κατενίνης στην άκρη του όγκου (

αιχμές βελών

), η έκφραση ΟΚ20 στο κέντρο του όγκου (

βέλη

), και Ki67 στο μεταξύ.

Κλίμακα μπαρ

, 100 μm.

Η

Ξενομοσχεύματος μοντέλα των καρκίνων του παχέος εντέρου αναπαράγουν το πλήρες φάσμα των κρύπτη-όπως οργάνωση

Στη συνέχεια, αναλύσαμε ένα πρωτοπαθή καρκίνο του παχέος εντέρου και κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου κάτω από διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης

in vitro

και

in vivo

. Προσκολλητικά

in vitro

κυτταρικές καλλιέργειες κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου και SW1222 Caco2 αποκάλυψε κάποιο βαθμό ετερογένειας των κυττάρων του όγκου για την πυρηνική β-κατενίνης, Ki67 και ΟΚ20 που ήταν περισσότερο εμφανές στην χαμηλή πυκνότητα από ό, τι σε συρρέουσες καλλιέργειες (Σχήματα 2α- ΡΕ). καλλιέργειες χαμηλής πυκνότητας SW1222 εμφάνισαν επίσης κάποια στοιχειώδη σχηματισμό κεντρομόλος άξονα με ελαφρώς ενισχυμένη έκφραση ΟΚ20 και μείωσε τον πολλαπλασιασμό Κί67 εντός των κέντρων αποικία, και ισχυρότερη χρώση πυρηνικής β-κατενίνης στην άκρη αποικία (Εικόνα 2Α). Σε κύτταρα Caco2, διαφορική έκφραση ΟΚ20 και πυρηνικών β-κατενίνης εμφανίζονταν πιο τυχαία κατανεμημένες (Σχήμα 2C). Για να εκτιμηθεί κατά πόσον τρισδιάστατη ανάπτυξη θα δώσουν υψηλότερους βαθμούς της οργανωτικής δομής και των καρκινικών κυττάρων ετερογένεια

in vitro

, καλλιεργήσαμε τις δύο κυτταρικές σειρές και τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου πρωτοβάθμια ως μη-προσκολλημένα σφαιροειδή. Παρόμοια με τα ευρήματά μας σε προσκολλημένες καλλιέργειες, παρατηρήσαμε κάποια καρκινικών κυττάρων ετερογένεια και για τους τρεις δείκτες (Σχήματα 2Ε-G). Ωστόσο, αν και πρωταρχικό του παχέος εντέρου σφαίρες καρκίνου έδειξαν μικρή σχηματισμό κεντρομόλος άξονα με ενισχυμένη κεντρική χρώση ΟΚ20 (Σχήμα 2G), δεν την πλήρη δομική οργάνωση, όπως είχαμε βρεθεί σε πρωτογενή ιστό καρκίνου του παχέος εντέρου, παρατηρήθηκε. Εμείς στη συνέχεια με ένεση αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου πρωτογενείς σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια για το σχηματισμό υποδόριου όγκου

in vivo

. Αντιθέτως προς μας

in vitro

ευρήματα, οι όγκοι αυτοί σχηματίζονται αδενικές δομές με πλήρη βαθμούς κυττάρου όγκου ετερογένειας και διακριτές πυρηνικής β-κατενίνης, Ki67 και ΟΚ20 θετικό διαμερισμάτων (Σχήματα 2Η-J), μιμούμενη εκείνα που βρέθηκαν σε πρωτοβάθμια ΚΕΣ και θυμίζει κανονική παχέος αρχιτεκτονικής κρύπτη. Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι τρισδιάστατη ανάπτυξη και γύρω στρωματικό ιστό απαιτούνται για να εκθέσει την ετερογένεια των κυττάρων του όγκου και την πλήρη σχηματισμό άξονα CRCs.

