Αφηρημένο

Σε μια προσπάθεια να παρακάμψουν αντίσταση στην ραπαμυκίνη – ένας αναστολέας mTOR – ψάξαμε για τα νέα ραπαμυκίνη-κατάντη-στόχους που μπορεί να είναι βασικοί παράγοντες στην αντιμετώπιση των καρκινικών κυττάρων στη θεραπεία. Βρήκαμε ότι η ραπαμυκίνη, σε συγκεντρώσεις ηΜ, αυξημένη φωσφορυλίωση των ευκαρυωτικών παράγοντα έναρξης (ΕΤΕ) 2α σε ραπαμυκίνη ευαίσθητη και εξαρτώμενος από οιστρογόνο MCF-7 κύτταρα, αλλά είχε μόνο ελάχιστη επίδραση επί της φωσφορυλίωσης eIF2α στη ραπαμυκίνη-αναίσθητη triple-αρνητικών MDA -ΜΒ-231 κύτταρα. Η προσθήκη salubrinal – ένας αναστολέας eIF2α αποφωσφορυλίωσης – μειωμένη έκφραση ενός δείκτη επιφανείας που συνδέεται με την ικανότητα τους να αυτοανανεώνονται, αυξημένη γήρανση και επάγεται κλωνογονική κυτταρικό θάνατο, γεγονός που υποδηλώνει ότι η υπερβολική φωσφορυλίωση της eIF2α είναι επιζήμια για την επιβίωση των κυττάρων. Αγωγή κυττάρων με salubrinal ενισχυμένη ακτινοβολία επαγόμενη αύξηση στη φωσφορυλίωση eIF2α και κλωνογονική θάνατο και έδειξε ότι τα ακτινοβολημένα κύτταρα είναι πιο ευαίσθητα σε αυξημένη φωσφορυλίωση eIF2α από μη ακτινοβολημένα αυτά. Παρόμοια με salubrinal – το phosphomimetic παραλλαγή eIF2α – S51D – αυξημένη ευαισθησία στην ακτινοβολία, και οι δύο κατήργησε την ακτινοβολία που προκαλείται από αύξηση στη γονιδιακή προδιάθεση τύπο καρκίνου του μαστού 1, ενοχοποιώντας έτσι αυξημένη φωσφορυλίωση της eIF2α στη διαμόρφωση της επιδιόρθωσης του DNA. Πράγματι, salubrinal ανέστειλε μη-ομόλογο τέλος ενώνει καθώς και ομόλογο ανασυνδυασμό επισκευή της διπλής διαλείμματα σκέλος που προκαλείται από την Ι-δοβΙ στην πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη πλασμίδια αναφοράς. Εκτός από την επίδρασή της στην ακτινοβολία, salubrinal αυξημένη φωσφορυλίωση eIF2α και κλωνογονικού θάνατο ως απάντηση στην αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης – vorinostat. Τέλος, η καταλυτική ανταγωνιστικός αναστολέας της mTOR – Ku-0063794 – αυξημένη φωσφορυλίωση της eIF2α αποδεικνύουν περαιτέρω τη συμμετοχή της δραστηριότητας mTOR στην διαμόρφωση φωσφορυλίωσης eIF2α. Αυτά τα πειράματα υποδηλώνουν ότι η υπερβολική φωσφορυλίωση eIF2α μειώνει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων? καθιστώντας eIF2α ένα άξιο στόχο για την ανάπτυξη φαρμάκων, με τη δυνατότητα να ενισχύσει τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα των καθιερωμένων αντι-νεοπλασματικές θεραπείες και παρακάμπτουν την αντίσταση να rapalogues και πιθανώς σε άλλα φάρμακα που αναστέλλουν ανοδικά συστατικά της οδού mTOR

Citation.: Tuval-Kochen L, Paglin S, Keshet G, Lerenthal Υ, Nakar C, Golani T, et al. (2013) ευκαρυωτικά Έναρξη Factor 2α – ένας καθοδικός τελεστής των θηλαστικών στόχος της ραπαμυκίνης – Διαμορφώνει επιδιόρθωση του DNA και του καρκίνου ανταπόκριση στη θεραπεία. PLoS ONE 8 (10): e77260. doi: 10.1371 /journal.pone.0077260

Επιμέλεια: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Απρ 2013? Αποδεκτές: 30 Αυγούστου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Tuval-Kochen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε από μια γενναιόδωρη δωρεά από το κτήμα της Μις Χαράν εστέρα ευλογημένο μνήμης μέσω Keren Izvonot, το Ισραήλ, Υπουργείο υγείας (SP) και από το Ταμείο Ανάπτυξης Υποδομών Ιατρικής Έρευνας – Sheba Medical Center (YL). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάση – πρωτεϊνική κινάση Β – στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (PI3K-Akt-mTOR) οδού ρυθμίζει την κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό. Η απορύθμιση του μονοπατιού κρύβεται πίσω από ογκογόνους μετασχηματισμούς και η διαφοροποίηση του από αντι-νεοπλασματικές θεραπείες επηρεάζει τα αποτελέσματά τους. Οι αναστολείς της mTOR είναι – ραπαμυκίνη, και τα παράγωγά της – να μειώσει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και έχουν δοκιμαστεί ως αντικαρκινικών παραγόντων σε κλινικές δοκιμές [1-3]. Η ραπαμυκίνη έχει χρησιμοποιηθεί για την επικάλυψη ενδοπροθέσεων για την πρόληψη αγγειογραφική επαναστένωση-[4], και έχει κερδίσει την έγκριση FDA ως ένα ανοσοκατασταλτικό. παράγωγα του – έχουν temsirolimous και everolimous εγκριθεί για τη θεραπεία διαφόρων τύπων καρκίνου [5,6]

Rapalogues δεσμεύουν ενδοκυτταρική πρωτεΐνη υποδοχέα τους FK506 πρόσδεσης 12 (FKBP12), σχηματίζοντας ένα σύμπλοκο το οποίο αναστέλλει συγκρότημα mTOR 1. (mTORC1) μέσω σύνδεσης FKBP12 τομέα ραπαμυκίνη δεσμευτική mTOR [7]. Επιπλέον, η παρατεταμένη επώαση με rapalogues μπορούν να αναστείλουν το σχηματισμό του mTOR συμπλόκου 2 (mTORC2) [8]. Ωστόσο, η επίδραση του rapalogues επί mTORC1 και mTORC2 είναι τύπου κυττάρου ειδικά και μπορεί να εξαρτάται από τη σχετική αφθονία των μορίων που συμμετέχουν στην σύνθεση των μακρομοριακών συμπλοκών mTORC του [8,9]. Κατά συνέπεια, η ανασταλτική έκβαση του rapalogues στην ανάπτυξη του όγκου δεν είναι καθολική [7].

