Αφηρημένο

Ιστορικό

δικλοφενάκη είναι ένα από τα παλαιότερα αντι-φλεγμονώδη φάρμακα σε χρήση. Εκτός από την αναστολή της κυκλοοξυγενασών (COX), diclofenac αναστέλλει αποτελεσματικά φωσφολιπάση Α

2 (PLA

2), αποδίδοντας έτσι μια ευρεία αντιφλεγμονώδη δράση. Δεδομένου ότι η φλεγμονή είναι ένας σημαντικός παράγοντας στην ανάπτυξη των παγκρεατικών όγκων διερευνήσαμε τις δυνατότητες των diclofenac να αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου σε ποντίκια που εμβολιάστηκαν με τα κύτταρα PANCO2 ορθοτοπικά.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Βρήκαμε ότι η δικλοφενάκη αγωγή (30 mg /kg /σωματικού βάρους επί 11 ημέρες) από ποντίκια που εμβολιάστηκαν με τα κύτταρα PANC02, μείωσε το βάρος του όγκου κατά 60%, συσχετίζοντας με αυξημένη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων. Επειδή δεν παρατηρήθηκε αυτό το φαινόμενο

in vitro

σε καλλιεργημένα κύτταρα PANCO2, έχουμε υποθέσει ότι η δικλοφενάκη ευεργετική θεραπεία που εμπλέκονται άλλων μεσολαβητών που υπάρχουν στο

vivo

. Πράγματι, δικλοφενάκη μειώθηκαν δραστικά αγγείωση όγκου με προς τα κάτω ρύθμιση VEGF στον όγκο και στην κοιλιακή κοιλότητα ρευστού. Επιπλέον, δικλοφενάκη αναστέλλεται άμεσα αγγειακή βλάστησης

ex vivo

. Αναπάντεχα, σε αντίθεση με άλλους αναστολείς COX-2, δικλοφενάκη αυξημένη δραστικότητα αργινάσης /αργινάσης 1 περιεκτικότητα πρωτεΐνης σε κύτταρα στρώματος του όγκου, περιτοναϊκά μακροφάγα και τα λευκά αιμοσφαίρια κατά 2,4, 4,8 και 2 φορές, αντίστοιχα. Προτείνουμε ότι η επακόλουθη εξάντληση αργινίνη και μείωση στα επίπεδα ΝΟ, τόσο στον ορό και περιτοναϊκή κοιλότητα, προσθέτει στην αναστολή ανάπτυξης όγκου από υποσιτισμό και κακή ανάπτυξη αγγείων.

Συμπέρασμα /Σημασία

Εν κατακλείδι, δικλοφενάκη παρουσιάζει έντονη αντικαρκινική ιδιότητες στον παγκρεατικό καρκίνο μοντέλο που μπορεί να συμβάλει στην περαιτέρω ανάπτυξη της θεραπείας. Η ικανότητα του diclofenac να προκαλέσει αργινάσης δραστηριότητα στρώματος του όγκου, περιτοναϊκή μακροφάγα και λευκά αιμοσφαίρια παρέχει ένα εργαλείο για να μελετήσουν ένα αμφιλεγόμενο θέμα της προ-και αντικαρκινική δράση της εξάντλησης αργινίνης

Παράθεση:. Mayorek Ν, Naftali-Shani Ν, Grunewald Μ (2010) δικλοφενάκη αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού για καρκίνο του παγκρέατος από τη διαφοροποίηση του VEGF Επίπεδα και αργινάση δραστηριότητας. PLoS ONE 5 (9): e12715. doi: 10.1371 /journal.pone.0012715

Επιμέλεια: Ειρήνη Oi Lin Ng, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 31ης Γενάρη του 2010? Αποδεκτές: 6 Αυγούστου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 15 Σεπ 2010

Copyright: © 2010 Mayorek et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εβραϊκό Πανεπιστήμιο-Hadassah Medical School (επιχορήγηση # 0463435). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η φλεγμονή είναι ιδιαίτερα σχετίζεται τόσο με την καρκινογένεση και στην εξέλιξη της ανάπτυξης του όγκου [1]. Επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι η χρόνια φλεγμονή προδιαθέτει τους ασθενείς σε ανάπτυξη καρκίνου και μακροχρόνια χρήση μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων (NSAIDs) μειώνει τον κίνδυνο πολλών μορφών καρκίνου [2]

κυκλοοξυγενάσες (COX-1 και. – 2) είναι περιοριστικό του ρυθμού ενζύμων στην παραγωγή προσταγλανδινών (PG) από το αραχιδονικό οξύ.

COX-1 έκφραση είναι γενικά συστατική, ενώ η COX-2 συνήθως επάγεται από ερεθίσματα που εμπλέκονται στις φλεγμονώδεις αποκρίσεις. Η προσταγλανδίνη Ε2 (PGE2), ένας κύριος μεταβολίτης της COX-2, έχει δειχθεί ότι προάγουν την κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση και αναστέλλουν την απόπτωση και κατά του όγκου ανοσοαπόκριση, όλες οι διεργασίες προώθηση της ανάπτυξης του καρκίνου [3].

παγκρέατος ο καρκίνος είναι μια θανατηφόρα ασθένεια με πολύ περιορισμένες επιλογές για τη θεραπεία. Η χρόνια παγκρεατίτιδα προδιαθέτει τα άτομα σε αναπτυσσόμενες παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα [4] και παγκρεατικής στρώματος του όγκου χαρακτηρίζεται από την ποικιλία των φλεγμονωδών κυττάρων [5] που υποδηλώνει την εμπλοκή των φλεγμονωδών διεργασιών σε αυτού του καρκίνου. COX-2 υπερεκφράζεται σε περίπου 75% των ανθρώπινων καρκινωμάτων συμπεριλαμβανομένων και εκείνων του παγκρέατος. Πρόσφατες μελέτες σε διαγονιδιακά ποντίκια [6], [7], [8] έχουν δείξει ότι η COX-2 υπερέκφραση στις εξωκρινές πάγκρεας που προκαλείται από παγκρεατίτιδα-like-κατάσταση. Η έναρξη του καρκίνου σε αυτά τα ποντίκια αποτράπηκε με τη διατήρηση ποντικούς επί εκλεκτικών αναστολέων της COX-2, καταδεικνύοντας περαιτέρω το σημαντικό ρόλο της φλεγμονής στην ανάπτυξη καρκίνου του παγκρέατος.