Triple ανοσοποιητικό χρώση αποκαλύπτει έλλειψη πλήρους δομικής οργάνωσης σε προσκολλημένες καλλιέργειες ιστού των (Α) χαμηλής πυκνότητας και (Β) συρρέουσες SW1222, και (Γ) χαμηλή πυκνότητα και (Δ) συρρέουσες Caco2 καρκινικά κύτταρα κόλου, όπως επίσης και σε σφαιροειδές καλλιέργειες (Ε) SW1222, (F) Caco2, και (G) πρωτογενή κόλου καρκινικά κύτταρα . Αντιθέτως, υποδόρια ξενομοσχεύματα του (H) SW1222, (Ι) Caco2, και (J) του καρκίνου του παχέος εντέρου πρωτογενή κύτταρα σχηματίζουν αδένες με την οργανωμένη έκφραση της πυρηνικής β-κατενίνης στην άκρη του όγκου (

αιχμές βελών

) και ΟΚ20 έκφραση στο κέντρο του όγκου (

βέλη

).

Κλίμακα μπαρ

, 100 μm.

Η

Ταξινόμηση και κλινική σημασία της κρύπτης-όπως οργάνωση του παχέος εντέρου

Για να προσδιοριστεί η συχνότητα των κρύπτη που μοιάζει με οργάνωση σε CRCs , χρησιμοποιήσαμε μια συλλογή περίπτωση 221 πρωτογενών όγκων και να εφαρμόζεται διπλό ανοσοποιητικό χρώση για β-κατενίνης και ΟΚ20, σήμανση και τις δύο ακραίες τιμές της κανονικής κολονικής κρύπτης διαμερισμάτων. Οι αναλύσεις αυτών των περιπτώσεων αποκάλυψε 5 διαφορετικούς τύπους καρκίνων του παχέος εντέρου: Η μεγαλύτερη ομάδα (τύπου Α) έδειξε οργανωμένη έκφραση της πυρηνικής β-κατενίνης στην αιχμή του όγκου και βελτιωμένη ΟΚ20 μέσα στο κέντρο του όγκου (Σχήμα 3). Αξίζει να σημειωθεί, ωστόσο, κατά την εξέταση των υποθέσεων αυτού του τύπου σε σειριακές τομές, παρατηρήσαμε επιπλέον ενισχυμένη έκφραση ΟΚ20 στις περισσότερες διηθητική καρκινικά κύτταρα που βρίσκονται στην αιχμή του όγκου, επικάλυψη με πυρηνικά β-κατενίνης στις περισσότερες από τις περιπτώσεις αυτές (Εικόνα S2). Οι άλλοι όγκοι έλειπε αυτή την οργάνωση σε κάποιο βαθμό (Εικόνα 3), είτε από την απουσία της πυρηνικής β-κατενίνης (τύπος Β), απουσία της ενισχυμένης ΟΚ20 στο κέντρο του όγκου (τύπος C), απουσία μειώθηκε πυρηνικής β-κατενίνης στον όγκο κέντρο (τύπου D), ή η απουσία και των δύο πυρηνικών β-κατενίνης και την έκφραση ΟΚ20 (τύπου Ε). Στη συνέχεια εξετάζονται αυτούς τους τύπους για ενώσεις με ειδικές όγκου επιβίωση. Είναι ενδιαφέρον ότι, κατά Kaplan-Meier για αποκάλυψε καλύτερο αποτέλεσμα για CRCs με πλήρη διοικητική οργάνωση κρύπτη-όπως, με βάση την πυρηνική β-κατενίνης και την έκφραση ΟΚ20 (τύπου Α) που ήταν σημαντικά καλύτερα, όταν στατιστικά δοκιμάστηκαν έναντι όλων των άλλων τύπων σε συνδυασμό (Σχήμα 4). Στη συνέχεια εξετάζονται οι όγκοι τύπου Α για τις ενώσεις με άλλες κλινικές μεταβλητές και βρήκε μια σημαντική συσχέτιση με χαμηλής ποιότητας του όγκου, ενώ δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση με άλλες μεταβλητές, όπως η ηλικία, το φύλο και την κατηγορία T (Πίνακας 1). Τέλος, κατά τη δοκιμή όγκους του τύπου Α σε βάρος άλλων για την πρόβλεψη της επιβίωσης στην πολυμεταβλητή ανάλυση, η πλήρης δομική οργάνωση αποδείχθηκε ότι είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για την καλύτερη καρκίνο συγκεκριμένες επιβίωσης (Πίνακας 2). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι CRCs μιμούνται κρύπτη-όπως διαμερίσματα και σχηματισμός του άξονα σε διάφορους βαθμούς και εμπλέκουν ότι η υψηλή δομική ομοιότητα με την κανονική του κόλου κρύπτες μπορεί να συνδέεται με λιγότερο επιθετική συμπεριφορά όγκου.