Ως εκ τούτου, η ραπαμυκίνη ευαίσθητα καρκινικά κύτταρα, οριοθετούν ραπαμυκίνη καθοδικούς τελεστές που ρυθμίζουν την ανάπτυξη του όγκου και την απόκριση σε αντι-νεοπλασματική θεραπεία είναι πιθανό να οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων ενώσεων που θα αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου και /ή να ενισχύσουν την ευαισθησία της με τις καθιερωμένες θεραπείες. Τέτοια μόρια αναμένεται να παρακαμφθεί η αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στα φάρμακα που στοχεύουν ανάντη συστατικά της οδού ΡΙ3Κ-Akt-mTOR, ενώ έχουν μια μερική μόνο επίδραση στην παγκόσμια δραστηριότητές της.

Στην παρούσα μελέτη αναφέρουμε ότι η αναστολή του mTOR οδηγεί σε αυξημένη φωσφορυλίωση της eIF2α – μια υπομονάδα eIF2. Μέχρι σήμερα, έχουν αντικρουόμενες εκθέσεις έχουν δημοσιευθεί σχετικά με τη συμμετοχή του mTOR στην φωσφορυλίωση eIF2α [10-16]. Ωστόσο, η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι σε κύτταρα που εξαρτώνται από οιστρογόνα ραπαμυκίνη ευαίσθητου καρκίνου του μαστού MCF-7 καθώς και σε τριπλή αρνητική ραπαμυκίνη-αναίσθητη MDA-MB-231 κυττάρων, η αναστολή της mTOR με ραπαμυκίνη και με ειδική καταλυτική αναστολέα (Ku-0063794 ) αντίστοιχα, οδηγεί σε αυξημένη φωσφορυλίωση της eIF2α. Όταν συνδέεται με GTP, eIF2 νεοσύλλεκτοι Met · tRNA

MET στο ριβόσωμα η οποία στη συνέχεια σαρώνει το καλυμμένο mRNA. Μετά την αναγνώριση του κωδικονίου έναρξης και GTP υδρόλυση, ο ανενεργός eIF2 · ΑΕΠ απελευθερώνεται και ανακυκλώνονται σε ένα δραστικό eIF2 · GTP συγκρότημα μέσω αλληλεπίδρασης με τον παράγοντα εναλλαγής νουκλεοτιδίου γουανίνης eIF2B [17]. Υπό κανονικές φυσιολογικές συνθήκες, eIF2α διευκολύνει την αλληλεπίδραση του eIF2 με eIF2B [18]. Ωστόσο, η φωσφορυλίωση της eIF2α σε Ser του

51 στροφές eIF2 από ένα υπόστρωμα της eIF2B σε ανταγωνιστικές αναστολέα της, που οδηγεί σε μείωση του επιπέδου των eIF2 · GTP · Met · tRNA

MET πολύπλοκη και εξασθένηση της παγκόσμιας πρωτεΐνης μετάφραση. Είναι σημαντικό ότι, επειδή το κυτταρικό επίπεδο του eIF2 είναι σε περίσσεια του eIF2B, μια μικρή αύξηση στη φωσφορυλίωση eIF2α μπορεί απομονώσει ένα σημαντικό κλάσμα του eIF2B [17]. Στα κύτταρα των θηλαστικών eIF2α φωσφορυλιώνεται από τέσσερις διαφορετικές κινάσες που αποκρίνονται διαφορικά σε διάφορα σήματα στρες [17], και αποφωσφορυλίωση του διενεργείται από την καταλυτική υπομονάδα της φωσφο-πρωτεϊνική φωσφατάση 1 (ΡΡ1ο) σε σύμπλοκο με ειδικές ρυθμιστικές υπομονάδες π.χ. η συστατική καταστολέας της φωσφορυλίωσης eIF2α (CReP) ή το άγχος που προκαλείται από διακοπή αύξησης και επαγώγιμη πρωτεΐνη DNA βλάβη (GADD34) [19]. Salubrinal – ένας αναστολέας της eIF2α αποφωσφορυλίωση – παρεμβαίνει με τη σύνδεση των PP1c και ρυθμιστικές υπομονάδες της, οδηγώντας έτσι σε αυξημένη φωσφορυλίωση eIF2α. Η εφαρμογή του σε διάφορα κυτταρικά συστήματα in vitro έχει χρησιμοποιηθεί για να αποσαφηνιστεί η φυσιολογική σχετικότητα αυξημένη φωσφορυλίωση eIF2α για την επιβίωση των κυττάρων [20,21].