Ανθρώπινα δοκιμές για την πρόληψη του καρκίνου του παχέος εντέρου πρόσφατα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας COX- 2 αναστολέων. Παρά τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα στην πρόληψη και τη μείωση του καρκίνου του παχέος εντέρου στην συχνότητα εμφάνισης των αδενωμάτων του παχέος εντέρου, ΜΣΑΦ και εκλεκτικών αναστολέων της COX-2 μπορεί να προκαλέσει σοβαρές ανεπιθύμητες καρδιαγγειακές και γαστρεντερικές πλευρά και ως εκ τούτου δεν συνιστώνται συνήθως για αυτές τις ασθένειες [9], [10].

δικλοφενάκη, ένα από τα παλαιότερα ΜΣΑΦ ήταν σε χρήση από το 1976. δικλοφενάκη αναστέλλει κυκλοοξυγενασών μη επιλεκτικά. Μελέτες σε ανθρώπους έδειξαν ότι μειώνει το 94% του COX-2 και το 49% της COX-1 δραστηριότητα [11]. In vitro αναστέλλει ισχυρώς φωσφολιπάση Α2 (PLA2) [12], το ένζυμο που ελευθερώνει το αραχιδονικό οξύ και λυσοφωσφολιπίδιο για να δημιουργήσει μια οικογένεια προ-φλεγμονωδών εικοσανοειδών (συμπεριλαμβανομένων PGE2) και παράγοντα ενεργοποίησης αιμοπεταλίων. Πρόσθετες στοιχεία δείχνουν ότι η δικλοφενάκη αναστέλλει επίσης PLA2 στο

vivo

. PLA2 πιστεύεται ότι παίζει βασικό ρόλο στα πρώτα στάδια του καταρράκτη φλεγμονωδών οδηγεί σε οξεία παγκρεατίτιδα [12]. Η αρχική μελέτη [13], που ακολουθείται από αρκετές άλλες ομάδες, έχει δείξει ότι η δικλοφενάκη μπορεί να μειώσει σημαντικά την ταχύτητα της οξείας παγκρεατίτιδας προκαλούνται από την ενδοσκοπική ανάδρομη χολαγγειοπαγκρεατογραφία.

Υπό το φως της ικανότητας diclofenac να αναστέλλουν ισχυρά τόσο COX-2 και PLA2 έχουμε διερευνηθεί αντικαρκινικά δυναμικό του σε ένα μοντέλο ποντικού καρκίνου του παγκρέατος. Εδώ αναφέρουμε ότι η θεραπεία με δικλοφενάκη προκαλεί μια μείωση 60% στο μέγεθος του όγκου. Αυτό οφείλεται στην αυξημένη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων. Παρέχουμε αποδείξεις ότι η επίδραση αυτή είναι έμμεση και λειτουργεί μέσω τουλάχιστον δύο μηχανισμών. Πρώτον, δικλοφενάκη προκύπτει σημαντικό αντιαγγειογενετική δράση, όπως αποδεικνύεται από την ισχυρή μείωση της αγγειακής περιεχόμενο όγκου ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), μειωμένη πυκνότητα μικροαγγειακές και μορφολογικές αλλαγές στα αιμοφόρα αγγεία του όγκου. Δεύτερον, η θεραπεία δικλοφενάκη αυξάνει αξιοσημείωτα δραστηριότητα αργινάσης σε κύτταρα στρώματος του όγκου, περιτοναϊκά μακροφάγα και τα λευκά αιμοσφαίρια. Αυτό είναι ένα μη αναμενόμενο εύρημα επειδή οι αναστολείς COX-2 αποδείχθηκε ότι μειώνουν την ανάπτυξη του όγκου μέσω αναστολής αργινάσης [14], [15] Τα αποτελέσματα μας συμφωνούν με προηγούμενες μελέτες, οι οποίες έπειτα στην αντικαρκινική [16] και αντιαγγειογενετική δράση [17] της αργινίνης εξάντληση και να υποστηρίξει την μάλλον αμφιλεγόμενη προσέγγιση της αντικαρκινικής θεραπείας με την ενίσχυση της δραστηριότητας αργινάσης [18], [19].

Μέθοδοι

δήλωση Ηθικής

διαδικασίες σε πειραματόζωα εγκρίθηκαν από το Επιτροπή Ηθικής του Εβραϊκού Πανεπιστημίου, η οποία ενεργεί υπό την εποπτεία του AAALAC International.

Ζώα και PANCO2 κυτταρική σειρά

Γυναίκα CB6F1 ποντίκια (ηλικίας 9-10 εβδομάδων) και αρσενικοί αρουραίοι Sprague-Dawley (200 g) ήταν από την Harlan, Ισραήλ. Γυναίκα CX3CR1

/+ ποντίκια GFP [20] ήταν γενναιόδωρα παρέχεται από τον S. Jung (Rehovot, Ισραήλ). Σε αυτούς τους ποντικούς ένας αναφοράς GFP οδηγείται από τον υποκινητή CX3CR1. Δραστηριότητα αυτού του υποκινητή του υποδοχέα χημειοκίνης περιορίζεται σε μονοπύρηνα κύτταρα μυελοειδούς, συμπεριλαμβανομένων όλων των κυκλοφορούντων CD116

+ μονοκύτταρα, και ουσιαστικά απουσιάζει από τα κύτταρα του λεμφοειδούς γράμμωσης. Όλα τα πειράματα, εκτός του πειράματος παρουσιάζονται στο Σχήμα S3 διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ποντίκια CB6F1.

PANC02 κύτταρα ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Μ Dauer (Μόναχο, Γερμανία). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 2 mM L-γλουταμίνη, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη.