Διπλή ανοσολογική χρώση για β-κατενίνης (

καφέ

) και ΟΚ20 (

κόκκινο

). (Τύπος Α) Πλήρης δομική οργάνωση με πυρηνικά β-κατενίνης στην άκρη του όγκου (

βέλος

) και ΟΚ20 μέσα στο κέντρο του όγκου (

βέλος

). (Τύπος Β) Απουσία της πυρηνικής β-κατενίνης. (Τύπος C) Απουσία κεντρικού ΟΚ20. (Τύπος D) Απουσία μειώθηκε πυρηνικής β-κατενίνης στο κέντρο του όγκου. (Type E) Η απουσία των δύο πυρηνικών β-κατενίνης και ΟΚ20. Οι συχνότητες αυτών των τύπων που αναφέρονται στον πίνακα.

Η

(Α) κατά Kaplan-Meier οικόπεδο για τους διάφορους τύπους του παχέος εντέρου, όπως υποδεικνύεται με επιστολές στις καμπύλες. (Β) τον τύπο Α του παχέος ασθενείς με καρκίνο (

ανώτερη καμπύλη

) παρουσιάζουν σημαντικά (test log-rank) καλύτερη επιβίωση σε σύγκριση με άλλα είδη (

κατώτερη καμπύλη

). Αναλογίες σε καμπύλες δείχνουν τον αριθμό των γεγονότων πάνω από τον αριθμό των ασθενών ανά ομάδα.

Η

Συζήτηση

Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι CRCs phenocopy κανονική παχέος αρχιτεκτονική κρύπτη. Σε αντίθεση με την κανονική κρύπτες, αυτοί οι όγκοι αναπτύσσονται επεμβατικά και σχηματίζουν μορφολογικά disarrayed αδένων [7]. Ωστόσο, μπορούν να προσδιοριστούν διακριτές διαμερίσματα με υψηλή WNT δραστηριότητα στην αιχμή του όγκου, δίπλα πολλαπλασιασμό, και να ενισχυθεί η έκφραση ΟΚ20 προς το κέντρο του όγκου. Δεδομένου ότι η κανονική του παχέος κρύπτες έχουν γνωστή WNT οδηγείται αρχέγονων κυττάρων στη βάση τους, ωρίμανση σε επιθηλιακά κύτταρα με ισχυρή έκφραση ΟΚ20 στην κορυφή [4] – [6], τα ευρήματά μας υποστηρίζουν την ιδέα των καρκίνων του παχέος εντέρου που μιμούνται αυτά τα λειτουργικά τμήματα, με άνω και κάτω τελεία καρκινικά βλαστικά κύτταρα που βρίσκονται στην αιχμή του όγκου, και κεντρομόλος διαφοροποίηση των κυττάρων του όγκου, όπως είχε προηγουμένως υποτεθεί [13]. Ωστόσο, τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης σημαντικές διαφορές στην κανονική του παχέος αρχιτεκτονική κρύπτη, δεδομένου ότι δεν είναι όλες οι CRCs έδειξε το πλήρες φάσμα των κρύπτη-όπως διαμερισματοποίηση. Επιπλέον, CRCs με ορατή διαμερίσματα συχνά έδειξε αυξημένη ΟΚ20 όχι μόνο στις κεντρικές περιοχές του όγκου, αλλά επιπλέον βρίσκονται στην αιχμή του όγκου, που συμπίπτει με την ισχυρή πυρηνική β-κατενίνης και υψηλής WNT δραστηριότητα. Ενώ αυτά τα ευρήματα εμπλέκουν ότι μορφογενετική προγράμματα των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων είναι ακόμη ενεργά σε ορθοκολικούς καρκίνους σε κάποιο βαθμό, δείκτες για τερματική διαφοροποίηση στο φυσιολογικό έντερο μπορεί όχι απαραίτητα να περιορίζεται σε πλήρως διαφοροποιημένα κύτταρα όγκου του εντερικού νεοπλασμάτων.