Το μοριακό έκβαση και φυσιολογική σημασία των αυξημένη φωσφορυλίωση eIF2α έχει μελετηθεί εκτενώς κατά τη διάρκεια ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) υπερφόρτωση όπου γενικά πιστεύεται ότι ασκούν ένα προστατευτικό ρόλο. Σε απάντηση σε αυξημένο φορτίο ER PKR-όπως ER-εντοπισμένη eIF2α κινάσης (PERK) ενεργοποιείται και μια παροδική αύξηση της φωσφορυλίωσης eIF2α ακολουθεί [22]. Αυτό οδηγεί σε μια παγκόσμια εξασθένηση της μετάφρασης πρωτεϊνών που μπορεί να πάει χέρι-χέρι με την αυξημένη μετάφραση των συγκεκριμένων mRNAs που διαθέτουν είτε ένα στοιχείο εσωτερικού ριβοσώματος είσοδο του ξενοδοχείου [23] ή βραχυκύκλωμα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης σε «ηγέτη τους 5 [17]. Η παγκόσμια εξασθένηση της μετάφρασης πρωτεΐνης μειώνει το φορτίο ER, ενώ ειδικές πρωτεΐνες των οποίων η μετάφραση είναι αυξημένη ενεργοποίηση της μεταγραφής των γονιδίων που ρυθμίζουν την κυτταρική απόκριση στο στρες. Η ανακούφιση της φωσφορυλίωσης eIF2α απαιτείται προκειμένου να καταστεί δυνατή η μετάφραση της νέας μεταγραφικό [24]

Η έκθεση των εμβρυϊκών ινοβλαστών ποντικού (MEF) για αντικαρκινικούς παράγοντες – όπως αναστολείς δοξορουβικίνη ή αποακετυλάσης ιστόνης – επίσης οδηγήσει σε αυξημένη φωσφορυλίωση της eIF2α, αν και μια παρατεταμένη και όχι ένα παροδικό όνη [25,26]. Σε αυτές τις μελέτες τροποποιημένα ΥΠΟΙΟ μεταφέρουν τα μη φωσφορυλιώσιμη μεταλλάξεις eIF2α Α /Α έδειξε υψηλότερη ευαισθησία στα φάρμακα από τους ομολόγους S /άγριου τύπου S τους οδηγούν στο συμπέρασμα ότι το φάρμακο που προκαλείται από αύξηση της φωσφορυλίωσης eIF2α είναι προστατευτική ενάντια κυτταρικό θάνατο. Ωστόσο, ενώ οι αυστηρές ρυθμίσεις φωσφορυλίωση eIF2α μπορεί να είναι προστατευτική, η υπερβολική και παρατεταμένη φωσφορυλίωση eIF2α μπορεί να είναι τόσο επιβλαβές όσο συνολική κατάργηση της. Πράγματι, έχει παρατηρηθεί ότι, ενώ σφιχτά ρυθμιζόμενη φωσφορυλίωση eIF2α απαιτείται για τη σωστή εμβρυϊκή ανάπτυξη, μια ανεπάρκεια σε φωσφορυλιωμένη eIF2α σηματοδότησης, λόγω ομοζυγωτία για eIF2α Α /Α, καθώς και η υπερβολική φωσφορυλίωση που προκύπτουν από ένα νοκ-άουτ από CReP, μία μετάλλαξη η οποία οδηγεί σε αναστολή του eIF2α αποφωσφορυλίωσης, συνδέονται με εμβρυϊκό αναιμία και καθυστέρηση της ανάπτυξης [22]. Επίσης, η μετάλλαξη σε PERK και αναστολή eIF2α φωσφορυλίωσης αποτέλεσμα βήτα-κύτταρα του θανάτου και το σύνδρομο Wolcott-Rallison, και παρομοίως η υπερβολική φωσφορυλίωση eIF2α σε TSC μεταλλαγμένα κύτταρα μετά από έκθεση σε ER στρεσογόνο αναστέλλει την έκφραση του στρες που προκαλείται από μεταγραφικό που οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο [24] .

Οι μελέτες μας εμπλέκουν διατηρηθεί και η υπερβολική φωσφορυλίωση eIF2α σε αναστολή της επιδιόρθωσης του DNA, την ανάπτυξη και γήρανση μειωμένη έκφραση ενός δείκτη επιφανείας που συνδέεται με την ικανότητα τους να αυτοανανεώνονται, παρέχοντας έτσι ένα σκεπτικό για σύνδεση με αυξημένη ευαισθησία στον αντι νεοπλασματικές θεραπείες, όπως ιονίζουσα ακτινοβολία αναστολείς και αποακετυλασών των ιστονών (HDACi). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ανάπτυξη φαρμάκων που αυξάνουν την φωσφορυλίωση eIF2α μπορεί να παρέχει επιπλέον μέσα για την ενίσχυση της ευαισθησίας με καθιερωμένες αντι-νεοπλασματικές θεραπείες ή /και παρακάμπτοντας την αντίσταση στα φάρμακα που στοχεύουν ανάντη συστατικά της οδού ΡΙ3Κ-Akt-mTOR.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

MCF-7 και MDA-MB-231 καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές, από την American Type Culture Collection (Manassas, VA), απλώθηκαν σε πυκνότητα 4 · 10

3 ανά cm

2 και διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Τα κύτταρα ακτινοβολούνται 48 ώρες μετά την επίστρωση σε ένα Cs

137 ακτινοβολίας (Gammacell 1000 Elite /3000 Elan) σε δόση 475 cGy /λεπτό ή ακτινοβολίας ακτίνων Χ (Polaris SC-500 series II) σε μία δόση ποσοστό 100 cGy /λεπτό. Η ραπαμυκίνη, Vorinostat (εργαστήρια LC, Boston, ΜΑ), Ku-0063794 (Σέλεκ, Houston, ΤΧ) και salubrinal (Calbiochem-Merck4Biosciences, Γερμανία) προστέθηκαν στις καλλιέργειες από διαλύματα αποθέματος σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). Οι καλλιέργειες ελέγχου έλαβαν ίσες ποσότητες του οχήματος. συγκέντρωση DMSO στο μέσο δεν υπερέβη το 0,08%. Τα φάρμακα προστέθηκαν στην καλλιέργεια αμέσως μετά την ακτινοβολία.