ορθοτοπική-συγγενές πρότυπο του καρκίνου του παγκρέατος

ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ένα μείγμα κεταμίνης-ξυλαζίνης. Το πάγκρεας εγχύθηκε με 4 × 10

5 (CB6F1 ποντικούς) ή 6 × 10

5 (CX3CR1

GFP /+ ποντίκια) PANC02 κύτταρα σε 30 ρυθμισμένο με φωσφορικό άλας αλατούχο ορό μΙ (PBS). Τα ποντίκια είχαν αφαιρεθεί από ένα πείραμα αν μια περιτοναϊκή διαρροή ήταν ύποπτη. Sham λειτουργεί ποντίκια υποβλήθηκαν στην ίδια διαδικασία και εγχύθηκαν με 30 μΐ PBS. Οι ποντικοί χωρίστηκαν σε ομάδες των 6 έως 8 ζώα ανά ομάδα. Η ομάδα που υπέστη αγωγή έλαβαν 30 mg /kg σ.β. δικλοφενάκη στο πόσιμο νερό, αρχής γενομένης από την ημέρα 3 μετά τον εμβολιασμό. Η δοσολογία υπολογίστηκε με βάση την εκτίμηση ότι ένα ποτό ποντίκι περίπου 3 ml νερού ανά ημέρα. Τα ποντίκια θανατώθηκαν 14 ημέρες μετά τον εμβολιασμό εκτός αν ορίζεται διαφορετικά.

αίμα για τα λευκά αιμοσφαίρια (WBC) προετοιμασία, συγκέντρωση VEGF και οξειδίων του αζώτου (ΝΟ) λήφθηκε από την καρδιά. Περιτοναϊκή κοιλότητα ξεπλύθηκε με 2 ml PBS με αλβουμίνη 0,1% βόειου ορού (BSA) για την προετοιμασία των μακροφάγων, για τη μέτρηση του VEGF και για κανένα συγκεντρώσεις.

περιτοναϊκή κύτταρα και περιτοναϊκών μακροφάγων απομόνωση

Περιτοναϊκή κύτταρα ελήφθησαν με φυγοκέντρηση της περιτοναϊκής κοιλότητας flush. Περιτοναϊκά μακροφάγα απομονώθηκαν από κύτταρα περιτοναϊκού με διαφορική προσκόλληση σε πλαστικό. Τα μακροφάγα καλλιεργήθηκαν σε RPMI με 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη για 20 ώρες. Για να μετρηθεί η δραστικότητα αργινάσης, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και διαλύονται σε 0.1% TritonX100 σε νερό για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.

ομογενοποιήματα όγκου

ομογενοποιήματα όγκου παρασκευάστηκαν από δείγματα όγκων που αποθηκεύθηκαν στους -80 ° C, σε νερό που περιέχει 0.1% Triton Χ 100 και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma P8340). Τα ομογενοποιήματα φυγοκεντρήθηκαν για 30 λεπτά σε 13400 g και τα υπερκείμενα χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση της αργινάσης δραστηριότητα, αργινάσης 1, λείου μυός ακτίνη και περιεχόμενο VEGF και κασπάσης-3 ενεργοποίησης.

Οστών κύτταρα μυελού απομόνωση

κνημών και μηριαία οστά από τα ποντίκια που φέρουν όγκο απομακρύνθηκαν και ξεπλένεται με PBS. Μετά από φυγοκέντρηση των κυττάρων που συλλέγονται σε κλίση Ficoll σε 4000 g για 20 λεπτά σε μονοπύρηνα κύτταρα θερμοκρασία δωματίου απομονώθηκαν με ΡΕ-συζευγμένο πρωτογενές αντίσωμα αντι-CD 115 και μικροσφαιρίδια αντι-ΡΕ (Biolegends). CD-115 θετικά και αρνητικά κύτταρα αναλύθηκαν για αργινάσης δραστηριότητα.

απομόνωση Λευκά αιμοσφαίρια (WBC)

WBC απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας διαβάθμιση πυκνότητας Ficoll (Amersham). WBC κλάσμα πλύθηκε, κύτταρα μετρήθηκαν, λύθηκαν σε νερό που περιέχει 0.1% Triton Χ 100 και αναλύθηκαν για περιεκτικότητα αργινάσης 1 πρωτεΐνη.

αορτικού δακτυλίου βλάστησης δοκιμασία

αορτικών δακτυλίων παρασκευάστηκαν από θωρακικές αορτές του Sprague-Dawley, όπως περιγράφεται [21]. Δαχτυλίδια ήταν ενσωματωμένα σε τζελ κολλαγόνου και διατηρούνται σε μέσο Bio MPM (Biological Industries, Israel). Η θεραπεία με 10 μΜ diclofenac ξεκίνησε μία ημέρα μετά την σπορά και διήρκεσε 5 ημέρες. Οι δακτύλιοι στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 4% ρυθμισμένη φορμαλίνη, χρωματίζονται με 0,02% κρυσταλλικό ιώδες σε απόλυτη αιθανόλη. Βλάστησης περιοχή αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Pro Image.

κασπάσης-3

ενεργοποίηση

κασπάσης-3 ενεργοποίησης μετρήθηκε σε προϊόντα ομογενοποίησης όγκου, διαχωρίζοντας το μη διασπαστεί και να διασπαστεί κασπάσης-3 σε 20% ακρυλαμιδίου SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση πηκτής και Western με μονοκλωνικά αντι-κασπάσης-3 (κυτταρική σηματοδότηση).

VEGF και περιεκτικότητας σε ΝΟ

περιεχόμενο VEGF μετρήθηκε στον ορό, στο υπερκείμενο της περιτοναϊκής κοιλότητας φλος, σε ομογενοποιήματα όγκων, PANC02 και καλλιεργήθηκαν μακροφάγα χρησιμοποιώντας το VEGF Quantikine kit ποντικού ανοσοδοκιμασίας (R &? συστήματα D).

ΝΟ περιεχόμενο μετρήθηκε στον ορό και στο υπερκείμενο της περιτοναϊκής κοιλότητας flush χρησιμοποιώντας νιτρικό /νιτρώδες χρωματομετρική κιτ προσδιορισμού (Cayman Chemical Company).

αργινάση δραστηριότητα

η αργινάση δραστηριότητα μετρήθηκε όπως περιγράφεται [22]. 100 μα πρωτεΐνης αναλύθηκε επί 10 λεπτά στους 37 ° C για περιτοναϊκή κύτταρα και μακροφάγα, 30 λεπτά για ομογενοποιήματα όγκου και 2 ωρών για τα κύτταρα του μυελού των οστών. Η περιεκτικότητα πρωτείνης μετρήθηκε σε κάθε δείγμα χρησιμοποιώντας το micro BCA κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Thermo Scientific).