Συγκρίνοντας διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας και ανάπτυξης των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, παρατηρήσαμε πλήρως ανεπτυγμένες και σε διαμερίσματα αδενικό δομές στο

in vivo

ξενομοσχεύματος όγκους μόνο. Ανακεφαλαίωση των δομών, που μοιάζουν με κανονική παχέος αρχιτεκτονική κρύπτη και το σχηματισμό πλήρη κλίση τουλάχιστον και πιο διαφοροποιημένο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, μπορούν να απαιτούν σηματοδότηση από ένα μικροπεριβάλλον του όγκου [8], [14], που λείπει στο πρότυπο συστήματα καλλιέργειας. Τα ευρήματα αυτά έχουν σημαντικές συνέπειες για τις μελέτες που εστιάζουν σε συγκεκριμένες υποπληθυσμών των κυττάρων του όγκου, αφού σύνθεση κυττάρων του όγκου σε τακτική ή σφαιροειδές πολιτισμών μπορεί να μην αντανακλούν επαρκώς την κατάσταση στην πρωτογενή όγκων. Είναι ενδιαφέρον όμως, όταν αναπτύσσονται ως όγκοι ξενομοσχεύματος, ακόμη και καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές καρκίνου του παχέος εντέρου που σχηματίζεται πλήρως ανεπτυγμένη κρύπτη δομές σαν και διαμερισματοποίηση, παρόμοια με πρωτογενείς καρκίνους του παχέος εντέρου. Αυτό υποδηλώνει ότι, παρά την ύπαρξη ορισμένων αναμένεται γενετικές μεταβολές σε διαβιβαζομένων κυτταρικές γραμμές [15], με τη χρήση ξενομοσχεύματα καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή μπορεί να μην είναι κατώτερη από την χρήση των πρωτογενών καρκίνων του παχέος εντέρου για μελέτες επί των κυττάρων του όγκου υποπληθυσμούς, όπως ο καρκίνος του παχέος εντέρου βλαστικά κύτταρα [12] , [16]. Σε αυτό το πλαίσιο, τις συνθήκες ανάπτυξης

in vivo

μπορεί να είναι σημαντικότερη από την πηγή του κυττάρου καρκίνου του παχέος εντέρου, είτε προέρχονται από τις καθιερωμένες καλλιέργειες ή πρωτογενείς όγκους.