επιβίωση αποικία δοκιμασία

Επίστρωση για προσδιορισμό αποικίας επιβίωση, καταμέτρηση των αποικιών, και ο υπολογισμός της επιβίωσης κλασμάτων πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Εκτός αν σημειώνεται διαφορετικά, οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν 8-10 ημέρες μετά την επίστρωση, όταν 90-95% των αποικιών στον έλεγχο διαθέτει περισσότερα από 50 κύτταρα. Η θεωρητική αθροιστική δράση, των συνδυασμένων αντι-νεοπλασματική θεραπείες, επί κυτταρικής επιβίωσης υπολογίσθηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: 100 χ SFA x Sfb (SFA = κλάσμα επιβίωσης των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με παράγοντα ‘a’? SFB = κλάσμα επιβίωσης των κυττάρων που έλαβαν με το «β» παράγοντας). Μια προσδιορίζονται πειραματικά κλάσμα επιβίωσης που είναι χαμηλότερο από το υπολογιζόμενο μία υποδηλώνει ότι οι δύο παράγοντες έχουν μια βελτιωμένη και όχι ένα πρόσθετο ανασταλτική επίδραση στην επιβίωση των κυττάρων. Η βασική παραδοχή αυτής της εξίσωσης είναι ότι οι παράγοντες δρουν ανεξάρτητα μεταξύ τους εντός του ίδιου πληθυσμού. Το κυτταρικό κλάσμα σε ποσοστό που δεν επιβιώνουν θεραπεία (IF)% είναι ίση με: [1-επιζών κλάσμα] x100 και το θεωρητικό πρόσθετο ανασταλτικό αποτέλεσμα των παραγόντων Α και Β από το μέγεθος του σκοτώθηκαν κυτταρικό κλάσμα σε τοις εκατό – (IFAB)% είναι ίσο με [29]: 100 χ [1- (1-Ia /100) χ (1-Ib /100)] = 100 χ (1-x SFA SFB).

κηλίδωση Western ανάλυση

Παρασκευή των κυτταρολυμάτων και ανάλυση της θεραπείας που προκαλείται από αλλαγές στο επίπεδο της πρωτεΐνης και φωσφορυλίωση έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27] με μικρές τροποποιήσεις. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίζεται με ένα αντιδραστήριο δικιγχονινικού οξέος (Bio-Rad, Hercules, CA), και ίση φόρτωση επιβεβαιώθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 520 nm του Ponceau S (Sigma, St-Louis, ΜΟ) εκχυλίστηκε με PBS από μεμονωμένες λωρίδες ένα δίδυμο τρέξιμο. Τα στυπώματα εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ για χημειοφωταύγεια μετά από αγωγή με αντιδραστήριο West Pico ECL (Thermo Scientific Rockford, IL). Οι τιμές για την ολοκληρωμένη πυκνότητα φωτός του αυτοραδιογραφήματα ελήφθησαν με Image λογισμικό J ΝΙΗ και χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της θεραπείας που προκαλείται από τις αλλαγές στα επίπεδα της πρωτεΐνης και στην αναλογία του φωσφορυλιωμένου eIF2α (ρ-eIF2α) στο συνολικό επίπεδο της πρωτεΐνης. Κουνέλια αντισώματα που αναγνωρίζουν είτε π-eIF2α ή και τα δύο των φωσφορυλιωμένων και μη φωσφορυλιωμένων eIF2α ήταν από τη Cell Signaling Technologies (Boston, ΜΑ) και αντισώματα προς BRCA1 (κλώνος D9) και CD2 ήταν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, ΤΧ)

Χαρακτηρισμός των επιθηλιακών ειδικό αντιγόνο (ESA) έκφραση με ανάλυση FACS

Έλεγχος και salubrinal επεξεργασμένα κύτταρα αποκολλήθηκαν με μη ενζυμικό διάλυμα διαστάσεως κυττάρων (Sigma, Ισραήλ), επωάζονται με ανθρώπινο ορό και FcR αντιδραστήριο δέσμευσης και στη συνέχεια με ισοθειοκυανικό φθορισμού (FITC) -αντι-ESA ή με ισοτυπικό έλεγχο (Miltenyi Biotec, Germany). 7-αμινοακτινομυκίνης D (7ΑΑΌ, eBiosciences, San Diego, CA) χρησίμευσε ως χρωστική βιωσιμότητας. Ανίχνευση χρώση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με FACSCalibur χρησιμοποιώντας λογισμικό Quest (BD Biosciences, San Jose, CA) όπως περιγράφεται από Keshet et al. για χρώση των επιφανειακών MDR1 [30].

Η χρώση για όξινες β-Galacotosidase

κιτ χρώσης κυττάρων από τη Cell Signaling Technologies χρησιμοποιήθηκε για την χρώση των κυττάρων και μικροφωτογραφίες των χρωματισμένων κυττάρων ελήφθησαν με Nikon TS100 Eclipse ανεστραμμένο μικροσκόπιο και Nikon DS κάμερα.

Αναλύσεις για την επιδιόρθωση του DNA

Μη-ομόλογο τέλος ενώνει (NHEJ) Επισκευή αναλύθηκε σε κύτταρα HeLa και ομόλογο ανασυνδυασμό επισκευής (HRR) αναλύθηκε σε κύτταρα U2OS σταθερά επιμολυσμένα με pEJSSA και PDR-GFP αντίστοιχα [31,32]. Η HeLa [33,34] κύτταρα ήταν ένα δώρο από τον Dr. Dahm-Daphi, Πανεπιστήμιο του Αμβούργου και οι U2OS ήταν ένα δώρο από τον Dr. Scully, Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ [32,34]. Η δοκιμασία διεξήχθη ουσιαστικά όπως περιγράφεται από Moyal et al. και Seluanov et al. [34,35], εκτός του ότι τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 4,5 μΜ salubrinal 6 ώρες πριν από την επιμόλυνση με πλασμίδια που εκφράζουν Ι-δοβΙ (ή κενό φορέα σε ελέγχους). Για τη μέτρηση της NHEJ, τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με το I-δοβΙ που εκφράζουν φορέα και pDsRed2-Ν1 σε αναλογία 10: 1. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε με αντιδραστήριο διαμόλυνσης LT1 DNA (Mirus Bio LLC.) Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Παράλληλη, άγριου τύπου GFP και DsRed εκφράζουν κύτταρα καθώς και αρνητικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν για τη βαθμονόμηση FACS (ρύθμιση τάσης και αποζημίωση χρώμα). δραστηριότητα ΝΗΕΙ ακολούθησε στο Σημειώνεται χρόνο μετά την επιμόλυνση με το I-δοβΙ με την παρακολούθηση της έκφρασης GFP σε DsRed κύτταρα που εκφράζουν. Διεξήχθη ανίχνευση με FACSCalibur σε 50.000 συμβάματα ανά δείγμα. Για τον προσδιορισμό της δραστικότητας HR το κλάσμα των I-δοβΙ που εξαρτώνται GFP κυττάρων που εκφράζουν διαιρέθηκε με την αποτελεσματικότητα μορφομετατροπής σε αυτά τα κύτταρα όπως περιγράφεται από Moyal et al. [34]. Κάτω από τις πειραματικές μας συνθήκες, η επίδραση του salubrinal στη μέση ένταση φθορισμού σε κύτταρα που εκφράζουν GFP ήταν πάντοτε μικρότερη από 10%, υποδεικνύοντας ότι η επίδραση του σημειωμένη salubrinal για την επισκευή του DNA δεν προκύπτει από την αναστολή της μετάφρασης. Επίσης, όπως φαίνεται στον Πίνακα S1 στο File S1, salubrinal δεν μεταβάλλει την κατανομή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων U2OS υποδεικνύοντας ότι η ανασταλτική επίδραση της salubrinal στην δραστικότητα HRR μετά από επιμόλυνση με το I-δοβΙ προκύπτει από την άμεση αναστολή της επισκευής και όχι από μια επίδραση επί το κλάσμα των κυττάρων στη φάση S.