αργινάση 1 και λείου μυός ακτίνη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη

Οι πρωτεΐνες από ομογενοποιήματα όγκου, WBC λύματα και θετικά κύτταρα GFP απομονωμένος από όγκους διαχωρίστηκαν σε 10% πηκτή ακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρησης SDS-PAGE και στυπώθηκαν είτε με μονοκλωνικό αργινάσης-1 (BD Transduction Laboratories) ή μονοκλωνικά λείου μυός ακτίνη (Sigma).

Απομόνωση μονοπύρηνων μυελοειδή κύτταρα από όγκους

οι όγκοι που εξάγονται από CX3CR1

GFP /+ ποντίκια και υπέστησαν πέψη με κολλαγενάση (400 μονάδες /ml? Sigma και Dnase 0,33 mg /ml? Sigma) για 45 λεπτά στους 37 ° C. GFP θετικό πληθυσμό καθαρίζεται με διαλογή κυττάρων υψηλής ταχύτητας χρησιμοποιώντας FACS Aria (Becton, Dickinson). Τα κύτταρα μετρήθηκαν και λύθηκαν σε νερό που περιέχει 0.1% Triton Χ 100 και αναλύθηκαν για περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη αργινάσης 1.

Cells PANCO2 ρυθμός αύξησης

PANC02 κύτταρα σπάρθηκαν σε RPMI συμπληρωμένο με 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Diclofenac (10 ή 50 μΜ) προστέθηκε την επόμενη ημέρα και μετά από 4 ημέρες θεραπείας, τα κύτταρα περιεκτικότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Biological Industries, Israel).

Ανοσοϊστοχημεία, χρώση TUNEL και μορφομετρίας

τομές παραφίνης των όγκων χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-ποντικού αρουραίου F4 /80 (Serotec), μονοκλωνικά αντι- αργινάσης-1 (BD Transduction Laboratories), μονοκλωνικά αντι-α λείων μυών ακτίνης (Sigma), μονοκλωνικά αντι- Ki 67 (NeoMarkers), κουνελιού αντι-φωσφόρου-ιστόνης Η3 (Cell Signaling), αντι-VEGF (Calbiochem) και μονοκλωνικά αντι- παράγοντα von Willebrandt (DACO). Χρένο υπεροξειδάσης (HRP) δευτερογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για χρωμογόνο ανίχνευση.

χρώση TUNEL [23] πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ situ ανίχνευση κυτταρικού θανάτου (Roche).

Η ποσοτικοποίηση των immunostaning δεδομένων έγινε είτε από πεδίο υψηλής ανάλυσης καταμέτρηση τουλάχιστον 10 τομείς /slide από 4 διαφορετικούς όγκους σε κάθε ομάδα ή με τη βοήθεια του συστήματος ανάλυσης εικόνας (Ariol SL-50).

η στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό SigmaStat (λογισμικό Aspire διεθνής). Μια δοκιμασία Mann-Whitney χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί σημαντικές διαφορές μεταξύ μη επεξεργασμένα και diclofenac δείγματα επεξεργασμένα. Η τιμή p ≤ 0,05 έγινε δεκτή ως σημαντική.

Το μέγεθος του δείγματος και τον αριθμό των επαναλήψεων που αναφέρεται στο θρύλους.

Αποτελέσματα

δικλοφενάκη αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο καρκίνο του παγκρέατος σε ποντίκια

κύτταρα PANC02 εγχύθηκαν στην ουρά του παγκρέατος. Μετά από 4 ημέρες τα καρκινικά κύτταρα σχηματίζονται μικροί όγκοι μήκους περίπου 4 mm. Οι όγκοι αναπτύσσονται γρήγορα? κατά την ημέρα 8 είχαν διπλασιαστεί σε μήκος και μετάσταση με συνέπεια στην περιτοναϊκή περιοχή της κοιλιακής τομής που εκτελούνται για τον εμβολιασμό του όγκου. Κατά την ημέρα 14, όγκοι οι οποίοι αναπτύχθηκαν στη θέση του εμβολιασμού (πρωτοπαθείς όγκους), ζύγιζε 300-500 mg και ήταν εξαιρετικά vascularized. Οι μεταστατικούς όγκους στο κοιλιακό κόψιμο και στο σπλήνα ήταν επίσης εξέχοντα (Σχήμα 1Α).

Τα ποντίκια εμβολιάστηκαν με 4 × 10

5 PANC02 κύτταρα στην ουρά τμήμα του παγκρέατος. Την ημέρα 3 μετά τον εμβολιασμό (την ημέρα του εμβολιασμού ορίστηκε ως ημέρα 1) ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν σε αγωγή και δικλοφενάκη αγωγή ομάδες (7-8 ποντίκια σε κάθε ομάδα) και ξεκίνησε η δικλοφενάκη Χλγρ βάρους σώματος θεραπεία /30 mg. Την ημέρα 14 μετά τον ενοφθαλμισμό των ποντικών σκοτώθηκαν και πρωτογενών και μεταστατικών όγκων αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν. Ένας, ένας εκπρόσωπος φωτογραφίες του

in situ

πρωτογενή (

κύκλους

) και μεταστατικούς όγκους (

βέλη

). Ένθετα δείχνουν απομονωμένα πρωτοπαθείς όγκους. Β, Μέσος όρος ± SE των βαρών του όγκου των 8 χωρίς θεραπεία και 7 ποντίκια που έλαβαν θεραπεία δικλοφενάκη * P≤0.01. Το αντιπροσωπευτικό πείραμα από τα τέσσερα εμφανίζεται.

Η

Τρεις έως τέσσερις εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό, η περιτοναϊκή κοιλότητα ήταν γεμάτη από αιματηρές ασκίτη. Πολυάριθμες μεταστατικούς όγκους βρέθηκαν στην περιτοναϊκή κοιλότητα, συμπεριλαμβανομένων των λεμφαδένων του πεπτικού γραμμής, και οι ποντικοί άρχισαν να πεθαίνουν. Μεταστατικούς όγκους στο ήπαρ ή οι πνεύμονες δεν είχαν εντοπιστεί.