Όταν κοιτάζετε συσχετίσεις με τις κλινικές παραμέτρους, εμείς συνδέονται κρύπτη-όπως δομή της οργάνωσης του ΚΕΣ στη βελτίωση της επιβίωσης και της χαμηλής ποιότητας των όγκων. Ενώ πρόγνωση αυτών των όγκων μπορεί καλύτερα να εκτιμηθεί από σταδιοποίησης, περιγράφοντας την έκταση της νόσου [17], ιστοπαθολογική ταξινόμηση όγκος έχει ανεξάρτητα συνδεθεί με την πορεία της νόσου και αντανακλά τη συνολική βαθμό διαφοροποίησης των κυττάρων του όγκου [18]. Πολλά συστήματα ταξινόμησης που βασίζονται σε διαφορετικές πτυχές της μορφολογίας του όγκου έχουν προταθεί, όμως, που οφείλονται στην κακή επαναληψιμότητα, ένα απλοποιημένο σύστημα δύο επιπέδων, λαμβάνοντας υπόψη μόνο το σχηματισμό αδένα, σήμερα ευνοείται, και ταξινομεί αυτές τις όγκων σε χαμηλές και υψηλές νεοπλάσματα ποιότητας [19] . Αν και αυτό το σύστημα ταξινόμησης είναι ευρέως αποδεκτό και θεωρείται ως μια συνεπή προγνωστικός παράγοντας από το Σώμα των Αμερικανών Παθολόγων, δεν ενσωματώνει ύπαρξη και την κατανομή των διακριτών υποπληθυσμών των κυττάρων του όγκου που μπορεί να επηρεάσουν την πρόγνωση. Από την άλλη πλευρά, οι αναδυόμενες πρόσφατα προσεγγίσεις για την αξιολόγηση CRC πρόγνωση, όπως έκφρασης δείκτη βλαστικών κυττάρων [20], [21] ή microRNA profiling [22], εφόσον είτε δεν διαθέτουν γενική αποδοχή ή έχουν τη προειδοποίηση ότι είναι δαπανηρή και τεχνικώς απαιτητική. Δεδομένου ότι στη μελέτη μας, κρύπτη, όπως οργάνωση εξυπηρέτησε καλά στην πρόβλεψη της έκβασης της νόσου, προτείνουμε ότι η προσέγγιση αυτή μπορεί να ενσωματωθεί μορφολογικές πτυχές του σχηματισμού του αδένα με δείκτες δείχνουν λειτουργικά τμήματα του όγκου. έκφραση της β-κατενίνης και ΟΚ20 μπορεί να εκτιμηθεί σθεναρά στο παχύ έντερο δείγματα και την ολοκλήρωση αυτών των παραμέτρων στη ρουτίνα διάγνωση του καρκίνου μπορεί επομένως να βελτιώσει την ιστοπαθολογική ταξινόμηση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Εκτός από αυτές τις εκτιμήσεις, τα ευρήματά μας μπορεί επίσης να εξηγήσει τα προηγούμενα ασυνεπή δεδομένα σχετικά κλινικοί συσχετισμοί της πυρηνικής β-κατενίνης [23], [24], του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου [25], [26], και η έκφραση ΟΚ20 σε καρκίνο του παχέος εντέρου [27] , [28]. Αν αυτοί οι δείκτες δείχνουν λειτουργικά και δομικά διαμερίσματα μέσα σε αυτούς τους όγκους, είναι πιθανό ότι η οργάνωση του χώρου είναι πιο σχετικές με τη βιολογία του όγκου και αντανακλάται στην κλινική έκβαση από την απλή μέγεθος διαμερίσματος.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Αυξημένη WNT δραστηριότητας στη βάση της κανονικής παχέος κρύπτες. Ενώ η β-κατενίνης ετικέτες επιθηλιακών κυτταρικών μεμβρανών, ως μέρος της adherens κόμβων, υψηλές μεγεθύνσεις δείχνουν επιπλέον έκφραση της πυρηνικής β-κατενίνης σε κρύπτη βάση (

μαύρα βέλη

). Η έλλειψη της πυρηνικής έκφρασης με την κυριαρχία του μπλε αντιχρωματισμός παρατηρείται σε επιθηλιακά κύτταρα πάνω από την κρύπτη βάση (

μπλε αιχμές βελών

). .

Αριστερό πλαίσιο

δείχνει μεγαλύτερη μεγέθυνση της περιοχής εγκλωβιστούμε στο

δεξί πάνελ

Η doi: 10.1371 /journal.pone.0104284.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2. έκφραση

ΟΚ20 δεν περιορίζεται στο κέντρο του όγκου του τύπου Α του παχέος εντέρου. Διαδοχικές τομές αποδείξει, εκτός από αυξημένη χρώση ΟΚ20 στο κέντρο του όγκου (

βέλη

), ενισχυμένη χρώση για ΟΚ20 στην άκρη του όγκου, επικάλυψη με πυρηνικά β-κατενίνης (

αιχμές βελών

). Αυτό το σχέδιο βρέθηκε στο 61% του τύπου Α του παχέος εντέρου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0104284.s002

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Είμαστε ευγνώμονες για την Α Sendelhofert, A. Schäfer και Μ Melz για την πειραματική βοήθεια, και να ευχαριστήσω τον ιστό Stiftung του Ανθρώπου και Cell Research (HTCR) για την παροχή ιστό καρκίνου του παχέος εντέρου.