Η επιμόλυνση των κυττάρων με πλασμίδια που κωδικοποιούν για eIF2α παραλλαγές

heIF2α S51A και heIF2α S51D σε pcDNA3.CD2 [36,37] ήταν ένα δώρο από το εργαστήριο του Δρ Ρον Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη. Παροδική διαμόλυνση διεξήχθη με JetPei (Polyplus, New York, ΝΥ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όταν διαμόλυνση εκτελέστηκε σε τρυβλία καλλιέργειας 10 cm – 10 μg πλασμίδια επωάστηκαν σε 6 ml μέσου ανάπτυξης χωρίς αντιβιοτικά επί 24 ώρες πριν από την προσθήκη 4 ml μέσου και προχωρώντας με το πειραματικό πρωτόκολλο. Όταν διαμόλυνση διεξήχθη σε 6 φρεατίων, τα ποσά σημειωθεί πλασμιδίων επωάστηκαν σε 2 ml μέσου ανάπτυξης χωρίς αντιβιοτικά επί 24 ώρες πριν από την προσθήκη 0.5 ml μέσου και προχωρώντας με το πειραματικό πρωτόκολλο. Η έκφραση της πρωτεΐνης ανταποκριτή παρακολουθήθηκε σε κηλίδες Western με αντι-CD2.

Η στατιστική ανάλυση

unpaired Student

t

δοκιμασία ή ένα δείγμα

t

τεστ μετά από λογαριθμική μετατροπή χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση.

p

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Έχει ήδη αποδειχθεί ότι τα οιστρογόνα εξαρτάται MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού είναι πολύ ευαίσθητα σε ραπαμυκίνη (IC

50 – ~ 10 nM). . Σε αντίθεση, το τριπλό αρνητική MDA-MB-231 δεν είναι ευαίσθητα στο φάρμακο (IC

50 -5900 ηΜ) [38] λόγω του σχετικά υψηλού επιπέδου φωσφατιδικό οξύ που ανταγωνίζεται με rapalogues για σύνδεση με την FRB τομέα [9] . Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι ενώ στα κύτταρα MCF-7 ραπαμυκίνη επάγει κλωνογόνων θανάτου με IC

50 ~ 50 ηΜ, στις συγκεντρώσεις MDA-MB-231 κύτταρα έως 2 μΜ δεν επηρέασε σημαντικά την επιβίωση των κυττάρων (Πίνακας S2 σε S1 αρχείο).

eIF2α είναι ένας προς τα κάτω στόχος της ραπαμυκίνης και την ακτινοβόληση

Σε συγκεντρώσεις ηΜ ραπαμυκίνη οδήγησε σε αυξημένη φωσφορυλίωση της eIF2α η οποία ήταν πολύ πιο έντονη σε MCF-7 σε σχέση με το MDA-ΜΒ-231 (Σχήμα 1 αβ). Η ιονίζουσα ακτινοβολία, από την άλλη πλευρά, αυξημένη φωσφορυλίωση eIF2α τόσο MCF-7 και MDA-MB-231 (Σχήμα 2 α-γ) κύτταρα. Σε MDA-MB-231 κύτταρα αυξημένο επίπεδο της p-eIF2α καθώς και η αυξημένη αναλογία p-eIF2α να eIF2α διατηρήθηκε μέσα 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Σε μερικά πειράματα μια μείωση στο συνολικό επίπεδο των eIF2α σε ακτινοβολημένα κύτταρα παρατηρήθηκε, ωστόσο αυτή η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Σε κύτταρα MCF-7, το επίπεδο του ρ-eIF2α καθώς και ότι από το συνολικό επίπεδο των eIF2α μειώθηκε σημαντικά από 48 ώρες μετά την ακτινοβολία, αλλά η αυξημένη αναλογία του π-eIF2α να eIF2α επιτυγχάνεται στις 24 ώρες διατηρήθηκε μετά την ακτινοβόληση.

α. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με 50 ηΜ ραπαμυκίνη, συλλέγονται και υποβάλλονται σε επεξεργασία για τον προσδιορισμό των μεταβολών της eIF2α φωσφορυλίωση β. Η μέση ± SEM φορές μεταβολή σε σχέση με τον έλεγχο των eIF2α (ε), ρ-eIF2α (p) και ο λόγος ρ-eIF2α /eIF2α (p /e) σε κύτταρα κατεργασμένα ραπαμυκίνη. Η ανάλυση αντιπροσωπεύει 6 ξεχωριστούς προσδιορισμούς για τα κύτταρα MCF-7 και 3 για MDA-MB-231 κύτταρα. * Δηλώνει σημαντική μεταβολή σε σχέση με τον έλεγχο –

σ

& lt? 0.05.