Μετέπειτα πειράματα, επομένως, τερματίστηκε την ημέρα 14 μετά τον εμβολιασμό. Τα ποντίκια φάνηκε φυσιολογικό σε αυτό το στάδιο και δεν υπήρχε απώλεια σωματικού βάρους.

δικλοφενάκη (30 mg /kg σωματικού βάρους) δόθηκε καθημερινά στο πόσιμο νερό που ξεκινούν από την 3η ημέρα μετά τον εμβολιασμό. Τα αποτελέσματά του εξετάστηκαν μετά από 11 ημέρες θεραπείας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, το βάρος του πρωτογενούς όγκου (καλλιέργεια στο πάγκρεας) ήταν σημαντικά χαμηλότερη (60%) σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή diclofenac σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα ζώα. Οι μεταστατικοί όγκοι οι οποίοι αναπτύχθηκαν στην κοιλιακή τομή ζυγίστηκε επίσης λιγότερο σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή diclofenac, σε όλα τα πειράματα, όμως το αποτέλεσμα αυτό δεν ήταν στατιστικά σημαντική.

Diclofenac αυξάνει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων

in vivo

, αλλά όχι

in vitro

Η

Το μειωμένο βάρος του όγκου παρατηρήθηκε σε ποντικούς που έλαβαν δικλοφενάκη μας οδήγησε να εξετάσει τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων.

Οι όγκοι βάφτηκαν για Ki 67 (παρόντες κατά τη διάρκεια της όλες οι ενεργές φάσεις του κυτταρικού κύκλου: G1, S, G2, και μίτωση) και φωσφο-ιστόνης Η3 (ο ειδικός δείκτης μιτωτικών κυττάρων) δεν έδειξε διαφορά μεταξύ μη επεξεργασμένων και diclofenac ποντίκια με αγωγή, Σχ S1

. Ωστόσο, όπως φαίνεται στο σχήμα 2, η θεραπεία με δικλοφενάκη αυξημένη απόπτωση κατά 6 φορές, όπως υποδεικνύεται από TUNEL χρώση των όγκων και ποσοτικού προσδιορισμού (Σχήμα 2Α). Το εύρημα αυτό υποστηρίχθηκε περαιτέρω από μια ενισχυμένη παρουσία διασπασμένης κασπάσης 3 σε προϊόντα ομογενοποίησης από όγκους αποκόπηκε από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή diclofenac (Σχήμα 2Β).

Α και Β, οι ποντικοί εμβολιάσθηκαν με κύτταρα PANC02 και επεξεργάστηκε με δικλοφενάκη, όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1. Α,

lef

t, χρώση TUNEL superpositioned πάνω DAPI χρώση των σταθερών όγκων,

δεξιά

, μέσος όρος ± SE% των TUNEL θετικών πυρήνων από DAPI χρώση των πυρήνων. Περίπου 9000 πυρήνες από όγκους των 4 ανεπεξέργαστων και 4 ποντίκια που έλαβαν θεραπεία δικλοφενάκη μετρήθηκαν * P≤0.001. Β, κασπάση-3 ενεργοποίησης σε ομογενοποιήματα όγκου 4 ανεπεξέργαστων και 3 δικλοφενάκη ποντικούς που υπέστησαν αγωγή μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι, ένας στους δύο πειραμάτων. C, PANC02 (3000 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 96 πηγαδιών NUNC. Η ημέρα μετά τη σπορά 10 ή 50 μΜ δικλοφενάκη προστέθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 4 ημέρες. Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Η μέση ± SE της OD από 6 φρεάτια σε κάθε ομάδα. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από 3.

Η

Η αυξημένη απόπτωση που προκαλείται από δικλοφενάκη

in vivo

δεν θα μπορούσε να ανακεφαλαιωθούν

in vitro

. κύτταρα PANC02 καλλιεργήθηκαν για 4 ημέρες παρουσία του 10 και 50 μΜ του diclofenac αυξήθηκε με τον ίδιο ρυθμό όπως μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 2C) υποδεικνύοντας ότι το

in vivo

επιδράσεις του diclofenac απαιτούν κάποια μεσολαβητές που απουσιάζουν στην

in vitro

σύστημα.

Αντιαγγειογενής επίδραση του diclofenac

in vivo

και

ex vivo

Η

οι όγκοι από ζώα στα οποία χορηγήθηκε η δικλοφενάκη ήταν πολύ χλωμό (Σχήμα 1Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι η θεραπεία προκάλεσε αντιαγγειογενετική δράση. Πράγματι, όπως φαίνεται στο σχήμα 3Α και Β, χρώση για αγγειακά ενδοθηλιακά δείκτη νοη Willebrand Factor και καταμέτρηση των αιμοφόρων αγγείων αποκάλυψε μια σταγόνα 4 φορές του αριθμού των μεγάλων περιφερικών αγγείων και μια σταγόνα 2 φορές σε τριχοειδή πυκνότητα σε όγκους των ποντικών που έλαβαν δικλοφενάκη. Επιπλέον, η χρώση του λείου μυός ακτίνη (Σχήμα 3C) αποκάλυψε λεπτό, ίσιο σκάφη σε όγκους αγωγή σε σύγκριση με πολλές, ευρεία, ελικοειδή αιμοφόρα αγγεία από όγκους ποντικών χωρίς θεραπεία. Ανάλυση της έκφρασης λείου μυός ακτίνης σε ομογενοποιήματα όγκων με στύπωμα western έδειξε μία σημαντική μείωση (2,5 φορές) σε ποντικούς που θεραπεύονται δικλοφενάκη (Σχ 3D και Ε).