Η

α. MCF-7 και b. MDA-MB-231 κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με την υποδεικνυόμενη δόση ακτινοβολίας και επεξεργάστηκαν για ανάλυση φωσφορυλίωσης eIF2α στο σημειώνεται ώρα μετά την ακτινοβόληση. ντο. Η μέση ± SEM του πλάσια μεταβολή σε σχέση με τον έλεγχο των eIF2alpha (ε), ρ-eIF2α (p) και η αναλογία του p-eIF2α /eIF2α (p /e) σε ακτινοβολημένα MCF-7 και MDA-MB-231 κύτταρα. Ανάλυση για MCF-7 στις 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση με 1,5 και 9,5 Gy αντιπροσωπεύει 2 και 3 χωριστούς προσδιορισμούς, αντίστοιχα, και στις 48 ώρες 3 χωριστούς προσδιορισμούς για κάθε δόση. Ανάλυση για MDA-MB-231 κυττάρων σε 24 ώρες αντιπροσωπεύει 3 προσδιορισμών για κάθε δόση και στις 48 ώρες 5 Προσδιορισμός για 1,5 Gy και 6 για 9,5 Gy. * Δηλώνει σημαντική μεταβολή σε σχέση με τον έλεγχο –

σ

& lt? 0.05

Η

Η αυξημένη φωσφορυλίωση της eIF2α είναι επιζήμια για την κυτταρική επιβίωση

Για να προσδιοριστεί η σημασία της αυξημένης φωσφορυλίωσης eIF2α για την κυτταρική επιβίωση μας αντιμετωπίζονται MDA-MB-231 κυττάρων με salubrinal -. Ένας αναστολέας της eIF2α αποφωσφορυλίωσης. Salubrinal οδήγησε σε δοσοεξαρτώμενη αύξηση της φωσφορυλίωσης eIF2α που σχετίζονται με αυξημένη κλωνογόνο θάνατο (Σχήμα 3 Α, Β? Πίνακας 1). Συνδυάζοντας θεραπεία της salubrinal – σε μια συγκέντρωση η οποία δεν επηρεάζει την επιβίωση των κυττάρων (4.5 μΜ) – και την ακτινοβολία οδήγησε σε αυξημένη φωσφορυλίωση της eIF2α που συσχετίστηκε με αυξημένη κλωνογόνο θάνατο (Εικόνα 3 c, d? Πίνακας 2? Πίνακας S3 σε S1 File) . Είναι ενδιαφέρον ότι, σε κύτταρα που έλαβαν συνδυασμένη αγωγή του 4,5 μΜ salubrinal και 1,5 Gy, φωσφορυλίωση eIF2α ήταν παρόμοια με αυτή που λαμβάνεται σε κύτταρα κατεργασμένα με salubrinal μόνο, προτείνοντας ότι ακτινοβολημένα κύτταρα είναι πιο ευαίσθητα σε αυξημένη φωσφορυλίωση eIF2α από μη-ακτινοβολημένα κύτταρα. Αυξημένη ευαισθησία στην ακτινοβολία επίσης σημειωθεί salubrinal επεξεργασμένα κύτταρα MCF-7 (Πίνακας S4 στο S1 αρχείου).

α. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση της φωσφορυλίωσης eIF2α 48 ώρες μετά τη προσθήκη του salubrinal (Sal). σι. Η μέση ± SEM φορές μεταβολή σε σχέση με τον έλεγχο των eIF2α (ε), ρ-eIF2α (p) και του λόγου ρ-eIF2α /eIF2α (p /e) σε salubrinal κατεργασμένα κύτταρα (Sal). Το πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές για 4,5 μΜ και δύο φορές για 16 μΜ. * Δηλώνει σημαντική μεταβολή σε σχέση με τον έλεγχο – P & lt?. 0.05

γ. Τα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με την σημειωθεί δόση ακτινοβολίας πριν από την προσθήκη του 4.5 μΜ Salubrinal (Sal). ρε. Η μέση φορές μεταβολή σε σχέση με τον έλεγχο των eIF2α (ε), ρ-eIF2α (p) και ο λόγος p eIF2α /eIF2α (p /e) .Το πείραμα επανελήφθη μια φορά με παρόμοια αποτελέσματα (τιμές για το Ε, ρ, και ρ /e από αμφότερα τα πειράματα παρουσιάζονται στον πίνακα S3 σε S1 File).

Η Salubrinal (μΜ)

IF (%)

00 ± 0.64.50 ± 5938 ± 216.5100Table 1. Salubrinal προκαλεί δοσοεξαρτώμενη κλωνογονικού θάνατο.

MDA-MB-231 κύτταρα επιστρώνονται και υποβάλλονται σε επεξεργασία για κλωνογονική δοκιμασία. Οι αριθμοί είναι IF (%) ± SEM δειγμάτων εις τριπλούν. Η επίδραση της salubrinal επί του κυτταρικού θανάτου στις 9 και 16,5 μΜ ήταν σημαντική (

ρ

& lt? 0,05). CSV CSV Κατεβάστε Gy

Η-Sal IF (%) + Sal IF (%)

Υπολογιζόμενο Πρόσθετη

00 ± 10 ± 313 ± 0,38 ± 2.631.517 ± 0,630 ± 1.6172.548 ± 166 ± 2.648Table 2. Salubrinal ενισχύει κλωνογονικού κυτταρικό θάνατο σε ακτινοβολημένα κύτταρα.

MDA-MB-231 κύτταρα επιστρώθηκαν για δοκιμασία κλωνογόνο επιβίωση. Salubrinal (Sal) (4,5 μΜ) προστέθηκε στα κύτταρα αμέσως μετά την ακτινοβολία. Οι αριθμοί είναι μέσα IF (%) ± SEM δειγμάτων εις τριπλούν από αντιπροσωπευτικό πείραμα που επαναλαμβάνεται δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Θεωρητική προσθετική δράση των salubrinal και της ακτινοβολίας με το μέγεθος του σκοτώθηκαν κυτταρικό κλάσμα παρουσιάζεται στο «υπολογίζεται πρόσθετο». Η επίδραση της salubrinal στην αυξημένη κλωνογονικού θάνατο μέσα σε 1,5 Gy και 2.5 ομάδες ακτινοβολία Gy ήταν σημαντική (

σ

& lt? 0,05). CSV Λήψη CSV

Παρόμοια με την επίδραση της salubrinal, παροδική επιμόλυνση με το phosphomimetic παραλλαγή eIF2α S51D μειώθηκε – σε ένα πλασμίδιο-δοσοεξαρτώμενο τρόπο – κλωνογονική επιβίωση σε σχέση με αυτό που παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον μη-φωσφορυλιώσιμη παραλλαγή S51A. Σε υψηλές συγκεντρώσεις πλασμιδίου (Σχήμα 4 α) επιβίωση των κυττάρων που εκφράζουν το phosphomimetic παραλλαγής ήταν χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων που εκφράζουν τη μη φωσφορυλιώσιμη παραλλαγή. Ωστόσο σε χαμηλότερη συγκέντρωση πλασμιδίου eIF2α S51D δεν επηρέασε την επιβίωση σε σχέση με eIF2α S51A (Σχήμα 4 β), αλλά οδήγησε σε αυξημένη κλωνογονικού θάνατος σε ακτινοβολημένα κύτταρα (Σχήμα 4 C, Πίνακας 3). Κάτω από τις πειραματικές συνθήκες που προκαλείται από ακτινοβολία αύξηση μας στη φωσφορυλίωση του ενδογενούς eIF2α ήταν παρόμοια σε eIF2α S51A και eIF2α S51D εκφράζουν κύτταρα (Σχήμα S1), υποδεικνύοντας ότι είναι παρόμοια με salubrinal οι καταστροφικές επιπτώσεις που προκαλούνται από έκφραση των αποτελεσμάτων eIF2α S51D από αυξημένο κυτταρικό επίπεδο του ανέστειλε eIF2α δηλαδή eIF2α S51D και φωσφορυλιωμένη ενδογενής πρωτεΐνη.

α. Κύτταρα επιμολυσμένα με 2 μg /2ml eIF2α S51A (SA) ή με eIF2α S51D (SD) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση 17 ημέρες μετά την επιμετάλλωση. Σε αυτή τη συγκέντρωση SD μειώθηκε κλωνογονική επιβίωση. π.Χ. Κύτταρα επιμολυσμένα με 1.5μg /2ml SA ή με SD. Κύτταρα σε β δεν είχαν ακτινοβοληθεί ενώ κύτταρα σε c ακτινοβολήθηκαν με 1.5 Gy 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα κύτταρα σε b και c υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση 10 ημέρες μετά την ακτινοβόληση. Σε αυτή τη συγκέντρωση SD από μόνη της δεν επηρέασε κλωνογονική επιβίωση αλλά αύξησε την ευαισθησία στην ακτινοβολία. Το πείραμα επανελήφθη μια φορά με παρόμοια αποτελέσματα.

Η Α.Ε. IF (%)

+ 1.5 Gy IF (%)

SD Α.Ε. IF (%)

SD + 1.5 Gy IF (%)

0 ± 348 ± 0.50 ± 462 ± 1.5Table 3. Η phosphomimetic παραλλαγή eIF2α αυξήσεις κλωνογονικού θάνατος σε ακτινοβολημένα κύτταρα.

κύτταρα επιμολύνθηκαν με 1.5μg /2 ml eIF2α S51A ή eIF2α S51D. Η ακτινοβόληση με 1,5 Gy έγινε 24 ώρες αργότερα. Οι αποικίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση 10 ημέρες μετά την ακτινοβόληση. Οι αριθμοί είναι μέσα IF (%) από δείγματα εις τριπλούν ± SEM. Το πείραμα επανελήφθη μια φορά με παρόμοια αποτελέσματα. Διαφορές μεταξύ ελέγχου και ακτινοβολημένα ομάδων, καθώς και μεταξύ των δύο ομάδων των ακτινοβολημένων παραλλαγές ήταν σημαντική

σ

& lt? 0,05. SA – μη φωσφορυλιώσιμη eIF2α, S51A, SD – phosphomimetic eIF2α S51D. CSV Λήψη CSV

Salubrinal επηρεάζει την έκφραση των επιφανειακών ESA

Έχει αναφερθεί ότι οι ογκογόνο καρκίνου του μαστού βλαστικά κύτταρα εμπλουτισμένο με ένα υπο-πληθυσμό των κυττάρων που εκφράζουν CD

44 + /CD

24 – /low /ESA

+ στην επιφάνειά τους [39], και ότι ένας υπο-πληθυσμός που εκφράζει ένα παρόμοιο συνδυασμό δεικτών κυτταρικής επιφάνειας έχει ταυτοποιηθεί στον καρκίνο του μαστού κυτταρικές γραμμές (όπως MDA-MB-231), και έχει αποδειχθεί ότι έχουν υψηλή ικανότητα αυτοανανέωσης και την έναρξη του όγκου [40]. Επειδή πάνω από το 90% των κυττάρων MDA-MB-231 είναι CD

44 + /CD

24- /χαμηλή, η διαλογή για έκφραση ESA επιφανείας κυττάρου σε αυτά τα κύτταρα μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης για αλλαγές στο μέγεθος των κυτταρικό κλάσμα με ικανότητα αυτοανανέωσης [40]. Όπως σημειώνεται στο Σχήμα 5, κατεργασία των κυττάρων με salubrinal μειωμένη έκφραση του ESA στην επιφάνεια κυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει ότι η επιβλαβής επίδραση της υπερβολικής φωσφορυλίωσης eIF2α μπορεί να μειώσουν την ικανότητά τους για τον εαυτό ανανέωση.