Α-Ρ, οι ποντικοί εμβολιάσθηκαν με κύτταρα PANC02 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δικλοφενάκη, όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1. Α-Δ, θεραπεία δικλοφενάκη προκαλεί μορφολογικές αλλαγές στα αιμοφόρα αγγεία του όγκου. Α, Von Willebrand χρώση των μεγάλων περιφερειακών αγγείων (

πάνω)

και τα τριχοειδή αγγεία (

κάτω

). Β, Μέσος όρος ± SE μεγάλων περιφερικά αγγεία /slide. υπολογίζονται γύρω από την περιφέρεια του κάθε slide (

πάνω

) και μέση τιμή ± SE των τριχοειδών αγγείων /περιοχή υπολογίζονται σε 10 διαφορετικές κεντρικές περιοχές των όγκων κάτω X40 μεγέθυνσης (

κάτω

). Τα σκάφη μετράνε αξιολογήθηκε σε όγκους των 4 μη επεξεργασμένων και 4 ποντικούς που υπέστησαν αγωγή δικλοφενάκη, * P≤0.01. C, χρώση ακτίνης λείου μυός έδειξε πολύ λεπτά τοιχώματα των αιμοφόρων αγγείων σε ποντίκια με αγωγή δικλοφενάκη. D και Ε, η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες των λείων μυών ακτίνης σε ομογενοποιήματα όγκων (50 μg πρωτεΐνης φορτώθηκαν ανά λωρίδα) 4 χωρίς θεραπεία και 3 ποντικούς που υπέστησαν αγωγή diclofenac μετράται όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι, μέση ± SE από αυθαίρετες μονάδες /λωρίδα, * P≤0.01. F, Diclofenac μειώνει την περιεκτικότητα του VEGF του όγκου και της περιτοναϊκής κοιλότητας, αλλά όχι ο ορός. επίπεδα VEGF μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι στον όγκο ομογενοποιήματα-pg /mg πρωτεΐνης (

κορυφή

), στην περιτοναϊκή κοιλότητα-pg /ποντίκι (

κέντρο

) και στον ορό -PG /ml (

κάτω

). Τα αποτελέσματα είναι μέση τιμή ± SE από 4 έως 6 ποντικούς ανά ομάδα. *, ** Και # σημαντικά διαφορετική από χωρίς θεραπεία, τα ποντίκια που φέρουν όγκο P≤0.02. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε δύο ανεξάρτητα πειράματα. G, δικλοφενάκη αναστέλλει την αγγειακή βλάστησης. Η

ex vivo

ανασταλτική επίδραση του diclofenac επί βλάστησης μετρήθηκε σε δακτυλίους αορτής αρουραίου που καλλιεργούνται απουσία ή παρουσία 10 μΜ diclofenac για 5 ημέρες όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα είναι μέσος όρος ± SE της περιοχής φυτρώνουν 5 δαχτυλίδια σε κάθε ομάδα μετριέται χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Pro Image. * Σημαντικά διαφορετική από την ομάδα χωρίς αγωγή P≤0.01 Οι φωτογραφίες του εκπροσώπου δαχτυλίδια από μη επεξεργασμένα (

αριστερά

) και η δικλοφενάκη (

δεξιά

) αντιμετωπίζονται ομάδων. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε 4 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

VEGF έχει αποδειχθεί ότι είναι η κύρια προ-αγγειογόνος παράγοντας σε όγκους [24]. Συνεπώς, μετρήσαμε τα επίπεδα VEGF όγκου του diclofenac επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων ποντίκια (Σχήμα 3F). Επεξεργασμένα όγκους ποντικών περιείχαν 3 φορές λιγότερο VEGF σε σύγκριση με όγκους από ποντικούς χωρίς θεραπεία, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μείωση της αγγείωσης του όγκου αποτελέσματα από μια ρύθμιση προς τα κάτω του VEGF (Σχ 3F,

κορυφή

). Δεδομένου ότι τα καρκινικά κύτταρα εξαπλωθεί γρήγορα μέσω της κοιλιακής κοιλότητας, έχουμε την επόμενη μετρούμενη περιεκτικότητα VEGF στο περιτοναϊκό υγρό. Η flushable ποσότητα του VEGF από την περιτοναϊκή κοιλότητα του από όγκο που φέρουν ποντικών ήταν 13 φορές υψηλότερη από εικονικά χειρουργημένα υγιή ποντίκια. Το ποσό αυτό μειώθηκε κατά 2,8 φορές μετά τη θεραπεία δικλοφενάκη (Σχήμα 3F,

κέντρο

).

Αυτές οι έντονες επιπτώσεις στο περιεχόμενο VEGF, τόσο στην περιτοναϊκή κοιλότητα και στον ιστό του όγκου, δεν ήταν αντανακλάται σε κάθε αλλαγή στη συγκέντρωση του VEGF στον ορό (Σχήμα 3F,

κάτω

). Ετσι, οι συγκεντρώσεις του VEGF στον ορό ήταν παρόμοιες σε ορό υγιών-ψευδοχειρουργήθηκαν ποντικούς, σε από όγκο που φέρουν ποντίκια και σε ποντίκια που φέρουν όγκο σε επεξεργασία με δικλοφενάκη.

Για να καθοριστεί εάν η δικλοφενάκη μπορεί να αναστείλει άμεσα την αγγειογένεση, μετρήσαμε βλάστησης αγγειογένεση αρουραίου αορτικών δακτυλίων

ex vivo

σε απόκριση σε φαρμακευτική θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχ 3G, βλάστηση περιοχή αναστάλθηκε από 2,5 φορές, όταν αορτικών δακτυλίων επωάστηκαν με 10 μΜ του diclofenac (C max των ασθενών που έλαβαν diclofenac), δείχνοντας έτσι ότι η δικλοφενάκη μπορεί να αναστείλει άμεσα την ανάπτυξη των αιμοφόρων αγγείων.

Diclofenac αυξάνει τη δραστηριότητα αργινάσης στην παγκρεατικών όγκων και σε περιτοναϊκούς μακροφάγους, αλλά όχι σε μυελό των οστών-CD 115 θετικών και CD 115 αρνητικά κύτταρα

ένα από τα αποτελέσματα της COX-2 υπερέκφραση με τα καρκινικά κύτταρα είναι μια μεγάλη παραγωγή του PGE2 η οποία οδηγεί σε μειωμένη απόκριση Τ-κυττάρων [14] [25]. PGE2 προκαλεί δραστηριότητα αργινάσης 1 και η πρόσληψη αργινίνης στο προέρχονται μυελοειδή κατασταλτικά κύτταρα (MDSCs), προκαλώντας έτσι αργινίνη εξάντληση στον όγκο γύρω. Η σχετική έλλειψη αργινίνης προκαλεί μια ατέλεια στην έκφραση CD3ζ των ογκο-διηθητικά κύτταρα Τ. Δεδομένου ότι οι αναστολείς COX-2 φαίνεται να σταματήσει μερικώς την ανάπτυξη του όγκου μέσω της αργινάσης αναστολή στην MDSC [14], [25] μετρήσαμε δραστηριότητα αργινάσης στα παγκρεατικά ομογενοποιήματα όγκου από μη-επεξεργασμένα και τα ποντίκια έλαβαν δικλοφενάκη (Σχήμα 4Α,

κορυφή

).

Α-Ο, όλοι οι ποντικοί εκτός από αυτές που αναφέρονται εμβολιάσθηκαν με όγκους την ημέρα 1 και θανατώθηκαν την ημέρα 14., αργινάσης δραστηριότητα μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι στο ομογενοποίημα όγκου

( top)

, στα μακροφάγα απομονώθηκαν με περιτοναϊκή κοιλότητα ξεπλύνετε και καλλιεργήθηκαν για 20 ώρες (

κέντρο)

, και πρόσφατα απομονώθηκαν περιτοναϊκή κύτταρα (

κάτω)

. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με δικλοφενάκη 30 mg /kg για 11 ημέρες (

κορυφή και κέντρο

) ή για 2 ημέρες πριν από το τέλος του πειράματος (

κάτω). Τα αποτελέσματα είναι μέση τιμή ± SE της αργινάσης δραστηριότητας σε ομογενοποιήματα όγκου 6-7 ποντικών σε κάθε ομάδα (

κορυφή

) ή σε Triton Χ-100 διαλύονται κύτταρα που λαμβάνονται από 3-7 ποντικούς μέσω περιτοναϊκής flush και μετρήθηκαν εις τετραπλούν (

και στο κάτω

). Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον 3 φορές και τα αποτελέσματα του αντιπροσωπευτικού πειράματος φαίνονται. * Σημαντικά διαφορετική από την χωρίς θεραπεία ομάδα P≤0.01. # Σημαντικά διαφορετική από την χωρίς θεραπεία ομάδα από όγκο ελεύθερης ποντίκια. Β, αργινάση-1 χρώση των όγκων. Σταθεροποιείται όγκοι υπέστησαν χρώση για αργινάσης 1 όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι φωτογραφίες των τμημάτων ελήφθησαν υπό Χ 10

(κορυφή)

ή Χ 40 (

κάτω

) μεγέθυνση. C, ο προσδιορισμός των δύο ξεχωριστούς πληθυσμούς κυττάρων σε καρκινικά (diclofenac-θεραπεία) στρώματος: F4-80 θετικά και αργινάση θετικά κύτταρα. Οι σειριακές τομές χρωματίστηκαν για F4 /80

(αριστερά

) και για αργινάση 1,

(δεξιά)

. Οι ίδιες περιοχές προσδιορίστηκαν και συγκρίθηκαν ως προς την παρουσία και των δύο δεικτών. Οι φωτογραφίες των τμημάτων ελήφθησαν υπό Χ 20 μεγέθυνση. Ένα πείραμα, εκπρόσωπος της 2. Δ, δικλοφενάκη δεν επάγει δραστηριότητα αργινάσης όταν επωάζονται με τα μακροφάγα σε καλλιέργεια κυττάρων. Περιτοναϊκά μακροφάγα απομονώθηκαν από άνευ όγκου ποντικοί όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι και επωάστηκαν για 48 ώρες με 10 ή 30 μΜ δικλοφενάκη ακολουθούμενη από αργινάσης μέτρησης. Η μέση ± SE δραστηριότητας αργινάσης του 3 φρεάτια σε κάθε ομάδα. Ένα πείραμα, εκπρόσωπος της 3.

Η

Για δραστηριότητας έκπληξη αργινάσης μας δεν ανεστάλη με αγωγή δικλοφενάκη, αλλά ενεργοποιήθηκε σημαντικά κατά 2,4 φορές.

χρώσης ανοσο-ιστολογική έδειξε αργινάσης 1 θετικών κυττάρων στην περιφέρεια των όγκων σε αμφότερα χωρίς θεραπεία και ποντικών που υπέστησαν αγωγή δικλοφενάκη (Σχήμα 4Β). Ο αριθμός των αργινάσης 1 κυττάρων που εκφράζουν και την ένταση χρώσης τους φάνηκε να αυξάνεται υπό θεραπεία δικλοφενάκη. Ένα σημαντικό, 1,8 φορές αύξηση στην αργινάσης 1 περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες σε όγκους των ποντικών που έλαβαν diclofenac μετρήθηκε επίσης με ανάλυση στυπώματος Western ομογενοποιημάτων όγκου (Σχ S2). Χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα κατά της μακροφάγων δείκτη F4 /80 (Σχήμα 4C) δεν θα μπορούσαμε να ανιχνεύσουν οποιαδήποτε επικάλυψη με βαφή αργινάσης 1.

Για την περαιτέρω χαρακτηρισμό των αργινάσης 1 κύτταρα που εκφράζουν σε όγκους PANC02, θα εμβολιάζονται PANC02 κύτταρα σε διαγονιδιακά ποντίκια όπου ένας ρεπόρτερ GFP οδηγείται από τον υποκινητή CX3CR1. Δραστηριότητα αυτού του υποκινητή του υποδοχέα χημειοκίνης περιορίζεται σε μονοπύρηνα κύτταρα μυελοειδούς, συμπεριλαμβανομένων όλων των κυκλοφορούντων CD116

+ μονοκύτταρα, και ουσιαστικά απουσιάζει από τα κύτταρα του λεμφοειδούς γράμμωσης. Απομονώσαμε GFP θετικά κύτταρα από όγκους και διαπιστώθηκε ότι αυτά τα κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα της αργινάσης 1 (Σχ S3).