Τα κύτταρα επωάστηκαν με 24 μΜ salubrinal για 96 ώρες πριν από τη συγκομιδή, χρώση κυττάρων με FITC-αντι-ΕΟΔ ή με ισότυπο ελέγχους εντοπίστηκε με FACSCalibur. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. 7ΑΑΌ – βαφή βιωσιμότητας, FITC -. Αντι-ESA

Η

Salubrinal προκαλεί γήρανση σε καρκινικά κύτταρα του μαστού

Οι αποικίες των ακτινοβολημένων και salubrinal αντιμετωπίζονται τα κύτταρα περιέχουν διευρυμένη και γηρασμένα κύτταρα που αναζητούν. Μετρήσαμε αυτά τα κύτταρα σε αποικίες που σχηματίζονται μετά από έκθεση σε 1 Gy, σε 4,5 μΜ salubrinal στο συνδυασμό ακτινοβολίας και salubrinal και σε χωρίς θεραπεία ελέγχους. Είναι ενδιαφέρον, αν και συνδυασμένη θεραπεία των 4,5 μΜ salubrinal και 1 Gy δεν οδήγησε σε αυξημένη κλωνογόνο θανάτου (Πίνακας 2) το έκανε να οδηγήσει σε βελτιωμένη εμφάνιση του γηρασμένου αναζητούν κυττάρων (Σχήμα 6). Η χρώση των όξινων β-Galacotosidase έδειξε ότι αυτά τα μεγάλα κύτταρα εκφράζουν το ένζυμο που δείχνει ότι πράγματι salubrinal ενισχύει γήρανση σε ακτινοβολημένα κύτταρα (Σχήμα 6).

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για δοκιμασία επιβίωσης αποικίας. Salubrinal (4,5 μΜ) ή το όχημα προστέθηκε αμέσως μετά την ακτινοβολία με 1 Gy. Όξινο δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης αντικατοπτρίζεται στην κυάνωση. Οι αριθμοί είναι μέσος όρος των γηρασμένων αναζητούν κύτταρα /αποικία ± SD σε πλάκες εις τριπλούν και οι διαφορές μεταξύ των συνδυασμένων θεραπειών και κάθε μία από τις θεραπείες σόλα, καθώς και μεταξύ κάθε θεραπείας και ελέγχου ήταν στατιστικά σημαντικές

ρ

& lt? 0.05. Bar, 100 μΜ.

Η

Αυξημένη eIF2α φωσφορυλίωση ρυθμίζει την επιδιόρθωση του DNA

Η ακτινοβολία οδήγησε σε αύξηση του επιπέδου του BRCA1, μιας πρωτεΐνης που συμμετέχει στην επιδιόρθωση του DNA μετά από βλάβη της ακτινοβολίας [41]. Η αύξηση του BRCA1 καταργήθηκε από salubrinal και με παροδική έκφραση του phosphomimetic eIF2α S51D γεγονός που υποδηλώνει ότι η υπερβολική φωσφορυλίωση eIF2α διαμορφώνει επιδιόρθωση της βλάβης του DNA (Σχήμα 7). Πράγματι πειράματα με κύτταρα HeLa και κύτταρα που εκφράζουν U2OS πλασμίδια ανταποκριτές για NHEJ και HRR αντίστοιχα έδειξε ότι salubrinal ανέστειλε την επισκευή του Ι-δοβΙ επαγόμενη DSB μέσω και των δύο μηχανισμών (Σχήμα 8).

Πάνω πίνακας: Έλεγχος και ακτινοβολημένα κύτταρα (1.5 Gy) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 4,5 μΜ salubrinal ή το όχημα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση και σε επεξεργασία για ανάλυση κηλίδος western των αλλαγών στο επίπεδο των BRCA1.

Κάτω πάνελ: Κύτταρα επιμολυσμένα με 10 μg /ml του S51A και S51D eIF2α παραλλαγών ή με αντιδραστήρια διαμόλυνσης μόνο (ψευδό). Τα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με 9.5 Gy 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανάλυση BRCA1 24 ώρες μετά την ακτινοβολία. CD2 εκφράστηκε σε επιμολυσμένα κύτταρα υποδεικνύοντας μια επιτυχή διαμόλυνση. Sal – 4,5 μΜ salubrinal.

Η

α. Μέτρηση της δραστικότητας NHEJ διεξήχθη 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με Ι-δοβΙ. Το πείραμα επανελήφθη μία φορά με παρόμοια αποτελέσματα δηλαδή δραστηριότητα επισκευής 4% για τον έλεγχο και 3% για salubrinal επεξεργασμένα κύτταρα. σι. Μέτρηση της δραστικότητας HR διεξήχθη 36 ώρες μετά την επιμόλυνση με Ι-δοβΙ. Το πείραμα επανελήφθη μία φορά με παρόμοια αποτελέσματα δηλαδή 2,35% δραστικότητα για τον έλεγχο και 1,6% δραστικότητα για salubrinal κατεργασμένων κυττάρων στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με Ι-δοβΙ. Sal -. 4,5 μΜ salubrinal

Η

Η αυξημένη και παρατεταμένη φωσφορυλίωση επηρεάζει ανταπόκριση των καρκινικών κυττάρων του μαστού σε Vorinostat

Παρόμοια με ακτινοβολία, η HDACi – Vorinostat οδηγεί επίσης σε αυξημένη φωσφορυλίωση eIF2α. Η αύξηση αυτή έχει θεωρηθεί ως ένα μέσο κυτταρικής προστασίας έναντι ζημίας [26]. Ωστόσο, συνδυάζοντας χαμηλές συγκεντρώσεις salubrinal και Vorinostat, σε συγκεντρώσεις που μεμονωμένα δύσκολα επηρεάζει τη φωσφορυλίωση eIF2α, οδήγησε σε αυξημένη φωσφορυλίωση της eIF2α, η οποία για άλλη μια φορά συνδέθηκε με αυξημένο κλωνογονικού θάνατο (Εικόνα 9, Πίνακας 4, Πίνακας S5 στο S1 αρχείου).

α. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την εφαρμογή του οχήματος (D), 4.5 μΜ salubrinal (S), 0.75 μΜ Vorinostat (V) ή και τα δύο (V + S) και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανάλυση στυπώματος Western της φωσφορυλίωσης eIF2α. σι. Η μέση φορές μεταβολή σε σχέση με τον έλεγχο του eIF2α (ε), peIF2α (p) και του λόγου peIF2α /eIF2α (p /e). σι.