Έτσι, η αυξημένη δραστηριότητα της αργινάσης βρέθηκε σε όγκους από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή δικλοφενάκη οφείλεται τουλάχιστον εν μέρει στην η ενεργοποίηση της αργινάσης 1 σε μονοκύτταρα που προέρχονται CX3CR1

+ κύτταρα. Η δράση της αργινάσης απουσίαζε σε καλλιεργημένα PANC02 (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται) και πρωτεΐνη αργινάση 1 ποτέ δεν ανιχνεύθηκε σε κύτταρα όγκου

in vivo

με ανοσοχρώση.

Το εντυπωσιακό αποτέλεσμα της θεραπείας diclofenac επί αργινάσης δραστηριότητα στα παγκρεατικά όγκους μας οδήγησε να εξετάσει δραστηριότητα αργινάσης στην περιτοναϊκή μακροφάγα. Περιτοναϊκά μακροφάγα μπορούν να συμμετέχουν σε όγκο επιτήρηση [26] και δείχνουν μια ενισχυμένη έκφραση αργινάσης σε ποντικούς που φέρουν όγκο [27]. Μακροφάγα από περιτοναϊκή πλύση απομονώθηκαν από προτιμησιακές προσκόλληση σε δίσκους καλλιέργειας και καλλιεργήθηκαν τη διάρκεια της νύχτας. Ανοσοκηλίδωση έδειξαν ότι και οι δύο F4 /80 θετικά και αργινάση 1 θετικά (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται). Η δράση της αργινάσης ρυθμίζεται αυξητικά (4,8 φορές) σε μακροφάγα που προέρχονται από ποντίκια που φέρουν από όγκο σε επεξεργασία με δικλοφενάκη για 11 ημέρες, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα ποντίκια, (Σχ 4Α

κέντρο

).

Από αργινάση των μακροφάγων έκφραση μπορεί να αλλάξει σε απόκριση πρόσφυσης καλλιέργεια πιάτο [28] μετρήσαμε επίσης αργινάσης δραστικότητα σε μη καλλιεργημένα πρόσφατα απομονωμένα κύτταρα από την περιτοναϊκή κοιλότητα ποντικού, με τον τρόπο αυτό θέτει σε κίνδυνο την καθαρότητα μακροφάγα, (Σχ 4Α

κάτω)

.

Diclofenac διεγείρεται αποτελεσματικά δραστηριότητα αργινάσης σε μη καλλιεργημένα κύτταρα που προέρχονται από τα δύο χωρίς όγκο και φέροντες όγκο ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με δικλοφενάκη για 2 ημέρες μόνο κατά 7 και 3 φορές, αντίστοιχα. παρουσία όγκων ενισχυμένη δραστηριότητα αργινάσης κατά 4 φορές αύξηση της δραστικότητας από 0,03 (κύτταρα από ποντίκια που δεν φέρουν όγκο) έως 0,12 mg ουρίας /min /mg πρωτεΐνης (κύτταρα από τον όγκο οποία φέρουν το ποντικούς) που είναι σύμφωνα με προηγούμενες αναφερόμενα αποτελέσματα [27] .

Μετρήσαμε επίσης ο αριθμός των περιτοναϊκών κυττάρων που προέρχονται από κάθε ποντικό και βρήκαν ότι μια θεραπεία δικλοφενάκη 2 ημέρα απέδωσε ένα 3 φορές αύξηση σε κύτταρα από ποντίκια χωρίς όγκο. Ο μέσος αριθμός κυττάρων ± SE ήταν 0,6 × 10

6 ± 0,06 × 10

6 εξάγεται από τα μη θεραπευμένα ποντίκια και 1,5 × 10

6 ± 0,4 × 10

6 από τα ποντίκια έλαβαν δικλοφενάκη (p≤ 0.02, 7 ποντικούς σε κάθε ομάδα).

Αυτή η παρατήρηση δείχνει ότι μετά από ένα σύντομο κατεργασία diclofenac, η συνολική δραστηριότητα αργινάσης στην περιτοναϊκή κύτταρα (κυρίως μακροφάγα) είναι εξαιρετικά υψηλή, τόσο λόγω της μεγάλης αύξησης σε μια συγκεκριμένη δραστηριότητα αυτού του ενζύμου και λόγω της αύξησης του αριθμού των ενεργοποιημένων κυττάρων.

Η ενεργοποίηση της δραστηριότητας αργινάσης με δικλοφενάκη δεν μπορούσε να αποδειχθεί

in vitro

. Η επώαση περιτοναϊκών μακροφάγων επί 48 ώρες (Σχ 4D) δεν αύξησε δραστικότητα αργινάσης, αλλά μάλλον έδωσε κάποια μείωση στην ειδική δραστικότητα αυτού του ενζύμου. Τα ίδια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν οι μακροφάγοι επωάστηκαν για 96 ώρες με δικλοφενάκη (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται). Έτσι, παρόμοια με την επίδραση του diclofenac στην απόπτωση των καρκινικών κυττάρων, μεσολαβητές παρούσα

in vivo

και απούσα σε καλλιεργημένα μακροφάγα που απαιτούνται για να επιτευχθεί η επαγωγή της αργινάσης δραστηριότητα από αυτό το φάρμακο.

Διερευνήσαμε επίσης κατά πόσον η ενεργοποίηση αργινάσης με δικλοφενάκη μπορεί να ανιχνευθεί σε προδρόμους μακροφάγων του μυελού των οστών. Εμείς απομονώθηκαν μονοπύρηνα κύτταρα από κνημιαία και μηριαία οστά από τα ποντίκια που φέρουν όγκο μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων για 11 ημέρες με δικλοφενάκη. Βρήκαμε πολύ χαμηλή αργινάσης δραστηριότητα και στις δύο CD 115

+ και CD 115

– κύτταρα. Έτσι, αργινάση ενεργοποίηση με δικλοφενάκη συμβαίνει είτε σε διαφοροποιημένα μακροφάγα ή τους μεσολαβητές που απαιτούνται για την προώθηση diclofenac- induced- ενεργοποίηση της αργινάσης δεν φθάνουν το διαμέρισμα του μυελού των οστών.

δικλοφενάκη μειώνεται κανένα επίπεδο στην περιτοναϊκή κοιλότητα και στον ορό

επόμενο διερευνηθεί κατά πόσον η έντονη ενεργοποίηση της αργινάσης τόσο ιστό του όγκου και στην περιτοναϊκή μακροφάγα επηρέασε την παραγωγή του ΝΟ.